用于对hpv感染进行细胞治疗的树状多肽及其筛选方法、制备方法和应用
【专利摘要】本发明涉及一种用于对HPV感染进行细胞治疗的树状多肽，其特征在于，由四个HPV表位肽C?端的羧基与三个精氨酸残基构成的多聚精氨酸骨架的氨基连接而形成，所述表位肽的氨基酸序列为，Tyr?Met?Leu?Asp?Leu?Gln?Pro?Glu?Thr?Gly?Gly?Gly。本发明还提供了所述树状多肽的筛选制备方法，以及应用。本发明利用多种组合生物信息学软件设计和分析，提高了发现新抗原表位的能力，使负载表位肽的朝向具有一致性，在单位空间内指数级增加了表位肽的特异性结合能力和反应敏感性。本发明的表位肽结构与性质单一，具有特异性高、无潜在生物危害性、制备工艺可标准化等巨大优势。
【专利说明】
用于对HPV感染进行细胞治疗的树状多肽及其筛选方法、制备 方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及宫颈癌的防治技术领域，涉及一种用于对HPV感染进行细胞治疗的树 状多肽及其筛选方法、制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 宫颈癌是女性最常见的生殖道恶性肿瘤，严重威胁着妇女的健康和生命。我国是 宫颈癌高发国家，特别是近年来年轻宫颈癌患者有明显上升趋势，发病率以每年2 %-3 %速 度增长。人乳头瘤病毒〇1111]^11口3口；[101]^￥；[1'118，即\0可引起良、恶性增生，特别是高危型!^￥ 与宫颈癌的关系密切。目前，对宫颈癌的治疗多采用手术、化疗、放疗、生物治疗和中医疗法 联合应用。这些疗法的共同缺陷是缺乏特异，对正常组织细胞损伤大，毒副作用大，不但疗 效不能满意，而且医疗费用巨大。近年来，主动的、特异的细胞免疫治疗因其独特的优势将 成为宫颈癌治疗的理想手段。
[0003] 随着免疫识别理论、分子生物学知识和电子显微技术的不断进展与突破，大量研 究证实发现T细胞对于抗原的识别是与MHC分子结合递呈的抗原短肽。即当外源性抗原被抗 原呈递细胞捕获后，蛋白质抗原在内吞系统被降解成多肽片段，其中的免疫原性多肽即T细 胞表位与MHC I类分子结合，被转运至APC表面供T细胞受体识别，从而激发细胞免疫应答， 发挥免疫调节作用。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供用于对HPV感染进行细胞治疗的树状多肽，可 应用于致敏体外培养的树突状细胞，使其携带抗原信息，致敏后的树突状细胞可用于治疗 高危型人乳头瘤病毒感染的宫颈癌。
[0005] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0006] 一种用于对HPV感染进行细胞治疗的树状多肽，由四个HPV表位肽C-端的羧基与三 个精氨酸残基构成的精氨酸骨架的氨基连接而形成，所述树状多肽具有以下结构式：
[0007]
[0008]其中，R为精氨酸残基，X为所述表位肽，所述表位肽的氨基酸序列为Tyr-Met-Leu-Asp-Leu-Gln-Pro-Glu-Thr-Gly-Gly-Gly〇
[0009]进一步地，所述表位肽的N端有棕榈酰丝氨酸修饰。
[0010] 进一步的，所述表位肽采用SYFPEITHI远程预测数据库、PREDEPP数据库、基序法和 多项式法共同对HPV16 E7编码蛋白进行HLA-A2限制性CTL表位预测得到。
[0011] 进一步的，所述的树状多肽，采用固相合成法制备进行制备。
[0012] 进一步的，通过多聚精氨酸骨架将上述表位肽连接成4分枝状多聚抗原肽。
[0013] 进一步的，选择棕榈酰丝氨酸以-AAA-柔性连接的方式进行T细胞表位肽的修饰。
[0014] 进一步的，所述的树状多肽，应用于致敏树突状细胞，或应用于制备优势表位肽疫 苗。
[0015] 进一步的，所述优势表位肽疫苗和优势表位肽致敏的树突状细胞应用于治疗高危 型人乳头瘤病毒感染的宫颈癌。
[0016] 本发明的有益效果是:本发明利用多种组合生物信息学软件设计和分析，极大地 提高了发现新抗原表位的能力，使负载表位肽的朝向具有一致性，在单位空间内指数级增 加了表位肽的特异性结合能力和反应敏感性。与病原微生物裂解物和重组蛋白比较，本发 明的表位肽分子量小，结构与性质单一，具有特异性高、无潜在生物危害性、制备工艺可标 准化等巨大优势。
[0017] 基于T-DC的细胞治疗可以重建宫颈局部的免疫应答，靶向性的深入病变局部，清 除癌变细胞或被感染细胞内的HPV，对正常细胞无任何杀伤作用。重建宫颈局部免疫能力， 从而达到彻底杀灭、清除病毒的目的，修复受损上皮细胞和局部组织，进一步使难以治愈、 反复发作的宫颈疾病消失，从而有效的阻断了宫颈粘膜从癌前病变的各阶段向宫颈癌阶段 的发展。启动感染局部组织对HPV的特异性清除，修复受损的上皮细胞和局部组织。同时，可 以在体内形成长期免疫记忆，加强免疫防治效果，为防止复发或再感染提供长期保护
[0018] 通过多聚精氨酸骨架将上述表位肽连接成4分枝状多聚抗原肽，增加了分子量和 生物活性，使连接的表位肽的朝向具有一致性，在单位空间内指数级增加了表位肽的特异 性结合能力和反应敏感性。
[0019] 甘氨酸的增加可提高肽的免疫调节作用，增加免疫活性。在T细胞表位的N-末端加 上棕榈酰基可以增加小分子肽在细胞膜上的定位、跨膜及穿透能力。为了提高T细胞表位通 过外源性途径引发CTL反应的能力，我们选择了棕榈酰丝氨酸以-AAA-柔性连接的方式进行 T细胞表位肽的修饰。相对无修饰的对照组，经修饰后的表位肽可使细胞活性呈现极显著升 尚(p〈0·01)〇
【具体实施方式】
[0020] 以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限 定本发明的范围。
[0021] 一、表位肽的设计与筛选
[0022] 1.人乳头瘤病毒抗原及其同源性分析
[0023] HPV16、18型是最常见的高危型，是宫颈癌及其癌前病变的主要致病因子。特别是 HPV16型在宫颈癌组织中的检出率超过50%，在宫颈癌的发生中起着重要作用。研究表明， HPV16 E7蛋白是肿瘤细胞转化的主要癌蛋白，通过结合并失活肿瘤抑制蛋白Rb而发挥转化 作用。
[0024]从Genebank中选择HPV16 E7蛋白，其98个氨基酸序列：MHGDT PTLHE YMLDT QPETT DLYCY EQLND SSEEE DEIDG PAGQA EPDRA HYNIV TFCCK CDSTL RPLCVQ STHVD IRTLE DLLMG TLGIV CPICS QKP，将E7蛋白氨基酸序列与NCBI数据库中的蛋白片段进行Blast，以 确定该段蛋白质的特异性。
[0025] 2、HPV16 E7抗原的一般特性预测
[0026] 应用软件CLC Protein Workbench3版本和Signal P3.0软件对蛋白质进行预测， 包括疏水性、亲水性、抗原性、跨膜结构域、等电点及信号肽潜在切割位点。
[0027] 本发明采用SYFPEITHI远程预测数据库、PREDEPP数据库、基序法和多项式法共同 对HPV16 E7编码蛋白进行HLA-A2限制性CTL表位预测。
[0028] 3、利用SYFPEITHI数据库进行CTL表位初步预测
[0029] 4、通过PREDEPP数据库进行MHCI类结合基序预测。
[0030] 5、基序法
[0031] (1)不同的MHCI类对所结合的肽的组成有不同的要求，但其中起主要作用进而对 肽链与MHCI类分子的结合有重要影响的是肽链的两个主要锚点残基，他们在多肽与MHCI类 分子的高亲和力结合中是必需的。
[0032] (2)二级锚点残基的作用除了两个主要锚点残基的必需因素外，多肽链中的其他 氨基酸残基对多肽与HLA-A2分子的高或中等亲和力结合也有不可忽视的影响。在其他位置 上，不同氨基酸残基对多肽与HLA-A2分子的结合有着不同的影响，有的氨基酸残基有利于 结合，而有的则不利于结合。理想的与HLA-A2结合的CTL表位(即有高的或中等亲和力)应不 包含不利于结合的氨基酸残基，或有利于结合的残基多于不利于结合的残基。
[0033] 6、多项式方案预测表位肽
[0034]多项式方案是指当某残基R出现在某肽的第I位时，不考虑其他肽序列的情况下， 该残基对于整个肽与MHCI类分子的结合自由能提供了一常量Ri，用在第I位为残基R的大量 多肽的IC5Q的负loglO值的平均值来估计此常量。IC 5Q被定义为待测肽将对照肽-MHC复合物 中50 %的对照肽置换下来的浓度。将其所有氨基酸残基对应的Ri值相加，选择分值大于选 定阈值的抗原肽为可能的后选肽。
[0035] 将SYFPEITHI数据库的预测结果和PREDEPP数据库的预测结果进行对比，筛选出作 为T细胞表位肽的可能性最大的5条肽：TLHEYMLDL(E7 7-15)、YMLDLQPET(E7 11-19)、 RAHYNIVTF(E7 49-57)、RLCVQSTHV(E7 66-74)、UMGTLGIV(E7 82-90)，再计算其多项式的 值，设定阈值，最终筛选出HLA-A2限制性CTL表位肽:YMLDLQPET(E7 11-19)，然后再运用 Fmoc法固相合成优势表位肽。
[0036] 7、表位肽的修饰
[0037]为增加分子量和生物活性，使连接的表位肽的朝向具有一致性，增加免疫活性，增 加小分子肽在细胞膜上的定位、跨膜及穿透能力，对表位肽进行以下修饰:在肽的c端增加 三个甘氨酸;选择棕榈酰丝氨酸以-AAA-柔性连接的方式进行T细胞表位肽的修饰;通过多 聚精氨酸骨架将上述表位肽连接成4分枝状多聚抗原肽。
[0038]二、DC细胞负载HPV优势表位肽后的功能研究
[0039] 1. CD14+的选择和DC细胞体外增殖培养及致敏
[0040] 采用白细胞分离法分离出患者外周血单核细胞，在向其中加入CD14微珠，通过阳 性分选柱磁性分选⑶14+细胞，将通过⑶14+分选得到的细胞作为DC培养;经过GM-CSF和IL-4处理后，细胞变成明显的树突状。在第10天，经流式细胞仪分析细胞表面分子的表达，大部 分细胞表达辅助刺激分子标记⑶86、CD40、⑶80和HLA-DR、MHC-I分子。在第11天用优势表 位肽冲击DC细胞。
[0041 ] 2质控标准
[0042] 2.1DC细胞对HPV肽吸收情况
[0043]用FITC对肽标记，进行细胞定位，采用共聚焦显微法以确定DC细胞对HPV肽吸收情 况。分析显示:30分钟内肽就会被DC细胞吸收。最初，在细胞体会看到荧光，细胞核看不到荧 光;2小时后，肽会经由胞体扩散到树突；12小时后，在树突和胞体检测到荧光会逐渐消退。 在细胞核没有观察到荧光。说明小分子肽不参与细胞的遗传信息传递，这一现象提示我们 将表位肽作为疫苗，与DC共培养后回输机体，应该不会产生遗传性疾病（继发性伤害）。 2.2MTT检侧短肽对细胞活性的影响
[0044]采用MTT法检测HPV优势表位肽致敏后DC刺激T淋巴细胞的增殖效应。设置对照组 如下：未致敏DC+T细胞组、优势表位肽+T细胞组、优势表位肽致敏DC+T细胞组，以及空白对 照。结果显示:DC具有刺激T淋巴细胞增殖的作用。而单纯表位肽直接作用于T淋巴细胞不能 引起T细胞的明显增殖，只能通过非特异性刺激引起T淋巴细胞反应性增长。而负载表位肽 的DC细胞能有效刺激T淋巴细胞的生长，与其他对照组有显著差异(p〈0.05)，
[0045] 2.3 ELISP0T检测 γ-IFN分泌
[0046] ELISP0T检测经负载表位肽DC刺激后的释放γ -IFN的T细胞的频数。所设立空白对 照，DC组、Τ细胞组及负载优势表位肽的DC细胞组。结果显示：负载优势表位肽的DC细胞组相 对于空白对照，DC组、T细胞组的结果高出很多，说明γ -IFN分泌。
[0047]三、负载HPV优势表位肽的DC细胞在宫颈癌细胞免疫治疗中的临床效果探讨 [0048] 1.临床收集60例宫颈癌患者，年龄31-65岁，平均发病年龄49岁。均经人乳头状瘤 病毒PCR检测确诊。所有患者随机分成治疗组和对照组两组，治疗组30例，对照组30例。 [0049] 2.方法
[0050]治疗组通过血细胞成份分离机采集含有单核细胞的自体外周血60mL(必要需提前 皮下注射G-CSF进行细胞动员），提取单个核细胞，加入诱导因子将单个核细胞诱导为DC细 胞，第9天用优势抗原表位肽活化致敏，第10天收集成熟的DC制备成细胞悬液，通过静脉回 输和局部注射两种方式进行治疗。对照组以常规治疗做空白对照。观察治疗前后HPV DNA转 阴率、免疫功能变化、瘤体变化等指标。
[0051] 3、结果
[0052] 3.1 PCR检测HPV DNA
[0053]治疗组和对照组分别于治疗前及治疗一个月后，采用人乳头瘤病毒通用型引物， 取宫颈病变部位皮肤组织或局部分泌物，于PCR扩增仪上做聚合酶链反应，PCR产物经电泳、 染色后紫外分析仪下观察记录结果:治疗组HPV DNA转阴19例，对照组转阴者5例。显示细胞 治疗对HPV DNA的清除率高，效果明显。
[0054] 3.2细胞免疫功能检测
[0055]取治疗前一周及治疗结束一周取患者抗凝静脉血2mL，进行T细胞亚群检测：CD3， ⑶4,⑶8,用Excel软件分别对治疗组与对照组患者治疗前后数据做z检验.治疗组治疗前 ⑶3，⑶4，⑶8，⑶4/⑶8较治疗后⑶3，⑶4，⑶8，⑶4/⑶8，两组差异显著(P〈0.05)免疫功能改 善明显.而对照组治疗前⑶3，⑶4，⑶8，⑶4/⑶8与治疗后⑶3，⑶4，⑶8，⑶4/⑶8比较，两组 无显著差异(P>〇.05)免疫功能改善不明显。
[0056]
[0057]
[0058] 3.3瘤体变化
[0059]参照实体瘤疗效RECIST判定标准，通过治疗前和治疗后一个月的CT和B超数据进 行对照比较，治疗组患者完全缓解9例，部分缓解11例，轻度缓解MR2例，总缓解率达73.3% ; 对照组患者完全缓解6例，部分缓解8例，轻度缓解MR2例，总缓解率53.3 %。治疗组经治疗缓 解率高。
[0060]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 用于对HPV感染进行细胞治疗的树状多肤，其特征在于，由四个HPV表位肤c-端的簇 基与Ξ个精氨酸残基构成的多聚精氨酸骨架的氨基连接而形成，所述树状多肤具有W下结 构式：其中，R为精氨酸残基，X为所述表位肤，所述表位肤的氨基酸序列为Tyr-Met-Leu-Asp- Leu-Gln-Pr〇-Glu-Thr-Gly-Gly-Gly〇2. 根据权利要求1所述的用于对HPV感染进行细胞治疗的树状多肤，其特征在于，所述 表位肤的N端有栋桐酷丝氨酸修饰。3. 筛选权利要求1或2所述的树状多肤的方法，其特征在于:所述表位肤采用SYFPEITHI 远程预测数据库、PREDEPP数据库、基序法和多项式法共同对HPV16E7编码蛋白进行HLA-A2 限制性CTL表位预测得到。4. 制备权利要求1或2所述的树状多肤的方法，其特征在于:采用固相合成法制备进行 制备。5. 根据权利要求4所述的制备树状多肤的方法，其特征在于，选择栋桐酷丝氨酸W- AAA-柔性连接的方式进行T细胞表位肤的修饰。6. 根据权利要求4所述的制备树状多肤的方法，其特征在于，通过多聚精氨酸骨架将上 述表位肤连接成4分枝状多聚抗原肤。7. 权利要求1或2所述的树状多肤的应用，其特征在于，应用于致敏树突状细胞，或应用 于制备优势表位肤疫苗。8. 根据权利要求7所述的树状多肤的应用，其特征在于，所述优势表位肤疫苗和优势表 位肤致敏的树突状细胞应用于治疗高危型人乳头瘤病毒感染的宫颈癌。
【文档编号】C07K1/00GK106084008SQ201610431615
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】罗进, 闫小君
【申请人】江苏安泰生物技术有限公司