一种单环刺螠内脏蛋白源锌螯合肽的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种单环刺螠内脏蛋白源锌螯合肽，该锌螯合肽的氨基酸序列为Phe?Pro?Tyr?Lys?His，ESI?MS检测分子量为690.78 Da。制备时以单环刺螠内脏作为原料，经内脏的预处理、蛋白提取、酶解、凝胶纯化和色谱制备而得；该锌螯合肽为补锌保健食品和药物开发提供了一种技术支持，同时也为单环刺螠内脏的高值化利用提供了一条新思路。
【专利说明】
[0001] 一种单环刺螆内脏蛋白源锌螯合肽
技术领域
[0002] 本发明涉及一种动物内脏活性多肽，尤其涉及单环刺縊内脏蛋白源锌螯合肽。
【背景技术】
[0003] 活性生物肽以广泛的生物活性及其在医药、保健品、食品和化妆品等应用上的独 特功效被越来越多的消费者所青睐，使其成为食品行业和保健品行业、日化行业所竞相关 注的焦点。锌是人体必须的微量元素，其缺乏可导致儿童生长发育不良、智力发育落后、免 疫力降低等病症。传统的锌补充剂(如葡萄糖酸锌、柠檬酸锌)吸收利用率低，肠胃刺激大， 不易长期服用。而锌与金属螯合肽形成的螯合盐，即可促进微量元素的吸收，同时又能满足 机体对活性肽、氨基酸等的需求，得到了国内外学者的广泛关注。
[0004] 单环刺婦（Urechis unicinctus)，俗名海肠、海肠子，属于婦虫动物门、婦纲、无 管縊目、刺縊科。体粗大，长约100-300 mm，宽约25-27 mm，长200mm-250 mm，体表满布大小 不等的粒状突起，吻圆锥形;腹刚毛1对，粗大;肛门周围有一圈9-13条褐色尾刚毛。分布于 俄罗斯、日本、朝鲜和我国黄渤海沿岸，是我国北方沿海泥沙岸潮间带下区及潮下带浅水区 底栖生物的常见种。它个体肥大，肉味鲜美，体壁肌富含蛋白质和多种人体必需氨基酸。 自古以来，在我国、日本和朝鲜沿海均作为名贵的海鲜食品，有较高的经济价值。人们的传 统做法只食用其体壁，而废弃内脏，浪费的宝贵的渔业资源。
[0005] 基于此，
【申请人】以单环刺縊内脏为原料，利用现代生物技术制备一种具有金属锌 螯合活性的肽，既增加了单环刺縊资源的利用率，减少了内脏作为下脚料对环境的危害，同 时也为单环刺縊内脏的高值化利用提供了 一条新思路。
[0006]
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种单环刺縊内脏蛋白源锌螯合肽。
[0008] 本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为:一种单环刺縊内脏蛋白源锌螯 合肽，其特征在于该锌螯合肽的氨基酸序列为Phe-Pr〇-Tyr-Ly S-His(FPYKH)，ESI-MS检测 分子量为690.78 Da。
[0009] 该锌螯合肽的制备方法，可以通过以下方法制备： 1)单环刺縊内脏的预处理:将单环刺縊内脏剪碎后用组织搅碎器搅成匀浆。丙酮搅拌 脱脂过夜，离心弃去上清，沉淀在40 °C的鼓风干燥箱内烘干过夜后粉碎，得单环刺縊内脏 粉。
[0010])单环刺縊内脏蛋白的制备：取单环刺縊内脏粉按1: 20(质量体积比，50 g: 1000 mL)加入蒸馏水，于80°C的恒温水浴锅内加热4h后，离心取上清液，重复三次上述步骤，最终 得到的上清液为实验样品，浓缩冻干。
[0011])单环刺縊内脏蛋白的酶解:将样品按1:5(质量体积比，10 g:50 mL)加入蒸馏水， 然后调节pH 6.8,加入2%(质量分数)木瓜蛋白酶在60 °C水浴中加热4 h，后用100°C水浴加 热15 min灭酶，在离心机中4500 rpm离心20 min后取上清液。接着采用胰蛋白酶水解4 h， 提取温度60 °C，pH: 10，加酶量0.5%(质量分数）。提取完成后调pH至中性后100°C水浴加热 15 min灭酶，在离心机中4500 rpm离心20 min后取上清液。减压浓缩至原体积的1/20后，使 用95%乙醇沉淀，使乙醇终浓度约为80%，于4 °C冰箱中放置过夜，上清浓缩冷冻干燥，得单 环刺縊内脏蛋白酶解产物 4)单环刺縊内脏锌螯合肽的制备： ① Sephadex G-15凝胶色谱柱层析； 取单环刺婦内脏蛋白酶解产物用蒸馏水溶解成100 mg/ml溶液，Sephadex G-15凝胶色 谱柱2.0 cmX 100 cm进行分离纯化，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.5 ml/min，自动部分收 集器收集，每管收集3mL，280 nm测定吸光度，收集各峰，冻干备用 ② 高效液相色谱的分离纯化； 用高效液相色谱进一步分离纯化。色谱条件如下：色谱柱为反相C18键合硅胶柱 (Zorbax C18, 250 mmX4.6 mm, 5 μπι);流动相:A水，B乙腈，梯度洗脱条件见下表1;流速： 1.0 ml/min，柱温30°C，检测波长为254 nm和280 nm，收集主要色谱峰，冻干备用得到短肽 样品。
[0012] 表1高效液相色谱分离条件
，根据对Zn的螯合活性得1个高活性的锌螯合肽Phe-Pr〇-Tyr-Lys-His(FPYKH)，ESI/MS 检测分子量为690.78 Da。
[0013] 本发明基于多肽与金属离子螯合的理论基础，以及多肽-Zn螯合物的独特功效(可 同时补充多肽/氨基酸和Zn)，以单环刺縊内脏为原材料，通过对木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的 酶解条件控制，制备出具有高活性的锌螯合肽。本发明即为补锌保健食品和药物开发提供 了一种技术支持，同时也为单环刺縊内脏的高值化利用提供了一条新思路。
[0014]
【附图说明】
[0015] 图1是本发明的葡聚糖凝胶G-15层析图。
[0016] 图2是本发明的葡聚糖凝胶G-15制备酶解物的RP-HPLC分析图。
[0017] 图3是本发明的多肽的质谱图。
[0018] 图4是本发明的多肽的结构式。
[0019]
【具体实施方式】
[0020] 以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0021] -种单环刺縊内脏蛋白源锌螯合肽，其制备工艺流程如下:单环刺縊内脏"蛋白提 取〃酶解〃酶解物〃凝胶纯化〃高效液相色谱制备〃锌螯合肽。
[0022] 实施例： 1)单环刺縊内脏的预处理:将单环刺縊内脏剪碎后用组织搅碎器搅成匀浆。丙酮搅拌 脱脂过夜，离心弃去上清，沉淀在40 °C的鼓风干燥箱内烘干过夜后粉碎，得单环刺縊内脏 粉。
[0023])单环刺縊内脏蛋白的制备：取单环刺縊内脏粉按1:20(质量体积比，50 g: 1000 mL)加入蒸馏水，于80°C的恒温水浴锅内加热4h后，离心取上清液，重复三次上述步骤，最终 得到的上清液为实验样品，浓缩冻干。
[0024])单环刺縊内脏蛋白的酶解:将样品按1:5(质量体积比，10 g:50 mL)加入蒸馏水， 然后调节pH 6.8,加入2%(质量分数)木瓜蛋白酶在60 °C水浴中加热4 h，后用100°C水浴加 热15 min灭酶，在离心机中4500 rpm离心20 min后取上清液。接着采用胰蛋白酶水解4 h， 提取温度60 °C，pH: 10，加酶量0.5%(质量分数）。提取完成后调pH至中性后100°C水浴加热 15 min灭酶，在离心机中4500 rpm离心20 min后取上清液。减压浓缩至原体积的1/20后，使 用95%乙醇沉淀，使乙醇终浓度约为80%，于4 °C冰箱中放置过夜，上清浓缩冷冻干燥，得单 环刺縊内脏蛋白酶解产物 4)单环刺縊内脏锌螯合肽的制备： ① Sephadex G-15凝胶色谱柱层析； 取单环刺婦内脏蛋白酶解产物用蒸馏水溶解成100 mg/ml溶液，Sephadex G-15凝胶色 谱柱2.0 cmX 100 cm进行分离纯化，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.5 ml/min，自动部分收 集器收集，每管收集3mL，280 nm测定吸光度，收集各峰，冻干备用 ③高效液相色谱的分离纯化； 用高效液相色谱进一步分离纯化。色谱条件如下：色谱柱为反相C18键合硅胶柱 (Zorbax C18, 250 mmX4.6 mm, 5 μπι);流动相:A水，B乙腈，梯度洗脱条件见下表1;流速： 1.0 ml/min，柱温30°C，检测波长为254 nm和280 nm，收集主要色谱峰，冻干备用得到短肽 样品。
[0025]表1高效液相色谱分离条件
，根据对Zn的螯合活性得1个高活性的锌螯合肽Phe-Pr〇-Tyr-LyS-His(FPYKH)。
[0026] 锌螯合肽对锌离子的螯合作用采用EDTA滴定法测定:取螯合物100 mg于100 mL 小烧杯中，加水50 mL，滴入HC1(6 mol/L)数滴。摇匀后在水浴上加热使之完全溶解，冷却后 定容至100 mL，从中吸取10 mL于三角瓶，平行3份，加入pH 10的NH3-NH4C1缓冲液10 mL，铬 黑T指示剂适量，然后用0.01 mol/L Na2EDTA液滴定至蓝色;记录消耗EDTA的毫升数，计算 螯合物含锌量。
[0027] 测定结果表明：纯化得到的锌螯合肽Phe-Pr〇-Tyr-Lys-His(FPYKH)，ESI/MS检测 分子量为690.78 Da，对锌离子的螯合能力为78.51 yg/mg，与蛋白酶解产物(26.32 yg/mg) 相比其对Zn的螯合能力有了较大提高。
[0028]最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不 限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接 导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种单环刺縊内脏蛋白源锌螯合肽，其特征在于该锌螯合肽的氨基酸序列为？1^_ Pro-Tyr-Lys-His，ESI-MS检测分子量为690 · 78 Da〇
【文档编号】C07K7/06GK106084000SQ201610239257
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年4月18日 公开号201610239257.1, CN 106084000 A, CN 106084000A, CN 201610239257, CN-A-106084000, CN106084000 A, CN106084000A, CN201610239257, CN201610239257.1
【发明人】李佩佩, 张小军, 陈思, 龙举, 陈荫
【申请人】浙江省海洋水产研究所