基于细胞内酶催化聚合的多肽单体分子及其在构建纳米材料中的应用
【专利摘要】本发明涉及一种基于细胞内酶催化聚合的多肽单体分子及其在构建纳米材料尤其是类弹性蛋白纳米材料中的应用，所述多肽单体分子由功能分子、聚合活性位点和类弹性蛋白重复多肽构成，所述多肽单体分子可以高效地被谷氨酰胺转移酶催化聚合，形成的聚合物具有温敏特性，可以通过改变单体分子的多肽序列，调节聚合物的三维结构、转化温度、孔隙大小等参数；该聚合物可以在活细胞内原位可控合成，并形成纳米结构；该纳米材料的制备方法可以实现活细胞内实时原位成像或高置留率的药物递送，具有良好的应用前景。
【专利说明】
基于细胞内酶催化聚合的多肽单体分子及其在构建纳米材料 中的应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及纳米材料制作技术领域，具体涉及一种多肽单体分子及其在构建纳米 材料中的应用，尤其涉及一种基于细胞内酶催化聚合的多肽单体分子及其在构建类弹性蛋 白纳米材料中的应用。
【背景技术】
[0002] 可控的纳米材料制备是材料领域一贯的追求，这种可控不仅体现在纳米尺度的均 匀度、表面化学性质的统一性，也体现在制备方法的可控性。近年来，对于生物领域的应用， 纳米材料在体外的制备并具有生物功能已得到广泛的发展，但是其中的生物安全性、材料 在复杂生理环境下的稳定性以及纳米材料的代谢等问题的突出也在一定程度上制约了纳 米材料的发展。然而，针对上述问题提出的在活体或者活细胞内原位组装纳米材料，并具有 生物功能的策略成为解决上述瓶颈问题的有效手段。该策略不仅体现了小分子在生物体内 分布时的高效浸润的优势，也体现了纳米材料在病灶部位成像或治疗的优势，成为时下最 具潜力的研究方向。
[0003] 在此体系中，多肽为基础的组装体系由于其生物相容性好、合成方法成熟等特点 成为首先的材料体系。在前期的研究基础中，多肽的自组装主要推动力为弱的作用力，例 如:氢键、范德华力、静电相互作用、31-31相互作用等。其中在体外的多肽纳米材料制备已经 相当成熟，部分材料已经用于临床研究。但是在活体内原位的多肽纳米材料组装是近5年内 才出现并发展的。典型的案例如Xu课题组利用细胞内的磷酸酶使得入胞的多肽去磷酸化， 增强的疏水作用，导致在细胞内发生了凝胶化的组装，实现了细胞内酶的原位成像或者肿 瘤细胞的促凋亡作用。Rao课题组利用一种生物正交反应，成功实现了多肽分子在细胞内的 超分子组装，可以用来监控caspase-3酶的活性。也有研究在前期设计了叶绿素修饰的多肽 材料，通过明胶酶的分子剪切实现了在活体内的纳米纤维结构的超分子组装，成功用于活 体成像。
[0004] 虽然已有上述的成果案例，但是多肽在活体内的超分子组装仍然面临着可控性 差、复杂环境下组装效率不高等问题。因此，发展共价组装体系将有效解决上述所面临的困 难。结合生物体内的内源性催化剂-酶，建立共价酶催化聚合体系，将有效实现在复杂生理 环境下的可控聚合和分子组装，将为纳米材料的制备提供新思路和新方法，为生物领域的 应用提供新技术。
【发明内容】
[0005] 为解决现有技术中存在的不足，本发明提供了一种多肽单体分子及其在构建纳米 材料中的应用，特别是提供了一种基于细胞内酶催化聚合的多肽单体分子及其在构建类弹 性蛋白纳米材料中的应用，本发明还提供了所述纳米材料在细胞内谷氨酰胺转移酶表达量 成像或多肽缓释药物的递送中的应用。
[0006] 本发明提供的多肽单体分子可以在细胞内的谷氨酰胺转移酶催化下发生聚合，形 成的聚肽具有类弹性蛋白性质，可以在改变温度的环境中发生聚合物链的扭曲和缠绕，实 现原位的纳米超分子组装以及可控地在细胞内制备类弹性蛋白纳米材料，并实现成像或者 疾病治疗的功能。
[0007] 为达此目的，本发明采用以下技术方案：
[0008] 第一方面，本发明提供了一种基于细胞内酶催化聚合的多肽单体分子，所述多肽 单体分子由功能分子、聚合活性位点和类弹性蛋白重复多肽构成。
[0009] 本发明通过采用将多肽单体分子设计为由功能分子、聚合活性位点和类弹性蛋白 重复多肽构成的结构，该分子设计方式不仅保证了聚合后的聚肽具有类弹性蛋白的性质同 时也保证了所携带的功能分子的修饰密度。
[0010] 本发明中所述的多肽单体分子，其聚合活性位点是催化酶一谷氨酰胺转移酶的特 异性催化位点，包括谷氨酰胺(Q)端和赖氨酸(K)端，可以通过两个活性端的催化偶联实现 酶催化聚合。
[0011] 根据本发明，所述多肽单体分子的具体结构为:功能分子、聚合活性位点的谷氨酰 胺端、类弹性蛋白重复多肽和聚合活性位点的赖氨酸端，其依次连接构成。将聚合活性位点 设计在类弹性蛋白重复多肽的两端才可以实现酶催化聚合，同时保持聚合后的聚肽具有类 弹性蛋白的性质;两端头的聚合活性位点设计不可以改变。
[0012] 根据本发明，所述谷氨酰胺端序列表示为XQY，其表示具有3个氨基酸的多肽；其 中，X表示除脯氨酸以外的氨基酸，优选为疏水性氨基酸;Q表示谷氨酰胺;Y表示除带负电的 氨基酸以外的氨基酸，优选为疏水性氨基酸。
[0013] 本发明所述的谷氨酰胺端序列中的X和Y可同时采用疏水性氨基酸，这样的选择可 以大大增加酶催化的选择性和酶催化效率，对合成的聚合物的分子量有影响。
[0014] 根据本发明，所述谷氨酰胺端序列具体可以采用如SEQ ID N0.1-2之一所示的序 列，也可采用如下列举的各序列:￥91?、￥91、￥〇￥、1^1、1^￥等，在此不做特别限定，需要强调的 是，本发明的谷氨酰胺端序列优选采用如SEQ ID N0.1-2之一所示的序列，其在XQY的序列 中酶催化选择性最高，催化得到的聚合物分子量最大。
[0015] SEQ ID N0.1：LQR
[0016] SEQ ID N0.2：RQL
[0017] 本发明通过采用具有上述具有通式XQY所示的谷氨酰胺序列，即采用将谷氨酰胺 设计成中间位置Q，在Q+1位置上设计为X氨基酸，在Q-1位置上设计为Y氨基酸，其优势在于 保持酶催化选择性的同时，尽可能的减少对聚合后的类弹性蛋白聚肽的温敏响应性的影 响。因此三个氨基酸XQY的设计可以同时实现上述功能。
[0018] 根据本发明，所述类弹性蛋白重复多肽的序列中可以含有5-8个氨基酸，但并非仅 限于此；所述类弹性蛋白重复多肽的序列如SEQ ID N0.3-30之一所示，优选为SEQ ID NO.24-30所示的序列，所述序列所形成的聚肽的类弹性蛋白性质较好(灵敏的温度响应性、 转折温度可以在细胞培养的30-37Γ之间以及重复个数在20个重复单元以上就可以很好的 表现出类弹性蛋白的性质）。
[0019] SEQ ID N0.3：GVGVP
[0020] SEQ ID N0.4：GVGHP
[0021] SEQ ID N0.5：GVGAP
[0022] SEQ ID N0.6：AVPGVG
[0023] SEQ ID N0.7：TVPGVG
[0024] SEQ ID N0.8：VAPGVG
[0025] SEQ ID N0.9：GVPGVG
[0026] SEQ ID N0.10：VHPGVG
[0027] SEQ ID N0.11：VPVGVG
[0028] SEQ ID N0.12：APVGVG
[0029] SEQ ID N0.13：VPAVG
[0030] SEQ ID N0.14：GPAVG
[0031] SEQ ID N0.15：TPAVG
[0032] SEQ ID N0.16：VPHVG
[0033] SEQ ID N0.17：GPHVG
[0034] SEQ ID N0.18：TPHVG
[0035] SEQ ID NO.19：RGDSPYQG
[0036] SEQ ID NO.20：RGDAPYQG
[0037] SEQ ID NO.21：RGDSPYG
[0038] SEQ ID N0.22：RGDSPFG
[0039] SEQ ID N0.23：RGDSPHG
[0040] SEQ ID N0.24：VPHVG
[0041] SEQ ID N0.25：GVGFP
[0042] SEQ ID N0.26：VHPGVG
[0043] SEQ ID NO.27：GRGDSPFG
[0044] SEQ ID N0.28：GRDGSPYG
[0045] SEQ ID N0.29：GRGESPYG
[0046] SEQ ID N0.30：GRGDSPYG
[0047] 根据本发明，所述功能分子为成像分子和/或药物分子。
[0048] 优选地，所述成像分子为焚光成像分子、光声成像分子或极性敏感分子中的任意 一种或至少两种的组合，优选为紫红素18、焦脱镁叶绿素、Cy5-Cy7或DBD分子中的任意一种 或至少两种的组合。
[0049] 优选地，所述药物分子为肿瘤化疗分子和/或抗生素分子，优选为阿霉素和/或万 古霉素。
[0050] 第二方面，本发明还提供了如第一方面所述的多肽单体分子的聚合方法，所述多 肽单体分子的聚合是在活细胞内通过酶催化反应聚合而成。
[0051] 本发明提供的多肽单体分子可以在活细胞内通过酶催化反应聚合而成，通过改变 聚合反应的温度，使得聚合物链发生扭曲或缠绕，从而实现纳米超分子的原位组装以及可 控地在细胞内制备类弹性蛋白纳米材料。
[0052] 根据本发明，所述催化反应的温度为37-40 °C，例如可以是37°C、38°C、38.5°C、39 。(:或 40°C，优选为 37°C。
[0053] 根据本发明，所述催化反应的时间为4-12h，例如可以是4h、6h、7h、8h、1 Oh、1 lh或 12h，优选为4h。本发明的催化反应时间优选为4h，其可以保证酶催化聚合后的聚肽分子量 的同时，尽可能减少反应时间，也就是说催化4h时酶催化聚合速率达到平台期。
[0054] 根据本发明，所述多肽单体分子的浓度为10-50μΜ，例如可以是10μΜ、20μΜ、25μΜ、 30μΜ、35μΜ、40μΜ 或 50μΜ，优选为 50μΜ。
[0055] 根据本发明，所述酶的浓度为1-3U，例如可以是1U、1.2U、1.5U、1.8U、2U、2.5US 3U〇
[0056] 根据本发明，所述酶与多肽单体分子的反应摩尔比为1:5-1:10,酶与催化的多肽 底物比不同，对催化后的聚肽的分子量大小有影响。
[0057]根据本发明，所述酶为谷氨酰胺转移酶。
[0058]根据本发明，所述谷氨酰胺转移酶包括细菌提取的重组蛋白、人或动物组织中提 取的TG2。
[0059]第三方面，本发明还提供了一种细胞内酶催化聚合构建纳米材料的方法，包括以 下步骤：
[0060] (1)将如第一方面所述的多肽单体分子配制成溶液；
[0061] (2)将步骤(1)得到的多肽单体分子溶液加入到酶溶液中，在温度为4-40Γ条件下 反应4-12h，得到纳米材料。
[0062] 本发明中得到的纳米材料为类弹性蛋白纳米材料。
[0063]根据本发明，步骤（1)所述多肽单体分子溶液采用HEPES缓冲溶液进行配制;其中， 所述多肽单体分子溶液中多肽单体分子的浓度为1〇〇-1〇〇〇μΜ，例如可以是100μΜ、300μΜ、 50(^]?、60(^]\1、70(^]\1、80(^]\1或100(^]\1，优选为60(^]\1。
[0064] 根据本发明，步骤(2)所述反应的温度为37-40°C，例如可以是37 °C、38 °C、38.5 °C、 39°(：或40°(：，优选为37°(：。
[0065] 根据本发明，步骤(2)所述反应的时间为4-12h，例如可以是4h、6h、7h、8h、10h、1 lh 或12h，优选为4h。
[0066] 第四方面，本发明还提供了一种如第三方面所述的方法制备得到的纳米材料，所 述纳米材料为一维和/或三维纳米结构。
[0067] 根据本发明，所述一维结构的聚合单体两端分别由谷氨酰胺(Q)端和赖氨酸(K)端 组成;所述三维结构的聚合单体两端分别由谷氨酰胺-赖氨酸(QK)端和赖氨酸-谷氨酰胺 (KQ)端组成。
[0068]根据本发明，所述谷氨酰胺端序列如SEQ ID N0.1-2之一所示;所述谷氨酰胺-赖 氨酸端序列如SEQ ID N0.31所示;所述赖氨酸-谷氨酰胺端序列如SEQ ID N0.32所示。
[0069] SEQ ID N0.31：RQLK
[0070] SEQ ID N0.32：KRQL
[0071] 第五方面，本发明还提供了如第四方面所述的纳米材料的用途，所述纳米材料可 以用于细胞内谷氨酰胺转移酶表达量成像或多肽缓释药物的递送，其中所述药物可用于抗 肿瘤或抗感染。
[0072] 与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
[0073] 本发明提供的多肽单体分子可以在细胞内的谷氨酰胺转移酶催化下发生聚合，形 成的聚肽具有类弹性蛋白性质，可以在改变温度的环境中发生聚合物链的扭曲和缠绕，实 现原位的纳米超分子组装以及可控地在细胞内制备类弹性蛋白纳米材料，并实现成像或者 疾病治疗的功能。
【附图说明】
[0074] 图1是本发明多肽单体分子的结构示意图；
[0075] 图2是本发明多肽单体分子在细胞内发生聚合反应的示意图；
[0076]图3是实施例1中所述聚合单体分子的MALDI-T0F图
[0077]图4是实施例1中所述聚多肽在溶液内组装的纳米结构扫描电镜；
[0078]图5是实施例1中所述纳米聚集体在细胞成像的应用；
[0079]图6是实施例2中所述纳米凝胶的扫描电镜；
[0080] 图7是实施例2中所述纳米凝胶对于细胞骨架的破坏，其中图7(a)表示TG2阳性细 胞;图7(b)表示TG2阴性细胞。
【具体实施方式】
[0081] 本发明中提供的基于细胞内酶催化聚合的多肽单体分子，其是由功能分子、聚合 活性位点和类弹性蛋白重复多肽构成，具体结构为：功能分子、聚合活性位点的谷氨酰胺 端、类弹性蛋白重复多肽和聚合活性位点的赖氨酸端依次连接，其具体结构如图1所示。
[0082] 本发明中提供的基于细胞内酶催化聚合的多肽单体分子，其在活细胞内通过酶， 优选通过谷氨酰胺酶催化反应聚合，通过改变聚合反应的温度，使得聚合物链发生扭曲或 缠绕，从而实现纳米超分子的原位组装以及可控地在细胞内制备类弹性蛋白纳米材料，其 具体的聚合过程如图2所示。
[0083] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，本发明所涉及的主题保护范围并非仅限 于这些实施例。
[0084] 实施例1
[0085] 基于细胞内酶催化聚合的多肽单体分子，其结构设计为:功能分子、聚合活性位点 的谷氨酰胺端、类弹性蛋白重复多肽和聚合活性位点的赖氨酸端依次连接。
[0086]其中，功能分子为DBD荧光信号分子；聚合活性位点的谷氨酰胺端序列为SEQ ID NO.2所示的序列RQL;类弹性蛋白重复多肽序列为SEQ ID NO.25所示的序列:GVGFP;聚合活 性位点的赖氨酸端为K( Lys )，该多肽单体分子的结构如下所示。
[0087]
[0088] 实施例2
[0089] 基于细胞内酶催化聚合的多肽单体分子，其结构设计为:功能分子、聚合活性位点 的谷氨酰胺端、类弹性蛋白重复多肽和聚合活性位点的赖氨酸端依次连接。
[0090] 其中，功能分子为DBD荧光信号分子；聚合活性位点的谷氨酰胺端序列为SEQ ID N0.1所示的序列LQR;类弹性蛋白重复多肽序列为SEQ ID勵.24所示的序列:￥?狀6;聚合活 性位点的赖氨酸端为K(Lys)。
[0091] 实施例3
[0092] 基于细胞内酶催化聚合的多肽单体分子，其结构设计为:功能分子、聚合活性位点 的谷氨酰胺端、类弹性蛋白重复多肽和聚合活性位点的赖氨酸端依次连接。
[0093]其中，功能分子为DBD荧光信号分子；聚合活性位点的谷氨酰胺端序列为SEQ ID NO. 2所示的序列RQL;类弹性蛋白重复多肽序列为SEQ ID NO. 3所示的序列:GVGVP;聚合活 性位点的赖氨酸端为K(Lys)。
[0094] 实施例4
[0095] 基于细胞内酶催化聚合的多肽单体分子，其结构设计为:功能分子、聚合活性位点 的谷氨酰胺端、类弹性蛋白重复多肽和聚合活性位点的赖氨酸端依次连接。
[0096]其中，功能分子为阿霉素;聚合活性位点的谷氨酰胺端序列为SEQ ID NO.1所示的 序列LQR;类弹性蛋白重复多肽序列为SEQ ID NO.27所示的序列:GRGDSPFG;聚合活性位点 的赖氨酸端为K(Lys)。
[0097] 实施例5
[0098] 基于细胞内酶催化聚合的多肽单体分子，其结构设计为:功能分子、聚合活性位点 的谷氨酰胺端、类弹性蛋白重复多肽和聚合活性位点的赖氨酸端依次连接。
[0099]其中，功能分子为万古霉素;聚合活性位点的谷氨酰胺端序列为SEQ ID N0.2所示 的序列RQL;类弹性蛋白重复多肽序列为SEQ ID NO. 29所示的序列:GRGESPYG;聚合活性位 点的赖氨酸端为K(Lys)。
[0100] 实施例6
[0101] 基于细胞内酶催化聚合的多肽单体分子，其结构设计为:功能分子、聚合活性位点 的谷氨酰胺端、类弹性蛋白重复多肽和聚合活性位点的赖氨酸端依次连接。
[0102] 其中，功能分子为Cy5-Cy7;聚合活性位点的谷氨酰胺端序列为SEQ ID N0.1所示 的序列LQR;类弹性蛋白重复多肽序列为SEQ ID N0.29所示的序列:GRGESPYG;聚合活性位 点的赖氨酸端为K(Lys)。
[0103] 实施例7
[0104] 基于细胞内酶催化聚合的多肽单体分子，其结构设计为:功能分子、聚合活性位点 的谷氨酰胺端、类弹性蛋白重复多肽和聚合活性位点的赖氨酸端依次连接。
[0105] 其中，功能分子为Cy5-Cy7;聚合活性位点的谷氨酰胺端序列为SEQIDN0.2所示 的序列RQL;类弹性蛋白重复多肽序列为SEQ ID N0.30所示的序列:GRGDSPYG;聚合活性位 点的赖氨酸端为K(Lys)。
[0106] 实施例8
[0107] 实施例1中的基于细胞内酶催化聚合的多肽单体分子的聚合方法，包括:在活细胞 内通过谷氨酰胺酶在37 °C下，催化反应4h聚合而成。
[0108] 实施例9
[0109] 实施例2中的基于细胞内酶催化聚合的多肽单体分子的聚合方法，包括:在活细胞 内通过谷氨酰胺酶在37 °C下，催化反应6h聚合而成。
[0110] 实施例1〇
[0111] 实施例4中的基于细胞内酶催化聚合的多肽单体分子的聚合方法，包括:在活细胞 内通过谷氨酰胺酶在39 °C下，催化反应12h聚合而成。
[0112] 实施例11
[0113] 实施例6中的基于细胞内酶催化聚合的多肽单体分子的聚合方法，包括:在活细胞 内通过谷氨酰胺酶在40°C下，催化反应8h聚合而成。
[0m] 实施例12
[0115]利用实施例1的基于细胞内酶催化聚合的多肽单体分子制备纳米材料的方法，包 括以下步骤：
[0116] (1)连接多肽的合成
[0117]采用Fmoc固相合成法合成连接多肽：
[0118]合成选用〇 . 35mM修饰密度的Wang树脂，其中第一个氨基酸(赖氨酸）的N端被Fmoc 保护，C端固定于树脂上。用20%(v/v)的六氢吡啶的DMF溶液脱去N端的Fmoc保护，然后用茚 三酮测试法测试脱保护结果。然后将下一个氨基酸的羧基用0.4M的4-甲基吗啉(NMM)和10 倍于氨基酸的苯并三氮唑-^『少'-四甲基脲六氟磷酸酯(耶1'1])的01^溶液活化，并加入 到脱去保护的树脂中反应2h。按此方法，将剩余的所有氨基酸都通过缩合反应连接上去，形 成固定于树脂的连接多肽。
[0119] (2)荧光信号分子DBD连接多肽的合成
[0120] 在步骤(1)完成所有氨基酸的合成后，将活化好的DBD荧光信号分子作为最后一个 氨基酸重复上述步骤偶联在连接多肽的N端;然后用含有2.5%水和2.5%三异丙基硅烷的 三氟乙酸溶液将合成好的多肽从树脂上脱除，同时脱除氨基酸的侧链保护;将三氟乙酸用 旋转蒸发法去除，然后多肽的粗产物用无水乙醚沉淀，洗涤并干燥;最后选用反相制备液相 色谱，将多肽纯化。
[0121] 纯化过程的条件为:流动相是含有0.1%三氟乙酸的乙腈和含有0.1%三氟乙酸的 双蒸水;参数是梯度洗脱从5%乙腈/95%水到60%乙腈/40%水，流速为10ml/min，处理时 间为30min。上述方法所得到的聚合单体分子的MALDI-T0F图谱如图3所示。
[0122] (3)多肽在酶催化下的聚合。
[0123] 将合成好的聚合单体分子用HEPES缓冲溶液溶解，加入到配制好的谷氨酰胺转移 酶溶液中，37°C，150rmp下摇床4h左右，谷氨酰胺转移酶可以催化多肽链赖氨酸上氨基和谷 氨酰胺上羟酰胺基之间发生共价交联，从而形成对热敏感的类弹性蛋白聚肽，形成的聚合 物分子量约为30000,聚合度为27-28。该聚合物在体外的纳米组装形貌用扫描电镜表征，如 图4所示。
[0124] (4)该原位纳米材料的组装方法用于监控谷氨酰胺转移酶的活性。
[0125] 将聚合单体分子以浓度为600μΜ的最终浓度加入到细胞培养基中，静置培养12h 后，用PBS将细胞反复清洗三次，然后用Hochest (蓝色)和Di 1 (红色)分别对细胞核和细胞膜 进行染色，并用荧光共聚焦显微镜成像，成像温度为4°C(如图5所示）。
[0126] 实施例13
[0127] 利用基于细胞内酶催化聚合的多肽单体分子制备纳米材料的方法，包括以下步 骤：
[0128] 以SEQ ID ^).24所示的序列￥?狀6为弹性蛋白多肽片段，6111-1^8和1^8-6111分别 为Q端和K端，分子序列为QKVPHVGQK，按如下步骤进行本发明类弹性蛋白纳米凝胶的合成：
[0129] (1)连接多肽的合成
[0130]采用Fmoc固相合成法合成连接多肽：
[0131]合成选用0.35mM修饰密度的Wang树脂，其中第一个氨基酸(赖氨酸）的N端被Fmoc 保护，C端固定于树脂上。用20%(v/v)的六氢吡啶的DMF溶液脱去N端的Fmoc保护，然后用茚 三酮测试法测试脱保护结果。然后将下一个氨基酸的羧基用0.4M的4-甲基吗啉(NMM)和10 倍于氨基酸的苯并三氮唑-^『少'-四甲基脲六氟磷酸酯(耶1'1])的01^溶液活化，并加入 到脱去保护的树脂中反应2h。按此方法，将剩余的所有氨基酸都通过缩合反应连接上去，形 成固定于树脂的连接多肽。
[0132] (2)多肽在酶催化下的聚合。
[0133] 将合成好的聚合单体分子用HEPES缓冲溶液溶解，加入到配制好的谷氨酰胺转移 酶溶液中，37°C，150rmp下摇床4h左右，谷氨酰胺转移酶可以催化多肽链赖氨酸上氨基和谷 氨酰胺上羟酰胺基之间发生共价交联，从而形成对热敏感的类弹性蛋白纳米凝胶，凝胶性 质如图6所示。
[0134] (3)该原位纳米材料的组装方法用于促进细胞凋亡。
[0135] 将聚合单体分子以浓度为600μΜ的最终浓度加入到细胞培养基中，静置培养12h 后，用PBS将细胞反复清洗三次，然后用Cy5标记的鬼笔环肽染细胞的肌动蛋白，并用荧光共 聚焦显微镜成像，成像温度为37°C，可以看到对比没有谷氨酰胺转移酶表达的细胞，胞内凝 胶的形成和塌缩使得肌动蛋白被大量破坏，促使细胞凋亡(如图7(a)-(b)所示）。
[0136] 通过上述实施例可以看出，本发明提供的多肽单体分子可以在细胞内的谷氨酰胺 转移酶催化下发生聚合，形成的聚肽具有类弹性蛋白性质，可以在改变温度的环境中发生 聚合物链的扭曲和缠绕，实现原位的纳米超分子组装以及可控地在细胞内制备类弹性蛋白 纳米材料，并实现成像或者疾病治疗的功能。
[0137]
【申请人】声明，本发明通过上述实施案例来说明本发明，但本发明并不局限于上述， 即不意味着本发明必须依赖上述才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明 的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落 在本发明的保护范围和公开范围之内。
【主权项】
1. 一种基于细胞内酶催化聚合的多肽单体分子，其特征在于，所述多肽单体分子由功 能分子、聚合活性位点和类弹性蛋白重复多肽构成。2. 如权利要求1所述的多肽单体分子，其特征在于，所述聚合活性位点包括谷氨酰胺端 和赖氨酸端； 优选地，所述多肽单体分子由功能分子、聚合活性位点的谷氨酰胺端、类弹性蛋白重复 多肽和聚合活性位点的赖氨酸端依次连接构成。3. 如权利要求2所述的多肽单体分子，其特征在于，所述谷氨酰胺端序列表示为XQY;其 中，X表示除脯氨酸以外的氨基酸，优选为疏水性氨基酸;Q表示谷氨酰胺;Y表示除带负电的 氨基酸以外的氨基酸，优选为疏水性氨基酸； 优选地，所述谷氨酰胺端序列如SEQ ID NO. 1-2之一所示； 优选地，所述类弹性蛋白重复多肽的序列如SEQ ID NO.3-30之一所示，优选为SEQ ID NO. 24-30所示的序列。4. 如权利要求1-3之一所述的多肽单体分子，其特征在于，所述功能分子为成像分子 和/或药物分子； 优选地，所述成像分子为焚光成像分子、光声成像分子或极性敏感分子中的任意一种 或至少两种的组合，优选为紫红素18、焦脱镁叶绿素、Cy5-Cy7或DBD分子中的任意一种或至 少两种的组合； 优选地，所述药物分子为肿瘤化疗分子和/或抗生素分子，优选为阿霉素和/或万古霉 素。5. 如权利要求1-4之一所述的多肽单体分子的聚合方法，其特征在于，所述多肽单体分 子的聚合是在活细胞内通过酶催化反应聚合而成。6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述催化反应的温度为37-40Γ，优选为37 °C； 优选地，所述催化反应的时间为4-12h，优选为4h; 优选地，所述多肽单体分子的浓度为10_50μΜ，优选为50μΜ; 优选地，所述酶的浓度为1-3U; 优选地，所述酶与多肽单体分子的反应摩尔比为1:5-1:10; 优选地，所述酶为谷氨酰胺转移酶； 优选地，所述谷氨酰胺转移酶包括细菌提取的重组蛋白、人或动物组织中提取的TG2。7. -种细胞内酶催化聚合构建纳米材料的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将如权利要求1-4之一所述的多肽单体分子配制成溶液； (2) 将步骤（1)得到的多肽单体分子溶液加入到酶溶液中，在温度为4-40Γ条件下反应 4-12h，得到纳米材料。8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（1)所述多肽单体分子溶液采用HEPES缓 冲溶液进行配制； 优选地，步骤（1)所述多肽单体分子溶液中多肽单体分子的浓度为100-1 ΟΟΟμΜ，优选为 600μΜ； 优选地，步骤(2)所述反应的温度为37-40°C，优选为37°C ; 优选地，步骤(2)所述反应的时间为4-8h，优选为4h。9. 如权利要求7或8所述的方法制备得到的纳米材料，其特征在于，所述纳米材料为一 维和/或三维纳米结构； 优选地，所述一维结构的聚合单体两端分别由谷氨酰胺端和赖氨酸端组成;所述三维 结构的聚合单体两端分别由谷氨酰胺-赖氨酸端和赖氨酸-谷氨酰胺端组成； 优选地，所述谷氨酰胺端序列如SEQ ID NO. 1-2之一所示;所述谷氨酰胺-赖氨酸端序 列如SEQ ID NO.31所示;所述赖氨酸-谷氨酰胺端序列如SEQ IDN0.32所示。10. 如权利要求9所述的纳米材料的用途，其特征在于，所述纳米材料用于细胞内谷氨 酰胺转移酶表达量成像或多肽缓释药物的递送。
【文档编号】C07K7/06GK106084003SQ201610408076
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】王浩, 李莉莉, 乔圣林, 刘伟娇, 马洋
【申请人】国家纳米科学中心