专利名称：色素的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于鲑科鱼饲料的新型色素、包含这种色素的新型饲料及所述色素的应用。
在喂饲养殖的鲑鱼和鳟鱼(trout)时，必须加入色素，以获得所需鱼肉颜色。主要使用的色素是虾青素，所述虾青素相当于喂饲野生鲑科鱼的色素。另外，可以使用其它色素，例如鸡油菌素。这类色素暴露于空气和温度以及光时非常不稳定。因此，所述色素在饲料加工和贮藏期间在相当程度上被降解。这些色素都是类胡萝卜素。这种饲料多半用不含有效量虾青素的原料(例如白色肉质鱼)制备。养殖鲑鱼和鳟鱼是用工业化生产的饲料喂饲，其中所述饲料中加入色素。
此外，市售虾青素制品非常昂贵并且其生物保留率非常低。如上所述虾青素是相当不稳定的化合物，当然这是一个缺点。虾青素的低稳定性是由于氧化作用引起的。为了避免或降低氧化作用，配制市售色素制品。一种典型虾青素制剂含有明胶和淀粉。然而，所用制剂通常其色素生物利用度不是最理想，而解决所述稳定性问题一种新方法使其具有高度稳定性的同时改善生物利用度，这将对水产养殖工业产生巨大经济效益。因此，迫切需要一种更稳定的色素，因为这使得可以制备生物利用度更更佳的制剂，因此可显著降低成本。
因此，水产养殖工业需要找到可用于生产鲑科鱼饲料的更稳定和生物有效性更好的色素。
不同的鲑科鱼种利用膳食类胡萝卜素的能力不同。发现虹鳟(Oncorhynchus mykiss)比大西洋鲑鱼(鲑(Salmo salar))和海鳟(S.trutta)更有效地利用饲料中的色素。虹鳟也可以在鱼肉中积累比大西洋鲑鱼和海鳟高的类胡萝卜素量，但低于红大麻哈鱼(Oncorhynchusnerka)(Storebakken，T.和Ho，N.K.，Aquaculture，第100卷，(1992)，第209页)。
膳食虾青素和鸡油菌素更有效地沉积在鲑鱼鱼肉中(与鲑鱼鱼皮相比)，这与虹鳟相反(Schiedt，K.等，Pure & Appl.Chem.57(1985)685-692)。
合成生产的虾青素通常以未酯化形式(即二醇)存在。这也是所述色素被鱼吸收之前在其肠中将所述色素转化的假定形式(O.J.Torrissen等，Reviews in Aquatic Sciences，第1卷，(1989)第209-225页)。在自然界中，虾青素通常以二酯存在。
Simpson，K.L.和Kamata，T.，Proc.World Symp.on Finfish Nutr.and Fishfeed Technology，Hamburg 20.-23.1978年6月，第II卷，Berlin1979，第415-424页，报道了一项比较虾青素、虾青素酯和虾红素的虹鳟着色(pigmentation)研究。虾青素、虾青素酯和虾红素均从虾仁中提取获得。将所述色素溶于鲱鱼油中，然后加到鳟鱼的食物中。分析鳟鱼的着色发现鱼肉和鱼皮之间无差别。喂饲由虾青素酯组成的食物的鱼比其它鱼含有的总虾青素的水平高得多。这说明虾青素酯对于虹鳟的着色更有效。然而，在同一专题会议上，Torrissen，O.和Brakkan，O.R.(Proc.World Symp.on Finfish Nutr.and FishfeedTechnology，Hamburg 20.-23.1978年6月，第II卷，Berlin 1979，第377-382页)也证明了，虾青素掺入到虹鳟鱼肉中。这些作者发现，虾青素比从桡足动物Calanus finmarchisus中纯化的二酯和单酯更有效地掺入鱼肉中。
按照O.J.Torrissen等，Reviews in Aquatic Sciences，第1卷，(1989)第209-225页(即Foss，P.等，Aquaculture，第65卷，(1987)，第293页和Storebakken，T.等，Aquaculture，第65卷，(1987)，第279页)，在虹鳟、海鳟和大西洋鲑鱼中，似乎合成的虾青素二酯(即二棕榈酸虾青素酯)比游离虾青素更难被吸收。
在甲壳纲动物中，较大部分虾青素以酯形式存在。然而，所述色素比根据游离虾青素水平所预期的更易吸收。在O.J.Torrissen等，Reviews in Aquatic Sciences，第1卷，(1989)第209-225页其推测性解释是在甲壳纲动物体内可能存在增强吸收的未鉴定化合物。
总之，因为认为虾青素在鱼肠中的吸收涉及游离虾青素(即二醇)，所以迄今主要认为用酯类喂饲比用游离虾青素喂饲的生物吸收更少。二棕榈酸虾青素酯的实验支持这一观点。
已知以二酯存在的虾青素比游离虾青素稳定(Omara-Alwala，T.R.等，J.Agric.Food Chem.，第33卷(1985)，第260页和Arai，S.等，Aquaculture，第66卷(1987)，第255页)。
在所述文献中，二棕榈酸酯是所研究的主要二酯，据报道比所述二醇着色效果差(Torrissen，O.和Brakkan，O.R.；Proc.World Symp.on Finfish Nutr.and Fishfeed Technology，Hamburg 20.-23.1978年6月，第II卷，Berlin 1979，第377-382页；Storebakken，T.等，Aquaculture，第65卷(1987)，第279页；Foss，P.等，Aquaculture，第65卷(1987)，第293页；Torrissen，O.J等，CRC Crit Rev.Aqua.Sci.第1卷(1989)，第209页)。其解释是所述二酯的水解程度低。
我们证实，利用市售脂酶(Candida rugosa)，42小时后二棕榈酸酯水解成40％游离虾青素。我们合成了几种其它二酯，以便研究这些二酯是否比二棕榈酸酯水解得快。实施例1表明，在相同实验条件下，反油酸(反式-C18∶1)的二酯水解程度更高(73％)，而短链羧酸(C10∶0)水解略慢，用包含约50％EPA(全顺式C20∶5 n3)和约35％DHA (全顺式C22∶5 n3)的ω-3脂肪酸的浓缩物(总共90％以上ω-3脂肪酸)(EPA+DHA)制备的二酯以低于二棕榈酸酯速度二分之一速率水解成游离虾青素。
为了证实利用市售脂酶获得的这些虾青素二酯的水解数据，利用从大西洋鲑鱼肠中分离的酶进行了另一个相似实验。这个实验令人惊奇地得到与使用市售脂酶的实验获得的数据相反的数据；即EPA+DHA二酯水解得最快，而二反油酸酯(dielaidate)和二棕榈酸酯水解得最慢(参见实施例2)。因此，本发明人最惊人的发现是如果得自鲑鱼肠的酶水解ω-3多不饱和脂肪酸浓缩物酯化的虾青素，与二棕榈酸酯比较，它令人惊奇地快速水解成游离虾青素。意想不到的是，短链羧酸(C10∶0)二酯也比二棕榈酸酯快得多地水解，即使其水解速度显著低于EPA+DHA二酯的水解。
根据这些意外的数据，本发明人发现，当喂饲鲑鱼时，虾青素EPA+DHA二酯最可能迅速地水解成游离虾青素，因此可使鲑鱼有效着色。在实施例3中，饲养实验证实这种观点是正确的。本发明人用类似方法发现，短链羧酸的虾青素二酯作为稳定性好和潜力大的色素，适用于鲑科鱼着色。
此外，本发明人意外地发现，EPA+DHA二酯包含可接受的稳定特性，适用于不用明胶或淀粉配制的工业化生产的饲料(参见实施例3)。这出乎人们所料，因为ω-3多不饱和脂肪酸是不稳定化合物。
在实施例3中，比较EPA+DHA二酯与市售游离虾青素制品(Carophyll Pink，Roche)的鲑鱼着色。最意想不到的是，按照鲑鱼鱼片(salmon fillet)虾青素摄入量的测定，发现喂饲EPA+DHA二酯的鱼的生物利用度比喂饲市售色素的鱼高41％。因此，与游离虾青素相比，用这种虾青素二酯饲养意外地使生物吸收增强。
本发明的一个主要目的是提供一种用于喂饲鲑科鱼的色素，所述色素比用于鲑科鱼的游离虾青素和市售色素更稳定并且生物有效性更好。
本发明的另一个目的是提供一种可以加入到饲料中的色素，所述色素的加入量比先前已知色素的量少，并且还得到令人满意的着色鱼片。
通过所附权利要求书达到这个目的和其它目的。
利用实施例进一步解释本发明。实施例1用以下羧酸制备虾青素的二酯反油酸(反式-C18∶1)、棕榈酸(C16∶0)、癸酸(C10∶0)和包含约50％二十碳五烯酸(EPA)(全顺式C20∶5n3)和约35％二十二碳六烯酸(DHA)(全顺式C22∶6 n3)的ω-3脂肪酸的浓缩物。不同的二酯首先用市售脂酶Candida rugosa(脂酶AY，30)水解。室温下42小时后，这种反应得到以下结果二酯游离虾青素(％)18∶1 7316∶0 4010∶0 30EPA+DHA 18这些结果表明，多不饱和脂肪酸的二酯比相应的饱和脂肪酸或单不饱和脂肪酸二酯水解得更慢。
根据这个实验，用ω-3浓缩物的酯化使得较慢水解成游离虾青素，因此人们就预测其生物摄入比所述文献介绍的二棕榈酸虾青素酯饲养实验低。
意想不到的是，在此EPA+DHA-二酯比其它二酯转化的游离虾青素多得多。45小时后，二反油酸酯和二棕榈酸酯的水解程度刚好1％，而二癸酸酯(didecanoate)的水解程度为6％，EPA+DHA二酯的水解程度为25％。这些结果最意想不到的是与实施例1中的结果相反。由此表明，当用或者ω-3脂肪酸浓缩物或者短链羧酸制备的虾青素二酯饲养时，可能将获得比用所述文献介绍的虾青素二酯实验达到的生物摄取更高的生物摄取。
以如上所述相同的方式，将市售虾青素(Carophyll Pink，Roche，以游离虾青素计算的30mg/kg)加入到鱼饲料。在这种市售制品中，未酯化的虾青素均匀地分散在包括淀粉(stach-covered)的明胶和糖类基质中。加入乙氧喹和棕榈酸抗坏血酸酯作为抗氧化剂。包括加入尿素，其工艺和原料与以上所述相同，只是鱼油不含抗坏血酸。生产后，所述颗粒中回收平均重量为25.0mg/kg的游离虾青素。生产了数批这种饲料组合物。详细的分析数据在以下计算中给出。
将两种饲料组合物给予鲑鱼。开始鲑鱼的平均重量为70g。在随后的计算中，我们不包括在开始喂饲之前的鱼色素含量。对于两组数值均相同，所述数值非常小，它们对所述结论不会有影响。
8个月后，用虾青素二酯喂饲的鱼，每组20条鱼的平均重量为1180g，而用市售色素喂饲的鱼，每组20条鱼的平均重量为1153g。所述二酯喂饲鱼鱼片的平均虾青素含量为3.34mg/g，市售色素喂饲鱼鱼片的平均虾青素含量为3.23mg/g。如果我们假定鱼重量中鱼肉占70％，则虾青素含量平均值如下用虾青素二酯喂饲的鱼1.180kg/条鱼×0.70×3.34mg/kg＝2.76mg用市售虾青素喂饲的鱼1.153kg/条鱼×0.70×3.23mg/kg＝2.61mg用虾青素二酯喂饲的鱼接受以下饲料457.4kg含有18.4mg/kg ＝8416mg97.6kg含有17.1mg/kg ＝1669mg32.6kg含有17.9mg/kg ＝584mg总计 ＝10669mg除以研究期间的鱼平均数，每条鱼的接受量为10669mg/762 ＝14.00mg虾青素这得出生物利用度为100％×2.76mg/14.00mg ＝19.7％。
用市售虾青素喂饲的鱼接受以下饲料463.2kg含有25.0mg/kg ＝11580mg101,0kg含有24.8mg/kg ＝2505mg32.5kg含有30.0mg/kg ＝976mg总计 ＝15061mg除以研究期间的鱼平均数，每条鱼的接受量为
15601mg/775 ＝20.13mg虾青素这得出生物利用度为100×2.61/20.13 ＝13.0％。
因此，与游离虾青素相比，用ACD喂饲意外地实现增强生物吸收。
准确称量虾青素二酯(约40mg，33mmol)与2.5g chremophor EL乳化剂(BASF生产)，加入100ml锥形瓶中。剧烈搅拌溶液20分钟(直至均一)，然后加入20ml Tris缓冲液，再搅拌10分钟。将所述溶液抽吸过滤，将红色滤液倾至25ml容量瓶中，然后用缓冲液稀释至所述刻度。分光光度法(492nm)测定所有溶液的浓度为约1mg/ml，例外的是测得双乙酸酯(diacetate)的浓度较低。用铝箔包裹后冰箱保藏所有溶液。分离粗制酶混合物从本地养鱼场获取最后12个小时喂饲的新鲜鲑鱼和虹鳟。在实验室中，将所述新鲜鱼剖开，如下提取粗制酶混合物自消化线(digestion line)有许多脂肪组织包围的狭管(narrow tubes)。切除全部狭管，用手放入冷却容器。用0.25M Tris缓冲液，将粘性溶液(约50ml)稀释至100ml，在冰浴中搅拌30分钟。下一步是在4℃以11,000rpm离心20分钟(Du Pont的RC5C)。用移液管吸出水层放入另一个玻璃离心管中，在4℃以18,000rpm再次离心30分钟。将水层转移至锥形瓶中，用液氮使其快速冷冻。开始反应之前，将混合物解冻，然后在4℃以27,000rpm超速离心45分钟(最高157,000g)进行纯化。得到澄清黄色溶液的脂酶制备物。水解将2ml储备液和3ml鱼肠粗制酶混合物加入到10ml圆底烧瓶中。用氮气充满烧瓶，然后密封，用铝箔包裹，然后搅拌48小时。结束时减压(0.01 Torr)去除全部水分，然后再溶于CH2Cl2中。溶液通过棉绒塞过滤，贮存于密封容器的氮气下。用5％丙酮的CH2Cl2作为洗脱液，使用分析型TLC监测反应进程(二醇(Rf＝0.0-0.1)、单酯(Rf＝0.3-0.5)、二酯(Rf＝0.8-0.9))。为了确定水解程度，将所有样品都进样到分析型HPLC中。[洗脱液30％丙酮的正己烷，在子Nucleosil50-5(2×30cm)柱子，流速0.15ml/分钟，检测器470nm(二醇Rf＝0.4-0.5，单酯Rf＝0.7，二酯Rf＝0.9-1.0)]。
用以下羧酸酯化虾青素制备用于水解的二酯乙酸、C16∶0(棕榈酸)、富含ω-3脂肪酸的鱼油脂肪酸(约18％EPA和12％DHA，在下表中称为K30)、ω-3脂肪酸浓缩物(约30％EPA和20％DHA，在下表中称为K55)、与实施例2中所用相同的EPA和DHA的浓缩物(约50％EPA和35％DHA，在下表中称为ACD)、纯化EPA(95％以上EPA，在表中称为EPA)和纯化DHA(95％以上DHA，在表中称为DHA)。
表1显示用得自鲑鱼肠的粗制酶混合物水解48小时后的水解程度。
48小时后，棕榈酸(16∶0)虾青素二酯无游离虾青素产生。然而，现有技术已知这种二酯在鲑鱼体内水解，使鲑鱼体内的色素水平增加。因此，这种结果表明，所述粗制酶制剂不是处于最佳条件下，推测是由于可以降解所需酶的蛋白酶所致。
与虾青素和棕榈酸的二酯相比，所有其它ω-3脂肪酸或短链羧酸(乙酸酯)二酯使得更多的二酯水解成二醇，因此预期鲑鱼体内可摄取更多的色素。
观察到二酯ACD的水解程度最高(9％)。游离虾青素的相对量是较低浓缩度鱼油二酯(K30)的3倍。所述结果还表明，纯化EPA二酯比DHA二酯水解快。然而，意想不到的是称为ACD的EPA和DHA的浓缩物比纯化EPA水解快。乙酸二酯水解产生7％游离虾青素。然而，应该注意的是，反应结束时乙酸二酯化合物只有13％仍为二酯。这比所测试的其它制品低得多，说明如果延长反应时间，则可从这种二酯获得大量游离虾青素。同样，仅27％EPA二酯未反应。因此，预期在体内条件下所述二酯可以比表1证实的水解成游离虾青素的程度更高。
参阅表2中的游离虾青素相对量就可证实这些结果。这里，与棕榈酸二酯只有11％相比，ACD的结果最高，具有27％游离虾青素。下表1和表2结果支持的结论是养殖鱼生物摄入ω-3酸浓缩物虾青素二酯或者短链羧酸虾青素二酯比所述文献描述的虾青素二酯实验的生物摄入高。表1.用得自鲑鱼肠的粗制酶混合物水解48小时后，虾青素二酯、单酯和二醇之间的比例(％)
表2.用得自虹鳟肠的粗制酶混合物水解48小时后，虾青素二酯、单酯和二醇之间的比例(％)
实施例3中用以制备虾青素二酯的包含约50％二十碳五烯酸(EPA)和约35％二十二碳六烯酸(DHA)的ω-3脂肪酸浓缩物(总计90％以上的ω-3脂肪酸)，只是一个实例，不应认为是用来限制本发明。本领域技术人员知道，其它ω-3脂肪酸浓缩物例如含有90％以下ω-3脂肪酸的浓缩物，可以用来制备虾青素二酯，而得到的结果与所述实施例所示结果相似。本发明包括用得自含有ω-3羧酸的海洋鱼油的羧酸酯化的虾青素二酯或用包含总量为18-100％、优选为40-100％的EPA和DHA的ω-3脂肪酸浓缩物制备的虾青素二酯。更准确地说，本发明包括用包含8-98％、优选为25-98％的EPA和8-98％、优选为15-98％的DHA的ω-3脂肪酸浓缩物制备的虾青素二酯。
实施例2证实，使用鲑鱼肠的酶时短链羧酸二酯也比棕榈酸二酯更快地水解产生游离虾青素。因此，与市售色素制剂相比，这样的二酯也适合用作稳定性高及生物摄入增加的色素。在实施例2中，我们使用了癸酸，其它短链羧酸应是链长度C1-C12的羧酸。对于本领域技术人员而言，显而易见的是这些酸既可以是饱和酸又可是不饱和酸。
此外，本领域技术人员知道，可以用与市售虾青素色素相同的方法稳定本发明的虾青素二酯，即利用明胶-基质的方式。用于本发明色素的相对于色素量的明胶-基质量可以比稳定市售色素所需的量少。此外，本发明的色素可用抗氧化剂和/或尿素稳定，见我们的挪威专利申请号19983050介绍。
本领域技术人员显而易见的是，虾青素的脂肪酸二酯比游离虾青素脂溶性好。当然，这是本发明的一个优势，因为虾青素的脂肪酸二酯更易配制在富含脂肪的鱼饲料中。
虾青素可以从微生物源产生。具有前景的微生物虾青素源的典型实例是酵母Phalli rhodoxyma和藻类Haematococcus pluvialis。Phallirhodozyma具有游离形式的虾青素，而Haematococcus pluvialis虾青素主要(87％)以二酯存在(Johnson，E.A.和An，G-H.1991，微生物来源的虾青素，Crit.Rev.Biotechnol.11(4)297)。对于本领域技术人员显而易见的是，根据本发明通过选择微生物菌株和/或用合适脂肪酸或这类脂肪酸的前体培养、或者通过选择其它合适发酵条件使得产生的虾青素二酯含有ω-3脂肪酸和/或短链羧酸，从而可以获得微生物来源的生物利用度增加的虾青素二酯。
权利要求
1.一种包含用羧酸制备的虾青素二酯的色素，其特征在于所述羧酸是ω-3脂肪酸和/或1-12个碳原子的羧酸。
2.按照权利要求1的色素，其中所述ω-3脂肪酸包含总量为18-100％的二十碳五烯酸(EPA)(全顺式C20∶5 n3)和/或二十二碳六烯酸(DHA)(全顺式C22∶6 n3)。
3.按照权利要求1的色素，其中所述ω-3脂肪酸包含总量为40-100％的二十碳五烯酸(EPA)(全顺式C20∶5 n3)和/或二十二碳六烯酸(DHA)(全顺式C22∶6 n3)。
4.按照权利要求1的色素，其中所述ω-3脂肪酸包含8-98％的二十碳五烯酸(EPA)(全顺式C20∶5 n3)和/或8-98％的二十二碳六烯酸(DHA)(全顺式C22∶6 n3)。
5.按照权利要求1的色素，其中所述ω-3脂肪酸包含25-98％的二十碳五烯酸(EPA)(全顺式C20∶5 n3)和/或15-98％的二十二碳六烯酸(DHA)(全顺式C22∶6 n3)。
6.按照权利要求1的色素，其中所述ω-3脂肪酸包含约50％二十碳五烯酸(EPA)(全顺式C20∶5 n3)和约35％二十二碳六烯酸(DHA)(全顺式C22∶6 n3)。
7.一种用于鲑科鱼的饲料，该饲料包含25-70％(重量)蛋白质、5-60％(重量)脂类和0-40％(重量)糖类以及色素和0-15％(重量)的一种或多种其它组分；所述其它组分例如填充剂、粘合剂、防腐剂、维生素和无机物，其中所述色素是用ω-3脂肪酸和/或短链羧酸制备的虾青素二酯。
8.按照权利要求7的饲料，其中所述ω-3脂肪酸包含总量为18-100％的二十碳五烯酸(EPA)(全顺式C20∶5 n3)和/或二十二碳六烯酸(DHA)(全顺式C22∶6 n3)。
9.按照权利要求7的饲料，其中所述ω-3脂肪酸包含总量为40-100％的二十碳五烯酸(EPA)(全顺式C20∶5 n3)和/或二十二碳六烯酸(DHA)(全顺式C22∶6 n3)。
10.按照权利要求7的饲料，其中所述ω-3脂肪酸包含8-98％的二十碳五烯酸(EPA)(全顺式C20∶5 n3)和/或8-98％的二十二碳六烯酸(DHA)(全顺式C22∶6 n3)。
11.按照权利要求7的饲料，其中所述ω-3脂肪酸包含25-98％的二十碳五烯酸(EPA)(全顺式C20∶5 n3)和/或15-98％的二十二碳六烯酸(DHA)(全顺式C22∶6 n3)。
12.按照权利要求7的饲料，其中所述ω-3脂肪酸包含约50％二十碳五烯酸(EPA)(全顺式C20∶5 n3)和约35％二十二碳六烯酸(DHA)(全顺式C22∶6 n3)。
13.用ω-3脂肪酸和/或短链羧酸制备的虾青素二酯的用途，所述虾青素二酯用于鲑科鱼的着色。
14.用ω-3脂肪酸和/或短链羧酸制备的虾青素二酯的用途，所述虾青素二酯用作鲑科鱼饲料的色素。
全文摘要
本发明涉及用于鲑科鱼饲料的新型色素、包含这种色素的新型饲料及这种色素的用途。所述色素包含用ω－3脂肪酸和/或短链羧酸制备的虾青素二酯。本发明提供比游离虾青素和市售虾青素制品更稳定而且生物学上更有效、用于鲑科鱼饲料的色素。
文档编号C09B61/00GK1355675SQ00809058
公开日2002年6月26日 申请日期2000年4月17日 优先权日1999年4月19日
发明者H·布雷维克, L·I·桑纳, B·A·阿尔尼森 申请人:挪威海德罗公开有限公司