一种利用干冰运输胚胎的方法及运输装置与流程

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种利用干冰运输胚胎的方法及运输装置。

背景技术：

辅助生殖技术是一种集胚胎分割、嵌合、移植、体外受精、转基因等技术于一体的综合性技术，不但是动物繁殖领域的重要技术革命，也是治疗人类不孕不育的重要技术手段，利用此技术可以充分挖掘动物的遗传和繁殖能力、增加纯种家畜和优秀个体的后代数量、缩短家畜的改良周期以及保存具有优良遗传特性的胚胎和基因，在生物学及医学领域的被广泛地研究和应用。

其中，胚胎移植技术(又称受精卵移植技术)是整个辅助生殖技术中不可或缺的一个环节，所谓的胚胎移植技术主要是指将通过各种技术得到的胚胎(如自然胚胎、体外受精胚胎、克隆胚胎等等)，经手术操作移植到同种的受体雌性动物体内，后期发育并能得到后代的新技术。在实际应用的过程中，胚胎的获取工作通常是在实验室内进行的，而胚胎移植操作则通常是在养殖场内(或其他专用实验室内)进行的。因此，在胚胎生产后到移植前的这段周期内，则必然会存在一个对胚胎进行临时保存和输送的过程，而此过程往往会对胚胎在受体动物体内的发育以及妊娠率起到至关重要的影响。

目前，业内在对胚胎进行临时保存及运输时所主要采用的方式是液氮保存运输，即：通过将获取的胚胎放在液氮运输罐中来完成保存和运输；然而，此种方式却存在如下缺陷：1、利用液氮进行胚胎保存实质上是使胚胎处于玻璃化状态，这种状态一般在液氮温度(即：-196摄氏度)会保持稳定，但当保存温度高于-130摄氏度时，胚胎的玻璃化状态就无法保持稳定或者显现出不稳定的状况，容易导致胚胎内部细胞内的冰晶再一次形成(即：重结晶)，从而伤害胚胎细胞。2、液氮运输罐本身价格昂贵，而且运输过程胚胎必须放置在液氮中，在胚胎运输到目的地后还需要返还空置的液氮运输罐，不但操作极为繁琐，而且运输及保存的费用极为高昂。

技术实现要素：

针对上述现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种利用干冰运输胚胎的方法；本发明的第二个目的在于提供一种适用于此方法的运输装置。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用干冰运输胚胎的方法，它包括以下步骤：

s1、胚胎预处理：将获取的胚胎置于平衡液中处理至少2min，取出并置于保存液中，其中，按质量摩尔浓度计，平衡液以htf培养基为基础液由11.0mol/kg乙二醇、0.7mol/kg蔗糖和0.0062mol/kg聚蔗糖混合而成；按质量摩尔浓度计，保存液以htf培养基为基础液由24.6mol/kg乙二醇、3.1mol/kg蔗糖和0.0062mol/kg聚蔗糖混合而成；

s2、胚胎入管：按一定长度分别向无菌麦管中顺序地置入的蔗糖培养液、间隔空气柱、混合有胚胎的保存液、间隔空气柱和蔗糖培养液，然后将无菌麦管的两个端口作密封处理；

s3、装箱运输：首先将经过密封处理的无菌麦管封装于传热保护容器内，随后再将传热保护容器置于无菌保温箱中，最后将干冰填充于无菌保温箱与传热保护容器之间，并保持干冰始终包覆传热保护容器直至被运输至目的地；

s4、胚胎复苏：取出无菌麦管并对无菌麦管作室温水浴处理，即可复苏胚胎。

优选地，在完成步骤2后并执行步骤3之前的期间内，将无菌麦管置于液氮中作临时保存处理。

优选地，在完成步骤s3后并执行步骤s4之前的期间内，取出无菌麦管并将无菌麦管置于液氮中作临时保存处理。

优选地，在步骤s3中，在48h内将无菌保温箱运输至目的地；随后取出无菌麦管并对无菌麦管作临时保存处理或胚胎复苏处理。

优选地，在步骤s2中，对容积为0.25ml的麦管作紫外线照射消毒处理以获得无菌麦管，置入的混合有胚胎的保存液的长度为2cm。

优选地，在步骤s3中，对保温箱和传热保护容器分别作紫外线照射消毒处理。

一种利用干冰运输胚胎的运输装置，它包括保温箱体、置于保温箱体内的传热保护容器、置于保温箱体的内壁与传热保护容器的外壁之间的干冰碎块层以及封装于传热保护容器内且内部填充有胚胎的无菌麦管，所述无菌麦管的两个端口作密封处理。

优选地，所述保温箱体由聚乙烯泡沫材料制成，所述保温箱体与传热保护容器之间形成有真空保温空间，所述干冰碎块层位于真空保温空间内。

优选地，所述传热保护容器为由铝合金材料制成且侧壁上具有镂空孔位的圆筒状结构体。

优选地，无菌麦管内形成有经填充蔗糖培养液所形成的营养液段、经填充空气所形成的间隔空气段以及经填充保存液所形成以用于混合胚胎的保存液段，所述保存液段位于相邻的两个间隔空气段之间，且所述营养液段与间隔空气段相邻并位于无菌麦管的至少一端。

由于采用了上述方案，本发明通过对保存液和平衡液的改进，使胚胎能够在干冰温度下保持玻璃化稳定状态，从而利用价格相对低廉的干冰即可完成整个胚胎的临时保存及运输的过程，有效地解决了因采用液氮或其他冷冻介质进行临时保存及运输而产生的诸如运输成本高、操作繁琐、胚胎玻璃化状态不稳定等系列问题。

附图说明

图1是本发明实施例的无菌麦管内所填充内容物的分布示意图；

图2是本发明实施例的运输装置的截面结构示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

本实施例提供的一种利用干冰运输胚胎的方法，包括以下步骤：

s1、胚胎预处理：在室温状态下，将获取的胚胎(包括但不限于如自然胚胎、体外受精胚胎、克隆胚胎等)置于平衡液中处理至少2min后(最好为2-10min)，然后将胚胎从平衡液中取出并置于保存液中；其中，按质量摩尔浓度计，平衡液以htf培养基为基础液由11.0mol/kg乙二醇、0.7mol/kg蔗糖和0.0062mol/kg聚蔗糖混合而成；按质量摩尔浓度计，保存液以htf培养基为基础液由24.6mol/kg乙二醇、3.1mol/kg蔗糖和0.0062mol/kg聚蔗糖混合而成；

s2、胚胎入管：如图1所示，按一定长度分别向无菌麦管中顺序地置入的蔗糖培养液a1(其基础成分主要有蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钾、溴麝香草酚兰水溶液、琼脂、蒸馏水等)、间隔空气柱b1(即：由清洁空气充入无菌麦管中后所形成的具有一定长度距离的空气段)、混合有胚胎的保存液c、间隔空气柱b2和蔗糖培养液a2，然后将无菌麦管的两个端口作密封处理(在具体实施时，可将上述材料吸入的一端用密封塞塞住、相对端则可利用酒精等加热后作热压封口处理)，从而不但可以利用位于胚胎两侧的空气和蔗糖培养液实现对胚胎的隔离，而且保证胚胎在运输的过程中具有充足的营养和气体供给；

s3、装箱运输：首先将经过密封处理的无菌麦管封装于传热保护容器(其可根据实际情况采用具有良好导热性能的材料制作而成)内，随后再将传热保护容器置于无菌保温箱中，最后将干冰填充于无菌保温箱与传热保护容器之间，并保持干冰始终包覆传热保护容器直至被运输至目的地；

s4、胚胎复苏：取出无菌麦管并对无菌麦管作室温水浴处理，即可复苏胚胎；在将胚胎释放于培养皿中后即可为后续的胚胎移植做好准备工作。

由此，基于目前胚胎保存及运输过程中只能通过液氮进行冷冻保存处理(因为只有液氮温度才能保证胚胎玻璃化的稳定状态)而容易导致胚胎运输成本高、操作繁琐的现状，以及若更换保存介质(即采用其他介质来替换液氮)则容易导致胚胎发生重结晶现象而损伤细胞的问题；从解决冷冻胚胎稳定性的角度出发，本发明实施例通过对现有的保存液和平衡液提出改进方案(即：优化平衡液和保存液的组成成分及成分配比)，使得胚胎能够在干冰温度(一般为79摄氏度)下保持玻璃化稳定状态，从而利用价格相对低廉的干冰即可完成整个胚胎的临时保存及运输的过程，有效地解决了因采用液氮或其他冷冻介质而产生的系列问题；其中，利用平衡液对胚胎进行预先处理，可利用乙二醇在低浓度时候的低毒性的特性，在较长的处理时间内使乙二醇充分渗透至胚胎内部以形成对胚胎的内部保护，而利用蔗糖和聚蔗糖在平衡液中所起到的促进胚胎脱水的作用，来降低胚胎内部的水分含量；利用保存液所具有的高浓度冷冻保护成分的特点，不但可以在短时间内使乙二醇迅速渗透至胚胎内部并促进胚胎内部的水分快速渗出，同时利用高浓度的保存液也可在对胚胎进行冷冻后使胚胎的内外部不会形成冰晶，形成一个稳定的玻璃化冷冻状态，从而达到充分保护胚胎的目的，以为利用干冰对胚胎进行运输创造条件。

为满足胚胎在实际处理过程中(如从获取、预处理、运输、复苏、移植等阶段)的需求，在完成步骤2后并执行步骤3之前的期间内，可将经胚胎入管处理后的无菌麦管置于液氮中作临时保存处理(即：相当于将其暂存于出发地的实验室内的液氮保存容器中)。相应地，在完成步骤s3后并执行步骤s4之前的期间内，则可将无菌麦管从无菌保温箱及传热保护容器中取出并将无菌麦管置于液氮中作临时保存处理(即：相当于在对胚胎进行复苏或移植前，可先将无菌麦管暂存于目的地的实验室内的液氮保存容器中)。

为最大限度地保证冷冻胚胎在解冻复苏后没有丧失成活率和发育潜能，在步骤s3中，最好保证在48h内将无菌保温箱运输至目的地；随后取出无菌麦管并对无菌麦管作临时保存处理或胚胎复苏处理。

作为优选方案，在步骤s2中，可通过对容积为0.25ml的麦管作紫外线照射消毒处理来获得无菌麦管，此时，置入的混合有胚胎的保存液的长度为最好为2cm。由此，可为蔗糖培养液以及间隔空气柱植入麦管中提供充裕的空间并保证足够的用量，从而保证胚胎在运输的过程中能够获取充足的养分和气体。当然，在具体实施时，混合有胚胎的保存液在麦管内的长度可按上述参数比例，根据根据麦管的具体容积作反比选择处理。

另外，为确保无菌保温箱以及传热保护容器的无菌性能，在步骤s3中，可预先对保温箱和传热保护容器分别作紫外线照射消毒处理，以形成无菌保温箱和无菌的传热保护容器，而后在将无菌麦管置于传热保护容器中。

为对本实施例的方法进行可实施性的充分验证并充分体现出其有益效果，选取对温度敏感性相对较高的小鼠的胚胎(选用小鼠2细胞(即：小鼠2细胞期胚胎)作为实验对象(主要是基于小鼠胚胎比野生型动物的胚胎在临时保存及运输的过程中对温度的敏感性更高的特点)，在处于新鲜状态下和利用本实施例的保存液和平衡液进行预处理以及利用干冰进行临时保存运输后的冷冻状态下小鼠胚胎为对比对象；小鼠胚胎的成活率以及移植的活产率详见表一。

从表一所显示的实施结果来看，与新鲜的小鼠胚胎相比，采用本实施例的平衡液和冷冻液处理后以及利用干冰进行运输后的小鼠胚胎并没有发生形态及发育潜能降低的问题，而且胚胎移植后，产仔数也没有明显的降低。基于此，可以确定：本实施例的方法能够在取得利用液氮进行胚胎保存及运输时相同的效果；而相对于液氮，干冰所具有的性能可有效降低胚胎临时保存及运输的成本，且实施方式简单、方便、快捷。

基于上述的运输方法(具体为：基于保存液和平衡液的特性)，如图2并结合图1所示，本发明实施例还提供了一种利用干冰运输胚胎的运输装置，它包括保温箱体(其主要由本体1和箱盖2构成)、置于保温箱体内的传热保护容器3、置于保温箱体的内壁与传热保护容器3的外壁之间的干冰碎块层4以及封装于传热保护容器3内且内部填充有胚胎的无菌麦管5，无菌麦管5的两个端口作密封处理。由此，利用保温箱体作为运载工具，利用传热保护容器3作为无菌麦管5的封装工具以及干冰与无菌麦管5之间的隔离部件以避免因无菌麦管5的受冷温度不均匀而影响胚胎；在具体实施时，可依照上述方法对胚胎进行预处理以及入管处理后，将无菌麦管5置于预先放置于保温箱体内的传热保护容器3中，并利用干冰碎块填充于保温箱体与传热保护容器3之间以对传热保护容器3形成全面的包覆，从而利用传热保护容器3优良的导热性能将干冰碎块所产生的冷量均匀地散热至无菌麦管5的周围以形成冷冻稳层；然后将整个装置在48h内运至目的地，从而进行后续的胚胎临时冷冻、复苏、移植等工作。由于利用干冰作为冷冻介质可有效解决因采用液氮或者其他冷冻介质而产生的系列问题。

作为优选方案，为最大限度地降低整个装置的成本以及保证胚胎的稳定性，本实施例的保温箱体优选为由价格相对低廉且保温性能优异的聚乙烯泡沫材料制成的箱体结构，并且在保温箱体与传热保护容器3之间形成有真空保温空间，干冰碎块层4位于真空保温空间内。在具体实施时，当将无菌麦管5封装于传热保护容器3内后，再将传热保护容器3封装于保温箱体内并填充干冰碎块后，对保温箱体与传热保护容器3之间的空间作抽真空处理以形成真空保温空间，从而不但可以保证整个运输装置的内部处于无菌的状态，而且有利于传热保护容器3在保温箱体内放置的稳定性以最终在无菌麦管5的周围形成稳定的低温保护层。

作为优选方案，为充分利用干冰所产生的冷量，保证无菌麦管5能够均匀受冷，本实施例的传热保护容器3优选由具有优良导热性能的铝合金材料制成并且侧壁上具有镂空孔位的圆筒状结构体。

基于前述的保存液并结合图1所示，本实施例的无菌麦管5内形成有经填充蔗糖培养液所形成的营养液段a1、经填充空气所形成的间隔空气段(b1、b2)以及经填充保存液所形成以用于混合胚胎的保存液段c，其中，保存液段c位于相邻的两个间隔空气段(b1、b2)之间，而营养液段a1与间隔空气段(b1或b2)相邻并位于无菌麦5管的至少一端；从而通过对无菌麦管5的内部成分的优化选择，可为胚胎创造一个相对完备的营养及气体供给系统，进而为胚胎的临时保存及运输创造条件。

另外，需要指出的是：本实施例所述及的htf基础液是指人输卵管液(htf)培养基(英文为humantubalfluid(htf)medium)，其可参见表二作成分配置。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。