专利名称：一种反硝化聚磷菌强化人工湿地处理农村生活污水的方法
技术领域：
本发明涉及一种反硝化聚磷菌强化人工湿地处理生活污水的方法，属于环保技术领域。
背景技术：
我国是农业大国，农村面积占全国土地总面积的57. 59%。“十二五”规划(2011)中明确提出要大力推进农村环境综合整治，强调要加强农村饮用水水源地保护、农村河道综合整治和水污染综合治理。与城市相比，农村经济实力薄弱、基础设施建设差，农村污水处理工艺落后。采用成本低，运行简单，易于管理的处理工艺，可以实现农村生活污水的循环利用，节约水资源，同时还能有效改善村镇居民的生活环境卫生状况，对于推进新农村建设和环境资源的可持续发展具有重大的战略意义。
人工湿地是一种由人工建造和监督控制的，与沼泽地类似的地面，它利用自然生态系统中的物理、化学和生物的三重协同作用来实现对污水的净化。据国外资料报道，一般人工湿地的工程造价和运行费用仅为传统二级活性污泥法的1/10-1/2，单位污水耗电和污水处理费用明显低于传统污水处理厂。人工湿地系统中，微生物的活动是废水有机物降解的主要因素，是吸收和降解污染物的主要生物群体和承担者。在氮的去除方面起主要作用的是氨化细菌、亚硝化细菌和反硝化细菌，微生物的反硝化是人工湿地脱氮的主要作用。磷的去除主要通过植物和部分微生物的吸收利用以及湿地基质的吸附。人工湿地系统是一个完整的生态系统，它形成了内部的良好循环并具有较好的经济效益和生态效益。然而人工湿地本身也存在不足之处，比如占地面积大，水力停留时间长，处理效果受温度变化和植物生长成熟程度影响大，缺乏最优化设计规范和参数，有潜在的疾病传播媒介等，因此需要进一步的改进和完善。国内外长期实践工程表明，人工湿地对 有机物的去除率较高，但对氮磷的去除率偏低且不稳定，在现有人工湿地技术基础上进一步改进，强化其脱氮除磷效率才能更好的发挥作用。研究表明，增大湿地面积、增设预处理工艺、外加曝气和更换基质填料等方法能够提高人工湿地的氮磷去除效率，但同时也带来了运行成本增加、工艺管理不便的弊端，对于经济基础薄弱的农村来说难以实施。夏季人工湿地中植物生长茂盛，水体中微生物活动旺盛，能够更好的利用污水中的有机物，氮磷元素，对污水具有良好的净化作用。然而秋季时，湿地植物成熟，为防止植物体内吸收的氮磷等营养元素再次进入水体，需进行作物收割处理。随着气温降低，湿地系统中微生物的代谢作用减弱，因此在秋季通过增加植物根际优势微生物的数量，强化植物和微生物对目标污染物的协同去除作用，是一条经济、高效的污染治理新技术。对于经济基础薄弱的农村来说，采用生物技术强化人工湿地来增强污染治理力度，是提高氮磷去除率、节省治污成本的最佳途径。直接增加根际微生物的数量已经成为提高湿地处理效果的发展趋势。目前国外有利用微生物制剂处理有机废水，国内有利用共生复合微生物处理城市污水的应用，鉴于优势菌强化人工湿地工艺在村镇生活污水中的广阔的应用前景，并结合我国农村的经济生活现状，本发明人经反复研究和实践，发现利用微生物强化技术将反硝化聚磷菌Pseudomonas oleovorans CL_3投加到人工湿地系统中，来增加根际脱氮菌群的数量，强化植物和微生物的协同作用，有效净化生活污水。同时配以适当工艺处理，使得人工湿地处理后的废水中的COD、氨氮和总磷的含量指标达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918-2002)—级标准。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种反硝化聚磷菌强化人工湿地处理农村生活污水的方法。所述的人工湿地通过投加反硝化聚磷菌，能够使农村生活污水经人工湿地处理的出水的COD、氨氮和总磷的含量指标达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918-2002)一级B标准。本发明首先提供了一株反硝化聚磷菌，该菌株命名为Pseudomonas oleovoransCL-3，属于假单胞菌属的食油假单胞菌，已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCM2012226。 其菌学特征为细胞呈长杆状，直径约为(0. 25-0. 375) X (2. 0-3. 0) U m ;菌落乳白色，边缘有一块凸出、中间凸，有同心圆、有光泽；革兰氏染色为阳性；异染颗粒染色时有黑色聚磷颗粒物质；最适温度为30°C;pH在7. (T9. 0之间时，有良好的脱氮能力，最适pH为7. O。使用前用反硝化培养基活化菌株将保藏培养基斜面上保存的食油假单胞菌CL-3，用接种环刮取I环菌苔，接种入装有200mL反硝化培养基的250mL锥形瓶中，30°C恒温培养箱静置培养12h，即可获得菌株。其次，本发明还提供了一种人工湿地，所述的人工湿地选用页岩和陶粒来构建湿
地基质层。页岩是人工湿地技术中应用比较成熟的湿地填料，在有机物、氮、磷等营养元素的去除方面效果较好。陶粒以页岩、粘土等惰性物质为主要原料并附加少量金属氧化物高温焙烧而成。其成份主要以无机非金属物质为主。粒径为3-5mm的陶粒对微生物具有良好的固定作用，同时对磷元素具有很好的吸附作用。较好的是，本发明中，所述人工湿地的构成单元结构自下而上依次为碎石层(厚度为150-180mm)、防渗层(防渗膜)、组合填料层(厚度为600-700mm)、陶粒层(厚度为150_180mm)、表面熟土层(厚度为 100_150_)。较好的是，在本发明中，所述人工湿地长4m，宽lm，深I. 3m。较好的是，在本发明中，所述的碎石粒径范围为30-100mm，组合填料层由粒径不等的页岩组成，粒径范围为5-30mm,陶粒粒径范围为3_5_。较好的是，在本发明中，人工湿地植物采用芦苇湿地植物进行种植，芦苇根系发达，分蘖生长，耐盐碱、水质净化能力强。本发明还提出了一种反硝化聚磷菌强化人工湿地处理农村生活污水的方法。根据本发明，人工湿地用于农村生活污水回用处理的具体步骤如下(I)先将生活污水经中水站处理，处理后的二级出水进入潜流人工湿地。(2)将培养活化的反硝化聚磷菌菌液投加到芦苇人工湿地系统中，继续对二级出水进行进一步处理，去除COD、N、P等污染物；(3)污水在潜流人工湿地内的水力停留时间为7-9d。放出上述在潜流人工湿地内停留7d的潜流污水，所述污水水体中的有机物、氮、磷等污染物含量指标达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918-2002) —级标准。根据本发明的上述步骤，利用微生物对湿地的强化作用，通过填料、植物和微生物之间的相互作用，经吸附、离子交换、植物吸收和微生物降解等过程，降低水体中的有机物、氮、磷等污染物的含量，使COD、NH3-N, P含量指标达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918-2002) 一级 B 标准。本发明具有的有益效果(I)本发明基建费用低，运行管理方便，处理成本低，吨水处理费为0. 23-0. 29元，可以大幅度节省投资； (2)本发明选用3-5_陶粒作为人工湿地新型填料，填充于土壤层下方，与植物根系密切接触，有利于更好的固定根际微生物，使微生物更好的发挥作用。(3)本发明中选用根际微生物丰富的芦苇作为湿地植物，对有机物、氮、磷去除效果良好。(4)本发明中通过投加反硝化聚磷菌加强了微生物对湿地的强化作用，有效提高了污水中氮磷素的去除效率。(5)本发明中的污水处理效果较好，能使农村生活污水经人工湿地处理的出水的C0D、氨氮和总磷的含量指标达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918-2002) —级B标准。
图I为食油假单胞菌CL-3菌体透射电镜显微照片。图2为温度对食油假单胞菌CL-3总氮去除率的影响。图3为pH对食油假单胞菌CL-3总氮去除率的影响。图4为食油假单胞菌CL-3在最佳脱氮条件下的生长曲线图5为食油假单胞菌CL-3在最佳脱氮条件下的脱氮除磷率。图6为本发明人工湿地现场布置平面图。图7为本发明一种以页岩和页岩陶粒为基质填料的人工湿地内部结构示意图。图8为本发明加菌强化芦苇人工湿地对COD的处理效果图。图9为本发明加菌强化芦苇人工湿地对氨氮的处理效果图。图10为本发明加菌强化芦苇人工湿地对硝态氮和亚硝态氮的处理效果图。图11为本发明加菌强化芦苇人工湿地对总氮的处理效果图。图12为本发明加菌强化芦苇人工湿地对总磷的处理效果图。其中，I.碎石层，2.防渗层，3.组合填料层，4.陶粒层，5.表面熟土层。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例用于说明本发明内容，而不是限定本发明内容。
实施例I本发明菌株的分离鉴定(I)培养基菌株筛选、脱氮培养基(DM:Denitrifying Medium) (/L) =CH3COONa, 2g ；KH2P04,0. 4g ；MgS04 7H20，0. 6g ；CaCl2 2H20，0. 07g ；KN03, Ig ；Tris 缓冲液 12mL ;微量元素 2mL ；pH控制在7. 0 7. 2。上述培养基如制成固体培养基，则添加琼脂I. 5%(w/v)。(2)食油假单胞菌CL-3的分离纯化用无菌移液管取双泥序批式反应器(DS SBR)缺氧结束时的污泥混合液10mL，置于装有数粒玻璃珠的无菌三角瓶中，加入无菌水90mL，制成稀释度为KT1的菌悬液，在磁力搅拌器上搅拌20min打散菌胶团。用移液枪分别吸取0. 5mL样品于装有4. 5mL无菌水的试管中，混匀，依此类推，最后吸取稀释度为10_4的稀释液，以每块平板0. 2mL的量，涂布四块DM培养基，用无菌三角玻璃刮刀在培养基表面均匀涂布，将稀释涂布后的培养基平板倒置于30 °C恒温培养箱中培养48h后,培养至长出明显菌落。选取单一菌落多的一个平板，进行平板划线。在DM培养基平板上多次划线纯化，直至显微镜下观察显示无杂菌为止，此时可认为本发明的菌株食油假单胞菌CL-3已纯化完毕。(3)食油假单胞菌CL-3的菌落形态特征在培养基A平板上培养3d后，显微镜下观察到菌落乳白色，边缘有一块凸出、中间凸，有同心圆、有光泽。(4)食油假单胞菌CL-3的菌体形态特征透射电镜观察结果表明菌体呈长杆状，直径约为(0. 25-0. 375) X (2. 0-3. 0) u m (如图 I 所示)。(5)食油假单胞菌CL-3的生理生化特征革兰氏染色为阳性；异染颗粒染色时有黑色聚磷颗粒物质；最适温度为30°C (如图2所示)；pH在7. (T9. 0之间时，有良好的脱氮能力，最适pH为7.0 (如图3所示)。(6) 16S rDNA 的 PCR 扩增与测序实验仪器小型离心机(Eppendorf,转速>12000r/min);电泳仪(北京六一仪器厂)；PCR热循环扩增仪(Eppendorf);凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)。实验方法从菌株CL-3的新鲜斜面上直接挑取菌体，加入至含100 u L双蒸水的离心管中，旋涡混匀后，沸水浴7min，12000r/min离心5min，上清液用于PCR扩增模板。扩增引物为一对通用引物。正向引物为27F :5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ；反向引物为1492R :5’ -GGTTACCTTGTTA CGACTT-3’。PCR反应在25 ii L体系中进行。反应体系的组成为模板DNA IuL ；dNTP混合物I U L ；rTaq DNA聚合酶0. 2 y L ;正向引物I U L ;反向引物I y L ;双蒸水8. 8 y L。PCR 扩增条件94°C变性 5min ;94°C lmin, 55°C lmin, 72°C lmin。循环 29 次；72°C延伸10min，4°C放置。用1%的琼脂糖凝胶对菌株的16S rDNA扩增产物做电泳检测，验证后切下胶条，用DNA凝胶回收试剂盒(上海生工生物工程有限公司)纯化PCR产物。回收后的PCR扩增产物委托上海生工生物工程有限公司进行测序。(7) 16S rDNA序列分析与系统发育分析测序后得到CL-3菌株的16S rDNA长度为1268bp的序列，提交到Genbank与其他菌株进行比对(登录号为FJ594993)，发现和CL-3菌株亲缘关系最近的是Pseudomonas属中的Pseudomonas oleovorans,序列同源性可达100%。将菌株CL-3归属假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)类群中，命名为 Pseudomonas oleovorans CL-3。实施例2本发明菌株的培养( I)所使用的培养基菌株反硝化培养基(DM:Denitrifying Medium) (/L) CH3C00Na, 2g ；KH2P04,0. 4g ；MgSO4 7H20，0. 6g ；CaCl2 2H20，0. 07g ；KN03, Ig ；Tris 缓冲液 12mL ;微量元素 2mL ;pH 控制在 7. 0 7. 2。上述培养基如制成固体培养基，则添加琼脂I. 5%(w/v)。使用前，121°C，灭菌20分钟。
(2)培养条件将保藏培养基斜面上保存的食油假单胞菌CL-3用接种环刮取I环菌苔，接种入装有200mL反硝化培养基的250mL锥形瓶中，30°C恒温培养箱静置培养12h，即可获得菌株。实施例3本发明菌株在最佳脱氮条件下的脱氮性能实验在250mL三角瓶中进行，每瓶含50mL反硝化培养液，加入50mL已培养好的菌液，调整PH使CL-3处于反硝化所需的最佳脱氮条件，于最适温度下密封间歇振荡培养，振荡4h、静止培养4h。定时检测培养基中细菌的OD6tltl，实验结果见图4。并分别按对应时间取培养液在0. 22 y m的滤膜下抽滤，测定滤液中硝酸盐氮和磷酸盐含量，计算脱氮率和除憐率。头验结果见图5。从图4中可以看出，菌株CL-3的生长较缓慢，生长周期较长。48小时之后进入指数增长期，0D_由0. 5增加到3. O。120 168小时之后进入稳定期，168小时之后CL-3菌株趋向衰亡。0D_逐渐降低。从图5中可以看出，总氮去除率随着菌株CL-3的增长不断升高。前16小时内氮磷曲线下降较快，说明氮磷去除主要在前16小时，而16 24小时为过渡期。前24小时氮磷去除率分别为64. 5%,52. 5%，去除速率分别为3. 7mg/h、l. 76mg/h ;整个实验过程氮磷去除率分别为84. 6%, 76. 8%。实施例4如图6所示，湿地系统总占地约100m2，由8个面积大小相同的单池组成。单池长4m，宽lm，深I. 5m。单池的蓄水量约为1000L。池中每隔一米设有垂直高度间隔15cm的5个出水孔，便于取样检测。湿地通过末端底部设置出水孔，池外连接上部开口、高I. 3m的出水管来控制湿地最高水位。如图7所示，其中，碎石层1，防渗层2，组合填料层3，陶粒层4，表面熟土层5。湿地底部为粒径大于3cm的页岩,距底部0. 15m到0. 6m为粒径3cm左右的页岩，0. 6m到0. 75m处粒径为3_5mm的陶粒；表层IOcm为细土层。湿地植物采用根际微生物丰富的芦苇进行分池种植。中水站二级出水首先进入配水箱，然后由配水箱分别向八个人工湿地进行均匀布水。处理后的出水经收集后直接外排。八个单池既可独立运行，互不干扰，又可同时运行，共同发挥作用。且各池中都安装有曝气阀，可以实现单独曝气，运行简易，方便。实施例5秋季对芦苇湿地进行生物强化实验。在启动运行期，将培养的反硝化细菌的菌液(OD600=L 0)按5%的比例投加于人工湿地中，取水力停留时间7d。在运行过程中，污水在潜流人工湿地内停留10d，湿地内的填料、植物和微生物之间相互作用，通过填料、植物和微生物之间的相互作用，经吸附、离子交换、植物吸收和微生物降解等过程，降低水体中的有机物、氮、磷等污染物的含量，使COD、NH3-N, P含量达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918-2002) 一级 B 标准。具体处理效果见图8、图9、图10、图11、图12。强化芦苇湿地对COD的去除效果明显(见图8)，第7天时则降至60mg/L以下，COD去除率为83. 4%，比对照组提高了 12. 6%。图10显示，实验过程中芦苇加菌强化湿地中NH3-N浓度呈现逐渐降低的趋势，与对照组相比具有更优的去除效果。NH3-N浓度7天时降至7. 7mg/L,达到水质排放标准(NH3_N〈8mg/L)，NH3-N的去除主要在前7天内，去除率达到81%。而对照组NH3-N为28. 6mg/L未达标。图11中，由于反硝化细菌的作用，芦苇湿地加菌强化实验时在初始阶段均出现N03_-N浓度先升高后降低，与同期的对照组相比均具有较好的N03_-N去除效果。湿地中的反硝化细菌 在N的转化中起了关键的调节作用，使得N02_-N浓度保持在较低范围内(见图11)，保证了湿地系统正常运行，免于N02_-N的毒害作用。通过生物强化作用，人工湿地对TN的去除效果要明显好于对照实验组(见图9)。图12显示，加菌强化实验组和对照组TP浓度降低趋势相似，由于初始进水浓度较低，约为0. 7mg/L，加菌强化对P的去除作用不明显。水力停留时间7天时，P浓度达标(P〈0. 5mg/L)。本发明基建费用省，运行过程中无需曝气，即能达到排放标准，可以有效节省工艺运行成本，维护简单，吨水处理费为0. 23-0. 29元。通过投加反硝化细菌对秋季人工湿地进行生物强化，水力停留时间7d时，C0D、氨氮和总磷的去除效果显著，处理后的废水达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918-2002) —级B标准，有效改善人工湿地系统占地面积大，水力停留时间长等缺点，具有良好的社会环境经济效益。
权利要求
1.一种反硝化聚磷菌强化人工湿地处理农村生活污水的方法，其特征是，包括步骤如下 (1)先将生活污水经中水站处理，处理后的二级出水进入潜流人工湿地； (2)将培养活化的反硝化聚磷菌菌液投加到芦苇人工湿地系统中，污水在潜流人工湿地内的水力停留时间7-9天。
2.根据权利要求I所述的一种反硝化聚磷菌强化人工湿地处理农村生活污水的方法，其特征是，潜流人工湿地为种植芦苇的人工湿地。
3.根据权利要求I所述的一种反硝化聚磷菌强化人工湿地处理农村生活污水的方法，其特征是，所述的人工湿地的组成自下而上依次为碎石层、防渗层、组合填料层、陶粒层、表面熟土层。
4.根据权利要求3所述的一种反硝化聚磷菌强化人工湿地处理农村生活污水的方法，其特征是，所述的碎石层碎石粒径范围为30-100 mm，所述的防渗层为一层防渗膜，所述的组合填料层由粒径不等的页岩组成，粒径范围为5-30 mm，陶粒层陶粒粒径范围为3_5mmD
5.根据权利要求3所述的一种反硝化聚磷菌强化人工湿地处理农村生活污水的方法，其特征是，碎石层厚度为150-180 mm，组合填料层厚度为600-700 mm，陶粒层厚度为150-180 mm，表面熟土层厚度为100-150mm。
6.根据权利要求I所述的一种反硝化聚磷菌强化人工湿地处理农村生活污水的方法，其特征是，所述的反硝化聚磷菌为oleovorans CL_3,属于假单胞菌属的食油假单胞菌，其保藏编号为CCTCCM2012226。
7.根据权利要求I所述的一种反硝化聚磷菌强化人工湿地处理农村生活污水的方法，其特征是，所述反硝化聚磷菌的培养活化过程为将保藏培养基斜面上保存的食油假单胞菌CL-3，用接种环刮取I环菌苔，接种入装有200 mL反硝化培养基的250 mL锥形瓶中，30 °C恒温培养箱静置培养12 h,即可获得菌株。
8.根据权利要求I所述的一种反硝化聚磷菌强化人工湿地处理农村生活污水的方法，其特征是，培养活化的反硝化聚磷菌菌液以0D_=1. 0计加入量为污水质量的5%。
全文摘要
本发明涉及一种反硝化聚磷菌强化人工湿地处理农村生活污水的方法，将培养活化的反硝化聚磷菌菌液投加到芦苇人工湿地系统中，污水在潜流人工湿地内的水力停留时间7-9天，本发明中通过投加反硝化聚磷菌加强了微生物对湿地的强化作用，有效提高了污水中氮磷素的去除效率。选用根际微生物丰富的芦苇作为湿地植物，对有机物、氮、磷去除效果良好。本发明中的污水处理效果较好，能使农村生活污水经人工湿地处理的出水的COD、氨氮和总磷的含量指标达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918-2002)一级B标准。
文档编号C02F3/34GK102757132SQ201210269870
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者孟盼盼, 李政, 胡文容, 裴海燕, 邵媛媛 申请人:山东大学