用血红密孔菌降解磺胺类化合物的方法与流程

本发明属于环境污染治理领域，涉及一种用血红密孔菌降解磺胺类化合物的方法。

背景技术：

漆酶(Laccases)是一种结合多个铜离子的蛋白质，属于铜蓝氧化酶。漆酶可存活于空气中，发生反应后唯一的产物就是水，因此本质上是一种环保型酵素。由于这几年环保意识逐渐被人所重视，因此近年来漆酶也成为众多学者的研究对象。漆酶常见于真菌及植物中。其中，白腐菌生产的漆酶在木质素降解过程中起到了重要作用，尤其受到关注。而且，白腐菌生产的漆酶多为胞外酶，易于提取利用。目前研究最多的白腐菌是栓菌属Trametes和侧耳属Pleurotus。近年来，密孔菌属Pycnoporus开始引起关注，因为它能够生产具有高氧化还原电位的漆酶，这意味着密孔菌属Pycnoporus生产的漆酶可作用的底物范围更大，而且漆酶是密孔菌属Pycnoporus在液体发酵时生产的主要化酵素。

现有生产漆酶的技术，多需要较长的发酵周期，尤其在发酵初期，60h之内，漆酶产量极低。使用天然培养基进行发酵，生产过程重复性较差。另外，现有技术利用漆酶降解磺胺类化合物，多使用从菌体发酵液提取纯化或粗提的漆酶，这一系列程序繁琐且代价高昂。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用血红密孔菌降解磺胺类化合物的方法。

本发明的技术方案概述如下：

用血红密孔菌降解磺胺类化合物的方法，包括如下步骤：

(1)种子培养：将保藏编号为CGMCC 5.815的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中，在25-30℃培养6-8天；再转入马铃薯葡萄糖液体培养基中,在25-30℃培养45-50小时，得到血红密孔菌一级种子；

(2)发酵培养：取步骤(1)获得的血红密孔菌的一级种子，在6000-10000rpm离心8-12min，弃上清，用发酵培养基将菌体重悬，在25-30℃，100-150rpm条件下，发酵40-50h；所述一级种子与发酵培养基的体积比为1：10-12.5；

(3)降解磺胺类化合物：将磺胺类化合物生产排放废水与步骤(2)获得的发酵液混合，使磺胺类化合物的浓度为20-50mg/L，加入2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐，使浓度为0.4-0.6mM，降解5-8h。

马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基优选为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂18g/L，自然pH，余量是水。

马铃薯葡萄糖液体培养基优选为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，自然pH，余量是水。

优选地，发酵培养基用下述方法制成：取葡萄糖,1.0g/L；KH₂PO₄,1.0g/L；NaH₂PO₄,0.13g/L；2,2-二甲基琥珀酸1.0g/L；MgSO₄·7H₂O,0.5g/L；CuSO₄·5H₂O,0.01g/L；CaCl₂·2H₂O,0.05g/L；ZnSO₄·7H₂O,0.03g/L；MnSO₄·H₂O,0.02g/L；CoCl₂·6H₂O,0.001g/L；乙酸钠1g/L，加水溶解，灭菌，得溶液一；取(NH₄)₂SO₄,0.5g/L；FeSO₄·7H₂O,0.01g/L；加水溶解，使用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得溶液二；将溶液一和溶液二混合，加足余量水。

磺胺类化合物优选为磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺异恶唑、磺胺二甲基嘧啶或磺胺二甲氧嘧啶。

本发明的优点：

本发明的方法不但提供了一种可以使P.sanguineus在没有诱导物存在的情况下快速产漆酶的培养条件，而且建立了一种在发酵液中利用整个菌体及其胞外环境进行磺胺类化合物降解的方法，省去了分离纯化等一系列繁琐的步骤。本发明发酵时间大大缩短，降解率也显著提高。并且，在本发明的条件下，降解过程可以被准确地重复，十分稳定。

附图说明

图1为血红密孔菌在发酵过程中产漆酶的情况。

图2为血红密孔菌降解磺胺甲恶唑(SMX)的情况。

具体实施方式

2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐英文为,2-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS)

下面结合具体实施例对本发明进一步说明：

各实施例中：

马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂18g/L，自然pH，余量是水。

马铃薯葡萄糖液体培养基为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，自然pH，余量是水。

发酵培养基用下述方法制成：取葡萄糖,1.0g/L；KH₂PO₄,1.0g/L；NaH₂PO₄,0.13g/L；2,2-二甲基琥珀酸1.0g/L；MgSO₄·7H₂O,0.5g/L；CuSO₄·5H₂O,0.01g/L；CaCl₂·2H₂O,0.05g/L；ZnSO₄·7H₂O,0.03g/L；MnSO₄·H₂O,0.02g/L；CoCl₂·6H₂O,0.001g/L；乙酸钠1g/L，加水溶解，灭菌，得溶液一；取(NH₄)₂SO₄,0.5g/L；FeSO₄·7H₂O,0.01g/L；加水溶解，使用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得溶液二；将溶液一和溶液二混合，加足余量水。

实施例1

用血红密孔菌降解磺胺类化合物的方法，包括如下步骤：

(1)种子培养：将保藏编号为CGMCC 5.815的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中，在28℃培养7天；再转入马铃薯葡萄糖液体培养基中,在28℃培养48小时，得到血红密孔菌一级种子；

(2)发酵培养：取步骤(1)获得的血红密孔菌的一级种子40mL，在8000rpm离心10min，弃上清，用460mL发酵培养基将菌体重悬，在28℃，130rpm条件下，发酵48h，漆酶酶活为0.85U/mL,见图1；

(3)降解磺胺类化合物：将磺胺甲恶唑生产排放废水与步骤(2)获得的发酵液混合，使磺胺甲恶唑的浓度为50mg/L，加入2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐，使浓度为0.5mM，降解6h。(见图2，图2中的54小时是步骤(2)的48h和步骤(3)的6h之和)磺胺甲恶唑(SMX)降解率为100％。

实施例2

用血红密孔菌降解磺胺类化合物的方法，包括如下步骤：

(1)种子培养：将保藏编号为CGMCC 5.815的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中，在25℃培养8天；再转入马铃薯葡萄糖液体培养基中在25℃培养50小时，得到血红密孔菌一级种子；

(2)发酵培养：取步骤(1)获得的血红密孔菌的一级种子45mL，在6000rpm离心12min，弃上清，用450mL发酵培养基将菌体重悬，在25℃，100rpm条件下，发酵50h；漆酶酶活为0.78U/mL；

(3)降解磺胺类化合物：将磺胺嘧啶生产排放废水与步骤(2)获得的发酵液混合，使磺胺嘧啶的浓度为20mg/L，加入2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐，使浓度为0.4mM，降解5h。

磺胺嘧啶降解率为100％。

实施例3

用血红密孔菌降解磺胺类化合物的方法，包括如下步骤：

(1)种子培养：将保藏编号为CGMCC 5.815的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中，在30℃培养6天；再转入马铃薯葡萄糖液体培养基中在30℃培养45小时，得到血红密孔菌一级种子；

(2)发酵培养：取步骤(1)获得的血红密孔菌的一级种子40mL，在10000rpm离心8min，弃上清，用500mL发酵培养基将菌体重悬，在30℃，150rpm条件下，发酵40h；漆酶酶活为0.92U/mL；

(3)降解磺胺类化合物：将磺胺异恶唑生产排放废水与步骤(2)获得的发酵液混合，使磺胺异恶唑的浓度为35mg/L，加入2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐，使浓度为0.6mM，降解8h。

磺胺异恶唑降解率为100％。

实验证明，用磺胺二甲基嘧啶或磺胺二甲氧嘧啶替代本实施例的磺胺异恶唑，其它同本实施例，其降解率均为100％。

高效液相色谱所用色谱柱为C18色谱柱，所用仪器为Waters e2695Alliance HPLC和2489UV/Visible检测器，检测波长为265nm。检测条件为：色谱柱温度30℃，进样体积10μL，流速1mL·min-1。流动相组成：40％乙腈and 60％0.1％甲酸溶液。