一种拟南芥sod1蛋白及其在化妆品中的应用

一种拟南芥sod1蛋白及其在化妆品中的应用
【专利摘要】本发明涉及一种拟南芥SOD1蛋白及其在化妆品中的应用，属于基因工程技术领域。一种拟南芥SOD1蛋白，由拟南芥At1g08830基因编码，通过在大肠杆菌中异源表达、分离和纯化获得。所述的拟南芥SOD1蛋白在化妆品中的应用，将所述SOD1蛋白添加进化妆品中，获得抗氧化化妆品。本发明明通过异源表达所获得的植物拟南芥SOD1蛋白可以提高模拟化妆品的抗氧化特性，进一步说明通过基因工程手段可以对植物的天然抗氧化蛋白酶进行操作来获得更多的天然抗氧化蛋白，而获得的这些蛋白可以应用到化妆品的研制中，为利用植物抗氧化基因生产天然抗氧化化妆品提供了一种新的工具和思路，具有重要的指导意义。
【专利说明】
一种拟南芥S0D1蛋白及其在化妆品中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种拟南芥S0D1蛋白在化妆品中的应 用。
【背景技术】
[0002] 近年来，国内外抗衰老化妆品的市场销售量逐年增加，市场热度连年不减。随着这 种市场的迅速发展，人们对化妆品的安全性成分要求也越来越高，主要表现在:更加注重天 然的植物提取成分。抗衰老抗氧化成分的安全性、可靠性、无刺激性、无任何致敏物质和无 不良反应等成为此类化妆品的主要卖点。现在流行的酶抗氧化来预防皮肤的衰老，能够有 效阻止氧自由基对皮肤老化的加速和损伤过程。随着科技的进步及研究的深入，今后也将 会有更多的技术应用及无害成分的添加，使得整个化妆品行业更加安全，效果更加显著。
[0003] 拟南芥Atlg08830基因编码一种超氧化物歧化酶(S0D)，目前的研究结果表明，从 微生物，动物到植物，从单细胞生物到人类，S0D都广泛存在。S0D现已被认为是一种新型酶 制剂，同时也是生物体内重要的抗氧化酶。众所周知，不管是植物应对逆境，还是动物乃至 人类的疾病产生都与细胞内的活性氧(R0S)密切相关。R0S在细胞内的不断积累会加剧细胞 的病变和衰老。S0D是细胞内产生的清除R0S的一种重要蛋白酶，被视为生命科技中最具神 奇魔力的酶，是氧自由基的自然天敌，是清除机体内氧自由基的首要功能酶。该基因的CDS 长度为469个碱基，编码152个氨基酸的蛋白，已有研究表明拟南芥Atlg08830基因在植物应 答逆境胁迫，如干旱、高温、盐害等时都会表现出明显的上调表达现象，也说明该基因可以 提高植物的抗逆性，这种抗逆性的发挥与其具有较强的R0S清除能力息息相关。目前的抗氧 化化妆品多是基于对植物成分的提取和添加，并没有天然纯化蛋白的参与，而由此产生的 高技术附加值，高效抗氧化性能的化妆品还没有相关报道。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的在于提供一种拟南芥Atlg08830基因编码的蛋白（命名为S0D1蛋 白），作为一种天然抗氧化蛋白，能够清除细胞内产生的活性氧。
[0005] 本发明的另一个目的是提供一种拟南芥Atlg08830基因编码的S0D1蛋白在化妆品 中的应用，以提高化妆品的抗氧化性能。
[0006] 为实现上述目的，本发明的技术方案如下： 一种拟南芥S0D1蛋白，通过下述方法获得： 步骤S1:克隆拟南芥Atlg08830基因，进行载体构建，获得具有HIS标签的融合基因重组 载体； 步骤S2:通过遗传转化和重组载体的筛选获得具有Atlg08830基因的阳性菌株，同时提 取重组质粒并转化受体蛋白表达菌株，通过筛选和鉴定获得具有At lg08830基因的阳性表 达菌株； 步骤S3:利用异丙基硫代半乳糖苷诱导所述阳性表达菌株进行表达，离心，过HIS柱，获 得纯化的S0D1蛋白。
[0007] 进一步的，所述利用异丙基硫代半乳糖苷诱导阳性表达菌株进行表达的条件为： 温度16~37°C，时间3~20h，转速210~230rpm，异丙基硫代半乳糖苷的浓度为0.01mmol/l~ 0.lmmol/1〇
[0008] 进一步的，所述利用异丙基硫代半乳糖苷诱导阳性表达菌株进行表达的条件为： 温度28°C，时间5~6h，转速220rpm，异丙基硫代半乳糖苷的浓度为0.01mmol/l。
[0009] 本发明还提供了上述拟南芥S0D1蛋白在化妆品中的应用，将所述S0D1蛋白添加进 化妆品中，获得具有抗氧化功效的化妆品。
[0010] 本发明与现有技术相比，其有益效果如下： 本发明属于基因工程领域，具体是通过构建拟南芥Atlg08830基因编码的HIS标签的融 合蛋白载体，通过在大肠杆菌中进行Atlg08830基因的异源表达获得天然S0D1蛋白，然后通 过体外抗氧化实验分析摸索拟南芥S0D1蛋白在化妆品方面的应用。本发明清楚地表明通过 异源表达所获得的植物拟南芥S0D1蛋白可以提高模拟化妆品的抗氧化特性，进一步说明通 过基因工程手段可以对植物的天然抗氧化蛋白酶进行操作来获得更多的天然抗氧化蛋白， 而获得的这些蛋白可以应用到化妆品的研制中。
[0011] 本发明人将获得的天然S0D1蛋白与甘油进行不同比例浓度的配比，进行抗氧化特 性分析，确定该天然S0D1蛋白具有抗氧化能力。本发明方法的建立为进一步探索S0D1蛋白 的抗氧化能力，利用植物抗氧化基因生产天然抗氧化化妆品提供了一种新的工具和思路， 具有重要的指导意义。
【附图说明】
[0012] 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明。
[0013] 图l:PET_28a(+)载体的质粒谱图； 图2:PCR扩增获得的Atlg08830克隆基因的电泳图，其中，Μ表示分子量Marker，l表示从 拟南芥基因组中克隆Atlg08830基因的PCR产物，箭头所指为Atlg08830基因； 图3:对质粒和Atlg08830克隆基因进行双酶切的电泳图，其中，Μ表示分子量Marker，1~ 3依次表示At 1 g08830克隆基因的质粒PCR的DNA，质粒对照的DNA，质粒双酶切的DNA; 图4:菌落PCR筛选的阳性菌株的电泳图，其中，箭头所指为Atlg08830克隆基因的菌落 PCR扩增片段； 图5: S0D1蛋白小量诱导蛋白的SDS-PAGE电泳图，IPTG浓度为0.01mmol/l; 1~6依次表示 S0D1蛋白的16°C上清液和全蛋白、28°C上清液和全蛋白、未诱导上清液和全蛋白；图中标记 蛋白部分为诱导出的蛋白； 图6:大量诱导后纯化获得的S0D1蛋白电泳图，箭头所指为纯化获得的S0D1蛋白； 图7:测定纯化S0D1蛋白浓度的标准曲线。
【具体实施方式】
[0014] 为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步清楚阐述本发明的内容，但本发 明的保护内容不仅仅局限于下面的实施例。
[0015] 拟南芥Atlg08830基因的⑶S长度为469个碱基，编码152个氨基酸的蛋白，该基因 所编码的蛋白质是植物重要的抗氧化酶，能够清除体内产生的ROS，从而提高植物的抗逆 性。
[0016] 本发明拟南芥Atlg08830基因编码的蛋白命名为S0D1蛋白，其氨基酸序列如序列 表中序列1所示，由152个氨基酸组成。
[0017] 本发明中所使用的甘油，化学名称为丙三醇，是一种无色透明粘稠液体，无臭，味 甜，具有良好的吸湿保湿作用，普遍应用于各种化妆品中，给皮肤角质层补充水分，调节肌 肤生理作用，保持肌肤健康，并提高使用感。为了探索本发明所获S0D1蛋白的抗氧化性能， 本发明将其与甘油配合，模拟化妆品，制备成样品，从而测定和分析上述样品的抗氧化性 能。
[0018] 实验一、通过基因工程操作构建具有HIS标签的S0D1融合基因重组载体 参阅图1，本发明所采用的克隆载体为PET-28a (+)。
[0019] 为了获得S0D1的克隆基因，首先是提取RNA，具体步骤为：取O.lg新鲜拟南芥叶片 组织于研钵，加一定的液氮快速研磨成粉末;转入提前已添加 lmlTrizol的离心管中；室温 放置5min，加入0· 2ml氯仿，用力摇晃15s，放置5~lOmin;置于低温离心机中，4°C，12000rpm， 15min后取上清；加入0.5ml的异丙醇，室温放置lOmin;再次置于低温离心机中，4°C， 12000印111，101^11，弃上清；加1111175%乙醇洗管底的乳白色沉淀；置于低温离心机，4°(：， 7500rpm，5min，弃上清;瞭干沉淀，溶于适当体积的无 RNase的高温灭菌双蒸水中，置于-20 °C保存备用。
[0020] 然后，通过反转录PCR获得CDNA，再通过Atlg08830基因特异的引物进行Atlg08830 基因的克隆。
[0021] 引物序列为： S0D1-F:5 'GGAATTCATGGCGAAAGGAGTTG3 '（EcoRl) S0D1-R：5'CCCAAGCTTTTAGCCCTGGAGAC3'(HindiII) 弓丨物序列S0D1-F的序列如序列表中序列2所示;S0D1-R的序列如序列表中序列3所示。 [0022]参阅图2,经PCR扩增后得到Atlg08830基因，该片段大小为469个碱基，凝胶成像显 示结果一致，确定为所克隆的Atlg08830基因。利用凝胶回收试剂盒对克隆片段进行回收。 [0023] 参阅图3,对空载体和克隆片段利用EcoRl和Hindlll进行双酶切和连接。双酶切后 载体和双酶切后基因比例为1:3~1:7之间。采用小的EP管，密封后置于16°C水浴锅内，过夜 培养。连接后的连接液进行大肠杆菌(co^i)的转化和菌落PCR。挑选阳性菌落 进行菌落PCR，结果表明所克隆的Atlg08830基因已经连接进入载体(参阅图4)。在得到的阳 性克隆中选取三个菌株进行重组质粒的提取和测序。结果表明所构建的载体成功。
[0024] 实验二、通过诱导获得HIS-S0D1融合蛋白，并进行纯化和测定 为了获得S0D1的异源表达纯化蛋白，首先挑取单菌落进行培养，菌液取50μ 1置于5ml 1B 液体培养基，加入5μ1卡那霉素于37°C，220rpm摇床，过夜摇菌。小摇后，使用提前配好的 300ml~500ml 1B液体培养基，卡那抗性，菌液1:100加入培养基，抗生素1:1000加入培养基。 37°C，lh，40min，摇床220rpm培养。定时测定培养液0D 6qq值，使之在0.4~0.6之间。
[0025]然后将培养液接种1B液体培养基，大摇后，加入终浓度为0.01mm〇l/l~0. lmmol/1 的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG)进行蛋白质诱导。蛋白小量诱导的实验条件有如下四组:37 Γ、3h，28 Γ、5h，25 Γ、5h，16Γ、20h。经验证，28Γ，220rpm，5~6h，IPTG浓度为0 · 0lmmo 1/1 为 Atlg08830基因的最佳诱导条件（图5)。诱导后将菌液离心集菌，采用500ml离心瓶，离心使 用低温高速离心机，离心条件为4°C，4500rpm，20min;离心后倒尽培养液，可以放置于-20°C 暂时保存。
[0026]收集的菌液中加入20ml的1 X roS，分两次，震荡将菌液均匀重悬，置于80ml离心管 中。加入200μ1，1πι〇1/1的PMSF蛋白酶抑制剂后置于冰上超声破菌，破菌5s停3s，共lOmin。破 菌后将离心管置于低温离心机中，4°C，12000rpm，45min离心。取上清置于冰上，过柱。将刚 离心后的SOD 1蛋白上清液过HI S柱，过柱之前分别用4 °C双蒸水预冷液，4 °C的1 X PBS平衡柱 子进行平衡，上清液过柱三遍。现配5mmol/l、10mmol/l、2〇1111]1〇1/1、20〇1111]1〇1/1的咪唑1〇1111置 于冰上降温，温度到4°C以下时分别按顺序依次清洗柱子使杂蛋白流出。每次加入1~2ml，避 免温度高使柱内蛋白活性降低，随时加相应浓度的咪唑不能使柱子干。使唑用200_〇1/1咪 时，滴7~8滴后开始收集，收集6~8ml，此时流出的蛋白即为目的蛋白（参阅图6)。
[0027]通过SDS凝胶电泳分析确定所得目的蛋白是否已经被纯化，为了对其进行定量测 定，通过标样牛血清蛋白（BSA)制定标准曲线（图7)完成对S0D1蛋白浓度进行测定。根据考 马斯亮蓝法测蛋白浓度的方法将纯化获得的S0D1蛋白进行浓度测定。参阅图7,图中横坐标 代表蛋白浓度，纵坐标A595代表所测物质在波长595nm处的吸光值，使用牛血清蛋白母液浓 度为2 g/ml，稀释浓度为2.0 mg/ml、1.0 mg/ml、0.5 mg/ml、0.25 mg/ml、0.125 mg/ml作为 标准蛋白溶液。加入考马斯亮蓝振荡混匀，测定其在波长595nm处的吸光值，做出上述标准 曲线。其中R 2=〇. 9803，得出的计算方程是:Y=0.0536X+0.295。通过此方程可以参考计算未 知浓度蛋白的浓度。根据方程计算S0D1蛋白浓度为2.81 mg/ml。
[0028]实验三、对具有不同浓度S0D1蛋白的模拟化妆品进行抗氧化分析 1、羟基自由基清除率的测定 羟基自由基（.0H)是一种重要的活性氧，抗氧化蛋白具有清除羟基自由基的功能，而测 定其清除率就可知道测定物的抗氧化能力。羟基自由基实验的测定是样品经过处理后在 536nm处测定吸光值，根据现有的计算公式来计算羟基自由基的清除率。根据羟基自由基的 清除率可以看出待测样品的抗氧化能力，本实验中测定对象为抗氧化S0D1蛋白，通过实验 可以比较S0D1蛋白抗氧化能力的高低和差异的显著性。
[0029] 待测样品处理为：取0.6ml浓度为0.005mol/l邻二氮菲的无水乙醇溶液于带塞试 管中，分别加入浓度为0.2 mol/1的pH 7.0磷酸盐缓冲液0.4ml和1 ml不同浓度的样品（参 见表1)，充分混匀后加入0 · 3ml浓度为0 · 02mol/l的EDTA溶液和0 · 3ml浓度为0 · 01mol/l的硫 酸亚铁溶液，再次混匀后加入〇.8ml 0.1% (v/v)的双氧水，于37°C恒温水浴，60 min后，在 536 nm下分别测量各组混合溶液的吸光度值。
[0030] 以lml双蒸水代替样品作为空白组测吸光度值，以lml70%乙醇溶液替代双氧水作 为损伤组，测其吸光度值。
[0031] 抗氧化剂的羟自由基清除率按以下公式计算： 羟基自由基清除率X%=(A样品-A损伤)/(A空白-A损伤）X 100%(1) 式(1)中： A样品一一样品溶液的吸光值； A损伤一一损伤吸光值，本实验用lml70%乙醇溶液测定损伤吸光值； A空白一一空白吸光值，本实验用lml双蒸水来替代样品溶液测定空白吸光值。
[0032]本实验的测定结果如表1所示，表中，10%甘油是指甘油与样品的体积比为1:10。
[0033]表1羟基自由基清除率测定结果
2、丙二醛(MDA)含量的测定 丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化的测定指标。植物组织器官在逐渐衰老或遭受逆境 的情况下会受到氧化损伤，从而发生膜脂过氧化作用，而丙二醛是膜脂过氧化后的最终分 解产物之一。测定经待测样品处理的拟南芥组织中的丙二醛含量，就可得知待测样品的抗 氧化能力的大小。丙二醛(MDA)在膜脂氧化的情况下，从组织膜上相应的产生位置释放出来 后，可与蛋白质以及核酸发生反应来修饰其内在特征，使纤维素分子之间的共价桥键松开 或能够抑制相关蛋白质的合成。MDA的积累可对膜和细胞造成一定程度的伤害。在酸性和高 温度条件下，丙二醛可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应从而生成红棕色的物质。这种红棕色物 质的最大吸收波长在532η处。测定植物组织中的MDA含量时，主要会受到可溶性糖带来的干 扰，影响测定的MDA吸光值。可溶性糖与ΤΒΑ的显色反应产物的最大吸收波长在450nm处和 532nm处都有吸收。植物在遭受高温、干旱、氧化、低温等逆境情况时，可溶性糖含量会增加， 因此测定植物组织中MDA含量时要排除可溶性糖的干扰。
[0034]样品配制及其处理按羟基自由基清除实验的样品处理方法。
[0035]实验取用受高温逆境胁迫处理后的拟南芥叶片。分别称取四份剪碎的拟南芥组织 lg，置于研钵中加2mllO%TCA(三氯乙酸)和少量石英砂，磨至均匀浆液后再加8ml的TCA继续 研磨均匀，4500rpm常温离心10min后，所得上清液即为样品的提取液。取离心后的一定体积 的上清液加相同体积的〇 . 6%TBA溶液，分别加入配制好的样品溶液中（参见表2)，混匀物放 置于100°C沸水上反应15min左右，再用凉水冷却后离心4500rpm，10min左右，分别取上清液 测定波长为532nm、600nm和450nm处的消光度值。
[0036] 吸光度D = kCL，式中，C是浓度值，L为比色杯厚度，通常为1 cm。当L为1 cm时，k=D/C， k为该物质的比吸收系数。某一波长下的消光度值总和等于样品溶液中各种吸光物质在该 波长下的消光度之和。已知蔗糖与TBA显色反应产物在450nm和532nm波长下的比吸收系数 分别为85.40，7.40 JDA在450nm的波长下无吸收，所以比吸收系数为0; 532nm波长下的比吸 收系数为155,根据上述方程建立方程组： D45〇=85.4X0.001XCi(2) D532_D6qq=155 X 0 · 001 X C2+7 · 4 X 0 · 001 X Ci(3) 求解方程，得如下计算公式： Ci(mmol/1)=11.71XD45〇(4) C2(ymol/l)=6.45X( D532-D6。。) -〇 · 56 X D450 (5 ) 其中，上述(4)，（5)两式中： &是可溶性糖的浓度，单位mol/1; C2是MDA的浓度，单位μπιο?/?; D45〇、D532、D6qq分别表不450nm、532nm和600nm波长下的消光度值。
[0037]按照上述计算公式，可直接求得拟南芥样品提取液中MDA的浓度。根据植物组织的 重量，计算测定样品中MDA的含量公式为： MDA含量(μπι〇1/^)=Μ0Α浓度(μπι〇1/1)Χ提取液体积(ml)/拟南芥组织鲜重(g)(6) 本实验的测定结果如表2所示。
[0038]表2丙二醛含量的测定结果
3、过氧化值的测定 脂肪氧化的初级产物是氢过氧化物(R00H)，因此通过测定样品中氢过氧化物的量可以 评价样品的氧化程度。本实验通过将油脂样品在不同条件下处理，并定时测定其过氧化值， 从而得知样品中的相应蛋白的抗氧化效果。与空白样品进行比较，观察抗氧化剂的能力大 小及效果。在酸性条件下，样品中的过氧化物与过量的KI反应生成1 2,析出的12用硫代硫酸 钠(Na2S2〇 3)溶液滴定，根据硫代硫酸钠的用量来计算样品的过氧化值。求出每千克样品中 所含过氧化物的毫摩尔数，即为脂肪的过氧化值(P0V)。
[0039]样品溶液的配制按上述羟基自由基清除实验处理。取500μ1配制好的样品溶液(参 见表3)，分别添加不同蛋白溶液，使其终浓度为以不加蛋白的化妆品溶液作对 照，在紫外光照射下反应，间隔lh取样测过氧化值。处理温度为水浴25°C。
[0040] 测定的具体方法:称取混合均匀的样品溶液3.00g(精确到O.Olg)，置于灭菌过的 的碘量瓶底部，加入30ml氯仿-冰乙酸混合液，轻轻摇动充分混合。加入lml饱和的碘化钾溶 液摇匀后密封，在暗处放置5min。严格控制静置时间，减少实验误差。取出碘量瓶，立即加入 双蒸水50ml，充分混合后立即用0.005mol/lNa 2S203标准溶液滴定至水层呈浅黄色时，加入 lml淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失为止，记下体积Vi，并计算P0V。同时做不加样品的空 白试验，记下体积V2。
[0041] 过氧化值(P0V)的计算:用过氧化物氧的毫克当量数表示时，可按下面公式计算： P0V(mmol/kg) = (Vi-V2) XC/WX 1000(7) 式(7)中： Vi--样品用去的Na2S2〇3溶液体积(ml); V2 空白试验用去的Na2S2〇3溶液体积(ml); C--Na2S2〇3溶液的摩尔浓度(mol/1)， W-样品重(g)。
[0042]本实验的测定结果如表3所示。
[0043]表3紫外照射下过氧化值的测定结果
通过上述三种抗氧化实验测定，表1、表2和表3的数据都表明，同对照相比，随着S0D1蛋 白浓度的不断加大，抗氧化能力在不断增强。这些结果说明异源表达的植物拟南芥S0D1蛋 白可以通过外用提高模拟化妆品对活性氧的清除能力。这无疑为研制抗氧化化妆品提供了 一种新的思路和途径。
[0044]最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通 技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案 的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
【主权项】
1. 一种拟南芥SOD 1蛋白，其特征在于，通过下述方法获得： 步骤S1:克隆拟南芥Atlg08830基因，进行载体构建，获得具有HIS标签的融合基因重组 载体； 步骤S2:通过遗传转化和重组载体的筛选获得具有Atlg08830基因的阳性菌株，同时提 取重组质粒并转化受体蛋白表达菌株，通过筛选和鉴定获得具有At lg08830基因的阳性表 达菌株； 步骤S3:利用异丙基硫代半乳糖苷诱导所述阳性表达菌株进行表达，离心，过HIS柱，获 得纯化的S0D1蛋白。2. 如权利要求1所述的拟南芥S0D1蛋白，所述利用异丙基硫代半乳糖苷诱导阳性表达 菌株进行表达的条件为:温度16~37 °C，时间3~20h，转速210~230rpm，异丙基硫代半乳糖苷 的浓度为〇·01 mmol/卜0. lmmol/1。3. 如权利要求1所述的拟南芥S0D1蛋白，所述利用异丙基硫代半乳糖苷诱导阳性表达 菌株进行表达的条件为:温度28 °C，时间5~6h，转速220rpm，异丙基硫代半乳糖苷的浓度为 0.01mmol/l〇4. 一种拟南芥S0D1蛋白在化妆品中的应用，其特征在于：将所述S0D1蛋白添加进化妆 品中，获得具有抗氧化功效的化妆品。
【文档编号】A61P17/18GK105969742SQ201610311776
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】宋玉伟, 杨伟林, 法明, 陈斯楠, 侯楠
【申请人】南阳师范学院