新的以三唑为基础的解毒剂和它们的应用的制作方法

专利名称：新的以三唑为基础的解毒剂和它们的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的亲合配体，它们的制备和与基质的连接，所述的基质是由固体、半固体，微粒或者特别是胶体物质或可溶性聚合物。本发明还涉及这些新的亲合配体-基质接合体及其制备和以其结合由各种流体如水、水溶液、体液、血液、血浆、药用产品的溶液、蛋白质和生命起源的其它化合物中除去内毒素的应用。
由格兰氏阴性菌的细胞壁释放出来的内毒素被认为是伴有格兰氏阴性败血症的许多病理出现的基本原因。血液中有pg/ml浓度的内毒素就会导致多种细胞因子的释放，包括白细胞介素和TNF。内毒素对免疫系统的刺激导细胞因子的大量释放，最终会引起代谢混乱和感染性休克。在感染性休克期间，互补和凝聚的串联被活化，血管渗透性增加。这可能导致血管内凝聚的散布和多器官功能衰竭，并常常有致命的后果。由于对感染缺少最初的响应，感染性休克常常会继续发展，从而使血液中产生的内毒素达到临界水平。
除了在肠胃外药用产品中由于存在活的格兰氏阴性菌或细胞壁碎片显然的危险的以外，在药物制剂中存在游离的内毒素也是主要问题。由于内毒素是有效的免疫刺激物，在很低的浓度下基可能引起毒性反应，包括发热效应。内毒素是相对稳定的分子，用常规的高压灭菌或有机溶剂处理不能使其失活。与浓氢氧化钠接触或延长高温(250℃)的时间可使内毒素失活，虽然此方法对大多数生物制品并不适用。另外，要在生物治疗剂制备的整个过程中使其完全不育是有问题的。因此，非常需要由肠胃外药物中高效的捕获和排除内毒素，特别是在已知内毒素与治疗制剂的组分有关的情况下。
已经有多种技术用于排除水溶液中的内毒素，包括超滤、活性碳吸附、阳离子交换色谱和各种固定亲合配体，包括多粘菌素B和内毒素结合蛋白质。所有这些技术都有很大的缺陷，特别是在把内毒素由大分子量的化合物如治疗用蛋白质中除去的情况下更是如此。超滤只能用于除去低分子量化合物中的内毒素，而活性碳吸附趋向于促进大多数有机化合物的结合。在由水中除去内毒素时，阳离子交换色谱是有效的，但对含有蛋白质的溶液作用很小，特别是对有酸性等电点的蛋白质更是如此。多粘菌素B，是环状多肽抗生素，就用于纯化治疗用产品而言毒性太大，而就商业应用而言，内毒素结合蛋白价格太贵。
固定化的阳离子氨基酸(组氨酸、赖氨酸和精氨酸)已经被用于除去内毒素(Tosa，T.等人，Molecular Interactions inBioseparations，Ed.Ngo，T.T.，Plenum Press，New York，pp.323-332，1993；Lawden，K.H.等人，Bacterial EndotoxinsLipopolysaccharides From Genes to Therapy，Wiley-Liss Inc.，pp.443A52，1995)。通过将氨基酸直接连接于环氧活化的色谱基质制备这些材料。pyrosepTM是由Tanabe Seiyaku Company Limited，Osaka，Japan，制造的商品，是将一个组氨酸基团通过己二胺间隔臂固定于载体基质。另外，这些材料适用于由水或低分子量的溶液中除去内毒素，但是此方法在有盐(＞50mM)或有与内毒素有亲合性的蛋白质存在时，其效果就要打折扣。因此，没有一种除去内毒素的方法适用于由肠胃外施用的生物治疗化合物中除去内毒素。特别是，确实没有单一作用的和安全的方法由蛋白质治疗剂中除去内毒素。
由血液或血浆中除去内毒素有可能提供有效的控制感染性休克的方法，特别是在感染的早期或在预防的情况下，预期感染性休克的危险增加(例如主要是肠或肝的手术)。已有报道说应用直接作用于内毒素或在休克反应的最初阶段释放的细胞因子的单克隆抗体。但是，发现这些方法中大多数是无效的(Siegel，J.P.，Drug Information Journal 30，pp.567-572，1996)。相反，应用纤维-固定的多粘菌素B完成了由全血中在体外除去内毒素(Aoki，H.等人.，Nippon Geka Gakkai Zasshi(Japan)，94，pp.775-780，1993)，虽然保留了多粘菌素B lechates的毒性。因此，与内毒素结合配体的结合有亲合性的吸附剂对内毒素有高亲合性和低毒性，对处置败血症也是有益的。
固定化的氨基酸也作为有效的内毒素除去剂进行了研究，但是这些物质与内毒素的结合弱，并且没有特异性，在从生物流体和生物化合物的溶液中除去内毒素方面的价值是有限的。已有报告说以三唑为基的化合物可选择性的与蛋白质结合；但是，这些配体不能用于分离内毒素。
发明综述本发明涉及发现了合成的亲合性配体结构，该结构可选择性地与内毒素结合。已经发现了新的亲合性配体所属基团，该基团对内毒素显示了高亲合性，并且可用于由多种来源中分离内毒素。
本发明的特征是提供了由生物物质中除去内毒素污染的一般性工具。内毒素与本发明的亲合性配体-基质结合物结合得非常紧密。此特征能够使之高效地由水或水溶液中萃取出内毒素，从而提供了生产无热原水或无热原溶液的方法。对于除去内毒素，本发明的亲合性配体-基质结合物是特别有价值的，内毒素可与蛋白质、药物或其它可作为药物或药用的生物化合物结合或相联系。某些生物化合物，特别是蛋白质，常常可用于内毒素紧密的结合，其结果是用现有的方法要除去是很困难的。本发明的亲合性配体-基质结合物也可应用于由血液和血浆中除去内毒素，因此而提供了在体外或体内除去内毒素的特别有用的方法，例如，后者可通过内毒素的体外萃取装置来实现。这种装置对除去内毒素时特别有价值的，内毒素在发生细菌感染时可释放到血液中，这些感染常常会引起对生命有威胁的疾病如败血症或脑膜炎。除去血液中生成的内毒素对治疗这些疾病以及预防和治疗感染性休克是特别有利的。
本发明提供的新的亲合性配体-基质结合物可用来代替其它的内毒素结合材料，并且在此应用中更易于掌握，更健全，价格低，以及产生和提供更高的内毒素有效结合率。
本发明涉及亲合性配体-基质结合物，包括具有下述通式(I)的配体 其中符号X之一表示氮原子，另一符号X表示氮原子或带有氯原子或氰基基团的碳原子；A1和A2各自独立地表示氧原子、硫原子或基团N-R1；R1表示氢原子、具有1-6个碳原子的烷基、具有1-6个碳原子的羟基烷基、苄基或β-苯基乙基基团；B1和B2各自独立地表示任意取代的、有1-10个碳原子的烃基链(就应用而言，是什么取代基实质上是不重要的)，包括烷基、苯基、萘基和环己基基团；D1表示氢原子、伯氨基、仲氨基、叔氨基、季铵基、咪唑基、胍基或脒基；D2表示伯氨基(例如，由赖氨酸或鸟氨酸衍生的)、仲氨基、叔氨基、季铵基、咪唑基、胍基或脒基；和p是0或1。
所述的配体连接于载体基质的Z位上，任选通过插入配体和基质之间的间隔臂连接。另外，在本发明的新配体中，Z表示能与活化(如果必要或希望)或失活的固体基质反应的官能基类型。发明的详细描述在与基质结合时，任选的间隔臂优选用下述通式(II)表示-T-[L-V]m-(II)其中T表示氧原子、硫原子或基团N-R2；其中R2表示氢原子或具有1-6个碳原子的烷基；V表示氧原子、硫原子、-COO-基团、CONH基团或NHCO基团、-PO3H基团、NH-亚芳基-SO2-CH2-CH2-基团或N-R3基团；其中R3表示氢原子或具有1-6个碳原子的烷基；L表示任意取代的、有2-10个碳原子的烃基链；和m是0或1。
载体基质可以是任意化合物或材料，颗粒或非颗粒、可溶或不可溶、多孔或非多孔，可用于和亲核性配体连接，以形成亲核性配体-基质结合物，并且提供了在接触的溶液中将亲核性配体与溶质分离的便利手段。
本发明提供了亲核性配体-基质结合物，所述的亲核性配体-基质结合物可用于由水、水溶液、体液、血液、血浆、药用产品溶液、蛋白质和其它生物源的化合物中分离或除去内毒素。
在优选的实施方案中，本发明提供了用下述通式(III)表示的亲核性配体-基质结合物 其中A1、A2、B1、B2、D1、D2、p、X、T、L、V、m、R1、R2和R3同上文定义；以及M表示载体基质的残基，所述的基质可以是任意化合物或材料，颗粒或非颗粒、可溶或不可溶、多孔或非多孔，可用于和亲核性配体连接，以形成亲核性配体-基质结合物，并且提供了在接触的溶液中将亲核性配体与溶质分离的便利手段。
可以理解的是，在本发明中，还涉及化合物的应用，这些化合物是带有-T-[L-V]0-1-M取代基或其前体，和通过杂原子连接于环上的其它取代基的嘧啶类、二嗪类或三嗪类。这些取代基包括具有0-20个碳原子的非干扰基团。
在本说明书中，无论何时用到复数或全称的术语内毒素时，是指取自任何微生物来源的内毒素。术语内毒素是指包括肠杆菌科、从赤壳菌科和衣原体科的任何物种中的脂多糖。因为已知内毒素不是纯一的，因此这里所用的术语“内毒素”包括所有天然存在的形式，包括以共价键连接于多糖的脂质A，包括其类似物、衍生物、碎片和前体。
这里所用的术语“伯胺基”，不论其是单独使用还是结合使用，是指-NH2基团。
这里所用的术语“仲胺基”，不论其是单独使用还是结合使用，是指-NHR4基团；其中R4表示具有1-6个碳原子的直链或支链的烷基。
这里所用的术语“叔胺基”，不论其是单独使用还是结合使用，是指-NR5R6基团；其中R5和R6各自表示具有1-6个碳原子的直链或支链的烷基。
这里所用的术语“季铵基”，不论其是单独使用还是结合使用，是指-NR7R8R9+基团；其中R7、R8和R9各自表示具有1-6个碳原子的直链或支链的烷基；这里所用的术语“具有1-6个碳原子的烷基”，不论其是单独使用还是结合使用，是指直链或支链的，具有1-6个碳原子的饱和烃基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、4-甲基戊基、新戊基和2，2-二甲基丙基。
这里所用的术语“具有1-6个碳原子的羟基烷基”，不论其是单独使用还是结合使用，是指直链或支链的，被一个或多个羟基取代的具有1-6个碳原子的饱和烃基，优选被一个羟基取代，例如羟基甲基、2-羟基乙基、3-羟基丙基、4-羟基丁基5-羟基戊基和6-羟基己基。
这里所用的术语“具有1-6个碳原子的烷氧基”，不论其是单独使用还是结合使用，是指直链或支链的一价取代基，其中包括通过醚氧键连接的、具有1-6个碳原子的烷基，所述的醚氧从醚氧上有一个游离的键，并且具有1-6个碳原子，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基和戊氧基。
术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
这里所用的术语“具有1-6个碳原子的酰氧基或酰氨基”是一价取代基，该取代基含有与羰氧基或氧羰基连接的具有1-5个碳原子的烷基基团，如甲基羰氧基、乙基羰氧基或乙基氧羰基基团，或是与羰基氨基或氨基羰基连接，例如甲基羰基氨基、乙基羰基氨基、甲氨基羰基或乙氨基羰基。
这里所用的术语“具有1-6个碳原子的烷基磺酰基”是一价取代基，该取代基含有与磺酰基连接的具有1-6个碳原子的烷基基团，例如甲磺酰基、乙磺酰基、正丙基磺酰基、异丙基磺酰基、正丁基磺酰基、仲丁基磺酰基、异丁基磺酰基、叔丁基磺酰基、正戊基磺酰基、2-甲基丁基磺酰基、3-甲基丁基磺酰基、正己基磺酰基、4-甲基戊基磺酰基、新戊基磺酰基和2，2-二甲基丙基磺酰基。
术语“一个或多个取代基独立地选自”优选1-3个取代基，该术语更优选1-2个取代基，最优选1个取代基。
这里所用的术语“具有2-20个碳原子的任意取代的烃基链”是指一个或多个直链或支链的烷基链，由诸如羟基或其中具有1-6个碳原子的烷氧基基团所取代，如果该链含有2-20个碳原子，可任意地与氨基、醚、硫醚、酰胺或磺酰胺键连接。该构造优选是柔性的，例如这种任意取代的构成在Lowe，C.R.和Dean，P.D.G，1974，AffinityChromatography，John Wiley & Sons，London，中已有描述，本文引用其作为参考。
这里所用的术语“具有1-10个碳原子的任意取代的烃基链”，不论其是单独使用还是结合使用，是指被一个或多个官能基任意取代的、具有1-10个碳原子的直链或支链的烃基链，所述的官能基包括但不限于羧基，和羟基，优选一个羧基。
在本发明的一个优选实施方案中，R1表示氢原子。
在本发明的另一优选实施方案中，R2表示氢原子。
在本发明的另一优选实施方案中，R3表示氢原子。
在本发明的另一优选实施方案中，R4表示甲基、乙基或丙基。
在本发明的另一优选实施方案中，R5表示甲基、乙基或丙基。
在本发明的另一优选实施方案中，R6表示甲基、乙基或丙基。
在本发明的另一优选实施方案中，R7表示甲基、乙基或丙基。
在本发明的另一优选实施方案中，R8表示甲基、乙基或丙基。
在本发明的另一优选实施方案中，R9表示甲基、乙基或丙基。
在本发明的一个优选实施方案中，A1表示N-R1，其中R1如上文定义。
在本发明的另一优选实施方案中，A2表示N-R1，其中R1如上文定义。
在本发明的另一优选实施方案中，B1表示-CHCOOC-CH2-基团、-CHCOOH-(CH2)2-基团、-CHCOOH-(CH2)3-基团、-CHCOOH-(CH2)4-基团、乙基、丙基、2-羟基丙基、丁基、戊基、己基或苯基。
在本发明的另一优选实施方案中，B2表示-CHCOOH-CH2-基团、-CHCOOH-(CH2)2-基团、-CHCOOH-(CH2)3-基团、-CHCOOH-(CH2)4-基团、乙基、丙基、2-羟基丙基、丁基、戊基、己基或苯基。
在本发明的另一优选实施方案中，D1代表氢、氨基、咪唑基、胍基、脒基、三甲基铵基、三乙基铵基、二甲基氨基、二乙基氨基、甲氨基或乙氨基。
在本发明的另一优选实施方案中，D2代表氨基、咪唑基、胍基、脒基、三甲基铵基、三乙基铵基、二甲基氨基、二乙基氨基、甲氨基或乙氨基。D2(D1常常也是)优选强荷电基。
在本发明的另一优选实施方案中，p代表0和1。
在本发明的另一优选实施方案中，两个X代表氮原子。
在本发明的另一优选实施方案中，T代表氧原子，或较优选表示NH基。
在本发明的另一优选实施方案中，L代表丁基、戊基、庚基、辛基、壬基、癸基或十二烷基，V和m定义同前。
在本发明的另一优选实施方案中，V代表氧原子、-COO-基、PO3H-基或N-R3基；比较优选氧原子或NH基，L和m定义同前。
在本发明的另一优选实施方案中，m代表1，L和V定义同前。
术语“x和y之间的整数x”可包括x(包括0)和y。
本发明还提供本发明的新的亲合性配体-基质结合体的制造方法，该方法包括以任一顺序进行下述反应，(i)使与通式(IV)的卤代杂环化合物 式中X具有同上文定义的含义，W代表卤原子，与(ii)通式(v)的化合物反应D1-[B1]p-A1-H(V)式中D1，B1，A1和p具有同上文定义的含义，H是氢，(iii)与通式(VI)的化合物反应D2-B2-A2-H(VI)式中D2，B2和A2具有同上文定义的含义，H是氢，和(iv)与通式(VII)的任意衍生的载体基质反应
H-T-[L-V]m-M(VII)式中T，L，V，m和M具有同上文定义的含义，H是氢，或，与通式(VIII)的连结单元反应H-T-L-V-H(VIII)式中T，L，和V具有同上文定义的含义，得到通式(IX)化合物 式中A1，A2，B1，B2，D1，D2，p，X，T，L，V，m，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8和R9具有与上文定义相同的含义；而后通过本领域专业技术人员熟悉的活化和偶联的方法，使通式(IX)进一步与其残基由M表示的载体基质反应。
作为通式(IV)的卤代杂环化合物的例子，可例举出5-氯-2，4，6-三氟嘧啶、5-氰基-2，4，6-三氯嘧啶、氰尿酰氟、氰尿酰溴，上述化合物中最重要的是氰尿酰氯。
作为通式(V)的化合物的例子，可例举出氨、水、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、α，γ-二氨基丁酸、间-氨基苄脒、对-氨基苄脒、间-氨基苯三甲基溴化铵、对-氨基苯三甲基溴化铵、2-(二乙氨基)乙胺、2-(氨基乙基)三甲基氯化铵、组胺、胍基丁胺、乙二胺、1，3-二氨基丙烷、1，3-二氨基-2-羟基丙烷、1，4-二氨基丁烷、1，5-二氨基戊烷、1，6-二氨基己烷。
作为通式(VI)的化合物的例子，可例举出精氨酸、赖氨酸、组氨酸、α，γ-二氨基丁酸、间-氨基苄脒、对-氨基苄脒、间-氨基苯三甲基溴化铵、对-氨基苯三甲基溴化铵、2-(二乙氨基)乙胺、(2-氨基乙基)三甲基氯化铵、组胺、胍基丁胺、乙二胺、1，3-二氨基丙烷、1，3-二氨基-2-羟基丙烷、1，4-二氨基丁烷、1，5-二氨基戊烷、1，6-二氨基己烷。
其残基由M表示的载体基质的例子，可例举出不溶性的载体基质，如天然聚合物，例如多肽或蛋白质，如交联清蛋白或多糖类，如琼脂糖、藻酸酯、角义菜聚糖、甲壳素、纤维素、葡聚糖或淀粉；合成聚合物，如聚丙烯酰基酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯醛、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸酯或全氟化碳；无机化合物如二氧化硅、玻璃、硅藻土、矾土、氧化铁或其他金属氧化物，或由两个以上的天然聚合物、合成聚合物或无机化合物的任意结合构成的共聚物。在残基由M表示的载体基质的定义内，还包括聚合物如葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯醇或水解淀粉在内的可溶性载体基质，它们为在液体分配中使用提供亲合-配体接合体；或包括如全氟萘烷化合物的载体基质，它们在形成亲合乳化液的应用中提供亲合-配体接合体。为避免产生疑问，载体基质在这里被定义为可用于形成本发明的新亲合配体-基质结合体，并提供从接触溶液中使亲合配体与溶质分离的常规方法的任何化合物或材料，不管是颗粒或非颗粒、可溶解的或非溶性的、多孔的或非多孔的。
在其残基由M表示的载体基质的定义之内，还包如下的载体基质，如琼脂糖、纤维素、葡聚糖、淀粉、藻酸盐、角义菜聚糖、合成聚合物、二氧化硅、玻璃和金属氧化物，它们在与配体结合前、结合中通过活化剂处理而被改性。
在本发明的一个优选实施方案中，M表示选择性活化的琼脂糖、二氧化硅、纤维素、葡聚糖、玻璃、toyopearl、羟基乙基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、苯乙烯二乙烯基苯、Hyper D、全氟烃、聚砜、聚醚砜、聚1，2-二氟亚乙烯(polyvinylidine fluoride)、尼龙和聚氯乙烯。M优选选择代表三氟乙磺酰基(tresyl)-活化的、磺酰氯-活化的、甲苯磺酰基-活化的、乙烯砜-活化的或环氧-活化的琼脂糖。
存在大量的具有用于使配体附着在支撑基质上这种一般目的的活化剂。这些化合物及其使用方法是本领域专业技术人员所熟知的，既然本发明的核心在于附着在基质上配体的性质，而不在于附着的方式，所以任何一个这样的活化剂都可用于制备本发明的新基质-配体接合物。作为这种活化剂的非限制性例子可举出以下这些各种各样的化合物，如溴化氰、氰尿酰氯、高氯醇、二乙基砜、对-甲苯磺酰氯、1，1’-羰基二咪唑、偏高碘酸钠、2-氟-1-甲基吡啶翁甲苯-4-磺酸盐、环氧丙基三甲氧基甲硅烷、2，2，2-三氟乙磺酰氯。如上面指出的那样，进行活化步骤的方法是本领域专业技术人员所熟悉的。
同样，有许许多多的凝聚剂可用于将通式(VIII)和(IX)化合物附着在下述支撑基质上，如琼脂糖、纤维素、葡聚糖、淀粉、藻酸盐、角义菜聚糖、二氧化硅或玻璃。这些化合物及其使用方法也是本领域专业技术人员所熟悉的，还有，因为本发明的核心在于配体的性质，而不在于连接的方式，所以任何一种这样的缩合剂都可用于制备本发明的新基质-配体接合物。作为这种缩合剂的非限制性例子，可举出的是N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉、二环己基碳化二亚胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺。
作为可用于制备通式(IX)化合物的通式(VIII)连结单元的例子，可举出的二胺例如是乙二胺、N，N-二甲基乙二胺、N-乙基乙二胺、N-(β-羟乙基)乙二胺、丙二胺、N-甲基丙二胺、N-(β-羟乙基)丙二胺、1，4-二氨基丁烷、1，5-二氨基戊烷、1，6-二氨基己烷、1，7-二氨基庚烷、1，4-二氨基辛烷、1，9-二氨基壬烷、1，10-二氨基癸烷、1，12-二氨基十二碳烷、哌嗪、3-羟基-1，5-二氨基戊烷、间-和对-苯二胺、间-和对-氨基苯甲胺；氨醇，如乙醇胺、N-甲基乙醇胺、N-丙基乙醇胺、二乙醇胺、3-羟基丙胺、2，3-二羟基丙胺、异丙醇胺、5-氨基戊-1-醇、和6-氨基己-1-醇；氨基酚，如邻-、间-和对-氨基苯酚、氨基羧酸如对羟基苯基甘氨酸、N-甲基对羟基苯基甘氨酸、3-和4-氨基丁酸、3-氨基异丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、7-氨基庚酸、间-和对-氨基苯甲酸；氨基膦酸，如间-氨基苯膦酸和对-氨基苯甲基膦酸；和氨基亚芳基乙烯基砜的前体，如苯胺-3-β-硫酸根合乙基砜和苯胺-3-β-硫酸根合乙基砜。
通式(IV)的卤代杂环化合物与通式(V)、(VI)、(VII)和(VIII)化合物的反应，可在与水不混溶的有机溶剂中进行；或在与水混溶的有机溶剂中进行，或在水与水混溶的有机溶剂混合物中进行。与水不混溶的适宜的有机溶剂的例子是甲苯、二甲苯和氯苯；与水混溶的适宜的有机溶剂的例子是丙酮、甲乙酮和二噁烷。卤代杂环化合物的第一个反应在温度0℃和25℃之间，理想的在0℃和5℃之间进行；第二个反应在温度20℃和50℃之间，理想的在30℃和45℃之间进行；第三个反应在温度20℃和100℃之间进行。在这些反应期间，无机酸如盐酸或产生的盐酸，由酸的结合剂进行中和，如氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钙或碳酸钙。
另外，通式(IX)化合物可与可聚合的活性单体反应形成可聚合的通式(X)化合物 其中A1，A2，B1，B2，D1，D2，p，X，T，L，V，m，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8和R9具有与上文定义相同的含义；R11表示氢原子或含有1-6个碳原子的烷基；R12表示羰基、亚甲基、-NH-CH2-基团或-S-CH2-基团。可聚合的活性单体的实例包括丙烯酰氯、甲基丙烯酰氯、烯丙基溴、烯丙基胺或3，4-环氧丙烷。通式(X)的可聚合化合物可选择在其它可聚合单体存在下，聚合成通式(III)的亲合性配体基质结合物。这些聚合方法是本领域技术人员所熟知的。
本发明的另一实施方案涉及新的通式(XI)的亲合性配体基质结合物 其中A1，A2，B1，B2，D1，D2，p，X，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8和R9具有与上文定义相同的含义，卤素表示氟、氯、溴或碘原子。
进一步的，本发明涉及将上文定义的通式(XI)的新亲合性配体与上文定义的通式(VII)的基质结合的方法，该方法是使新的亲合性配体与基质在0℃-100℃的温度下，和选择性地存在酸结合剂的情况下进行反应。
本发明的另一实施方案涉及新的通式(XII)的亲合性配体 其中A1，A2，B1，B2，D1，D2，p，X，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8和R9具有与上文定义相同的含义，以及j是2-20的整数。
进一步的，本发明涉及制备上述新的亲合性配体的方法，该方法包括使上述通式(XI)化合物与通式H2N-(CH2)j-NH2的亚烷基二胺在0℃-100℃的温度下，和选择性地存在酸结合剂的情况下进行反应。
本发明的另一实施方案涉及新的通式(XIII)的亲合性配体 其中A1，A2，B1，B2，D1，D2，p，X，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8和R9具有与上文定义相同的含义；j是2-20的整数，以及q是0或1。
进一步的，本发明涉及将上文定义的通式(XIII)的亲合性配体与上文定义的通式(VII)的基质结合的方法，该方法包括使新的亲合性配体与基质在0℃-100℃的温度下，在酸结合剂存在下进行反应。这些结合剂的非限制性实例是N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉、二环己基碳化二亚胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺。
进一步的，本发明涉及制备上述新的通式(XIII)亲合性配体的方法，该方法包括使上述通式化合物与通式H2N-(CH2)j-(CO)q-OH在0℃-100℃的温度下，和选择性地存在酸结合剂的情况下进行反应。
本发明的另一实施方案涉及新的通式(X)的亲合性配体，其中A1，A2，B1，B2，D1，D2，p，X，T，L，V，m，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8和R9具有与上文定义相同的含义；R10表示氢原子或含有1-6个碳原子的烷基；R11表示羰基、亚甲基、-NH-CH2-基团或-S-CH2-基团；优选L表示含有4-10个碳原子的烷基，优选T表示-NH2-基团，优选V表示-NH2-基团，和优选m是1。
本发明的另一优选实施方案涉及新的通式(XIV)的亲合性配体 其中A1，A2，B1，B2，D1，D2，p和R1具有与上文定义相同的含义。
本发明的另一优选实施方案涉及新的通式(XV)的亲合性配体 其中A1，A2，B1，B2，D1，D2，p和R1具有与上文定义相同的含义，j是2-20的整数。
本发明的另一优选实施方案涉及通式(X)，(XI)，(XII)，(XIII)，(XIV)和(XV)亲合性配体，其中D1和D2均各自独立地表示胍基、咪唑基、伯氨基、二乙氨基、三甲铵基或三乙铵基。
本发明的另一优选实施方案涉及通式(IX)，(X)，(XI)，(XII)，(XIII)，(XIV)和(XV)的亲合性配体，其中p是1。
本发明的另一优选实施方案涉及通式(IX)，(X)，(XI)，(XII)，(XIII)，(XIV)和(XV)亲合性配体，其中B1和B2均各自独立地表示-CHCOOH-(CH2)3-基团、-CHCOOH-(CH2)4-基团、丁基、戊基或苯基。
本发明的另一优选实施方案涉及通式(IX)，(X)，(XI)，-(Xt1)，(XIII)，(XIV)和(XV)的亲合性配体，其中A1和A2各自独立地表示-NH-基团。
本发明的另一优选实施方案涉及通式(IX)，(X)，(XI)，(XII)和(XIII)亲合性配体，其中X表示氮原子。
本发明的另一优选实施方案涉及通式(XII)，(XIII)和(XV)的亲合性配体，其中j是4-10。
本发明优选的亲合性配体是 有价值的亲合性配体基质结合物由通式(XXVII)表示 其中B1，B2，D1，D2，p，M，R1，R2和R3具有与上文定义相同的含义，j是4-20的整数。
特别有价值的亲合性配体基质结合物由通式(XXVIII)表示 其中B1，B2，D1，D2，p，M，R1，R2，R3和M具有与上文定义相同的含义。
具体地说，使通式(XXIX)化合物 与3-丙氧基-(1，2-环氧)衍生的基质在0℃-100℃的温度下，和在酸结合剂的存在下进行反应，得到新的亲合性配体基质结合物，该结合物在与水、水溶液、蛋白质、药物、血液和血浆结合时有优异效果。
本发明优选的亲合性配体基质结合物是 其中的M定义同上。
本发明包括所有这些亲合性配体-载体基质在内毒素或其类似物、碎片、衍生物和前体的分离、离析、纯化、定量、鉴定和特征化中的用途。
内毒素是一组脂多糖，常常被缩写为LPS，它们具有共同的结构。内毒素有多种形式，例如最有意义的内毒素类型包括与核心多糖组分连接的脂质A，该组分也可连接于多糖的O-特异性链。核心多糖可由内核、与外层寡糖连接的内核或与外核连接的内核。已知内毒素是特别不同的，特别是关于O-特异性链多糖和外层的核心多糖。因为内毒素是不同的，因此这里所用的术语“内毒素”包括所有天然存在的形式，包括与多糖共价键连接的脂质A，包括其类似物、衍生物、碎片和前体，不管其来源如何，所有这些形式都是本发明要求专利保护的主题。
进一步的，本发明涉及将新的上文定义的通式(IX)、上文定义的通式(X)、上文定义的通式(XII)、上文定义的通式(XV)、上文定义的通式(XXIX)的亲合性配体连接于碳水化合物或有机聚合物基质的方法，该方法包括使碳水化合物或有机聚合物基质与活化剂反应，然后使活化的基质与新的亲合性配体反应，反应在选择性存在酸结合剂的情况下进行。本发明还涉及将新的上文定义的通式(XIII)的亲合性配体连接于碳水化合物或有机聚合物基质的方法，该方法是将其与基质缩合。本发明进一步涉及将上文定义的通式(IX)、上文定义的通式(X)、上文定义的通式(XII)、上文定义的通式(XV)、上文定义的通式(XXIX)的新的亲合性配体连接于金属氧化物、玻璃或二氧化硅基质的方法，该基质选择性地涂有有机聚合物，该方法包括使涂复后的金属氧化物、玻璃或二氧化硅基质与活化剂反应，接着使活化的基质与新的亲合性配体反应，反应在选择性存在酸结合剂的情况下进行。本发明的另一实施方案涉及使新的上文定义的通式(XIII)的亲合性配体与涂复后的金属氧化物、玻璃或二氧化硅基质连接的方法，该方法是将其与基质缩合。本发明的另一实施方案涉及将上文定义的通式(XI)、上文定义的通式(XIV)和上文定义的通式(XVI-XXVI)的新亲合性配体与上文定义的通式(VII)的基质结合的方法，该方法是使新的亲合性配体与基质在-0℃-100℃的温度下，在选择性存在酸结合剂的情况下进行反应。本发明还涉及按照上述方法制备的所有的亲合性配体-基质结合物。
在另一实施方案中，本发明涉及本发明亲合性配体和的亲合性配体-基质结合物在离析、分离、纯化、特征化、鉴定或定量分析内毒素时的应用。本发明的另一实施方案涉及在pH为1.0-13.0时，将含有内毒素的溶液或液体应用于本发明的亲合性配体-基质结合物的各种方法。本发明还涉及有各种流体中分离内毒素的方法，所述的流体例如是水、水溶液、体液、血、血浆、药用产品溶液、蛋白质和生物来源的其它化合物，该方法是在亲合色谱中将上文定义的通式(I)化合物作为生物特异性配体。
本发明的另一实施方案涉及本发明亲合性配体和的亲合性配体-基质结合物从全血或血浆中由体外除去内毒素的应用，所述的全血或血浆取自供体，并且在处理之后再灌输给同一的供体或其它接受者。
通过下述实施例将会更详细地描述本发明。但是，实施例只是为了说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1此实施例说明了由通式(IV)的卤代杂环化合物与通式(V)和(VI)的化合物反应合成通式(XIV)所定义的典型的亲合配体。
将在10份丙酮中的1份氰尿酰氯的溶液滴加到在100份水中含有2份L-精氨酸的搅拌溶液中。使该混合物在0-5℃搅拌2小时，随后使该溶液加热到30℃，再继续混合搅拌16小时。通过滴定1M的氢氧化钠溶液始终维持pH在5.0-7.0的范围内。加入固体氯化钠使反应产物沉淀到最后浓度20％(w/v)，过滤并真空干燥。TCL(THF/丙-2-醇/水(1∶2∶1按体积)溶剂)分析显示，存在单一反应产物(Rf0.42)。分离的该化合物的分子量由质谱测定法测定，并发现与包含由2分子的精氨酸(计算的Mr＝459.5；分子离子(+ve FAB)＝460.3，(-ve FAB)＝458.4)衍生的氰尿酰氯的化合物一致。1H-NMR谱与包含精氨酸的化合物一致。
实施例2此实施例说明了选择性衍生的通式(VII)载体基质的合成。
将在12份水中的1份1，6-二氨基己烷的溶液滴加到48份水中含有29份环氧-活化的琼脂糖颗粒(每克琼脂糖凝胶用30μmol环氧基)的搅拌悬浮液中。使该混合物在30℃搅拌24小时，过滤出氨基-已基琼脂糖凝胶，用12×29份水连续地进行洗涤，在完成洗涤后用重力排水。对得到的氨基己基琼脂糖进行分析知存在伯胺(TNBS试验)和环氧基团(硫代硫酸盐/氢氧化钠滴定)，说明完成了环氧基团与1，6-二氨基己烷的反应。
实施例3用1，4-二氨基丁烷、1，5-二氨基戊烷、1，7-二氨基庚烷、1，8-二氨基辛烷、1，9-二氨基壬烷和1，10-二氨基癸烷代替1，6-二氨基己烷，重复实施例2。在所有情况下都得到氨基-烷基衍生的琼脂糖。
实施例4此实施例说明了选择性衍生的通式(VII)载体基质与通式(IV)的反应。
将在10份丙酮中的1份氰尿酰氯的溶液，加入到预冷却的按照实施例2制备的40份氨基-己基琼脂糖基质在pH7.0的0.5M磷酸钾缓冲液中的悬浮液(0-4℃)中。使该混合物在0-4℃搅拌1小时，过滤，用5×40份包含1份丙酮和1份水的溶液、5×40份水、5×40份包含1份丙酮和1份水的溶液和5×40份水依次进行洗涤。对得到的二氯三嗪活化的琼脂糖基质进行分析，看是否存在胺(TNBS试验)和用1M的氢氧化钠处理后释放出氯离子，说明氰尿酰氯和氨基-己基琼脂糖基质上的初级氨基完全反应。
实施例5用实施例3的产物代替实施例2的产物，重复实施例4。对得到的二氯三嗪活化的琼脂糖基质进行分析，看是否存在胺(TNBS试验)和用1M的氢氧化钠处理后释放出氯离子，说明氰尿酰氯和氨基-己基琼脂糖基质上的初级氨基完全反应。
实施例6此实施例说明了按照实施例4制备的产物与通式(VI)和(V)化合物的反应制备通式(III)的亲合配体-基质接合体所有溶液都是由无热源水制备的。
将1份精氨酸加入到在105份pH10.25、0.1M碳酸钠缓冲液中含有35份按照实施例4制备的产物的悬浮液中。使该混合物在30℃搅拌24小时，过滤，用12×35份pH10.25、0.1M碳酸钠缓冲液连续洗涤，并重力排水。这个材料重新成浆于105份pH10.25、0.1M碳酸钠缓冲液中。
将1份N-ε-t-BOC-L-赖氨酸加入到琼脂酸浆液中，使该混合物在85℃搅拌72小时。过滤该悬浮液，用12×35水连续洗涤，并重力排水。使该混合物再悬浮于35份0.1M的三氟乙酸中，在20℃搅拌1小时，过滤，用3×35份甲醇、12×35份水连续洗涤，并重力排水。这个方法需除去t-BOC保护基。
实施例7-14表1给出了合成本发明新亲合配体-基质接合体的更多例子，它们都是由上述方法制备的，但用表1第2列的胺化合物取代精氨酸，用表1第3列的胺化合物取代N-ε-t-BOC-L-赖氨酸。实施例的序号列于表1的第1列。
表1
实施例15该实施例说明通式(III)的亲合配体-基质接合体结合水中内毒素的能力。
将按照实施例6制备的亲合配体-基质接合体(150μl)加入到包含Escherichia coli#055B5内毒素(1.5×104EU)的水(1.5ml)中，并在20℃搅拌1小时。对该样的离心处理，用Limulus Ameobocyte溶菌产物显色试验检测上层液中内毒素的存在。在该上清液中仅检测出0.1EU/ml(相当于10pg/ml)，说明水中99.99％以上的内毒素被排除了。
实施例16-23表2给出了更多的本发明新的亲合配体-基质接合体结合水中内毒素能力的例子。按上面描述的方法进行，所不同的是，亲合配体-基质接合体是按照表2第2列给出的实施例序号合成的，残留在上清液中的内毒素量(EU/ml)列于表2第3列，由亲合配体-基质接合体吸收的内毒素量(％)列于表2第4列。实施例序号列于表2第1列。
表2
实施例24该实施例说明通式(III)的亲合配体-基质接合体从包含内毒素污染溶液的蛋白质中离析内毒素的能力。
将按照实施例6制备的亲合配体-基质接合体(150μl)加入到包含Escherichia coli#055B5内毒素(1.5×104EU)和人的血清白蛋白(15mg)的水(1.5ml)中，并在20℃搅拌1小时。对该样的离心处理，用已作了校正的Limulus Ameobocyte溶菌产物显色试验检测上层液中内毒素的存在，以检测在10mg/ml人的血清白蛋白中的内毒素。在该上清液中检测出的内毒素浓度为50EU/ml，说明从包含10mg/ml人的血清白蛋白的溶液中排除了99.5％以上的内毒素。
实施例25-32表3给出了更多的本发明新的亲合配体-基质接合体从包含内毒素污染溶液的蛋白质中离析内毒素能力的例子。按上面描述的方法进行，所不同的是，亲合配体-基质接合体是按照表3第2列给出的实施例序号合成的，残留在上清液中的内毒素量(EU/ml)列于表3第3列，由亲合配体-基质接合体吸收的内毒素量(％)列于表2第4列。实施例序号列于表3第1列。
表3
实施例33该实施例说明通式(III)的新亲合配体-基质接合体在蛋白质存在下结合内毒素的能力。将按照实施例6制备的亲合配体-基质接合体(150μl)加入到包含Escherichia coli#055B5内毒素(7.5×103-1.5×105EU)和人的血清蛋白(15mg)的水(1.5ml)中，并在20℃搅拌1小时。对该样品离心处理，用已作了校正的Limulus Ameobocyte溶菌产物显色试验检测上层液中内毒素的存在，以检测在10mg/ml人的血清白蛋白中的内毒素。在摄取混合物中存在的内毒素总量和吸收的内毒素量列于表4。
表4
这些结果表明，1g通式(III)的新亲合配体-基质接合体，在10mg/ml人的血清白蛋白存在下，能结合1×106EU(100μg)内毒素，萃取效率大于99％。
实施例34该实施例说明通式(III)的新亲合配体-基质接合体在蛋白质和不同离子强度的缓冲液存在下结合内毒素的能力。将按照实施例6制备的亲合配体-基质接合体(150μl)加入到包含Escherichia coli#055B5内毒素(7.5×104)、人的血清蛋白(15mg)和PBS缓冲液(0-200mM)的水(1.5ml)中，并在20℃搅拌1小时。对该样品离心处理，用已作了校正的LimulusAmeobocyte溶菌产物显色试验检测上层液中内毒素的存在，以检测在10mg/ml人的血清白蛋白中的内毒素。对所有研究的PBS缓冲液浓度，对所存在的内毒素的吸收率都大于99％。这些结果表明，通式(III)的新亲合配体-基质接合体能高效地结合内毒素，并不受离子强度和蛋白质存在的影响。
权利要求
1.一种亲合性配体-基质结合物，其包括基质和基团Z结合其上的具有下述通式(I)结构的亲合性配体 其中X之一表示氮原子，而另一X表示N、CCl或CCN；A1和A2各自独立地表示O、S或N-R1；以及R1表示H、C1-6烷基、C1-6羟基烷基、苄基或β-苯基乙基基团；B1和B2各自独立地表示任意取代的、有1-10个碳原子的烃基链；D1表示H、伯氨基、仲氨基、叔氨基、季铵基、咪唑基、胍基或脒基；和D2表示仲氨基、叔氨基、季铵基、咪唑基、胍基或脒基；或B2-D2是-CHCOOH-(CH2)3-4-NH2；和p是0或1。
2.按照权利要求1的结合物，其中A1和A2各自独立地是N-R1，其中R1如权利要求1定义。
3.按照权利要求2的结合物，其中A1和A2各自是NH。
4.按照前述任一权利要求的结合物，其中B1和B2各自独立地表示-CHCOOH-(CH2)1-4-，或二价的乙基、丙基、2-羟基丙基、丁基、戊基、己基、苯基、萘基或环己基。
5.按照权利要求4的结合物，其中B1和B2各自独立地表示－CHCOOH-(CH2)3-4-，或二价的丁基、戊基或苯基。
6.按照前述任一权利要求的结合物，其中D1是H、氨基、咪唑基、胍基、脒基、三甲铵基、三乙铵基、二甲氨基、二乙氨基、甲氨基或乙氨基。
7.按照前述任一权利要求的结合物，其中D2是咪唑基、胍基、脒基、三甲铵基、三乙铵基、二甲氨基、二乙氨基、甲氨基或乙氨基。
8.按照前述任一权利要求的结合物，其中p是1。
9.按照前述任一权利要求的结合物，其中每个X是N。
10.按照前述任一权利要求的结合物，其中Z是-T-[L-V]m-(II)其中T表示O、S或N-R2以及R2是H或C1-6烷基；V是O、S、-COO-、CONH、NHCO、-PO3H、NH-亚芳基-SO2-CH2-CH2-或N-R3；以及R3是H或C1-6烷基；L表示任意取代的、有2-20个碳原子的烃基链；和m是0或1。
11.按照权利要求10的结合物，其中R2和R3各自是H。
12.按照权利要求10或11的结合物，其中T是O或NH。
13.按照权利要求12的结合物，其中T是NH。
14.按照权利要求9-13任意一项的结合物，其中m是1，和L是二价丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基或十二烷基。
15.按照权利要求10-14任意一项的结合物，其中m是1，和V是O、-CONH-、-NHCO-或N-R3。
16.按照权利要求15的结合物，其中V是O或NH。
17.按照权利要求16的结合物，其中V是NH。
18.按照权利要求16或17的结合物，其中Z-M(M是基质)是-NH-(CH2)4-10-NH-M。
19.按照权利要求18的结合物，选自式XXX-XXXX的任意一个。
20.按照前述任一权利要求的结合物，其中的基质选择性地被三氟乙磺酰基-活化、磺酰氯-活化、甲苯磺酰基-活化、乙烯砜-活化或环氧基-活化。
21.按照前述权利要求1-9任意一项定义的式(I)配体，其中Z是能与固体基质反应的官能基团。
22.按照权利要求21的配体，其中的基质如权利要求20定义。
23.按照权利要求22的配体，其中Z是F、Cl、Br或I。
24.按照权利要求22的配体，其中Z是-NH(CH2)2-20-NH2。
25.按照权利要求22的配体，其中的Z是-NH-(CH2)2-20-(CO)0-1-OH。
26.按照权利要求22的配体，其中Z是-T-[L-V]m-R10-CR11＝CH2(II)其中T、L、V和m如权利要求10-17任意一项定义；R10是CO、CH2、NH-CH2-、或-S-CH2-；和R11是H或C1-6烷基。
27.按照权利要求23的配体，其中Z是Cl，以及每个X是N。
28.按照权利要求24的配体，其中每个X是N。
29.按照权利要求22的配体，选自式XVI-XXVI。
30.按照前述任意一项权利要求的的亲合性配体或结合物在内毒素的分离、离析、纯化、特征化、鉴定或定量中的应用。
31.按照权利要求30的应用，所述的应用是由水、水溶液、体液、血、血浆、药用产品、蛋白质或其它生物来源的化合物的溶液中除去内毒素。
32.按照权利要求31的应用，其中包括用结合物从体外由全血、血浆中除去内毒素，然后再灌输给供体或其它接受者。
33.按照权利要求30-32任意一项的应用，其中的内毒素源来自格兰氏阴性菌。
34.按照权利要求30-35任意一项的应用，其中含有内毒素的溶液或液体是在pH1.0-13.0时被应用于结合物。
全文摘要
包括基质和与基团Z结合的配体的亲合性配体－基质结合物,配体具有通式(I)结构,其中X之一表示氮原子,而另一X表示N、CCl或CCN;A
文档编号B01J20/32GK1350476SQ0080736
公开日2002年5月22日 申请日期2000年5月9日 优先权日1999年5月10日
发明者C·R·洛维, K·H·劳登 申请人:普罗米蒂克生物科学有限公司