一种具有清除展青霉素作用的消化乳杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有清除展青霉素作用的消化乳杆菌及其应用，属于微生物【技术领域】。本发明所提供的消化乳杆菌(Lactobacillus alimentris)具有耐酸性，能够快速脱除水溶液中的展青霉素，将菌体数为1×1010CFU/mL的消化乳杆菌与浓度为1000μg/L的展青霉素共培养，共培养4h，对展青霉素的清除率可以达到80％以上，共培养8h后，对其清除率可达到90％以上。同时可显著降低苹果汁和发霉苹果渣中的展青霉素。所述的消化乳杆菌用于去除食品或饲料中的展青霉素，具有非常广泛的应用前景。CGMCC No966320140915
【专利说明】一种具有清除展青霉素作用的消化乳杆菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种具有清除展青霉素作用的消化乳杆菌及其应用，属于微生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]展青霉素又称棒曲霉素，是青霉属、曲霉属、丝衣霉属等霉菌代谢产生的一种有毒的真菌代谢产物。它对人及动物具有广泛而强烈的毒性作用。急性毒性表现为抽搐、痉挛、皮下组织水肿、肺肠充血、肠炎、无尿直至死亡；慢性毒性可导致胃溃疡，并具有抑制免疫、致畸性以及潜在的致癌性等。展青霉素能溶于水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和氯仿，微溶于乙醚、苯，不溶于石油醚，在酸性条件下化学性质稳定。
[0003]展青霉素是一种世界范围内的污染物，食品和饲料生产中展青霉素的污染相当普遍，广泛存在于苹果、葡萄、橘子、菠萝、玉米、奶酪和动物饲料等产品中，特别是在水果及以水果为加工原料的产品中的展青霉素污染最为严重。水果中展青霉素主要是由扩展青霉(Penicillium expansum)产生的,这种病菌不仅会引起果实腐烂,还会向果实组织中分泌大量的展青霉素。在果汁加工产业中，如果腐烂的果实混入原材料中，那么产出的果汁就会有不同程度的展青霉素的残留，给消费者(特别是儿童)的身体健康带来严重的危害。基于展青霉素对人体健康的潜在危害，世界上很多国家都对果汁产品中展青霉素的最大限量做了规定，EU、USFDA规定果汁产品中的展青霉素的最大限量为50μ g/kg，婴幼儿产品中最大限量为10 μ g/kg, WHO建议每人每天展青霉素摄入量不超过0.4 μ g/kg体重。
[0004]目前主要通过吸附、微波处理等物理手段或添加添加剂、臭氧处理等化学手段进行去除展青霉素，但物理方法效果不是十分理想，而且很容易使展青霉素聚集到吸附材料中，对环境构成了潜在威胁。而化学方法存在成本高、安全性及去除机理尚不明确等问题，还未见在生产实际中得到应用。
[0005]鉴于传统的方法存在多种问题，亟需研发新型的展青霉素去除手段。
[0006]目前通过微生物清除展青霉素的效率普遍不高，且局限于清除水溶液或培养液中的展青霉素，很少应用到食品和饲料中。本发明旨在筛选出能高效清除展青霉素的微生物并将其用于清除食品和饲料中的展青霉素。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种消化乳杆菌(Lactobacillus alimentris),该菌株已于2014年09月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.9663。
[0008]所述消化乳杆菌具有以下特性:
[0009](I)菌落特征:在MRS培养基上生长良好，形成乳白色、半透明、圆形菌落，菌落表面湿润。细菌形态呈中长杆状，两端椭圆，革兰氏染色反应呈阳性，无运动性，不产芽抱。
[0010](2)生长特性:该菌株的最低生长温度为15°c，最高生长温度为40°C，该菌株以30-370C的生长温度为佳，最高和最低初始生长pH为9.0和3.0，最适生长初始pH为6.0 ;该消化乳杆菌的延迟期相对较短，4h左右开始进入对数生长期12h就达到稳定期。
[0011](3)具有耐酸性，在pH3.0-9.0环境条件下生长良好，在pH 2.5环境下存活良好。
[0012](4)在含1000 μ g/L展青霉素的水溶液中，能够将展青霉素浓度降到11.1 μ g/L。
[0013](5)在含ΙΟΟΟμ g/L展青霉素的培养基中，能够对展青霉素的清除率达90%以上。
[0014](6)在含966.95 μ g/L展青霉素的苹果汁中，能够将展青霉素的含量从966.95 μ g/L 降到 54.41 μ g/L,清除率达 94.37%。
[0015]本发明还提供一种制备用于清除展青霉素的消化乳杆菌CGMCC N0.9663的生物制齐IJ，是将消化乳杆菌CGMCC N0.9663活化培养后离心获得消化乳杆菌菌体，洗涤后收集菌体得到消化乳杆菌生物制剂。或者，将收集得到的菌体再用保护剂重悬达到浓度101(lCFU/mL，将悬浮液培养一段时间后进行冷冻干燥得到消化乳杆菌菌粉生物制剂。
[0016]所述的保护剂可以为脱脂奶粉、海藻糖或蔗糖等。
[0017]所述消化乳杆菌CGMCC N0.9663菌具有以下用途:
[0018](I)制成清除展青霉素的生物制剂；
[0019](2)用来清除水溶液、果汁及食品和饲料中的展青霉素。
[0020]本发明的消化乳杆菌CGMCC N0.9663具有耐酸性，对展青霉素有良好的耐受能力，能够耐受起始浓度为10000 μ g/L的展青霉素溶液。并且对展青霉素有较强的清除作用，能够显著降低水溶液、苹果汁及发霉苹果渣中展青霉素的含量。所述的消化乳杆菌CGMCCN0.9663用于去除食品或饲料中的展青霉素，具有非常广泛的应用前景。
[0021]生物材料保藏
[0022]消化乳杆菌(Lactobacillus alimentris),已于2014年09月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.9663。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为展青霉素对消化乳杆菌CGMCC N0.9663生长影响分析。
[0024]图2为不同时间消化乳杆菌CGMCC N0.9663对展青霉素的清除效率图。
[0025]图3为添加消化乳杆菌CGMCC N0.9663后苹果汁中展青霉素含量的变化图。
[0026]图4为添加消化乳杆菌CGMCC N0.9663的发霉苹果渣与对照组中展青霉素的含量图。
【具体实施方式】
[0027]下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0028]实施例1展青霉素标准品母液的配制
[0029]所述展青霉素为展青霉素标准品，购于北京泰乐祺科技有限公司，使用时配制成100mg/L的母液。配置方法为:准确称取5mg的展青霉素标准品,溶于50mL乙酸乙酯中，充分混匀溶解，并使用0.22 μ m微孔滤膜进行过滤除菌后贮存于_20°C。
[0030]实施例2制备用于清除展青霉素的消化乳杆菌CGMCC N0.9663的生物制剂
[0031]将消化乳杆菌CGMCC N0.9663以2%接种量接种于MRS培养基，在温度为30?37°C，摇床转速为150r/min-200r/min的摇床中培养18_24h后，经5000r/min，1min离心获得消化乳杆菌菌体，将离心后的菌体用0.85%生理盐水清洗三次后离心得到消化乳杆菌CGMCC N0.9663 生物制剂。
[0032]或者，将菌体再用保护剂重悬达到浓度101(lCFU/mL。所述的保护剂为100g/L脱脂奶粉、100g/L海藻糖和150g/L鹿糖。接着,让该悬浮液在温度37°C的条件下预培养60min,再在_20°C预冻2-4h，最后进行冷冻干燥得到消化乳杆菌CGMCC N0.9663菌粉生物制剂。
[0033]实施例3展青霉素对消化乳杆菌CGMCC N0.9663生长的影响
[0034]1、含不同浓度展青霉素的MRS培养液的配制
[0035]根据需要，准确量取一定体积实施例1中浓度为100mg/L的展青霉素标准品母液，用氮气吹干后溶于MRS培养液，并定容至100mL。如配制浓度为1000 μ g/L的展青霉素培养液时，首先准确量取浓度为100mg/L的展青霉素标准品lmL，用氮气吹干后溶于MRS培养液中，定容至10mL,即得到浓度为1000 μ g/L的展青霉素培养液。
[0036]2、展青霉素对消化乳杆菌CGMCC N0.9663生长影响分析
[0037]将经过活化的消化乳杆菌CGMCC N0.9663按2%的接种量接种到步骤I配制的分别含有O μ g/L、2000 μ g/L、5000 μ g/L和10000 μ g/L的展青霉素MRS培养液中，接种后分装于96孔板，置于温度为37°C培养箱中培养，每个处理4个平行样，同时设置空白组。总共培养24小时，每隔两个小时取出96孔板使用酶标仪测600nm下的OD值。
[0038]结果如图1，从图中可以看出，消化乳杆菌CGMCC N0.9663在不同浓度的培养基生长曲线与空白组基本重合，说明消化乳杆菌CGMCC N0.9663对展青霉素具有较强的耐受能力。
[0039]实施例4消化乳杆菌CGMCC N0.9663对水溶液中展青霉素清除作用
[0040]1、展青霉素标准品母液的配制
[0041]同实施例1。
[0042]2、含不同浓度展青霉素的溶液样品的配制
[0043]根据需要，准确量取一定体积的展青霉素标准品母液，用氮气吹干后溶于pH 4.0水中，并定容至100mL。如配制浓度为1000 μ g/L的展青霉素培养液时，首先准确量取浓度为100mg/L的展青霉素标准品lmL，用氮气吹干后溶于pH 4.0水中，定容至10mL,即得到浓度为1000 μ g/L的展青霉素溶液样品；配制浓度为500 μ g/L、1500 μ g/L和2000 μ g/L的展青霉素溶液样品时，分别需要取0.5mL、l.5mL和2mL的展青霉素标准母液。
[0044]3、不同时间下消化乳杆菌CGMCC N0.9663对展青霉素清除能力的分析
[0045]收集IX1iciCFU的菌体与ImL浓度为1000 μ g/L展青霉素溶液样品在温度为25°C，转速为150r/min的摇床里共培养，分别在共培养0.5小时、4小时、8小时、12小时和24小时取出反应后的样品，于4°C、12000rpm的转速离心1min取上清液，用0.22 μ m滤膜过滤，采用高效液相色谱检测样品中展青霉素的残留情况。每个时间的处理做3个平行样。同时,每个不同时间的的展青霉素处理组均设置一个不加消化乳杆菌CGMCC N0.9663的对照组。
[0046]检测条件:色谱柱Unitary C18，150_Χ4.6_X5 μ m ;流动相为甲醇:水=10:90,流速lml/min，检测器为紫外检测器，检测波长276nm，上样量为20 μ L，展青霉素的出峰时间为8.lmin-10.lmin。
[0047]实验结果:消化乳杆菌CGMCC N0.9663对展青霉素的清除作用随时间的变化曲线如图2，在4小时时消化乳杆菌处理组对展青霉素的清除率为88.93%,8小时后可达94.29%,12小时后消化乳杆菌CGMCC N0.9663对展青霉素的清除效果没有明显的变化，24小时时的清除率为98.89%。
[0048]实施例5消化乳杆菌CGMCC N0.9663降低苹果汁中展青霉素的含量
[0049]以市售苹果汁为溶剂加入展青霉素调整其浓度为1000 μ g/mL,加入101(lCFU/mL消化乳杆菌CGMCC N0.9663生物制剂，混匀后于25°C，转速为150r/min的摇床中孵育24h后取出。取出后提取苹果汁中的展青霉素使用高效液相色谱测定其含量。同时设没加入消化乳杆菌CGMCC N0.9663生物制剂的空白组。具体提取方法如下:
[0050]取5-10mL含展青霉素的苹果汁，加入20mL的乙酸乙酯，振摇2min，静止分层后收集上层有机相，重复以上步骤两次，合并3次有机相，加入4mL 1.5 %的碳酸钠溶液振摇Imin (此步骤要快，防止扩展青霉素在碱性条件下不稳定)，静置分层后，碳酸钠层再用1mL乙酸乙酯提取一次。将提取后的净化液倒入10mL的梨形瓶中，于40°C水浴上旋转蒸发至I?2mL，将浓缩液移至离心管中，于40°C氮气吹干，以1.0mL pH 4.0的乙酸水溶液溶解残留物，经0.45 μ m的滤膜过滤后，供液相色谱测定。
[0051]实验结果如图3，消化乳杆菌CGMCC N0.9663能显著降低苹果汁中展青霉素的含量，可将苹果中展青霉素的含量从966.95 μ g/L降到54.41 μ g/L,清除率达94.37%。
[0052]实施例6消化乳杆菌CGMCC N0.9663降低发霉苹果渣中展青霉素的含量
[0053]称取一定量的苹果渣，放入平皿中，用牛皮纸包好，高压蒸汽灭菌；苹果渣灭菌冷却后，按接种量2-5%接入能够产展青霉素的扩展青霉素孢子悬浮液，搅拌混合均匀；将无菌水按料水比1:0.5?I加入苹果渣中，搅拌均匀混合后平均分装到已灭菌平皿中，其中三个平皿中分别接种1-2%消化乳杆菌CGMCC N0.9663，空白平皿中不加入消化乳杆菌，将接种消化乳杆菌的平皿与未接入消化乳杆菌的空白平皿在25-35°C的温度下保温发酵3-5天，发酵完后，提取苹果渣中的展青霉素，提取方法如实施例5。提取后用高效液相色谱检测展青霉素的含量。
[0054]实验结果如图4，从图中可以看出，在发霉的苹果渣中加入消化乳杆菌CGMCCN0.9663可以有效降低展青霉素的含量，将苹果渣中展青霉素的量从652.72 μ g/kg降到105.09 μ g/kg。
[0055]实施例7制备含消化乳杆菌CGMCC N0.9663玉米秸杆青贮饲料
[0056]将玉米秸杆饲料原料揉切至l-4cm后待用，然后称取50kg玉米秸杆饲料原料，把0.6g消化乳杆菌CGMCC N0.9663工作发酵剂与220mL无菌水混合均匀，然后装入青贮饲料桶中压实密封，然后在常温条件下贮存10个月后即得到含消化乳杆菌CCFM 636的玉米秸杆饲料，与未添加消化乳杆菌的玉米秸杆饲料相比，展青霉素的含量显著降低。
[0057]实施例8消化乳杆菌CGMCC N0.9663的获得
[0058]取ImL拍打均匀发酵蔬菜匀浆加入到30mL MRS培养基中富集培养，37°C培养20h。梯度稀释涂布于添加0.02%溴甲酚紫的MRS平板上。挑取变色圈明显的单菌落，反复划线得到纯化的单菌落，挑选菌落直径在I?3mm之间，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，乳白、灰白或暗黄色等符合乳酸菌菌落特征的菌株，进行革兰氏染色，挑选革兰氏阳性、无芽孢菌株。
[0059]以2%接种量将菌株传代两次后，离心1min(5000gX，4°C )收集菌体，再用磷酸盐缓冲液(pH 7.2)洗涤离心2次。将获得的菌体重悬于ImL含PAT浓度为1000 μ g L-1的生理盐水中(pH 4.0)，调整菌浓度在1010CFU mL_l左右，置于转速为150r min_l的摇床中37°C培养24h后取样，离心1min (12000gX，4°C )，取上清液使用0.22 μ m微孔滤膜进行过滤后用高效液相色谱仪(HPLC)检测PAT残存浓度。同时设未加入菌体的同浓度PAT溶液作为阴性对照。从而筛选出展青霉素清除能力较强的展青霉素菌株CCFM 636，经鉴定保藏，得到消化乳杆菌CGMCC N0.9663。
[0060]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1.一种消化乳杆菌(Lactobacillus alimentris),该菌株已于2014年09月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.9663。
2.一种应用权利要求1所述消化乳杆菌CGMCC N0.9663制备用于清除展青霉素的生物制剂的方法，是将所述消化乳杆菌活化培养后离心获得消化乳杆菌菌体，洗涤后收集菌体得到消化乳杆菌生物制剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，进一步将收集得到的菌体用保护剂重悬达到浓度101(lCFU/mL，将悬浮液培养一段时间后进行冷冻干燥得到消化乳杆菌菌粉生物制剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的保护剂为脱脂奶粉、海藻糖或蔗糖。
5.一种含有权利要求1所述消化乳杆菌CGMCC N0.9663的生物制剂。
6.权利要求5所述生物制剂的应用。
7.权利要求1所述消化乳杆菌CGMCCN0.9663在去除食品或饲料中的展青霉素中的应用方法。
8.权利要求1所述消化乳杆菌CGMCCN0.9663在生产动物饲料中的应用方法。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述动物饲料是苹果渣发酵饲料或青贮饲料。
10.权利要求1所述消化乳杆菌CGMCCN0.9663在制备展青霉素解毒剂中的应用。
【文档编号】C02F101/34GK104403973SQ201410734478
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月5日 优先权日:2014年12月5日
【发明者】陈卫, 田丰伟, 郭敏, 龚雪, 翟齐啸, 王刚, 赵建新, 张灏 申请人:江南大学