一种通过环糊精表面接枝来提高蛋白质结晶成功率的方法
【专利摘要】本发明提供了一种通过环糊精表面接枝来提高蛋白质结晶成功率的方法，首先对结晶板表面进行处理，使结晶板表面羟基化，采用环糊精或其衍生物修饰结晶板表面；然后配置蛋白溶液，最终建立蛋白质结晶体系，进行结晶。本发明只需要对结晶板进行两步处理即可得到表面接枝环糊精的结晶板，一次可处理大量结晶板，同时工艺简单，避免了逐一添加异相形核剂的人工与时间耗费。通过本发明，结晶成功率的提高最大可达到现有技术的2倍以上。
【专利说明】
一种通过环糊精表面接枝来提局蛋白质结晶成功率的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种在结晶板表面接枝环糊精或其衍生物用于蛋白质结晶的方法，特别是通过在结晶板表面接枝环糊精或其衍生物来提高蛋白质结晶成功率的方法。
【背景技术】
[0002]蛋白质作为生命活动的物质基础，对其功能研究具有重要的生物学意义。蛋白质结构是功能研究的前提和基础，因此解析蛋白质结构对阐明相关的生物学问题具有重要的意义。目前获取蛋白质结构的技术主要有X-射线衍射技术、核磁共振技术和冷冻电镜等，其中应用最广和精度最高的是X-射线衍射技术。获得可衍射的蛋白质晶体是实现该技术的前提和基础，但目前蛋白质结晶成功率较低，严重制约了该项技术的发展，所以如何提高蛋白质结晶成功率是首当其冲需要解决的问题。
[0003]蛋白质结晶包括两个步骤，蛋白质分子首先在过饱和溶液中形核，继而在晶核表面进行有序堆积，完成晶体生长，其中形核是蛋白质结晶的关键和前提。只有蛋白质溶液和盐溶液浓度达到过饱和才能跨越形核势皇而形核，这就使形核变得非常困难。在提高蛋白质形核成功率的诸多尝试中，通过添加异相形核剂来提高结晶成功率是目前应用最为广泛的方法，将异相核引入蛋白结晶体系中，可以使蛋白质分子免除跨越形核势皇的步骤，而直接在异相核表面堆积从而进行晶体生长。通常，这些异相核需要手动逐一添加到结晶体系中，阻碍了结晶自动化的实现，同时也非常耗费时间与人工，最简单的解决方法是对结晶基底直接接枝异相核来提高结晶效率。目前，已经有一些通过对结晶板表面进行官能团修饰来提高蛋白质结晶成功率的方法，文献“Pham T.,Lai D., Ji D.，et al.,Well-orderedself-assembled monolayer surfaces can be used to enhance the growth ofprotein crystals,Colloids and Surfaces B:B1interfaces,2004,34(3):191-196^ ψ报道，表面修饰i 烧硫醇、十二烧硫醇、十八烧硫醇构成的疏水自组装单分子层的镀金玻璃载玻片，比传统硅烷化玻璃载玻片更快得到晶体，同时晶体尺寸也会增加，结晶成功率显著提高。可见，对结晶板表面进行修饰是一种有效地提高蛋白质结晶成功率的方法。
[0004]环糊精是由葡萄糖单元组成的环状低聚糖，其中各葡萄糖单元均以I，4-糖苷键结合成环，其分子呈现两端开口的中空筒状结构，筒状外缘相对亲水而空腔内部相对疏水。特殊的结构使环糊精或其衍生物可以与其它分子结合构成包合物。环糊精现已经成功地应用于蛋白复性、稳定蛋白结构、膜蛋白纯化等方面。文献“Anand U.,Mukherjee S.，Reversibility in protein folding:effect of beta-cyclodextrin on bovine serumalbumin unfolded by sodium dodecyl sulphate,Physical Chemistry ChemicalPhysics ,2013,15(23): 9375-83”中报道，β-环糊精可以提高由十二烷基硫酸钠引起的牛血清白蛋白变性的复性效率。
[0005]
【申请人】已提交了一种使用环糊精作为籽晶来提高蛋白质结晶成功率的方法的专利申请，将环糊精及其衍生物添加到蛋白质结晶体系中作为异相形核剂来促进晶体形核。通过此发明，证明环糊精及其衍生物对于蛋白质结晶有促进作用。但是原有技术中需要将环糊精手动逐一添加到结晶体系中，耗费时间和人工并且不利于自动化的实现。
【发明内容】
[0006]为了克服现有技术的不足，本发明提供一种将环糊精或其衍生物接枝于结晶板表面来提高蛋白质结晶成功率的方法，通过对结晶基底直接接枝环糊精或其衍生物来提高结晶效率，直接对结晶板进行表面改造免除了异相形核剂逐一添加至结晶体系的步骤，极大的节约了时间，提高了效率。
[0007]本发明解决其技术问题所采用的技术方案包括以下步骤:
[0008](a)对结晶板表面进行处理，包括以下内容:
[0009]用H20、98wt%*硫酸和K2Cr2O7配置成处理液，其中H20、浓硫酸和K2Cr2O7所占的质量份数为(30?70): (30?70): (0.5?5)，用处理液浸泡材质为聚苯乙烯的结晶板20min?240min;然后用去离子水将浸泡后的结晶板表面冲洗干净;将结晶板放入I?20wt %的50?70°C稀硫酸溶液中浸泡I?24h;最后用去离子水清洗干净，即得到表面含有羟基的结晶板；
[0010]将表面含有羟基的结晶板放入用醋酸调pH为4?7、含0.5?2vol%2，3-环氧丙氧基三甲氧基硅烷、0.5?2to I % H2O的乙醇溶液中室温浸泡6?24h，取出后用乙醇冲洗数次，再用去离子水清洗干净，N2吹干;然后，再将其浸入0.01?0.2?丨％环糊精或其衍生物的无水乙醇溶液中，于75 °C浸泡5?1h，取出后依次用乙醇和去离子水冲洗干净，N2吹干，得到环糊精或其衍生物表面接枝的结晶板；
[0011](b)配置用于溶解蛋白质的缓冲液，使pH值在3?1，浓度范围为0.001?IM，溶解蛋白质，得到终浓度为I?100mg/ml蛋白溶液；
[0012](c)将结晶试剂与蛋白溶液按照体积比为(0.01?50):1滴加在环糊精或其衍生物表面接枝的结晶板中，建立蛋白质结晶体系用于结晶；
[0013](d)将蛋白质结晶体系在O?60°C环境下静置I?720h结晶；在显微镜下统计出现蛋白质晶体的条件数目。
[0014]所述的环糊精或其衍生物包括但不限于环糊精、烯丙基-环糊精、羟丙基-环糊精、羟丁基-环糊精、己二胺基-环糊精、对甲苯磺酰基环糊精、聚合环糊精、乙二胺-环糊精、甲基-环糊精、巯基-环糊精和羧甲基-环糊精。
[0015]所述的缓冲液包括但不限于三羟甲基氨基甲烷系统、硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸、磷酸盐、醋酸、巴比妥酸、柠檬酸、碳酸。
[0016]本发明的有益效果是:通过在结晶板表面接枝环糊精或其衍生物，来促进晶体形核，从而使蛋白质结晶成功率能够提高。环糊精及其衍生物由于其特殊的结构特征，在蛋白相关研究中已有广泛应用，将其直接表面接枝修饰在结晶板表面，可以实现简化添加异相形核剂的过程，又提高了结晶成功率。在本发明中只需要对结晶板进行两步处理即可得到表面接枝环糊精的结晶板，一次可处理大量结晶板，同时工艺简单，避免了逐一添加异相形核剂的人工与时间耗费。通过本发明，结晶成功率的提高最大可达到现有技术的2倍以上。
【具体实施方式】
[0017]下面结合实施例对本发明进一步说明，本发明包括但不仅限于下述实施例。
[0018]本发明提供一种通过对结晶板表面接枝环糊精或其衍生物来提高蛋白质结晶成功率的方法，具体的技术方案步骤如下:
[0019](a)对结晶板表面进行处理
[0020]①结晶板表面羟基化:对目前商业的结晶板材质常用的聚苯乙烯(polystyrene，简写为PS)板进行表面处理。首先，用H20、98%浓硫酸和1(2&207配置成的处理液(其中处理液H20、浓硫酸和K2Cr2O7各组分所占的质量配比分别为(30?70): (30?70): (0.5?5)，浸泡PS板20min?240min;然后，用去离子水将浸泡后的PS板表面冲洗干净;接着，将结晶板放入I?20wt%的50?70°C稀硫酸溶液中浸泡I?24h;最后，用去离子水清洗干净，即得到表面含有轻基的PS板；
[0021]②环糊精或其衍生物修饰结晶板表面:首先，将表面含有羟基的结晶板放入用醋酸调pH为4?7，含0.5?2vol % 2，3-环氧丙氧基三甲氧基硅烷，0.5?2vol %H20的乙醇溶液中室温浸泡6?24h，取出后用乙醇冲洗数次，再用去离子水清洗干净，N2吹干;然后，再将其浸入0.01?0.2wt%环糊精或其衍生物(所述的环糊精或其衍生物包括但不限于环糊精、烯丙基-环糊精、羟丙基-环糊精、羟丁基-环糊精、己二胺基-环糊精、对甲苯磺酰基环糊精、聚合环糊精、乙二胺-环糊精、甲基-环糊精、巯基-环糊精和羧甲基-环糊精)的无水乙醇溶液中，于75°C浸泡5?1h，取出后依次用乙醇和去离子水冲洗干净，N2吹干，得到环糊精或其衍生物表面接枝的结晶板；
[0022](b)配置蛋白溶液:配置用于溶解蛋白质的缓冲液(指所有可以减少溶液体系内pH改变，维持体系酸碱度的溶液，缓冲液类型包括但不限于三羟甲基氨基甲烷系统、硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸、磷酸盐、醋酸、巴比妥酸、柠檬酸、碳酸)，使其PH值在3?10，浓度范围为
0.001?IM，溶解蛋白质，得到终浓度为I?100mg/ml蛋白溶液；
[0023](c)蛋白质结晶体系的建立:将结晶试剂(指所有用于蛋白质结晶的试剂)与蛋白溶液按照体积比为(0.01?50):1滴加在环糊精或其衍生物表面接枝的结晶板中，建立蛋白质结晶体系用于结晶；
[0024](d)结晶:将蛋白质结晶体系在O?60°C环境下静置I?720h结晶。在显微镜下统计出现蛋白质晶体的条件数目。
[0025]实施例1:葡萄糖异构酶结晶条件的筛选
[0026]第一步:通过表面处理得到甲基环糊精表面接枝的结晶板。具体为，用H20、98%浓硫酸和K2Cr2O7按照质量百分比30: 65: 5混合后配置成处理液。用该处理液浸泡PS板40min;然后，用去离子水将浸泡过的PS板表面冲洗干净;接着，将处理的结晶板放入1wt %的60°〇稀硫酸溶液中24h;最后用去离子水清洗干净，即得到表面接枝羟基的PS板。将表面接枝羟基的结晶板放入用醋酸调PH约为4，含lvol%2，3-环氧丙氧基三甲氧基硅烷，Ivol^H2O的无水乙醇溶液中室温浸泡12h，取出后用乙醇冲洗数次，再用去离子水清洗干净，N2吹干;然后，再浸入0.15vol %甲基环糊精的无水乙醇溶液中，于75°C浸泡5h，取出后依次用乙醇、去离子水冲洗干净，N2吹干，得到表面接枝甲基环糊精的结晶板；
[0027]第二步:将美国Hampton公司的葡萄糖异构酶溶于pH为3，0.5M的HEPES-Na缓冲液中，达到终浓度为2mg/ml，得到葡萄糖异构酶溶液；
[0028]第三步:用Hampton公司的Index?试剂盒的96种结晶试剂筛选葡萄糖异构酶晶体，将结晶试剂与蛋白质溶液按照体积比为0.1:1滴加在结晶板坐滴孔中混合，得到蛋白质结晶体系；
[0029]第四步:将结晶体系置于15°C条件下静置结晶72h。显微镜下观察统计出现葡萄糖异构酶晶体的条件个数。
[0030]经过统计得到以下结果:61种结晶条件中出现了葡萄糖异构酶晶体，结晶成功率为63.54%。与未处理结晶板的对照组相比，成功率提高了2.1倍。
[0031]实施例2:溶菌酶结晶条件的筛选
[0032]第一步:通过表面处理得到β-环糊精表面接枝的结晶板。具体为，用H20、98%浓硫酸和K2Cr2O7按照质量百分比50: 47: 3混合后配置成处理液。用该处理液浸泡PS板20min;然后，用去离子水将处理过的PS板表面冲洗干净;接着，将处理的结晶板放入15wt %的60°(:稀硫酸溶液中浸泡Ih;最后用去离子水清洗干净，即得到表面接枝羟基的PS板。将表面接枝羟基的结晶板放入用醋酸调PH约为6，含IV01 % 2，3-环氧丙氧基三甲氧基硅烷，1.5to I % H2O的无水乙醇溶液中室温浸泡24h，取出后将其用乙醇冲洗数次，再用去离子水清洗干净，N2吹干;然后，再浸入0.15νο1%β-环糊精的无水乙醇溶液中，于75°C浸泡10h，取出后依次用乙醇、去离子水冲洗干净，N2吹干，得到表面接枝β-环糊精的结晶板；
[0033]第二步:将日本Seikagaku公司的溶菌酶溶于pH为4.6,0.1M的醋酸钠缓冲液中，达到终浓度为80mg/ml，得到蛋白质溶液；
[0034]第三步:将80mg/ml氯化钠溶液与蛋白质溶液按照体积比30: I滴加在结晶板坐滴孔中，得到蛋白质结晶体系；
[0035]第四步:将结晶体系置于4°C条件下静置结晶24h。显微镜下观察统计出现溶菌酶晶体的条件个数。
[0036]经过统计得到以下结果:72种结晶条件下出现了溶菌酶晶体，结晶成功率为75%。与现有技术中使用未处理的结晶板的对照组相比，成功率提高了2.4倍。
[0037]实施例3:刀豆球蛋白结晶条件的筛选
[0038]第一步:通过表面处理得到对甲苯磺酰基环糊精表面接枝的结晶板。具体为，用出0、98%浓硫酸和1(2(^207按照质量百分比40: 58: 2混合后配置成处理液。用该处理液浸泡PS板140min;然后，用去离子水将处理过的PS板表面冲洗干净;接着，将处理的结晶板放入10^%的55°(:稀硫酸溶液中浸泡1h;最后用去离子水清洗干净，即得到表面接枝羟基的PS板。将表面接枝羟基的结晶板放入用醋酸调pH约为5.5，含2vol%2，3-环氧丙氧基三甲氧基硅烷，0.5to I % H2O的无水乙醇溶液中室温浸泡I Oh，取出后将其用乙醇冲洗数次，再用去离子水清洗干净，N2吹干;然后，再浸入0.0Svol %对甲苯磺酰基环糊精的无水乙醇溶液中，于75°C浸泡5h，然后依次用乙醇、去离子水冲洗干净，N2吹干，得到表面接枝对甲苯磺酰基环糊精的结晶板；
[0039]第二步:将美国Sigma公司的刀豆球蛋白溶于pH为7，0.0lM的HEPES-Na缓冲液中，达到终浓度为30mg/ml，得到蛋白质溶液；
[0040]第三步:用Hampton公司的Index?试剂盒的96种结晶试剂筛选刀豆球蛋白晶体，将结晶试剂与蛋白质溶液按照体积比为1:1滴加在结晶板坐滴孔中混合，得到蛋白质结晶体系;
[0041]第四步:将结晶体系置于20°C条件下静置结晶168h。显微镜下观察统计出现刀豆球蛋白晶体的条件个数。
[0042]经过统计得到以下结果:43种结晶条件下出现了刀豆球蛋白晶体，结晶成功率为44.79%。与现有技术中使用未处理的结晶板的对照组相比，成功率提高了2.69倍。
[0043]实施例4:蛋白酶K结晶条件的筛选
[0044]第一步:通过表面处理得到巯基环糊精表面接枝的结晶板。具体为，用H20、98%浓硫酸和K2Cr2O7按照质量百分比45: 54.5:0.5混合后配置成处理液。用该处理液浸泡PS板120min;然后，用去离子水将处理过的PS板表面冲洗干净；接着，将处理的结晶板放入15^%的70°(:稀硫酸溶液中浸泡3h;最后用去离子水清洗干净，即得到表面接枝羟基的PS板。将表面接枝羟基的结晶板放入用醋酸调pH约为4.3，含1.5vol%2，3-环氧丙氧基三甲氧基硅烷，Ivol^H2O的无水乙醇溶液中室温浸泡12h，取出后将其用乙醇冲洗数次，再用去离子水清洗干净，N2吹干，浸入0.01%1%巯基环糊精的无水乙醇溶液中，于75°(:浸泡711，然后依次用乙醇、去离子水冲洗干净，N2吹干，得到表面接枝巯基环糊精的结晶板；
[0045]第二步:将美国Sigma公司的蛋白酶K溶于pH为9，IM的Tris缓冲液中，达到终浓度为50mg/ml，得到蛋白质溶液；
[0046]第三步:用Hampton公司的Index?试剂盒的96种结晶试剂筛选蛋白酶K晶体，将结晶试剂与蛋白质溶液按照体积比为10:1滴加在结晶板坐滴孔中混合，得到蛋白质结晶体系;
[0047]第四步:将结晶体系置于50°C条件下静置结晶2h。显微镜下观察统计出现蛋白酶K晶体的条件个数。
[0048]经过统计得到以下结果:65种结晶条件下出现了蛋白酶K晶体，结晶成功率为67.71%。与现有技术中使用未处理的结晶板的对照组相比，成功率提高了2.83倍。
[0049]实施例5:核糖核酸酶A结晶条件的筛选
[0050]第一步:通过表面处理得到己二胺基环糊精表面接枝的结晶板。具体为，用H20、98%浓硫酸和1(2&207按照质量百分比60: 39: I混合后配置成处理液。用该处理液浸泡PS板200min;然后，用去离子水将浸泡过的PS板表面冲洗干净;接着，将结晶板放入5wt %的68°〇稀硫酸溶液中浸泡3h;最后，用去离子水清洗干净，即得到表面接枝羟基的PS板。将表面含有羟基的结晶板放入用醋酸调PH约为5，含1.6vol%2，3-环氧丙氧基三甲氧基硅烷，1.4vol%H2O的无水乙醇溶液中室温浸泡20h，取出后用乙醇冲洗数次，再用去离子水清洗干净，N2吹干;然后，再将其浸入0.05vol %己二胺基环糊精的无水乙醇溶液中，于75°C浸泡7h，取出后依次用乙醇、去离子水冲洗干净，N2吹干，得到表面接枝己二胺基环糊精的结晶板；
[0051 ] 第二步:将美国Sigma公司的核糖核酸酶A溶于pH为8，0.025M的HEPES-Na缓冲液中，达到终浓度为20mg/ml，得到蛋白质溶液；
[0052]第三步:用Hampton公司的CrystalScreen和Crystal Screen 2试剂盒的98种结晶试剂筛选核糖核酸酶A晶体，将结晶试剂与蛋白质溶液按照体积比为0.01:1滴加在结晶板坐滴孔中混合，得到蛋白质结晶体系；
[0053]第四步:将结晶体系置于10°C条件下静置结晶720h。显微镜下观察统计出现核糖核酸酶A晶体的条件个数。
[0054]经过统计得到以下结果:13种结晶条件下出现了核糖核酸酶A晶体，结晶成功率为13.54%。与现有技术中使用未处理的结晶板的对照组相比，成功率提高了3.25倍。
[0055]实施例6:纤维素酶结晶条件的筛选
[0056]第一步:通过表面处理得到乙二胺基环糊精表面接枝的结晶板。具体为，用H20、98 %浓硫酸和1(2&207按照质量百分比42:53.5:4.5混合后配置成处理液。用该处理液浸泡PS板240min;然后，用去离子水浸泡过的PS板表面冲洗干净;接着，将结晶板放入20wt %的70°C稀硫酸溶液中浸泡12h;最后，用去离子水清洗干净，即得到表面接枝羟基的PS板。将表面接枝羟基的结晶板放入用醋酸调PH约为5.5，含2vol%2，3-环氧丙氧基三甲氧基硅烷，2voI % H2O的无水乙醇溶液中室温浸泡24h，取出后用乙醇冲洗数次，再用去离子水清洗干净，N2吹干；然后，再将其浸入0.1vol %乙二胺基环糊精的无水乙醇溶液中，于75°C浸泡10h，取出后依次用乙醇、去离子水冲洗干净，N2吹干，得到表面接枝乙二胺基环糊精的结晶板；
[0057]第二步:将美国Sigma公司的纤维素酶溶于pH为6，0.0OlM的HEPES-Na缓冲液中，达到终浓度为1mg/ml，得到蛋白质溶液；
[0058]第三步:用Hampton公司的CrystalScreen和Crystal Screen 2试剂盒的98种结晶试剂筛选纤维素酶晶体，将结晶试剂与蛋白质溶液按照体积比为0.5: I滴加在结晶板坐滴孔中混合，得到蛋白质结晶体系；
[0059]第四步:将结晶体系置于30°C条件下静置结晶240h。显微镜下观察统计出现纤维素酶晶体的条件个数。
[0060]经过统计得到以下结果:28种结晶条件下出现了纤维素酶晶体，结晶成功率为29.17%。与现有技术中使用未处理的结晶板的对照组相比，成功率提高了3.5倍。
【主权项】
1.一种通过环糊精表面接枝来提高蛋白质结晶成功率的方法，其特征在于包括下述步骤: (a)对结晶板表面进行处理，包括以下内容: 用H2O、98wt %浓硫酸和K2Cr2O7配置成处理液，其中H2O、浓硫酸和K2Cr2O7所占的质量份数为(30?70): (30?70): (0.5?5)，用处理液浸泡材质为聚苯乙烯的结晶板20min?240min;然后用去离子水将浸泡后的结晶板表面冲洗干净;将结晶板放入I?20wt %的50?70°C稀硫酸溶液中浸泡I?24h;最后用去离子水清洗干净，即得到表面含有羟基的结晶板； 将表面含有羟基的结晶板放入用醋酸调pH为4?7、含0.5?2vol%2，3-环氧丙氧基三甲氧基硅烷、0.5?2to I % H2O的乙醇溶液中室温浸泡6?24h，取出后用乙醇冲洗数次，再用去离子水清洗干净，N2吹干;然后，再将其浸入0.01?0.2wt%环糊精或其衍生物的无水乙醇溶液中，于75°C浸泡5?1h，取出后依次用乙醇和去离子水冲洗干净，N2吹干，得到环糊精或其衍生物表面接枝的结晶板； (b)配置用于溶解蛋白质的缓冲液，使pH值在3?10，浓度范围为0.001?IM，溶解蛋白质，得到终浓度为I?100mg/ml蛋白溶液； (c)将结晶试剂与蛋白溶液按照体积比为(0.01?50):1滴加在环糊精或其衍生物表面接枝的结晶板中，建立蛋白质结晶体系用于结晶； (d)将蛋白质结晶体系在O?60°C环境下静置I?720h结晶；在显微镜下统计出现蛋白质晶体的条件数目。2.根据权利要求1所述的通过环糊精表面接枝来提高蛋白质结晶成功率的方法，，其特征在于:所述的环糊精或其衍生物包括但不限于环糊精、烯丙基-环糊精、羟丙基-环糊精、羟丁基-环糊精、己二胺基-环糊精、对甲苯磺酰基环糊精、聚合环糊精、乙二胺-环糊精、甲基-环糊精、巯基-环糊精和羧甲基-环糊精。3.根据权利要求1所述的通过环糊精表面接枝来提高蛋白质结晶成功率的方法，，其特征在于:所述的缓冲液包括但不限于三羟甲基氨基甲烷系统、硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸、磷酸盐、醋酸、巴比妥酸、柠檬酸、碳酸。
【文档编号】C12N9/92GK105924496SQ201610393710
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】张辰艳, 杨雪舟, 尹大川, 王前进, 董晨, 郭云珠, 闫二开
【申请人】西北工业大学