一种香蕉果实颗粒结合淀粉合成酶基因启动子的关键响应元件及其筛选方法
【专利摘要】本发明提供了一种香蕉果实颗粒结合淀粉合成酶基因启动子的关键响应元件及其筛选方法，该关键响应元件是以巴西蕉基因组DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物，通过PCR方法扩增获得的DNA片段。本发明设计不同长度的香蕉MaGBSSI?3基因启动子缺失片段，筛选得到MaGBSSI?3基因启动子的关键相应元件，这为如何有效调控香蕉直链淀粉的合成，以满足食品、医疗、工业等行业对不同含量直链淀粉的需求提供了研究方向，同时为其他植物GBSS基因的研究提供了借鉴。
【专利说明】
一种香蕉果实颗粒结合淀粉合成酶基因启动子的关键响应元 件及其筛选方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种香蕉果实颗粒结合淀粉合 成酶基因启动子的关键响应元件及其筛选方法。
【背景技术】
[0002] 香蕉是热带、亚热带地区重要的经济作物，是仅次于柑橘的世界第二大水果。淀粉 作为香蕉果实中的主要组成成分，又促使其被联合国粮农组织(FA0)认定为仅次于水稻、小 麦、玉米之后的第四大粮食作物，是超过4亿人的口粮(Englberger et al.，2006)。然而，随 着香蕉产业的快速发展和人们生活水平的迅速提高，对香蕉果实品质的要求也越来越高。 将现代生物技术运用于香蕉品质改良中，可以解决一些用常规方法难以解决的问题。近年 来，香蕉生物技术取得了很大的发展，一些控制重要农艺性状基因的相继分离并在香蕉中 遗传转化成功（Sreedharan et al.，2013;Rustagi et al.，2015;Tripathi et al. ,2015; Elitzur et al.，2016)为用基因工程技术来改良香蕉果实品质奠定了良好的基础。
[0003] 目前，我国香蕉优质果率不足30%，大多数香蕉果实后熟过程中出现硬心、糯性 差、糖分含量偏低、抗性淀粉含量不稳定等品质问题。直链淀粉是香蕉果实的主要成分之 一，它的含量直接决定着果实糯性、甜味及抗性淀粉含量等品质。直链淀粉合成酶基因 (GBSS)编码结合在淀粉颗粒上的淀粉合成酶，又称为颗粒结合型淀粉合成酶，是影响直链 淀粉合成的一个关键酶基因。前期研究发现GBSSI-3基因只在香蕉果实中高效表达，因此它 是专一性表达的基因 （Miao et al·，2014)。
[0004] 植物基因工程中常用组成型启动子（如35S)来调控外源基因的表达，但存在一些 缺点，如:35S启动子能促使外源基因在双子叶植物中获得较高的表达，但在单子叶植物中 驱动基因表达能力不强;35S驱动的表达无明显的组织和器官专一性，产生大量异源表达产 物甚至有毒物质，导致植物代谢失衡影响其正常生长发育甚至死亡。应用组织特异性启动 子则可以避免这种影响。
[0005]因此，希望从香蕉直链淀粉合成酶基因中分离出能在香蕉果实中专一表达的启动 子和表达调控元件，从而能在单子叶植物、特别是包括香蕉在内的淀粉转化型作物中驱动 外源基因表达，从而提高作物产量，改善淀粉品质。但是MaGBSSI-3的表达调控机制目前还 不完全清楚，可能受多个水平、多种因子的协同调控，需要进一步研究确认。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，从基因启动子的响应元件角度进行研 究，发现了香蕉果实颗粒结合淀粉合成酶基因 MaGBSSI-3启动子的关键响应元件。
[0007] 本发明的第一个方面是提供一种香蕉果实颗粒结合淀粉合成酶基因启动子的关 键响应元件，其是以巴西蕉基因组DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID N0.7和SEQ ID NO. 8所示的引物，通过PCR方法扩增获得的DNA片段。
[0008] 其中，所述关键响应元件为113bp。
[0009] 本发明的第二个方面是提供一种重组载体，其为含有本发明第一个方面所述的关 键响应元件的载体。
[0010] 其中，所述载体为载体或病毒载体。
[0011] 优选地，所述重组载体为利用Sac I和BamHI两个限制性酶切位点将本发明第一个 方面所述的关键响应元件替换到pVKH-35S-GUS-pA表达载体的CaMV35S启动子处得到的表 达载体。
[0012] 本发明的第三个方面是提供一种香蕉果实颗粒结合淀粉合成酶基因启动子的关 键响应元件的筛选方法，包括以下步骤：
[0013] (1)以巴西蕉基因组DNA为模板，采用如下7组引物对，获得碱基序列为1075bp、 1051匕口、933匕口、645匕口、453匕口、293匕口和113匕口的香蕉1&168551-3基因启动子缺失片段，其中，7 组引物对的3'端引物序列相同为SEQ ID N0.8所示，5'端引物序列分别为：SEQ ID N0.1、 SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示；
[0014] (2)利用Sac I和BamHI两个限制性酶切位点将步骤（1)得到的不同的香蕉 MaGBSSI-3基因启动子缺失片段替换到pVKH-35S-GUS-pA表达载体的CaMV35S启动子处得到 的表达载体；
[0015] (3)利用步骤(2)得到的表达载体转化香蕉果实薄片，分化培养，观察基因 GUS染色 情况，推测最小缺失片段113bp为关键响应元件。
[0016] 本发明的第四个方面是提供一种DNA，其是以巴西蕉基因组DNA为模板，采用3'端 引物序列为SEQIDN0.8所示，5 /端引物序列为SEQIDN0.1、SEQIDN0.2、SEQIDN0.3、 SEQIDN0.4、SEQIDN0.5、SEQIDN0.6或者SEQIDN0.7所示的引物对，通过PCR方法扩 增获得的DNA片段。
[0017] 本发明的第五个方面是提供一种引物组，所述引物组含有核苷酸序列为SEQ ID N0·1和SEQIDN0·8、SEQIDN0·2和SEQIDN0·8、SEQIDN0·3和SEQIDN0·8、SEQID N0·4和SEQIDN0·8、SEQIDN0·5和SEQIDN0·8、SEQIDN0·6和SEQIDN0·8、SEQID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物对中的一种或多种。
[0018] 本发明设计不同长度的香蕉MaGBSSI-3基因启动子缺失片段，筛选得到MaGBSSI-3 基因启动子的关键相应元件，这为如何有效调控香蕉直链淀粉的合成，以满足食品、医疗、 工业等行业对不同含量直链淀粉的需求提供了研究方向，同时为其他植物GBSS基因的研究 提供了借鉴。
【附图说明】
[0019] 图1为MaGBSSI-3基因启动子缺失片段电泳图：M为DL 2000marker，A-G为MaGBSSI-3基因启动子缺失片段；
[0020] 图2为MaGBSSI-3基因启动子缺失片段表达载体构建示意图；
[0021] 图3为重组表达载体双酶切验证，其中，Ml为DL 2000Marker，M2为DL lOOOOMarker，A-P为双酶切及对照目的条带；
[0022]图4为不同MaGBSSI-3基因启动子缺失片段转化香蕉果实后的⑶S染色。
【具体实施方式】
[0023] 下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发 明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按 照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产 品。
[0024] l.MaGBSSI-3基因启动子5'端缺失
[0025] 为了对已获得的MaGBSSI-3的启动子响应元件进一步研究，通过对启动子序列的 生物信息学分析，将该启动子片段进行不同长度的5'端缺失及瞬时表达载体的构建。以已 克隆得到的启动子全长为模板，设计5'端缺失引物序列（3'端引物序列相同），克隆对应的 启动子缺失片段，其引物序列如下：
[0027] 克隆结果如图1所示，MaGBSSI-3基因启动子5'端缺失克隆得到长度为1075、1051、 933、645、453、293和113&?七个不同大小的片段，经?0財广增产物测序检测，其克隆片段大小 是正确的。
[0028] 2.不同缺失长度的MaGBSSI-3基因启动子重组表达载体的构建
[0029]将上述已经克隆得到的七个MaGBSSI-3基因启动子缺失片段PCR扩增产物进行回 收。将PCR克隆得到的不同缺失长度的启动子片段和PVKH-35S-⑶S-pA表达空载体质粒DNA 使用BamH I和Sac I两种限制性内切酶于37°C进行双酶切，对酶切后的产物进行检测及切 胶回收，然后于200yL PCR管中对酶切回收的目的产物和pPVKH空载体大片段进行T4DNA连 接酶16 °C连接过夜，转化、PCR筛选、双酶切及测序验证，结果如图2所示。结果表明：酶切产 物与MaGBSSI-3基因启动子各缺失片段大小相一致，经测序验证获得的片段序列是正确的， 说明各缺失片段已替换表达载体PPVKH上的35S:启动子，即各瞬时表达载体pPVKH-P、 pPVKH-1051、pPVKH-933、pPVKH-645、pPVKH-453、pPVKH-293和 pPVKH-113均已构建成功。 [0030] 3.不同缺失长度的MaGBSSI-3基因启动子重组表达载体的瞬时表达
[0031].不同缺失长度的MaGBSSI-3基因启动子重组表达载体基因枪转化及瞬时表达方 法
[0032] 利用基因枪将不同缺失长度启动子所构建的重组载体(pPVKH(阳性对照）、？?￥腿_ ?3、口？￥101-10514?￥101-9334?￥腿-6454?￥腿-4534?￥101-2934?￥101-113)质粒0嫩直接导 入巴西蕉果实薄片(厚度为0.3mm，直径为0.8cm，呈三角形)受体细胞，24~72h后观察该重 组载体中GUS基因的瞬时表达情况，其具体实验方法步骤如下：
[0033]受体材料预处理:在基因枪轰击前先将香蕉果实薄片转入含渗透剂(0.2mol/L甘 露醇和0.2mo 1/L山梨醇）的MS培养基中预处理4~6h。
[0034]微弹载体制备:称取6〇11^110钨粉置1.51^离心管中；加入111^70%的酒精，充分 祸旋，然后静置15min，1500rpm离心5min ;小心去除上清液，加入lmL无菌水，充分祸旋， 1500rpm离心5min，去上清液，用无菌水重复冲洗三次;将钨粉颗粒转入lmL无菌水的50 %甘 油中；取50yL上述制备好并已涡旋的钨粉颗粒转入一无菌的1.5mL离心管中，按顺序加入5μ L DNA(lygAxL)、50yL 2.5mol/L CaC12和20yL 0.1mol/L亚精胺(现配现用）；将混合物涡旋 lOmin，然后用15000rpm离心5s，去除上清液;用140yL 70 %乙醇冲洗上述沉淀物一次，再用 100%乙醇冲洗一次，最后用48yL 100%乙醇重新悬浮颗粒，并将离心管浸入超声波清洗器 中3s，以分散钨粉颗粒。
[0035]装弹:将基因枪放置于一个较大型的超净工作台上，以利于无菌操作。用70%乙醇 擦净真空室，用浸泡消毒法将可裂圆片、微粒子弹载体、阻挡网于70%酒精中消毒15min，然 后用无菌滤纸吸干或吹干残余酒精;打开电源开关、真空栗及氦气瓶阀；将可裂圆片装入固 定盖，旋紧;取6yL包被DNA的钨粉颗粒无水乙醇悬浮液(约含0.6yg质粒DNA和0.37mg的钨粉 颗粒)点于微粒子弹载体中心，立即在干燥器中干燥，或于工作台上吹干;将载有微粒子弹 的微粒子弹载体及阻挡网装入微粒子弹发射装置中；将欲转化的靶组织平铺在一个含有固 体MS培养基的9cm培养皿中心。
[0036] 轰击:按VAC键，当真空度达到所需要值(600~760mmHg，lmmHg=133.332Pa)时，将 VAC键转到HOLD位置;按FIRE键使氦气压力达到适当位置，约12s打一枪，再按VENT键，取出 样品。
[0037]外植体材料培养:将轰击后的外植体转入MS+AS分化培养基中于28°C、黑暗或弱光 条件下培养。该培养基中不添加卡那霉素等选择压力，以利于受轰击细胞的恢复及充分表 达外源基因。
[0038] 重组载体瞬时表达:将上述材料黑暗放置48h后，将其浸泡在染色液(50mmol/L磷 酸钠缓冲液（口17.0)中含有：0.1111〇1/11(3[卩6(0~)6]，0.1111〇1/11(4[卩6(0幻6]，10111111〇1/1 Na2EDTA，0.001%(v/v)Triton X-100,20% 甲醇，0.5mg/mL X-Gluc)中，于25~37°C保温lh 至过夜;然后将外植体材料转入70 %乙醇中脱色2~3次，至阴性对照材料呈白色;于显微镜 下观察靶启动子所调控的GUS基因的瞬时表达情况。
[0039] 结果如图4所示:不同缺失长度启动子及35S表达载体在香蕉果实中的瞬时表达， 其GUS显色基本一致，说明MaGBSSI-3基因启动子不同缺失片段具有相同且与35S启动子一 致的调控强度，因此也推测最小缺失片段-113bp (只包括光响应元件）的启动子是MaGBSSI -3基因正常表达的所必需的关键响应元件。
[0040] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限 制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种香蕉果实颗粒结合淀粉合成酶基因启动子的关键响应元件，其特征在于，其是 以巴西蕉基因组DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物，通 过PCR方法扩增获得的DNA片段。2. 根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述关键响应元件为113bp。3. -种重组载体，其特征在于，其为含有权利要求1所述的关键响应元件的载体。4. 根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述载体为载体或病毒载体。5. 根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，其为利用Sac I和BamHI两个限制性酶 切位点将权利要求1所述的关键响应元件替换到pVKH-35 S-GUS-pA表达载体的CaMV35 S启动 子处得到的表达载体。6. -种香蕉果实颗粒结合淀粉合成酶基因启动子的关键响应元件的筛选方法，其特征 在于，包括以下步骤： (1) 以巴西蕉基因组DNA为模板，采用如下7组引物对，获得碱基序列为1075bp、1051bp、 933匕？、645匕？、453匕？、293匕？和113匕？的香蕉1&168331-3基因启动子缺失片段，其中，7组引物 对的3'端引物序列相同为SEQ ID NO.8所示，5'端引物序列分别为：SEQ ID NO.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示； (2) 利用Sac I和BamHI两个限制性酶切位点将步骤（I)得到的不同的香蕉MaGBSSI-3基 因启动子缺失片段替换到pVKH-35S-GUS-pA表达载体的CaMV35S启动子处得到的表达载体； (3) 利用步骤(2)得到的表达载体转化香蕉果实薄片，分化培养，观察基因 GUS染色情 况，推测最小缺失片段113bp为关键响应元件。7. -种DNA，其特征在于，其是以巴西蕉基因组DNA为模板，采用3'端引物序列为SEQ ID N0·8所示，5/端引物序列为SEQIDN0·1、SEQIDN0·2、SEQIDN0·3、SEQIDN0·4、SEQID NO.5、SEQ ID NO.6或者SEQ ID NO.7所示的引物对，通过PCR方法扩增获得的DNA片段。8. -种引物组，其特征在于，所述引物组含有核苷酸序列为SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0·8、SEQIDN0·2和SEQIDN0·8、SEQIDN0·3和SEQIDN0·8、SEQIDN0·4和SEQID N0·8、SEQIDN0·5和SEQIDN0·8、SEQIDN0·6和SEQIDN0·8、SEQIDN0·7和SEQID NO. 8所示的引物对中的一种或多种。
【文档编号】C12N15/113GK105950627SQ201610476935
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月27日
【发明人】苗红霞, 孙佩光, 金志强, 徐碧玉, 刘菊华, 张建斌, 贾彩红, 王卓, 王静毅
【申请人】中国热带农业科学院热带生物技术研究所