一种以纳米线为载体的复合荧光探针的制备方法及应用与流程

1.本发明涉及无机荧光材料领域，生物小分子的分析检测领域，具体地说，涉及一种以纳米线为载体的复合荧光探针的制备方法以及利用该探针对溶液中多巴胺的荧光检测方法。


背景技术：

2.多巴胺(da)是一种在哺乳动物的神经组织和肾上腺中合成的单胺，作为一种重要的神经递质，参与调控中枢神经系统的多种生理功能，由下丘脑和垂体腺分泌，是大脑功能的物质基础。如果多巴胺系统调节出现障碍，会导致其含量偏离正常分泌水平，引起帕金森病、阿尔兹海默症、精神分裂症等疾病的发生。因此，发展一种多巴胺高灵敏度的检测方法对于生物医学具有重要意义。
3.近年来报道的检测da方法有液相色谱法、毛细管电泳法、电化学分析法等。然而，这些方法通常需要较长的分析时间和昂贵的测试仪器。稀土配位聚合物(ln cps) 由于具有独特的光学性能，例如大的stokes位移、窄的辐射带、长的荧光寿命和良好的生物相容性，作为荧光探针已经被成功地应用于各种金属离子、阴离子以及生物分子的检测中。碳量子点(cds)是是近年来被公认的发光材料的新兴候选者，不仅具有类似于传统量子点的发光性能与小尺寸(小于10nm)等特性，还具有水溶性好、生物毒性低、易于表面修饰和导电性能好等优势。此外，羟基磷灰石(hap)是脊椎动物骨骼和牙齿的主要无机成分，无毒无污染，耐高温，具有优异的生物相容性、生物活性、独特的多孔结构、较大的比表面积、丰富的表面吸附点以及稳定的物理性能，可以作为良好的载体。
4.有鉴于此，有必要提供一种测定多巴胺检测过程便捷、结果准确的比率型稀土荧光探针，以解决多巴胺检测分析时间长、选择性差、设备昂贵的技术难题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，解决碳量子点无法有效地负载于稀土配位聚合物材料上，形成比率型稀土荧光探针的难题。本发明制备的一种以纳米线为载体的复合荧光探针分别将单荧光信号探针碳量子点与稀土配位聚合物发在负载于羟基磷灰石纳米线表面，形成比率型稀土荧光探针。利用以纳米线为载体的复合荧光探针实现对低浓度多巴胺的检测，检测过程便捷，结果准确。
6.本发明的第一个方面提供了一种以纳米线为载体的复合荧光探针的制备方法，包括下述步骤：
7.将羟基磷灰石纳米线(hapnws)水溶液、硝酸铽(tb(no3)3·
6h2o)水溶液、均苯三甲酸(h3btc)乙醇溶液分散于去离子水中，羟基磷灰石纳米线、硝酸铽、均苯三甲酸的质量比为(3～6):(1～4):(0.5～2)，震荡20～30min后静置反应过夜，得到白色沉淀(hapnws-tb/mof)。然后将hapnws-tb/mof溶液和碳量子点(cds)溶液分散于去离子水中，hapnws-tb/mof和碳量子点的质量比为(4～6):(0.5～1.5)，摇床震荡过夜，得到所述以纳米线为载体的复
合荧光探针溶液hapnws-cds-tb/mof。
8.所述羟基磷灰石纳米线(hapnws)水溶液的浓度为30～60mg ml-1
，优选为50 mg ml-1
。
9.所述硝酸铽(tb(no3)3·
6h2o)水溶液的浓度为80～120mm，优选为100mm。
10.所述均苯三甲酸(h3btc)乙醇溶液的浓度为80～120mm，优选为100mm。
11.所述hapnws-tb/mof溶液的浓度为80～100mg ml-1
，优选为90mg ml-1
。
12.所述碳量子点(cds)溶液的浓度为16～20mg ml-1
，优选为18mg ml-1
。
13.所述羟基磷灰石纳米线(hapnws)、硝酸铽(tb(no3)3·
6h2o)、均苯三甲酸 (h3btc)的质量比为4.78:2.16:1。
14.所述hapnws-tb/mof和碳量子点的质量比为5:1。
15.所述cds溶液的制备方法包括以下步骤：称取540mg碳量子点分散于2ml去离子水中，室温下摇晃充分溶解备用，获得所述cds溶液。
16.所述碳量子点的制备方法包括以下步骤：称取甘氨酸溶于去离子水和乙二醇的混合溶液中，甘氨酸、去离子水、乙二醇的质量为1:30:22，室温下超声至完全溶解，将所得到的溶液转移到不锈钢高压反应釜中，180℃条件下反应12h后得到棕色液体，冷却到室温，将所得溶液转移到500mwc透析袋中，透析袋置于盛满去离子水的3000ml烧杯中，每隔6h换一次水，共透析24h，将透析液通过45℃水浴旋转蒸发，冻干，氮气吹干浓缩，得到cds。
17.所述hapnws的制备方法包括以下步骤：称取油酸溶于去离子水和甲醇的混合溶液中，油酸、去离子水、甲醇的质量比为9.36:4.75:13.5，室温下机械搅拌混合，将16.1g质量分数为6.5％的naoh溶液加入到上述混合物中，继续搅拌30min，然后将12.3g质量分数为2.7％的cacl2溶液和18.9g质量分数为5.0％的 nah2po4·
2h2o溶液加入到上述混合溶液中，将所得到的溶液转移到不锈钢高压反应釜中，180℃条件下反应24h，冷却到室温，离心分离所得沉淀，依次用无水乙醇和去离子水洗涤，得到hapnws。
18.本发明的第二个方面提供了一种所述制备的以纳米线为载体的复合荧光探针溶液在多巴胺检测中的应用，包括以下步骤：
19.将所述制备的以纳米线为载体的复合荧光探针溶液中加入da溶液，然后滴加 n-2-羟乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸(hepes)缓冲液，所述比率型稀土荧光探针溶液(浓度是 0.7～1g l-1
，优选为0.8g l-1
)、da溶液、n-2-羟乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸(hepes)缓冲液的体积比为(0.5～2):(0.5～2):(1～4)，反应富集5min后检测da浓度。
20.所述da溶液的浓度为0～360μm。
21.所述n-2-羟乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸(hepes)缓冲液的浓度为10～40mm，优选为 25mm，ph为6～10。
22.由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：
23.本发明制备的以纳米线为载体的复合荧光探针对多巴胺的检测具有稀土荧光探针stokes位移大、辐射带窄和荧光寿命长的光物理性能，碳量子点低毒性和高发光强度的性能以及羟基磷灰石纳米线高比表面积的特性与优势。
24.本发明制备的以纳米线为载体的复合荧光探针建立对多巴胺的检测方法，相对于液相色谱和电化学等方法，具有检测限低、前处理简单、易于操作和检测成本低等优势。
附图说明
25.图1为本发明实施例制备的以纳米线为载体的复合荧光探针 (hapnws-cds-tb/mof)溶液的透射电镜图(20nm)。
26.图2为本发明实施例制备的以纳米线为载体的复合荧光探针 (hapnws-cds-tb/mof)溶液的透射电镜局部放大图(20nm)。
27.图3为本发明实施例制备的以纳米线为载体的复合荧光探针 (hapnws-cds-tb/mof)溶液的扫描电镜图(100nm)。
28.图4为本发明实施例制备的以纳米线为载体的复合荧光探针 (hapnws-cds-tb/mof)溶液的傅里叶变换红外光谱图。
29.图5为本发明实施例制备的以纳米线为载体的复合荧光探针 (hapnws-cds-tb/mof)溶液的紫外-可见光谱图。
30.图6为本发明实施例制备的以纳米线为载体的复合荧光探针 (hapnws-cds-tb/mof)溶液的x射线能谱图。
31.图7为本发明实施例制备的以纳米线为载体的复合荧光探针 (hapnws-cds-tb/mof)溶液的荧光寿命图。
32.图8为本发明实施例制备的以纳米线为载体的复合荧光探针 (hapnws-cds-tb/mof)溶液在不同ph条件下荧光强度的折线图。
33.图9为本发明实施例制备的以纳米线为载体的复合荧光探针 (hapnws-cds-tb/mof)溶液在不同反应时间下荧光强度的折线图。
34.图10为本发明实施例制备的以纳米线为载体的复合荧光探针(hapnws-cds-tb/mof)溶液对da选择性对比图。
35.图11为本发明实施例制备的以纳米线为载体的复合荧光探针 (hapnws-cds-tb/mof)溶液的多巴胺滴定荧光光谱图。
36.图12为本发明实施例制备的以纳米线为载体的复合荧光探针 (hapnws-cds-tb/mof)溶液的多巴胺滴定标准曲线图。
具体实施方式
37.以下提供本发明一种以纳米线为载体的复合荧光探针的制备方法与应用的具体实施方式：
38.实施例1
39.甘氨酸(gly)、乙二醇、硝酸铽(tb(no3)3·
6h2o，99.99％)、均苯三甲酸(h3btc)、 n-2-羟乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸(hepes)购自上海麦克林生化科技有限公司。葡萄糖 (glu)、尿素(ua)、nah2po4·
2h2o、金属盐(alcl3，cucl2，nacl，kcl，cacl2)购自上海凌峰化学试剂有限公司。多巴胺(da)、抗坏血酸(aa)、谷氨酸(glc)、组氨酸(his)、酪氨酸(tyr)、天冬氨酸(asp)、精氨酸(arg)、缬氨酸(val)、油酸(oa)购自阿拉丁化学试剂有限公司。通过milli-q装置(millipore，bedford，ma，usa)制备超纯水。
40.第一步，称取500mg甘氨酸溶于25ml的混合溶液(去离子水：乙二醇＝15ml： 10ml)中，室温下超声至完全溶解，得到透明状液体。然后将所得溶液转移至250ml 聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，在180℃条件下反应12h，反应结束后，冷却至室温，得到棕色液
体。将所得溶液转移到500mwc透析袋中，透析袋置于盛满去离子水的3000ml烧杯中，每隔6h换一次水，共透析24h，将透析液通过45℃水浴旋转蒸发，冻干，氮气吹干浓缩，得到cds。
41.第二步，称取4.68g油酸、2.38g甲醇和6.75g去离子水，在机械搅拌下将它们混合。将8.05g naoh溶液(6.5wt％)加入上述混合物中，搅拌30min。随后，加入6.15g cacl2溶液(2.7wt％)和9.45g nah2po4·
2h2o溶液(5.0wt％)，继续搅拌30 min。将得到的混合溶液转移到聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，在180℃条件下反应24h。反应结束后，冷却至室温，通过离心收集产物，依次用无水乙醇和去离子水洗涤3次，分散在去离子水中以供进一步使用。
42.第三步，将226.5mg硝酸铽(tb(no3)3)溶于5ml去离子水中，105mg均苯三甲酸(h3btc)溶于5ml乙醇中，将上述溶液加入到含200mg hapnws的水溶液(20 ml)中，在室温下反应过夜，得到白色沉淀。然后，将2ml浓度为18mg ml-1
的 cds溶液和白色沉淀溶液混合，室温下搅拌30min，通过离心收集产物，用去离子水洗涤3次，得到hapnws-cds-tb/mof，分散在去离子水中以供进一步使用。
43.如图1、图2和图3所示，图1是本发明实施例制备的以纳米线为载体的复合荧光探针(hapnws-cds-tb/mof)溶液的透射电镜图(20nm)；图2是本发明实施例制备的以纳米线为载体的复合荧光探针(hapnws-cds-tb/mof)溶液的透射电镜局部放大图(20nm)；图3是本发明实施例制备的以纳米线为载体的复合荧光探针 (hapnws-cds-tb/mof)溶液的扫描电镜图(100nm)。从图中可以看出tb-mof纳米材料通过原位生长嵌入到hapnws中，原本的棒状结构形成纺丝状结构，在 hapnws的表面有大量的点分散装饰，表明，cds已成功在hapnws上修饰。同时，ft-ir也用于进一步表征hapnws-cds-tb/mof的形成。如图4所示，图4是本发明实施例制备的以纳米线为载体的复合荧光探针(hapnws-cds-tb/mof)溶液的傅里叶变换红外光谱图。图中a是tb-mof的红外光谱图，b是cds的红外光谱图，c是hapnws的红外光谱图，图d是hapnws-cds-tb/mof探针的红外光谱图。1700-1300cm-1
处的吸收峰是coo-的不对称和对称拉伸振动(a,d)，表明羧基中的氢已被取代，配体已与tb
3+
连接。在1072.47cm-1
处的吸收峰归因于po
43-的拉伸振动(d)。hapnws-cd-tb/mof与tb-mof相比，相应峰的波数没有明显变化，表明cds主要局限于网络结构内，对tb
3+
与配体的配位没有显著影响。
44.为了进一步证实hapnws-cd-tb/mof探针的形成，研究了不同条件下的紫外
ꢀ‑
可见吸收光谱。如图5所示，图5是本发明实施例制备的以纳米线为载体的复合荧光探针(hapnws-cds-tb/mof)溶液的紫外-可见光谱图。图中a是cds的紫外-可见光谱图，b是tb-mof的紫外-可见光谱图，c是hapnws@cds-tb/mof的紫外
‑ꢀ
可见光谱图，d是加入da后hapnws@cds-tb/mof的紫外-可见光谱图。cds在 280nm和350nm处有两个弱吸收，这是由于cds中c＝c、c＝n和c＝o的n-π*跃迁(a)。在235nm、250nm和270nm处的吸收量均属tb-mof(b,c)。 hapnws-cd-tb/mof在280nm和350nm处的吸光度减弱，表明cds已成功封装在tb-mof纺丝中，从而屏蔽了cds的吸收(c)。当加入da时，在235nm、250nm 和270nm处的吸收峰均发生红移，合并为244nm和277nm，表明da与探针中的 tb
3+
相互作用(d)。
45.如图6所示，图6是本发明实施例制备的以纳米线为载体的复合荧光探针 (hapnws-cds-tb/mof)溶液的x射线能谱图。hapnws主要由c、o、na、p、 ca元素组成，tb-mof嵌入后，tb元素的含量大幅增加，达到41.01wt％。探针荧光寿命的变化也可以进一步说明探针与da之间的相互作用。图7是本发明实施例制备的以纳米线为载体的复合荧光探针
(hapnws-cds-tb/mof)溶液的荧光寿命图。图中a是hapnws-cds-tb/mof在426nm处的荧光寿命图，b是 hapnws-cds-tb/mof在543nm处的荧光寿命图，c是加入da后的 hapnws-cds-tb/mof+da在426nm处的荧光寿命图，d是加入da后的 hapnws-cds-tb/mof+da在543nm处的荧光寿命图。随着da的加入，探针中 cds的荧光寿命在426nm处从11.97ns增加到15.74ns。当cds吸收具有能量的光子时，它们的表面会产生相应的电子空穴对，多巴胺被氧化为醌后，可以与它们相互作用，改变电子和空穴的重组动力学，进而改变荧光寿命。通过斯特恩-沃尔默方程计算，在426nm处荧光猝灭的猝灭常数为2.3
×
10
14
m-1
·
s-1
。tb
3+
的荧光寿命从 312.63μs增加到573.06μs。荧光物质的荧光寿命与其结构和微环境有关，因此推测 tb
3+
离子周围的配位和环境发生了变化，水分子被da取代，减少了碰撞猝灭效应，同时产生了从da分子到tb
3+
离子的有效能量转移。
46.第四步，将1ml第三步制备的以纳米线为载体的复合荧光探针 (hapnws-cds-tb/mof)溶液置于10组5ml离心管中(每个离心管中放入1ml以纳米线为载体的复合荧光探针(hapnws-cds-tb/mof))，每一个离心管中加入1ml 浓度为20μm的da溶液(da溶于去离子水中形成浓度为1mm的溶液，然后稀释到所需浓度)，然后1-10组分别滴加ph为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的hepes缓冲溶液至4ml，反应3min后，利用荧光光谱仪测定其在426nm和543nm 处的荧光强度。
47.图8是本发明实施例制备的以纳米线为载体的复合荧光探针 (hapnws-cds-tb/mof)溶液在不同ph条件下荧光强度的折线图。图中，a是以纳米线为载体的复合荧光探针(hapnws-cds-tb/mof)加入da后在不同ph条件下荧光强度的折线图；b是hapnws-cds-tb/mof探针溶液在不同ph条件下荧光强度的折线图。图9是本发明实施例制备的以纳米线为载体的复合荧光探针(hapnws-cds-tb/mof)溶液在不同反应时间下荧光强度的折线图。图中，a是以纳米线为载体的复合荧光探针(hapnws-cds-tb/mof)加入da后在不同反应时间下荧光强度的折线图；b是hapnws-cds-tb/mof探针溶液在不同反应时间下荧光强度的折线图。图10是本发明实施例制备的以纳米线为载体的复合荧光探针 (hapnws-cds-tb/mof)溶液对da选择性对比图。图1～10说明制备稀土荧光探针的结构组成以及对多巴胺的检测作用。
48.应用例1
49.实施例1制备的以纳米线为载体的复合荧光探针(hapnws-cds-tb/mof)溶液对超纯水中不同浓度多巴胺的荧光滴定：
50.量取1ml实施例1第三步制备的以纳米线为载体的复合荧光探针 (hapnws-cds-tb/mof)溶液于11组5ml离心管中(一个离心管中放入1ml以纳米线为载体的复合荧光探针(hapnws-cds-tb/mof))，分别加入1ml不同浓度的 da溶液，da浓度依次为0、0.04、0.15、0.3、1、1.5、3、8、10、15、20μm，然后分别滴加浓度为25mm、ph＝8.0的hepes缓冲溶液至4ml，反应3min后，利用荧光光谱仪测定其在426nm和543nm处的荧光强度。
51.结果如图11和图12所示，图11是本发明实施例制备的以纳米线为载体的复合荧光探针(hapnws-cds-tb/mof)溶液的多巴胺滴定荧光光谱图，荧光光谱仪的参数如下：激发波长300nm，发射波长350～700nm。图12是本发明实施例制备的以纳米线为载体的复合荧光探针(hapnws-cds-tb/mof)溶液的多巴胺滴定标准曲线图，图12中荧光强度比值(i
543
/i
426
)和多巴胺浓度的标准曲线图，其线性关系为 y＝0.0257x+1.38762，其相关系数r2为0.9979。图11和图12说明了利用稀土荧光探针可以进一步说明对多巴胺溶液的检测作用。
52.应用例2
53.实施例1制备的以纳米线为载体的复合荧光探针(hapnws-cds-tb/mof)溶液对人血清中多巴胺的加标回收荧光滴定：
54.以人血清为真实样本，按照不同浓度加入da标准溶液，将血清样本与配制好的10％的三氯乙酸按体积比为1:4的比例混合、摇匀，静置于4℃冰箱中24h。然后，在离心机中以8000rpm的转速离心20min，离心后，用医用注射器取出上清液，并经0.45μm的有机相微孔过滤膜过滤，所得的上清液即为脱蛋白的血清样品。将该样品置于4℃冰箱中保存备用。用hepes缓冲液稀释100倍。
55.量取1ml实施例1第三步制备的以纳米线为载体的复合荧光探针 (hapnws-cds-tb/mof)溶液于7组5ml离心管中(一个离心管中放入1ml以纳米线为载体的复合荧光探针(hapnws-cds-tb/mof))，分别加入1ml实际样品(加入 da的浓度分别为0,0.9,2,4,8,14,19μm)，然后分别滴加浓度为25mm、ph＝8.0 的hepes缓冲溶液至4ml，反应3min后，利用荧光光谱仪测定其在426nm和543 nm处的荧光强度。
56.结果见表1，分析结果表明，da的回收率为100.8～104.1％，说明稀土荧光探针对生物样品中da的检测具有一定的实用性和可靠性。
57.表1本发明实施例制备的以纳米线为载体的复合荧光探针 (hapnws-cds-tb/mof)溶液对人血清中多巴胺的加标回收结果
[0058][0059]
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。