一种合成卡贝缩宫素的方法
【专利摘要】本发明涉及医药合成领域，公开了一种合成卡贝缩宫素的方法。本发明所述方法选择保护基tBu替换现有工艺中使用的Alloc以及HOCH2CH2CN来保护(CH2)3COOH，并采用全新的氨基树脂、脱保护剂、酸解剂等完成整个合成过程，在保证总收率的前提下，提高了卡贝缩宫素的纯度，显著降低了单一杂质的含量。
【专利说明】
一种合成卡贝缩宫素的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种合成卡贝缩宫素的方法。
【背景技术】
[0002] 卡贝缩宫素(Carbetocin)是丹麦辉凌制药有限公司研发的一种合成的具有激动 剂性质的长效催产素8肽类似物，其临床和药理特性与天然产生的催产素类似。像催产素一 样，卡贝缩宫素与子宫平滑肌的催产素受体结合，引起子宫的节律性收缩，在原有的收缩基 础上，增加其频率和增加子宫张力。在非妊娠状态下，子宫的催产素受体含量很低，在妊娠 期间增加，分娩时达高峰。因此卡贝缩宫素对非妊娠的子宫没有作用，但是对妊娠的子宫和 刚生产的子宫具有有效的子宫收缩作用。
[0003] 不论是静脉注射还是肌肉注射卡贝缩宫素后，子宫迅速收缩，可在2分钟内达到一 个明确强度。单剂量静脉注射卡贝缩宫素对子宫的活性作用可持续大约1个小时，因此足以 预防刚生产后的产后出血。产后给予卡贝缩宫素后，在收缩的频率与幅度方面都比催产素 为长。
[0004] 研究表明，当硬膜外或腰麻下剖腹产术后立即单剂量静脉给予卡贝缩宫素 lOOyg， 在预防子宫张力不足和减少产后出血方面，卡贝缩宫素明显优于安慰剂。在产后的早期给 予卡贝缩宫素也可以促进子宫的恢复。
[0005] 卡贝缩宫素具有以下的结构：
[0006] [Tyr(Me)1-Ile2-Gln3-Asn 4-Cys((CH2)3C00)]5-Pro6-Leu 7-GIy8-NH2
[0007] 国内外已有关于卡贝缩宫素制备报道，欧洲专利ES2115543,采用固液结合合成 法，其原理为:先通过常规固相多肽合成法，得到4-Cl-Butyl-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys (1'1'1:)-?1'〇-1^11-617-1?;[111<:氨基树脂，酸解后得到线形4-(]1-131^71-15^(]\16)-116-6111-厶811-Cys-Pr〇-Leu-Gly-NH2，线性肽经环化得到卡贝缩宫素。
[0008] 捷克专利CS8605461，同样是采用固液结合合成法，先用固相多肽合成方法合成冗-Ile-Gln-Asn_Cys(Bzl )-Pr〇-Leu-Gly-〇-羟基树脂，然后裂解得到Z_I le-GIn-Asn-Cys (Bzl)-Pr〇-Leu-GIy-NH2,氢化后再跟 4-溴丁酸反应，得到 Ile-Gln-Asn-Cys((CH2)3COOH)-Pr〇-Leu_Gly-NH2再跟X-Tyr(Me)-〇H反应，脱保护，环化得到卡贝缩宫素。
[0009] 但是，在上述两个专利方法中，均以液相进行环化环合，制备过程繁琐，环化收率 低，制备成本高，产生大量废液，不适合商业化制备。
[0010]中国专利CN101555272A，采用固相合成法，先通过常规固相多肽合成法，得到4_ Br-Butyl-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys(Alloc)-P;r〇-Leu-Gly-Rink 氨基树脂，在四三苯基勝 钯催化下去 A1 loc 保护，得到 4-Br-Buty l_Tyr (Me) -I le-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-Rink 氨 基树脂，在氯化锂催化下进行固相环化，酸解后得到卡贝缩宫素。但该方法Cys(All〇c)在去 Alloc保护后SH裸露，易使四三苯基膦钯催化剂中毒而失效，从而严重影响去保护反应的效 率，同时在去All保护过程中引入了大量的重金属盐，增加了纯化难度。
[0011] 针对此问题，中国专利CN102260326A，同样采用固相合成法，先通过常规固相多肽 合成法，得到15^(]^)-116-6111(1'1'1:)-厶811(1'1'1:)-〇5^((012)3(1)(^11)-?1'〇-1^11-617-1?;[111<:氨 基树脂，在四三苯基膦钯催化下去Alloc保护，得到Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys ((CH2)3COOH)-Pr0-LeU-Gly-Rink氨基树脂，用常偶联试剂进行固相环化，酸解后得到卡贝 缩宫素。该方法虽然克服了四三苯基膦钯催化剂因中毒而失效的问题，但Fm 0c-CyS((CH2) 3C00A11)制备过程复杂，生产成本高，其次同样会在去All保护过程中引入了大量的重金属 盐，增加了纯化难度，导致最大单一杂质偏高，为0.2%，纯度也仅有99.4%，同时去Al 1保护 时间长以及去All保护不完全等不利的因素都会影响产品的质量和收率。
[0012] 中国专利CN102796178A公开了一种卡贝宫缩素的固相合成方法，其改变了 CN102260326A中保护（CH2)3⑶0H羧基的保护基Alloc为HOCH2CH 2CN，虽然脱保护剂成本降 低，利于大规模生产，但是保护基选择不当造成该专利方法中卡贝缩宫素最终的总收率只 有51%，而单杂也偏高，纯度为99.3%。
[0013] 目前卡贝缩宫素的纯度最高水平也未超过99.5%，而单一杂质的含量最低也仅是 0.2%，工艺水平的原因限制我国卡贝缩宫素产品品质难以有一个较明显的提升，目前急需 要对现有工艺进彳丁改进，以期提尚广品的整体品质。
【发明内容】
[0014] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新的合成卡贝缩宫素的方法，使得本发明 所述方法在保证卡贝缩宫素的总收率前提下显著降低最大单一杂质，提高其纯度。
[0015] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0016] 步骤1、保护的Gly在缩合试剂和活化试剂作用下和式1所示氨基树脂的氨基进行 偶联反应，得到肽树脂1;
[0017] 步骤2、按照卡贝缩宫素氨基酸序列C端到N端的顺序，从肽树脂1出发，在缩合试剂 和活化试剂作用下，将保护的Leu、保护的Pro、保护的Cys ((CH2)3C00tBu)、保护的Asn、保护 的Gln、保护的lie和保护的Tyr进行逐一延伸偶联，得肽树脂2;
[0018] 步骤3、去除肽树脂2中Cy s ((CH2) 3C00tBu)中的保护基tBu，得肽树脂3;
[0019] 步骤4、肽树脂3在缩合试剂和活化试剂作用下，进行分子内偶联反应环化，得卡贝 缩宫素肽树脂；
[0020] 步骤5、卡贝缩宫素肽树脂经酸解剂酸解后得卡贝缩宫素粗品；
[0021] 步骤6、卡贝缩宫素粗品纯化转盐后得卡贝缩宫素纯品；
[0022]
[0023]其中，式1左侧圆球表示聚苯乙烯树脂。在传统合成过程中，一般都是采用常规的 Rink Amide系列树脂，本发明在原有的MBHA树脂上进行改进，提供出一种全新的载体树脂 Μ0ΒΗΑ树脂，即式1所示树脂，所述式1氨基树脂可购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司。 本发明经过合成本品发现，该树脂不仅在成本上低于RinkAmide系列树脂，而且合成后的产 品总收率可达到70%以上。MBHA树脂的结构式如下，左侧的圆球表示聚苯乙烯树脂：
[0024]
[0025] 卡贝缩宫素主链氨基酸有8个，组成如下：
[0026] [Tyr(Me)1-Ile2-Gln3-Asn 4-Cys((CH2)3C00)]5-Pro6-Leu 7-GIy8-NH2〇
[0027] 其中，卡贝缩宫素 C端的氨基为采用酸解剂从氨基树脂上裂解下来的氨基，其并不 属于氨基酸上的氨基。
[0028] 本发明针对现有合成工艺中总收率和纯度较低、单一杂质含量较高的问题，本发 明选择保护基tBu替换现有工艺中使用的A1 loc以及HOCH2CH2CN来保护(CH2) 3C00H，并采用 适宜的氨基树脂、脱保护剂、酸解剂等完成整个合成过程，在保证总收率的前提下，提高了 卡贝缩宫素的纯度，显著降低了单一杂质的含量。
[0029] 本发明所述保护基是在氨基酸合成领域需要保护氨基酸主链以及侧链上氨基、羧 基等干扰合成的基团的保护基团，防止氨基、羧基等在制备目标产物过程中发生反应，生成 杂质，如本发明通过Ttr保护基保护Asn和Gin的侧链酰胺基，通过tBu保护基保护Cys((CH2) 3C00H)的侧链羧基。此外，在本发明所述方法涉及的保护的氨基酸中，N端优选通过Fmoc或 Boc保护基进行保护。被保护基保护的氨基酸统称为保护的氨基酸。作为优选，所述保护的 Gly、保护的Leu、保护的Pro、保护的Cys ((CH2)3C00tBu)、保护的Asn、保护的Gin、保护的11 e 和保护的Tyr如下：
[0030] Fomc-Gly或Boc-Gly;Fmoc_Leu或Boc-Leu;Fmoc-Pro或Boc-Pro;Fmoc_Cys((CH2) 3C00tBu);Fmoc-Asn(Trt);Fmoc-Gln(Trt);Fmoc_Ile;Fmoc-Tyr(0Me)〇
[0031] 作为优选，所述保护的Gly和式1氨基树脂的摩尔比为1-6:1，更优选为2.5-3.5:1。 [0032]作为优选，所述式1氨基树脂的取代值为0.2-1.8mm 〇l/g氨基树脂，更优选为0.5_ 1.0mmol/g氨基树脂。
[0033] 作为优选，所述缩合试剂优选为N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N，N-二环己基碳二 亚胺(DCC)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/有机碱(PyBOP/有机碱）、2-(7_氮 杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯/有机碱(HATU/有机碱）、苯并三 氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐/有机碱(HBTU/有机碱）、0-苯并三氮唑-N，N，N'，N'_ 四甲基脲四氟硼酸酯/有机碱(TBTU/有机碱）中的一种。所述缩合试剂的摩尔用量优选为多 肽树脂中氨基总摩尔数的1~6倍，更优选为2.5~3.5倍。
[0034] 需要说明的是，所述PyBOP/有机碱、HATU/有机碱、HBTU/有机碱、TBTU/有机碱，在 本发明中属于四种双体系的缩合试剂，即PyBOP、HATU、HBTU在使用时需要分别和有机碱组 合在一起成为一种缩合试剂使用，其中所述有机碱和?780?、撤1'1]、冊1'1]381'1]的摩尔比优选 为为1.3-3.0:1，更优选为1.3-2:1。
[0035]作为优选，所述缩合试剂中的有机碱优选为N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺 (TEA)或N-甲基吗啡啉(NMM)，更优选为DIPEA。
[0036]作为优选，所述活化试剂为1-羟基苯并三唑(HOBt)或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑 (HOAt)。所述活化试剂的用量优选为肽树脂中氨基总摩尔数的1~6倍，更优选为2.5~3.5 倍。
[0037] 作为优选，合成过程中所述各反应的反应溶剂均采用DMF。
[0038] 本发明所述延伸偶联是指在第一个氨基酸与氨基树脂偶联后，剩余氨基酸按照卡 贝缩宫素氨基酸的C端到N端的顺序逐个和前一个偶联的氨基酸发生缩合反应(主链氨基和 羧基的缩合反应)进行偶联。本发明偶联时，每次延伸偶联时所述保护的氨基酸和对应肽树 脂的摩尔比优选为1-6:1，更优选为2.5-3.5:1;所述偶联反应时间优选为60~300分钟，更 优选为120~180分钟。需要说明的是，本发明所述肽树脂指任意个数氨基酸按照卡贝缩宫 素氨基酸顺序和氨基树脂相连接形成的肽树脂，这其中也包括肽树脂1和肽树脂2。所述对 应的肽树脂是指保护的Gly和氨基树脂偶联形成的肽树脂1、肽树脂1就是保护的Leu进行偶 联的对应肽树脂，偶联了保护的Leu的肽树脂是保护的Pro进行延伸偶联时对应的肽树脂， 以此类推、保护的Cys ((CH2)3C00tBu)、保护的Asn、保护的Gin、保护的11 e、保护的Tyr等分别 和其上一个保护氨基酸偶联后的肽树脂形成偶联时的对应关系。
[0039] 在延伸偶联中，由于每个氨基酸N端都有保护基，因此需要先脱除N端保护基再偶 联，这对本领域技术人员来说是公知常识。本发明优选用PIP/DMF(哌啶/N，N-二甲基甲酰 胺)混合溶液脱除N端Fomc保护基，混合溶液中含哌啶为10~30% (V)，其余为DMF。去N端保 护基时间优选为10~60分钟，优选的为15~25分钟。去N端保护基试剂的用量优选为每 10mL/g肽树脂;本发明优选用TFA/DCM(三氟醋酸/二氯甲烷)混合溶液脱除N端Boc保护基， 混合溶液中含三氟醋酸为20~60% (V/V)，优选为25~35% (V/V)，去N端保护基时间优选为 10~50分钟，优选的为25~35分钟，去N端保护基试剂的用量优选为10mL/克肽树脂。
[0040] 作为优选，所述酸解剂为溴化氢三氟醋酸(TFA)溶液，其中：溴化氢的质量百分比 浓度优选为5~10 % wt，更优选浓度为6~7 % wt;所述酸解剂的用量为5~15mL酸解剂/克肽 树脂，优选酸解剂的用量为7~12mL酸解剂/克肽树脂;所述酸解的时间为1~6小时，优选的 为3~4小时。
[0041] 作为优选，所述纯化转盐具体为：
[0042] 卡贝缩宫素粗品，0.1%TFA/水溶液溶解，溶液用0.45μπι微孔滤膜过滤，纯化备用；
[0043] 采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为ΙΟμπι的反相C18,流动相系统为 0.1 %TFA/水溶液-0.1 %TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系 统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈 后，得卡贝缩宫素纯化中间体浓缩液；
[0044] 取卡贝缩宫素纯化中间体浓缩液，用0.45μπι滤膜滤过备用；
[0045] 采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1%醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱 填料为lOwn的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方 法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分 析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到卡贝缩宫素醋酸水溶液，冷冻干燥，得 卡贝缩宫素纯品。
[0046]由本发明所述方法合成的卡贝缩宫素经HPLC检测，纯度在99.5%以上，最大单一 杂质小于0.1%，总收率高于70%，相比当下现有的卡贝缩宫素合成工艺，本发明工艺能够 同时在纯度、总收率和最大单一杂质三方面达到较优水准。
[0047]由以上技术方案可知，本发明选择合适的合成方案，以HOCH2CH2CN来保护（CH 2) 3C00H，配合全新的氨基树脂、脱保护剂、酸解剂等，在优化了整个合成工艺的基础上，显著 地提高了卡贝缩宫素的纯度，具有较高的总收率，并且显著降低了产品最大单一杂质的含 量。
【具体实施方式】
[0048] 本发明公开了一种合成卡贝缩宫素的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来 说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了 描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述方法进行改动或适 当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0049] 在本发明【具体实施方式】中，本发明中的保护氨基酸购自于成都晖蓉生物科技有限 公司，所用树脂购自于天津南开和成科技有限公司，申请文件中所用英文缩写对应的中文 含义见表1。
[0050] 表1英文缩写释义
[0051]
[0052]下面结合实施例，进一步阐述本发明。
[0053] 实施例1:肽树脂1的合成
[0054] 取〇.15mol Fmoc-Gly和0.15mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.15mol DIC，搅拌下 慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基 酸溶液，备用。
[0055] 取0 · 05mol的Μ0ΒΗΑ树脂（取代值约0 · 6mmol/g)，DMF溶胀25分钟，洗涤过滤，加入活 化后的Fmoc-Gly溶液，室温搅拌反应3小时，抽掉反应液，DMF洗涤3次后，DCM洗涤3次，每次 洗涤时间为3min，得到Fmoc-Gly-MBHA树脂，即肽树脂1，在进行下一次偶联反应前用20 % PIP/DMF溶液去Fmoc保护25分钟，洗涤过滤得到Gly-MOBHA树脂。
[0056] 实施例2:肽树脂1的合成
[0057] 取〇.15mol Boc-Gly和0.15mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.15mol DIC，搅拌下 慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基 酸溶液，备用。
[0058] 取0 · 05mol的Μ0ΒΗΑ树脂（取代值约0 · 6mmol/g)，DMF溶胀25分钟，洗涤过滤，加入活 化后的Fmoc-Gly溶液，室温搅拌反应3小时，抽掉反应液，DMF洗涤3次后，DCM洗涤3次，每次 洗涤时间为3min，得到Boc-Gly-MOBHA树脂，即肽树脂1，在进行下一次偶联反应前用30% TFA/DCM溶液去Boc保护30分钟，经DIEA/DCM溶液中和，用DMF、DCM洗涤过滤，得到Gly-MOBHA 树脂。
[0059] 实施例3:肽树脂2的合成
[0060] 取0.15mol Fmoc-Leu和0.15mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.15mol DIC，搅拌下 慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基 酸溶液。
[0061 ]将上述活化后的保护氨基酸溶液加入到实施例1制得的Gly-MOBHA树脂，室温搅拌 反应3小时，抽掉反应液，DMF洗涤3次后，DCM洗涤3次，每次洗涤时间为3min，再用20%PIP/ DMF溶液去Fmoc保护25分钟，洗涤过滤，完成Leu的接入。
[0062] 同法接入Fmoc-Pro，Fmoc_Cys( (CH2)3COOtBu)、Fmoc-Asn(Trt)、Fmoc-Gln(Trt)、 Fmoc-Ile和Fmoc-Tyr (OMe)，Fmoc脱除采用20 %PIP/DMF溶液，洗涤过滤得到得肽树脂2，Tyr (OMe) -11 e-G In (Tr t) -Asn (Tr t) -Cy s ((CH2) 3C00tBu) -Pro-Leu-Gl y-M0BHA 树脂。
[0063] 实施例4:肽树脂2的合成
[0064] 取〇.15mol Boc-Leu和0.15mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.15mol DIC，搅拌下 慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基 酸溶液。
[0065] 将上述活化后的保护氨基酸溶液加入到实施例2制得的肽树脂1，室温搅拌反应3 小时，抽掉反应液，DMF洗涤3次后，DCM洗涤3次，每次洗涤时间为3min，再用30 % TFA/DCM溶 液去保护30分钟，经DIEA/DCM溶液中和，用DMF、DCM洗涤过滤，完成Leu的接入。
[0066] 同法接入Boc-Pro，Fmoc_Cys ((CH2)3COOtBu)、Fmoc-Asn(Trt)、Fmoc-Gln(Trt)、 Fmoc-Ile 和?111〇^71((1^)^111〇(3脱除采用20%?1?/01^溶液，8〇(3脱除采用30%了?4/^?11溶 液，洗涤过滤得到得肽树脂2，15^(016)-116-6111(1'1'1:)-八811(1'1'1:)-〇5^((〇12)3(1)(允1311)-?1'〇-Leu-Gly-MOBHA 树脂）。
[0067] 实施例5:肽树脂3的合成
[0068] 取0.05mol实施例3得肽树脂2,用30%TFA/DCM溶液去保护30分钟，经DIEA/DCM溶 液中和，用DMF、DCM 洗涤过滤，得肽树脂 3(Tyr(0Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH2) 3C00H)-Pr〇-Leu-Gly-M0BHA树脂）〇
[0069] 实施例6:肽树脂3的合成
[0070] 取0.05mol实施例4得肽树脂2，用30 %TFA/DCM溶液去保护30分钟，经DIEA/DCM溶 液中和，用DMF、DCM 洗涤过滤，得肽树脂 3(Tyr(0Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH2) 3C00H)-Pr〇-Leu-Gly-M0BHA树脂）〇 [0071]实施例7:卡贝缩宫素肽树脂的合成
[0072] 取0.2mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.2mol DIC，加入至DMF溶液中，所得溶液加 入到实施例5制得的肽树脂3，室温搅拌反应6小时，抽掉反应液，DMF洗涤3次后，DCM洗涤3 次，每次洗涤时间为3min，得卡贝缩宫素肽树脂：（[Tyr(OMe)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys ((CH2) 3C00) ] -Pro-Leu-Gly-M0BHA树脂）〇 [0073]实施例8:卡贝缩宫素肽树脂的合成
[0074] 取0.2mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.2mol DIC，加入至DMF溶液中，所得溶液加 入到实施例6制得的肽树脂3，室温搅拌反应6小时，抽掉反应液，DMF洗涤3次后，DCM洗涤3 次，每次洗涤时间为3min，得卡贝缩宫素肽树脂：（[Tyr(OMe)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys ((CH2)3COO)] -Pro-Leu-Gly-M0BHA树脂）〇
[0075]实施例9:卡贝缩宫素粗品的制备
[0076]取实施例7制得的卡贝缩宫素肽树脂，加入8%的HBr/TFA溶液(酸解液10mL/克卡 贝缩宫素肽树脂），搅拌反应6小时，过滤收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后 减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干、得类白色粉末即为卡贝缩宫 素粗品，粗品纯度为82.7%。
[0077] 实施例10:卡贝缩宫素粗品的制备
[0078] 取实施例8制得的卡贝缩宫素肽树脂，加入8%的HBr/TFA溶液(酸解液10mL/克卡 贝缩宫素肽树脂），搅拌反应6小时，过滤收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后 减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干、得类白色粉末即为卡贝缩宫 素粗品，粗品纯度为85.1%。
[0079] 实施例11:卡贝缩宫素粗品纯化转盐
[0080] 取实施例9所得卡贝缩宫素粗品，用20%醋酸溶液溶解，溶液用0.45μπι微孔滤膜过 滤，纯化备用；
[0081] 采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为ΙΟμπι的反相C18,流动相系统为 0.1 %TFA/水溶液-0.1 %TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系 统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈 后，得卡贝缩宫素纯化中间体浓缩液；
[0082]取卡贝缩宫素纯化中间体浓缩液，用0.45μπι滤膜滤过备用；
[0083]采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1%醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱 填料为lOwn的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方 法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分 析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到卡贝缩宫素醋酸水溶液，冷冻干燥，得 卡贝缩宫素纯品34.8g
[0084] 总收率为70.4%，分子量:989.2，纯度:99.6%，最大单一杂质0.07%。
[0085]实施例12:卡贝缩宫素粗品纯化转盐
[0086]取实施例10所得卡贝缩宫素粗品，用纯化流动相A溶解，溶液用0.45μπι微孔滤膜过 滤，纯化备用；
[0087]采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为ΙΟμπι的反相C18,流动相系统为 0.1 %TFA/水溶液-0.1 %TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系 统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈 后，得卡贝缩宫素纯化中间体浓缩液；
[0088]取卡贝缩宫素纯化中间体浓缩液，用0.45μπι滤膜滤过备用；
[0089]采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1%醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱 填料为lOwn的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方 法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分 析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到卡贝缩宫素醋酸水溶液，冷冻干燥，得 卡贝缩宫素纯品35. lg。
[0090] 总收率为71.1 %，分子量:989.0，纯度:99.7 %，最大单一杂质0.05%。
[0091]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种合成卡贝缩宫素的方法，其特征在于，包括W下步骤： 步骤1、保护的Gly在缩合试剂和活化试剂作用下和式1所示氨基树脂的氨基进行偶联 反应，得到肤树脂1; 步骤2、按照卡贝缩宫素氨基酸序列C端到N端的顺序，从肤树脂1出发，在缩合试剂和活 化试剂作用下，将保护的Leu、保护的Pro、保护的切s((C此）3C(X)tBu)、保护的Asn、保护的 Gin、保护的lie和保护的Tyr进行逐一延伸偶联，得肤树脂2; 步骤3、去除肤树脂2中切s((CH2)3COOtBu)中的保护基巧U，得肤树脂3; 步骤4、肤树脂3在缩合试剂和活化试剂作用下，进行分子内偶联反应环化，得卡贝缩宫 素肤树脂； 步骤5、卡贝缩宫素肤树脂经酸解剂酸解后得卡贝缩宫素粗品； 步骤6、卡贝缩宫素粗品纯化转盐后得卡贝缩宫素纯品；其中，式1左侧圆球表示聚苯乙締树脂。2. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述保护的Gly、保护的Leu、保护的Pro、保护 的Cys((C出)3CO〇tBu)、保护的Asn、保护的Gin、保护的lie和保护的Tyr如下： Fomc-Gly或Boc-Gly;Fmoc-Leu或Boc-Leu;Fmoc-Pro或Boc-Pro;Fmoc-Cys((邸2) sCOOtBu) ;Fmoc-Asn(T;rt) ;Fmoc-Gln(T;rt) ;Fmoc-Ile ;Fmoc-Ty;r(OMe)。3. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述缩合试剂为N，N-二异丙基碳二亚胺、N, N-二环己基碳二亚胺，六氣憐酸苯并Ξ挫-1-基-氧基Ξ化咯烷基憐/有机碱、2-(7-氮杂- 1H-苯并Ξ氮挫-1-基)-1，1，3,3-四甲基脈六氣憐酸醋/有机碱、苯并Ξ氮挫-N，N，N'，N'-四 甲基脈六氣憐酸盐/有机碱、0-苯并Ξ氮挫-Ν,Ν,Ν'，Ν'-四甲基脈四氣棚酸醋/有机碱中的 一种。4. 根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述有机碱为N，N-二异丙基乙胺、Ξ乙胺或 N-甲基吗啡嘟。5. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述活化试剂为1-径基苯并Ξ挫或N-径基- 7-氮杂苯并Ξ氮挫。6. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3为： 用TFA/DCM混合溶液去除肤树脂2中切S ((C出)3〇X)tBu)中的保护基巧U，得肤树脂3。7. 根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述TFA/DCM混合溶液中TFA体积百分比为20 ~60%，余量为DCM。8. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述酸解剂为漠化氨的Ξ氣醋酸溶液。9. 根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述酸解剂中漠化氨质量百分比浓度为5- 10%。
【文档编号】C07K1/08GK106084015SQ201610728294
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月25日
【发明人】黄璜, 郭德文, 曾德志, 文永均
【申请人】成都圣诺生物制药有限公司