一种用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针、荧标试剂盒以及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞内糖链抗原活检技术领域，尤其是一种用于细胞内糖链抗原活检 的双光子荧光探针、荧标试剂盒以及检测方法。
【背景技术】
[0002] 糖链抗原（Carbohydrateantigen19-9，CA19-9)是一种与胰腺癌、胆囊癌、 结肠癌和胃癌相关的肿瘤标识物，其单克隆抗体为1116NS19-9,简称Abl9-9 ;糖链抗原 (Carbohydrateantigen125,CA125)是一种与卵巢癌、输卵管腺癌、子宫内膜癌和宫颈癌 相关的肿瘤标识物，其单克隆抗体为0C125,简称Abl25。CA19-9测定广泛用于结肠直肠癌 胃癌、胰癌、肝细胞癌肺癌、乳癌的临床监测与诊断；而CA125测定则广泛用于卵巢癌、输卵 管腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌和乳腺癌的临床监测与诊断。
[0003] 因此，对于检测体内糖链抗原需要一种快速、专一、可靠的检测方法，并且这种快 速、专一、可靠的检测方法也是早期肿瘤或癌症的诊断和预警的有效途径之一。现有技术 中，对于糖链抗原的检测，其采用的方法较多，但由于这些方法的灵敏度和稳定性较差，并 且在进行检测操作时较为繁琐，检测的试样仅限于血液与外周血，进而逐步在糖链抗原检 测领域受到了局限性，造成早期肿瘤或癌症的诊断和预警的结果不理想。
[0004] 免疫荧光法，其特异性强、灵敏度高、速度快，与放射免疫法相比，无放射污染，操 作简便；由于单光子荧光激发波长一般在350~560nm，易产生光致毒与光漂白；因此，在 免疫荧光法中得到较大程度应用的是双光子荧光。但是，将双光子荧光应用于肿瘤或者癌 症标志物的糖链抗原的活检，还未见有任何文献报道。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种用于细胞内糖链抗原 活检的双光子荧光探针、荧标试剂盒以及检测方法。
[0006] 双光子荧光采用800~llOOnm的高强度激光作为激发光源，不仅能克服单光子 荧光的缺点，还能实现深层暗场成像与定点激发，避免组织自发荧光干扰以及降低组织吸 光系数，从而显著地提高成像的清晰度、检测的灵敏度与分辨率。
[0007]本发明以[MoralesAR,YanezCO,Schafer-HalesKJ,MarcusAI,Belfield KD.Biomoleculelabelingandimagingwithanewfluorenyltwo-photonfluorescent probe.BioconjugateChem. ,2009, 20:1992 - 2000]为参考文献，将该文献中制备的双光子 荧光探针LP标记抗-糖链抗原单克隆抗体-IgG，并将其借助免疫特异性亲合识别原理与双 光子诱导荧光机制实现肿瘤标志物糖链抗原的实时动态活检。
[0008] 其中双光子荧光探针LP的合成步骤以及合成过程是按照上述的参考文献进行合 成，其中的反应的分子结构式为：
[0009]
[0010] 其中得出的双光子荧光探针LP为黄色固体物质（m.p. 217~218°C)。 lHNMR(500MHz，CDC13)δ:8. 134(dd，6H，Ph-H)，7.933(d，2H，Ph-H)，7.721(t，6H，4H，CH= CH，and4H，Ph-H)，7. 615(s，2H，Ph-H)，7. 584(d，2H，Ph-H)，7. 521(t，2H，Ph-H)，7. 413(t， 2H，Ph-H)，7. 335(m，4H，Ph-H)，3. 232(m，7H，0CH2,CH3)，2. 884(t，2H，0CH2)，2. 765(s， 4H，CH2)，2.581 (m，4H，CH2)，1.953 (m，2H，CH2)。13CNMR(125MHz，CDC13)δ:170. 545(C =0)，167. 416 (Ar-C=N)，157. 103, 154. 175, 149. 362,140. 854, 140. 513, 137. 075， 135. 014, 132. 236, 131. 352, 128. 264, 127. 853,127. 317, 123. 425, 122. 971，121. 773， 71. 852,69. 921，58. 764,55. 735,52. 606,48. 344,34. 236,26. 224,25. 382。元素分析（％， C55H45N306S2 计算值）：C72. 71 (72. 74)，Η5· 06 (4· 99)，Ν4· 68 (4· 63)，0 10. 53 (10. 57)， S7· 01 (7· 06);HRMS(El) (C55H45N306S2 计算值），m/z:907. 2753 (907. 2750)。
[0011] 本发明的技术方案主要是将结构式为：
[0012]
的双光f灾尤称记採针LP用t细Μ円椐鮏沉原沽恆。
[0013] 其在用于细胞内糖链抗原活检的过程中包括有直接法和间接法，直接法是将抗原 采用稀释缓冲液稀释至一定的浓度；再将稀释好的抗原滴加在固相载体上，以封闭缓冲液 覆盖无抗原的区域，进而避免荧光指示剂的非特异性吸附；再将双光子荧光指示剂稀释至 实验所需要的浓度，按照包被、封闭、一次洗涤、点样、二次洗涤、荧光标记示踪、三次洗涤、 检测的步骤标记抗体，并稀释至一定的浓度；再滴加双光子荧光标记抗体LP-Ab样品至固 定有抗原的固相载体上，温育，以使抗原抗体结合，与免疫复合物充分反应后；再洗涤缓冲 液冲洗固相载体三次，去除未结合样品及荧光指示剂；在双光子荧光显微镜下进行定性/ 定量观察。
[0014] 间接法是用稀释缓冲液将抗原稀释至一定浓度；将稀释好的抗体Ab滴加至固相 载体上，以封闭剂覆盖无抗原区域，避免荧光指示剂的非特异性吸附；；使用稀释缓冲液将 样品稀释至一定浓度；将处理好的样品滴加至固定有抗体的固相载体上，温育，以使抗原抗 体结合，形成Ab·Ag;再将双光子荧光标记抗体LP-IgG滴加至抗原抗体结合后的固相载体 上，以使之与抗体结合，形成LP-IgG·Ab·Ag;再以洗脱缓冲液冲洗固相载体三次，去除未 结合样品及荧光指示剂；在双光子荧光显微镜下进行定性/定量观察。
[0015] 本发明的用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针制备成的荧标试剂盒，其由 双光子荧光标记探针LP、抗糖链抗原单克隆抗体-Ab、硝酸纤维素膜、抗糖链抗原单克隆抗 体-IgG、阳性对照品、阴性对照品、封闭缓冲液和洗涤缓冲液组成；其中，所述的封闭缓冲 液是pH为7. 4,摩尔浓度为20mmol/L的PBS，并且，其中含有质量百分比为0. 5 %的BSA; 所述的洗涤缓冲液是pH为7. 4,摩尔浓度为50mmol/L的PBS，并且，其中含有质量百分比为 0.05 %的吐温20 ;
[0016] 上述的荧标试剂盒用于细胞内糖链抗原活检的方法，包括以下步骤：
[0017] (1)包被：在硝酸纤维素膜上滴加2~6μL抗糖链抗原单克隆抗体-Ab，一滴一 点，各点间相隔l-2cm，并滴加完成后，置于温度为4°C环境中，吸附0. 5-lh;
[0018] (2)封闭：将步骤（1)包被完成的硝酸纤维素膜浸入封闭缓冲液中，在37°C下温 育 0· 5-2h;
[0019] (3) -次洗涤：将步骤（2)封闭完成的硝酸纤维素膜采用洗涤缓冲液清洗至少三 次，静置干燥；
[0020] (4)点样：向步骤（3) -次洗涤完成的硝酸纤维素膜按照步骤（1)滴加2~6μL 抗糖链抗原单克隆抗体-Ab形成的点滴加阳性样品、阴性样品和待测样品，其中阳性样品、 阴性样品和待测样品滴加的点的个数相等，每点滴加2-6uL;
[0021] (5)二次洗涤：待步骤（4)滴加的样品液完全渗入硝酸纤维素膜后，室温静置 10-30min，采用洗涤缓冲液清洗膜片至少三次，静置干燥；
[0022] (6)荧光标记示踪：向步骤（5)处理完成的膜片上加入双光子荧光标记抗体 LP-IgG，加入量为每点滴加2-6uL，在37°C下温育处理0. 5-2h;
[0023] (7)三次洗涤：将步骤（6)处理好的膜片采用洗涤缓冲液清洗至少三次，取出膜 片，去除表面残余液体；
[0024] (8)检测：将硝酸纤维素膜平铺在玻璃片上，在双光子荧光显微镜下检测。
[0025] 上述的阳性样品为纯化的糖链抗原Ag，其浓度为0.Ι-lOOug/mL;阴性样品为封闭 缓冲液。
[0026] 上述的双光子荧光标记抗体LP-IgG，其制备方法是将摩尔质量为 (1. 9-2. 1)X10 5mmol的抗糖链抗原单克隆抗体-IgG溶于0. 5mL的二甲基亚砜中，并采用 摩尔浓度为〇.lmol/L的溶液将pH调至9,将1. 1X10 5mmol的双光子荧光标记探针LP加 入，搅拌反应24h，得到反应混合液，加入4倍体积的乙醚稀释反应混合液，析出沉淀，过滤， 得固体；再向固体中加入二甲基亚砜至固体刚好溶解为止，得溶解液；并向溶解液中再次 加入乙醚至不再有沉淀析出，过滤，干燥，得黄色固体，即为双光子荧光标记抗体LP-IgG。
[0027] 上述的去除表面残余液体是采用吸水纸吸干表面残余液体。
[0028] 上述的抗糖链抗原单克隆抗体-IgG，其制备方法是取4mL抗血清，并向其中加入 pH值为4. 0,摩尔浓度为0. 06mol/L的醋酸缓冲液8mL，并采用氢氧化钠调整pH至4. 8,在振 荡条件下，加入120uL的正辛酸，在室温下振荡混合30min，在4°C下，lOOOOrpm离心15min， 去沉淀，并将上清液装入透析袋中，在0.Olmol，pH值为7. 4的PBS缓冲液中，透析12h，再 加入等体积的饱和硫酸铵溶液，在4°C静置30min，再在12000rpm离心20min，取沉淀，得到 抗糖链抗原单克隆抗体-IgG。
[0029] 上述的抗血清是经抗糖链抗原单克隆抗体_Ab三次免疫兔48天后，对其血液进行 沉淀分离得到的血清。
[0030] 本发明所述的双光子焚光标记抗体LP-Ab是按照双光子焚光标记抗体LP-IgG的 制备方法进行制备的，具体是是将摩尔质量为（1. 9-2. 1)X105mmol的抗糖链抗原单克隆 抗体-Ab溶于0. 5mL的二甲基亚砜中，并采用摩尔浓度为0.lmol/L的溶液将pH调至9,将 1. 1X105mmol的双光子荧光标记探针LP加入，搅拌反应24h，得到反应混合液，加入4倍体 积的乙醚稀释反应混合液，析出沉淀，过滤，得固体；再向固体中加入二甲基亚砜至固体刚 好溶解为止，得溶解液；并向溶解液中再次加入乙醚至不再有沉淀析出，过滤，干燥，得黄色 固体，即为双光子焚光标记抗体LP-Ab。
[0031] 本发明通过双光子荧光标记抗体LP-IgG和硝酸纤维素膜包被的固相抗体Ab，使 得在检测时，固相抗体通过抗原反应特异性捕获待测抗原，形成免疫复合物Ab·Ag，加入双 光子荧光标记抗体LP-IgG，与免疫复合物充分反应后（LP-IgG·Ab·Ag)，经洗涤去除非特 异性物质，即可检测判定结果。
[0032] 上述方法有效的将双分子荧光标记探针应用于细胞内糖链抗原活检，使得对肿瘤 或者癌症标志物的糖链抗原的活检的灵敏度和稳定性提高，使得在进行检测分析时的清晰 度和分辨率较高，克服了传统糖链抗原的检测方法中的灵敏度和稳定性较差，操作步骤繁 琐的缺陷，并且也使得检测试样不再局限于血液和外周血，只要带有糖链抗原的试样即可 用该双分子荧光标记探针LP制备成的试剂盒来进行检测。
[0033] 上述采用双分子荧光标记探针LP应用于糖链抗原活检时，克服了免疫荧光法单 光子荧光容易产生的光致毒、光漂白及组织自发荧光的干扰的缺陷，提高了对糖链抗原活 检的灵敏度和稳定性，提高了检测结果的准确