一种二倍体草莓的转基因培养基及其转基因方法
【专利摘要】本发明公开了一种二倍体草莓的转基因培养基及其转基因方法，该转基因培养基包括：二倍体草莓种子培养基S1、二倍体草莓共培养培养基S2、二倍体草莓筛选培养基S3；该转基因方法包括：(1)菌种活化，(2)二倍体草莓转基因；本发明建立了一个高效、快速、稳定二倍体草莓转化体系，外植体采用叶片和叶柄，将材料最大程度的应用，提高了提高二倍体草莓转基因转化效率，转化率可达到50％以上；并且能够解决传统农杆菌介导法中的步骤繁杂，容易污染的问题，为进一步应用遗传转化方法改良草莓品种提供实践基础，有利于今后草莓分子育种工作的发展，本发明转基因方法操作过程简单，转化效率高，试验周期短，耗费人力物力较小。
【专利说明】
-种二倍体草章的转基因培养基及其转基因方法
技术领域
[0001] 本发明设及植物基因工程，具体设及到一种二倍体草替的转基因培养基及其转基 因方法。
【背景技术】
[0002] 草替是一种兼具营养价值和观赏价值的水果，近年来草替栽培逐渐成为农民致富 的首选。而选育品质优良，产量高的草替品种也是草替研究工作者的一项重要任务。随着近 年来分子生物学和基因工程的飞速发展，研究热点转向草替种质资源优良基因的深度挖 掘，并进行分子标记和基因表达序列的鉴定和测定。同时在抗逆性、耐胆运、风味品质等遗 传改良等方面的研究结果相继有所报道，草替育种正朝着分子育种方向发展。而分子育种 中最重要的手段是草替的转基因。通常我们将草替品种分为两大类，分别是八倍体的栽培 草替（FragariaXananassa，化= 8x = 56)和二倍体野生草替品种。栽培种常见的品种都属 八倍体，而八倍体品种是高度杂合的，遗传背景复杂，因此在育种上周期长，不可控因素较 多。野生的二倍体草替品种'Rugen'是育种中的一个优良材料，因其没有甸筒茎，可直接播 种用于繁殖，而且该品种从播种到果实成熟只需要6个月时间，生长周期短，易于繁殖，因此 是目前草替研究工作者常用的品种。实现分子育种，首先需要建立高效稳定的转基因体系。
[0003] 目前常用的草替基因转化方法有农杆菌介导法、基因枪法和电击法，其中农杆菌 介导的叶盘法是草替转化的主要方法，也是迄今为止植物转基因研究中研究最为成熟最常 用的一种转基因方法。虽然草替的转基因技术路线比较成熟，但是传统方法费事费力，耗时 间长，操作繁琐而且效率很低，获得的转基因植株太少，给转基因植株的后期鉴定工作带来 了障碍。传统的农杆菌介导法操作过程比较繁琐，在转基因的过程中容易出现许多问题，比 如合适载体的选择、合适菌株的选择、杂菌的污染、农杆菌无法抑制、菌液浓度过高或者过 低导致转基因不成功、侵染时间长短的控制等等，运些问题都会影响草替转基因的效率W 及速度，传统方法获得的二倍体草替植株转基因效率不到百分之一。而目前报道的转基因 体系多建立于八倍体草替中，而对二倍体草替转基因体系很少有相关研究。尤其是二倍体 品种'Rugen'的转基因体系目前还未见相关报道。
【发明内容】
[0004] 发明目的：针对现有问题，本发明提供一种二倍体草替的转基因培养基及其转基 因方法，本发明建立了一个高效、快速、稳定二倍体草替转化体系，可W同时用叶柄和叶片 来做外植体进行转基因，将材料最大程度的应用，并且能够直接、高效的解决传统农杆菌介 导法中的步骤繁杂，容易污染的问题;解决二倍体草替转化效率低的问题。
[0005] 技术方案:为了实现上述目的，本发明提供了一种二倍体草替的转基因培养基，包 括如下成分:二倍体草替种子培养基S1: 2.0-2.5g/L MS、15-25g/L薦糖、0.2-0.5111邑/16- BA、0.05-0.15mg/L NAA、5.0-6. Og/L琼脂粉，p册.5-6.0;
[0006] 二倍体草替共培养培养基S2:4.2-4.6g/LMS、25-35g/L薦糖、0.2-0.4mg/L ZT，、 0.4-0.6mg/L TDZ、0.05-0.15mg/L IBA、5.0-6.Og/L琼脂粉，p册.5-6.0;
[0007] 二倍体草替筛选培养基53:4.2-4.6旨/115、25-35旨/1薦糖、0.2-0.4111旨/121'、0.4- 0.6mg/L TDZ、0.05-0.15mg/L IBA、5.0-6.Og/L琼脂粉、10-30mg/L卡那霉素、300-500mg/L 簇节青霉素，P册.5-6.0。
[0008] 作为优选，所述二倍体草替种子培养基SI、二倍体草替共培养培养基S2、二倍体草 替筛选培养基S3都进行高压灭菌，备用。
[0009] 6-BA是6-节氨基腺嚷岭，是一种细胞分裂素类的物质，具有高效、稳定、廉价和易 于使用等特点是组织培养者最喜爱的细胞分裂素，可W诱导愈伤组织发生。
[0010] NAA是糞乙酸，是一种有机化合物，是一种易溶于有机溶剂的无色固体，是植物生 长调节剂中的生长素类似物，常用于商用的发根粉或发根剂中，在植物使用杆插法繁殖时 使用，也可用于植物组织培养。
[0011] IBA为吗I噪下酸，是组织培养中常用的植物生长调节剂，对于愈伤组织的诱导和生 长非常有效。
[0012] TDZ是一种新型植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，且可W对植物激素 和生理活性物质的作用来调节植物的生长发育过程，是一个作用力很强的植物生长调节 剂，在农业上有广泛的应用和推广价值。
[0013] ZT为玉米素(Zeatin)，是存在于高等植物的一种天然植物细胞分裂素不仅促进侧 芽生长，刺激细胞分化(侧端优势），促进愈伤组织和种子发芽，还能防止叶片衰老，逆转芽 部受到的毒素伤害和抑制过度根部形成。高浓度的玉米素还能产生不定芽分化。
[0014] 本发明还提供了一种二倍体草替的转基因培养基的转基因方法包括如下步骤：
[001引（1)菌种活化：
[0016] 将含质粒地7WG2D农杆菌EHA105在LB固体培养基上划线，25-30°C培养1-3天；
[0017] 所述农杆菌菌株EHA105是二倍体草替转基因中常用菌株，侵染能力较强，该菌株 购买于美国模式培养物集存库ATCCXAmerican type州hure collection);
[0018] 所述质粒地7WG2D由植物表达载体地7WG2D携带超强表达的报告基因 Egfp，使用携 带强表达报告基因 Egfp的载体，通过观察可直接筛选得到转基因植株，避免传统的检测中 繁琐的工作，缩短了转基因的周期；植物表达载体地7WG2D购买于Invitrogen生物技术公 司，含基因蛇fp序列在NCBI上的登录号为GenBank:KU721836.1。
[0019] 植物表达载体选用基于Gateway?技术的地7WG2D植物表达载体，Gateway?技术大 大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，Gateway?利用了位点特异重组，所W在构建入口载 体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶；
[0020] 所述含质粒地7WG2D农杆菌EHA105的是将携带Egfp的基因表达载体地7WG2D转化 到农杆菌菌株EHA105中。
[0021] 挑取平板上长的好的单菌落2-3个，接种到50mL LB液体培养基中，25-30°C ,200- 250巧m在摇床中振荡培养至0D600值0.3-0.5;
[0022] 常溫下，4000-6000rmp离屯、7-9分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离屯、管，将上 清液去除，重悬菌体，在摇床中振荡培养，测定0D600值为0.1-0.3，制得活化好的菌液。
[0023] (2)二倍体草替转基因
[0024] 材料处理:二倍体草替种子种植于S1培养基上，长出叶片后在无菌条件下将叶片 完全剪下，用手术刀延叶脉横切；同时将草替叶柄切成0.5-1.5厘米长段，在叶柄上面用手 术刀刻伤；
[0025]侵染:将切好的叶片和刻伤的叶柄直接放入活化好的菌液侵染，过程中轻微摇匀， 浸染30~40分钟;侵染完成后将叶片和叶柄取出，直接放置于共培养培养基S2上，使叶片和 叶柄伤口与培养基充分接触，在培养室中23-27°C，暗培养2-4天，将叶片叶柄转入筛选培养 基S3上培养18-22天，二倍体草替叶片边缘会有白色愈伤组织长出，此时在体式巧光显微镜 下进行观察，一部分愈伤有非常亮的绿光发出，一部分没有发光。将发绿光的抗性愈伤保留 下来，经过约35-45天的培养W后，分化出抗性植株;此时再进行一次巧光检测，将整个抗性 植株叶片和叶柄都发绿光的保留下来，发红光的去除掉;抗性植株生长55-65天再进行一次 巧光检测，巧光检测中抗性苗的叶片，叶柄W及根都发亮绿光的可W确定为转基因植株。 [00%]作为优选，步骤（1)中质粒地7WG2D携带超强表达的报告基因 Egfp。使用携带强表 达报告基因 Egfp的载体，通过观察可直接筛选得到转基因植株，避免传统的检测中繁琐的 工作，缩短了转基因的周期。
[0027]作为优选，步骤（1)中LB固体培养基和LB液体培养基都含有50mg/L壮观霉素和 50mg/L利福平。
[00%]作为优选，所述步骤(1)中重悬菌体是用lOOmLMS液体重悬。
[0029] 作为优选，所述步骤(2)中浸染30-40分钟过程中每隔5分钟摇动一次。运样可W增 加菌液和叶片的接触面积。
[0030] 作为优选，所述步骤(2)中一部分愈伤有非常亮的绿光发出为抗性愈伤，要保留 下;一部分没有发光为非抗性愈伤，去除掉。通过运个步骤，将非抗性的愈伤去除，大大减小 下一步工作量。
[0031] 在现有技术中无论是哪种培养基配方，在二倍体草替中都容易导致再生芽的玻璃 化，而且再生效率不高，而本发明中的S2培养基，将低浓度的TDZ和ZT配合施用，既能够避免 再生芽的玻璃化，又能够提高再生效率，从而提高转基因效率;同时本发明直接将叶片转入 S2培养基，而不需要用滤纸吸干净菌液，减小操作过程中污染的可能性。
[0032] 本发明中，共培养之后不需要洗涂叶片，直接转移到S3培养基上，就能够很好的抑 制菌液生长。
[0033] 在检测过程本发明更为简单，因为无论染色或者取样进行PCR检测，都需要对植株 进行破坏性取样，而本发明可W直接在巧光显微镜下观察叶片颜色来筛选装基因植株。简 化工作流程的同时也免于植株被破坏。
[0034] 有益效果：与现有技术相比，本发明所述一种二倍体草替的转基因培养基及其转 基因方法具有如下优点：
[0035] 1、提高二倍体草替转基因效率，转化率可达到50 % W上；
[0036] 2、将菌液浓度降低，侵染时间加长，即避免农杆菌污染，又提高了侵染效率；
[0037] 3、侵染菌液中不添加任何的辅助侵染的药品药剂(传统方法中常添加乙酷下香酬 等辅助侵染的药剂，会对叶片造成伤害，降低叶片再生能力），减小对二倍体草替叶片的伤 害，提高叶片培养的成活率和再生率；
[0038] 4、外植体采用叶片和叶柄，将材料最大程度的应用，提高了转化效率；
[0039] 5、使用携带强表达报告基因的载体，通过观察可直接筛选得到转基因植株，避免 传统的检测中繁琐的工作，缩短了转基因的周期；
[0040] 6、操作过程简单，只需要用手术刀刻伤叶片和叶柄，不再像常规的转基因方法一 样，将叶片剪成叶块，运样减少了工作者的工作量，加快操作的速度，也能够最大程度的避 免污染；
[0041 ] 7、在二倍体草替的共培养培养基中W及筛选培养基中，首次将TDZ和ZT配合施用， 并且浓度都比较低，运个激素配比不仅很大程度降低了再生芽的玻璃化，而且提高了叶片 叶柄的再生效率，从而提高转化效率。
[0042] 本发明建立了一个高效、快速、稳定二倍体草替转化体系，为进一步应用遗传转化 方法改良草替品种提供实践基础，有利于今后草替分子育种工作的发展，本发明转基因方 法操作过程简单，转化效率高，试验周期短，耗费人力物力较小。
【具体实施方式】
[0043] 实施例1
[0044] 培养基：
[0045] 二倍体草替种子培养基Sl:2.0g/L MS、15g/L薦糖、0.2mg/L 6-BA、0.0.5mg/L 酷八、5.0邑/1琼脂粉，口册.5;
[0046] 二倍体草替共培养培养基52:4.2旨/1^15、25旨/1薦糖、0.2111旨/121\0.4111旨/1102、 0.05mg/L IBA、5.0g/L琼脂粉，P册.5;
[0047] 二倍体草替筛选培养基S3:4.2g/L MS，25g/L薦糖、0.2mg/L ZT、0.4mg/L TDZ，、 0.05mg/L IBA、5. Og/L琼脂粉、lOmg/L卡那霉素、300mg/L簇节青霉素，p册.5;
[0048] 二倍体草替种子培养基SI、二倍体草替共培养培养基S2、二倍体草替筛选培养基 S3都进行高压灭菌，备用。
[0049] 转基因方法：
[0050] (1)菌种活化：
[0化1] 将含质粒地7WG2D农杆菌EHA105在含有50mg/L壮观霉素和50mg/L利福平LB固体培 养基上划线，25 °C培养3天；
[0052] 挑取平板上长的好的单菌落2个，接种到含有50mg/L壮观霉素和50mg/L利福平 50mL LB液体培养基中，25°C，250巧m在摇床中振荡培养至0D600值0.3;
[0053] 常溫下，400化mp离屯、9分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离屯、管，将上清液去 除，用lOOmLMS液体重悬菌体，在摇床中振荡培养，测定0D600值为0.1，制得活化好的菌液；
[0054] (2)二倍体草替转基因
[0化日]材料处理:二倍体草替'Rugen'种子种植于S1培养基上，35天W后长出3-5片叶，在 超净工作台上将叶片完全剪下放置于无菌的滤纸上，用手术刀延叶脉横切3-5刀，但不能将 叶片切断，切好的叶片直接放置于活化好的菌液侵染，同时也将草替叶柄切成0.5厘米长的 段，在叶柄上面用手术刀刻伤两处，刻伤时也不能够切断叶柄，刻伤完成后直接放入活化好 的菌液侵染；
[0056]侵染:将切好的叶片和刻伤的叶柄直接放入活化好的菌液侵染，过程中轻微摇匀， 浸染30分钟，过程中每隔5分钟摇动一次;侵染完成后将叶片和叶柄取出，直接放置于共培 养培养基S2上，使叶片和叶柄伤口与培养基充分接触，在培养室中23°C，暗培养2天，将叶片 叶柄转入筛选培养基S3上培养18天，二倍体草替叶片边缘会有白色愈伤组织长出，此时在 体式巧光显微镜下进行观察，一部分愈伤有非常亮的绿光发出，运部分愈伤为抗性愈伤，要 保留下;而一部分没有发光，运部分愈伤为非抗性愈伤，去除掉;通过运个步骤，将非抗性的 愈伤去除，大大减小下一步工作量;将发绿光的抗性愈伤保留下来，经过约35天的培养W 后，分化出抗性植株;此时再进行一次巧光检测，在体式巧光显微镜下进行观察抗性植株， 将整个抗性植株叶片和叶柄都发绿光的保留下来，发红光的去除掉;抗性植株生长55天再 进行一次巧光检测，巧光检测中抗性苗的叶片，叶柄W及根都发亮绿光的可W确定为转基 因植株。
[0化7]实施例2 [0化引培养基：
[0059] 二倍体草替种子培养基51:2.5旨/1]?5、25旨/1薦糖、0.5111旨/16-84、0.15111旨/1熱八、 6.0邑/1琼脂粉，口册.0;
[0060]二倍体草替共培养培养基52:4.6肖/1115、35肖/1薦糖、0.4111肖/121'，、0.6111肖/1102、 0.15mg/L IBA、6.0g/L琼脂粉，P册.0;
[0061 ]二倍体草替筛选培养基S3:4.6g/L MS、35g/L薦糖、0.4mg/L ZT、0.6mg/L TDZ、 0.15mg/L IBA、6. Og/L琼脂粉、30mg/L卡那霉素、500mg/L簇节青霉素，p册.0;
[0062] 二倍体草替种子培养基SI、二倍体草替共培养培养基S2、二倍体草替筛选培养基 S3都进行高压灭菌，备用。
[0063] 转基因方法：
[0064] (1)菌种活化：
[00化]将含质粒地7WG2D农杆菌EHA105在含有50mg/L壮观霉素和50mg/L利福平LB固体培 养基上划线，3(TC培养3天；
[0066] 挑取平板上长的好的单菌落3个，接种到含有50mg/L壮观霉素和50mg/L利福平 50mL LB液体培养基中，30°C，200巧m在摇床中振荡培养至0D600值0.5;
[0067] 常溫下，600化mp离屯、7分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离屯、管，将上清液去 除，用lOOmLMS液体重悬菌体，在摇床中振荡培养，测定0D600值为0.3，制得活化好的菌液；
[0068] (2)二倍体草替转基因
[0069] 材料处理:二倍体草替'Rugen'种子种植于S1培养基上，35天W后长出3-5片叶，在 超净工作台上将叶片完全剪下放置于无菌的滤纸上，用手术刀延叶脉横切3-5刀，但不能将 叶片切断，切好的叶片直接放置于活化好的菌液侵染，同时也将草替叶柄切成1.5厘米长的 段，在叶柄上面用手术刀刻伤两处，刻伤时也不能够切断叶柄，刻伤完成后直接放入活化好 的菌液侵染；
[0070] 侵染:将切好的叶片和刻伤的叶柄直接放入活化好的菌液侵染，过程中轻微摇匀， 浸染40分钟，过程中每隔5分钟摇动一次;侵染完成后将叶片和叶柄取出，直接放置于共培 养培养基S2上，使叶片和叶柄伤口与培养基充分接触，在培养室中27°C，暗培养2天，将叶片 叶柄转入筛选培养基S3上培养22天，二倍体草替叶片边缘会有白色愈伤组织长出，此时在 体式巧光显微镜下进行观察，一部分愈伤有非常亮的绿光发出，运部分愈伤为抗性愈伤，要 保留下;而一部分没有发光，运部分愈伤为非抗性愈伤，去除掉;通过运个步骤，将非抗性的 愈伤去除，大大减小下一步工作量;将发绿光的抗性愈伤保留下来，经过约45天的培养W 后，分化出抗性植株;此时再进行一次巧光检测，在体式巧光显微镜下进行观察抗性植株， 将整个抗性植株叶片和叶柄都发绿光的保留下来，发红光的去除掉;抗性植株生长65天再 进行一次巧光检测，巧光检测中抗性苗的叶片，叶柄W及根都发亮绿光的可W确定为转基 因植株。
[0071] 实施例3
[0072] 培养基：
[0073] 二倍体草替种子培养基Sl:2.2g/L MS、20g/L薦糖、0.3mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、 5.5g/L琼脂粉，pH 5.8;
[0074] 二倍体草替共培养培养基52:4.4肖/1115、30肖/1薦糖、0.3111肖/121'，、0.5111肖/1102、 O.lmg/L IBA、5.5g/L琼脂粉，p册.8;
[00巧]二倍体草替筛选培养基53:4.4旨/1]?5、30旨/1薦糖、0.3111旨/121'、0.5111旨/1102、 0.1 mg/L IBA、5.5g/L琼脂粉、20mg/L卡那霉素、400mg/L簇节青霉素，P册.8;
[0076] 二倍体草替种子培养基S1、二倍体草替共培养培养基S2、二倍体草替筛选培养基 S3都进行高压灭菌，备用。
[0077] 转基因方法：
[007引（1)菌种活化：
[00巧]将含质粒地7WG2D农杆菌EHA105在含有50mg/L壮观霉素和50mg/L利福平LB固体培 养基上划线，28 °C培养2天；
[0080] 挑取平板上长的好的单菌落3个，接种到含有50mg/L壮观霉素和50mg/L利福平 50mL LB液体培养基中，28°C，220巧m在摇床中振荡培养至0D600值0.4;
[0081] 常溫下，500化mp离屯、8分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离屯、管，将上清液去 除，用lOOmLMS液体重悬菌体，在摇床中振荡培养，测定0D600值为0.2，制得活化好的菌液；
[0082] (2)二倍体草替转基因
[0083] 材料处理:二倍体草替'Rugen'种子种植于S1培养基上，35天W后长出3-5片叶，在 超净工作台上将叶片完全剪下放置于无菌的滤纸上，用手术刀延叶脉横切3-5刀，但不能将 叶片切断，切好的叶片直接放置于活化好的菌液侵染，同时也将草替叶柄切成0.1厘米长的 段，在叶柄上面用手术刀刻伤两处，刻伤时也不能够切断叶柄，刻伤完成后直接放入活化好 的菌液侵染；
[0084] 侵染:将切好的叶片和刻伤的叶柄直接放入活化好的菌液侵染，过程中轻微摇匀， 浸染35分钟，过程中每隔5分钟摇动一次;侵染完成后将叶片和叶柄取出，直接放置于共培 养培养基S2上，使叶片和叶柄伤口与培养基充分接触，在培养室中24°C，暗培养3天，将叶片 叶柄转入筛选培养基S3上培养20天，二倍体草替叶片边缘会有白色愈伤组织长出，此时在 体式巧光显微镜下进行观察，一部分愈伤有非常亮的绿光发出，运部分愈伤为抗性愈伤，要 保留下;而一部分没有发光，运部分愈伤为非抗性愈伤，去除掉;通过运个步骤，将非抗性的 愈伤去除，大大减小下一步工作量;将发绿光的抗性愈伤保留下来，经过约40天的培养W 后，分化出抗性植株;此时再进行一次巧光检测，在体式巧光显微镜下进行观察抗性植株， 将整个抗性植株叶片和叶柄都发绿光的保留下来，发红光的去除掉;抗性植株生长50再进 行一次巧光检测，巧光检测中抗性苗的叶片，叶柄W及根都发亮绿光的可W确定为转基因 植株。
[0085] 实施例4
[0086] 培养基：
[0087] 二倍体草替种子培养基Sl:2.0g/L MS、25g/L薦糖、0.5mg/L 6-BA、0.15mg/L NAA、 5.0邑/1琼脂粉，口册.7;
[008引二倍体草替共培养培养基52:4.6旨/1^15、35旨几薦糖、0.2111旨几21'，、0."02、 0.15mg/L IBA、6.0g/L琼脂粉，P册.7;
[0089] 二倍体草替筛选培养基S3:4.2g/L MS、25g/L薦糖、0.4mg/L ZT、0.6mg/L TDZ、 0.05mg/L IBA、6. Og/L琼脂粉、20mg/L卡那霉素、400mg/L簇节青霉素，p册.7;
[0090] 二倍体草替种子培养基SI、二倍体草替共培养培养基S2、二倍体草替筛选培养基 S3都进行高压灭菌，备用。
[0091] 转基因方法：
[0092] (1)菌种活化：
[0093] 将含质粒地7WG2D农杆菌EHA105在含有50mg/L壮观霉素和50mg/L利福平LB固体培 养基上划线，28 °C培养2天；
[0094] 挑取平板上长的好的单菌落3个，接种到含有50mg/L壮观霉素和50mg/L利福平 50mL LB液体培养基中，28°C，220巧m在摇床中振荡培养至0D600值0.4;
[00M]常溫下，500化mp离屯、8分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离屯、管，将上清液去 除，用lOOmLMS液体重悬菌体，在摇床中振荡培养，测定0D600值为0.2，制得活化好的菌液；
[0096] (2)二倍体草替转基因
[0097] 材料处理:二倍体草替'Rugen'种子种植于S1培养基上，35天W后长出3-5片叶，在 超净工作台上将叶片完全剪下放置于无菌的滤纸上，用手术刀延叶脉横切3-5刀，但不能将 叶片切断，切好的叶片直接放置于活化好的菌液侵染，同时也将草替叶柄切成0.1厘米长的 段，在叶柄上面用手术刀刻伤两处，刻伤时也不能够切断叶柄，刻伤完成后直接放入活化好 的菌液侵染；
[0098] 侵染:将切好的叶片和刻伤的叶柄直接放入活化好的菌液侵染，过程中轻微摇匀， 浸染35分钟，过程中每隔5分钟摇动一次;侵染完成后将叶片和叶柄取出，直接放置于共培 养培养基S2上，使叶片和叶柄伤口与培养基充分接触，在培养室中24°C，暗培养3天，将叶片 叶柄转入筛选培养基S3上培养20天，二倍体草替叶片边缘会有白色愈伤组织长出，此时在 体式巧光显微镜下进行观察，一部分愈伤有非常亮的绿光发出，运部分愈伤为抗性愈伤，要 保留下;而一部分没有发光，运部分愈伤为非抗性愈伤，去除掉;通过运个步骤，将非抗性的 愈伤去除，大大减小下一步工作量;将发绿光的抗性愈伤保留下来，经过约40天的培养W 后，分化出抗性植株;此时再进行一次巧光检测，在体式巧光显微镜下进行观察抗性植株， 将整个抗性植株叶片和叶柄都发绿光的保留下来，发红光的去除掉;抗性植株生长50再进 行一次巧光检测，巧光检测中抗性苗的叶片，叶柄W及根都发亮绿光的可W确定为转基因 植株。
[0099] 实施例5
[0100] 培养基
[0101] 二倍体草替种子培养基Sl:2.5g/L MS、25g/L薦糖、0.2mg/L 6-BA、0.05mg/L NAA、 6.0邑/1琼脂粉，口册.8;
[0102] 二倍体草替共培养培养基52:4.6肖/1115、35肖/1薦糖、0.4111肖/121'，、0.6111肖/1102、 0.05mg/L IBA、6.0g/L琼脂粉，p册.8;
[0103] 二倍体草替筛选培养基S3:4.6g/L MS、35g/L薦糖、0.2mg/L ZT、0.6mg/L TDZ、 0.05mg/L IBA、5. Og/L琼脂粉、20mg/L卡那霉素、400mg/L簇节青霉素，p册.8;
[0104] 二倍体草替种子培养基SI、二倍体草替共培养培养基S2、二倍体草替筛选培养基 S3都进行高压灭菌，备用。
[0105] 转基因方法：
[0106] (1)菌种活化：
[0107] 将含质粒地7WG2D农杆菌EHA105在含有50mg/L壮观霉素和50mg/L利福平LB固体培 养基上划线，28 °C培养2天；
[0108] 挑取平板上长的好的单菌落3个，接种到含有50mg/L壮观霉素和50mg/L利福平 50mL LB液体培养基中，28°C，220巧m在摇床中振荡培养至0D600值0.4;
[0109] 常溫下，500化mp离屯、8分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离屯、管，将上清液去 除，用lOOmLMS液体重悬菌体，在摇床中振荡培养，测定0D600值为0.2，制得活化好的菌液；
[0110] (2)二倍体草替转基因
[0111] 材料处理:二倍体草替'Rugen'种子种植于S1培养基上，35天W后长出3-5片叶，在 超净工作台上将叶片完全剪下放置于无菌的滤纸上，用手术刀延叶脉横切3-5刀，但不能将 叶片切断，切好的叶片直接放置于活化好的菌液侵染，同时也将草替叶柄切成0.1厘米长的 段，在叶柄上面用手术刀刻伤两处，刻伤时也不能够切断叶柄，刻伤完成后直接放入活化好 的菌液侵染；
[0112] 侵染:将切好的叶片和刻伤的叶柄直接放入活化好的菌液侵染，过程中轻微摇匀， 浸染35分钟，过程中每隔5分钟摇动一次;侵染完成后将叶片和叶柄取出，直接放置于共培 养培养基S2上，使叶片和叶柄伤口与培养基充分接触，在培养室中24°C，暗培养3天，将叶片 叶柄转入筛选培养基S3上培养20天，二倍体草替叶片边缘会有白色愈伤组织长出，此时在 体式巧光显微镜下进行观察，一部分愈伤有非常亮的绿光发出，运部分愈伤为抗性愈伤，要 保留下;而一部分没有发光，运部分愈伤为非抗性愈伤，去除掉;通过运个步骤，将非抗性的 愈伤去除，大大减小下一步工作量;将发绿光的抗性愈伤保留下来，经过约40天的培养W 后，分化出抗性植株;此时再进行一次巧光检测，在体式巧光显微镜下进行观察抗性植株， 将整个抗性植株叶片和叶柄都发绿光的保留下来，发红光的去除掉;抗性植株生长50再进 行一次巧光检测，巧光检测中抗性苗的叶片，叶柄W及根都发亮绿光的可W确定为转基因 植株。
[011引实施例6
[0114]如果需要获得果实进行果实的试验，可W将实施例获得转基因植株继续培养后移 栽进入田间开花结果。开花结果后为了进一步确定转基因的稳定性，可W在巧光显微镜下 再次检测花和果实不同发育阶段的巧光 [011引实施例7
[0116] 本发明二倍体草替转基因的转化率，见表1。
[0117] 对比例1为现有技术中八倍体草替转基因的转化率；
[0118] 对比例2为现有技术中二倍体草替转基因的转化率；
[0119] 表1本发明二倍体草替转基因的转化率
[0120]
[0121]由表1可知，本发明实施例中二倍体草替转基因的转化率都能达到50% W上，远高 于现有技术的转化率。
【主权项】
1. 一种二倍体草莓的转基因培养基，其特征在于，包括如下成分:二倍体草莓种子培养 基S 1:2.0-2.5g/L MS、15-25g/L蔗糖、0.2-0.5mg/L 6-BA、0.0.5-0.15mg/L NAA、5.0-6.Og/ L 琼脂粉，pH5.5-6.0; 二倍体草莓共培养培养基S2:4 · 2-4 · 6g/LMS、25-35g/L蔗糖、0.2-0.41^/121\0.4- 0.6mg/L TDZ、0.05-0.15mg/L IBA，、5.0-6.0g/L琼脂粉，ρΗ5·5-6·0; 二倍体草莓筛选培养基33:4.2-4.68/1]\^、25-358/1蔗糖、0.2-0.411^/121'、0.4-0·6mg/L TDZ、0·05-0· 15mg/L ΙΒΑ、5·0-6·Og/1 琼脂粉、10-30mg/L卡那霉素、300-500mg/L 羧苄青霉素、pH5.5-6.0。2. 根据权利要求1所述二倍体草莓的转基因培养基，其特征在于，所述二倍体草莓种子 培养基S1、二倍体草莓共培养培养基S2、二倍体草莓筛选培养基S3都进行高压灭菌，备用。3. -种利用权利要求1所述二倍体草莓的转基因培养基的转基因方法，其特征在于，包 括如下步骤： (1) 菌种活化： 将含质粒PK7WG2D农杆菌EHA105在LB固体培养基上划线，25-30°C培养1-3天； 挑取平板上长的好的单菌落2-3个，接种到50mL LB液体培养基中，25-30°C，200-250rpm在摇床中振荡培养至0D600值0.3-0.5; 常温下，4000-6000rmp离心7-9分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离心管，将上清液 去除，重悬菌体，在摇床中振荡培养，测定0D600值为0.1-0.3，制得活化好的菌液； (2) 二倍体草莓转基因 材料处理:二倍体草莓种子种植于S1培养基上，长出叶片后在无菌条件下将叶片完全 剪下，用手术刀延叶脉横切；同时将草莓叶柄切成〇. 5-1.5厘米长段，在叶柄上面用手术刀 刻伤； 侵染:将切好的叶片和刻伤的叶柄直接放入活化好的菌液侵染，过程中轻微摇匀，浸染 30-40分钟;侵染完成后将叶片和叶柄取出，直接放置于共培养培养基S2上，使叶片和叶柄 伤口与培养基充分接触，在培养室中23-27°C，暗培养2-4天，将叶片叶柄转入筛选培养基S3 上培养18-22天，二倍体草莓叶片边缘会有白色愈伤组织长出，此时在体式荧光显微镜下进 行观察，一部分愈伤有非常亮的绿光发出，一部分没有发光；将发绿光的抗性愈伤保留下 来，经过约35-45天的培养以后，分化出抗性植株;此时再进行一次荧光检测，将整个抗性植 株叶片和叶柄都发绿光的保留下来，发红光的去除掉;抗性植株生长55-65天再进行一次荧 光检测，荧光检测中抗性苗的叶片，叶柄以及根都发亮绿光的可以确定为转基因植株。4. 根据权利要求3所述的转基因方法，其特征在于，所述步骤（1)中质粒pK7WG2D携带超 强表达的报告基因 Egfp。5. 根据权利要求3所述的转基因方法，其特征在于，所述步骤（1)中LB固体培养基和LB 液体培养基都含有50mg/L壮观霉素和50mg/L利福平。6. 根据权利要求3所述的转基因方法，其特征在于，所述步骤（1)中重悬菌体是用 lOOmLMS液体重悬。7. 根据权利要求3所述的转基因方法，其特征在于，所述步骤(2)中浸染30-40分钟过程 中每隔5分钟摇动一次。8. 根据权利要求3所述的转基因方法，其特征在于，所述步骤(2)中一部分愈伤有非常 亮的绿光发出为抗性愈伤，要保留下;一部分没有发光为非抗性愈伤，去除掉。
【文档编号】A01H5/00GK106047921SQ201610392195
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】王媛花, 颜志明, 贾思振, 蔡善亚
【申请人】江苏农林职业技术学院