专利名称：：一种去除环境中甲烷的方法
技术领域：
：本发明涉及一种去除环境中甲烷的方法。技术背景甲烷是重要的化工原料和化学能源，也是地球大气中仅次于二氧化碳的第二号温室气体，由甲烷引起的温室效应是同等质量二氧化碳的2030倍(CiceroneRJ,OremlandRS.Biogeochemicalaspectsofatmosphericmethane.GlobleBiogeochemCycles,1998，2:299-327.)。据测算，在过去的200年中，大气中甲垸的含量平均以每年1%的速度增加，且近一两年呈明显升高趋势。根据IPCC(联合国政府间气候变化专门委员会)报告统计，1990年全球甲垸排放总量约为5080亿吨，其中有l/2是由于化石燃料开发利用(例如采煤，采油等)、垃圾填埋、污水、生物质燃烧、稻田生长等人类活动而造成的(IPCC.SpecialR印ortonEmissionsScenarios.CambridgeUK:CambridgeUniversityPress,2000.)。以甲烷为主要成份的瓦斯气体给煤矿的安全生产带来了威胁。我国576处重点煤矿中，高瓦斯矿井有277处，占48%(张丽，周玲玲.瓦斯爆炸机理及预防措施.化学教育.2006，1:2-4.)。在2003年，中国生产的煤炭占全球总量的35%，应煤炭生产造成的死亡人数则占世界总数的近80%。矿井瓦斯的燃烧和爆炸主要取决于瓦斯在空气中的浓度，当甲烷浓度在516%时，遇火源就会爆炸，甲垸浓度在78。/。时，最容易爆炸(张国栋.谈矿井瓦斯爆炸.煤炭技术，2006，25(2),6-7)。当甲烷含量在30%以上且杂质气体含量较少时，回收的瓦斯气或生物气有经济价值和实际应用价值。在实际生产、生活中，人类活动产生的甲烷很难回收，多以低甲烷浓度的形式排放到大气中。因此发展有效并环保的去除甲烷的方法，对于控制和治理温室效应，治理煤矿瓦斯爆炸，具有重大的意义。甲垸氧化菌是自然界中一类特殊的微生物，广泛存在于泥土、沼泽、稻田、河流、湖泊、森林和海洋中。大多数甲垸氧化菌以甲垸为唯一碳源及能源，个别甲烷氧化菌也可以同时利用甲醇，但所有的甲烷氧化菌都不能利用多碳化合物。甲烷氧化菌以其独特的性质和多样的催化功能，在大宗化学品生产、新功能酶开发、瓦斯气体治理以及环境污染物的生物修复方面都具有极大的应用潜力。甲垸氧化菌利用甲烷的第一步是在甲烷单加氧酶作用下将甲烷氧化为甲醇，甲醇在甲醇脱氢酶的作用下氧化为甲醛，继而通过丝氨酸循环或戊糖磷酸途径进行细胞合成，同时也可在甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶的作用下被进一步氧化成甲酸、C02和H20。甲垸氧化菌纯培养生长极为缓慢，功能不稳定，且甲垸氧化菌纯菌资源较少。
发明内容本发明的目的是提供一种去除环境中甲烷的方法。本发明提供的去除环境中甲垸的方法，包括如下步骤1)采集煤矿或垃圾填埋场的土样；2)将步骤l)的土样加入NMS培养基中，于密封瓶中培养；初始时，所述密封瓶中，NMS培养基、甲垸和空气的体积比为(5-30):(5-40):(30-80);每24-72小时向密封瓶中置换入甲垸，使所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为(5-30):(5-40):(30-80);3)每8-12天接种步骤2)的培养液至新的醒S培养基，进行传代；步骤2)的培养液与NMS培养基的体积比为(5-15):(95-85);传至10代以上，得到甲垸氧化混合菌；4)培养步骤3)得到的甲烷氧化混合菌，从而去除环境中的甲烷。所述步骤2)具体可为初始时，所述密封瓶中，NMS培养基、甲垸和空气的体积比为5:(2.5-3.5):(15-18);每48小时向密封瓶中置换入甲垸，使所述密封瓶中，NMS培养基、甲垸和空气的体积比为5:(2.5-3.5):(15-18)。所述步骤3)具体可为每10天接种步骤2)的培养液至新的NMS培养基，进行传代；步骤2)的培养液与NMS培养基的体积比为10:90;传至第10代，得到甲烷氧化混合菌。所述方法中，培养所述甲垸氧化混合菌的温度可为20-35'C。所述NMS培养基配制方法具体可为将100ml溶液A和lral溶液B混合并用水定容至1L，灭菌后加入10ml灭菌后的溶液C，得到NMS培养基；每升所述溶液A的配制方法为将腦310g，MgS04.7H2010g，CaCl2.2H202g，水定容至1L;每升所述溶液B的配制方法为Fe-EDTA0.38g，NaMo040.26g，FeS040.5g，MnCl2'4H200.02g，CoCl2'6H200.05g，H3B030.015g，Na-EDTA0.25g，ZnS04.7H200.4g，NiCl2.6H200.Olg，CuS04'5H200.025g，水定容至1L;每升所述溶液C的配制方法为Na2HP(V12H2071.6g，KH2P0426g，水定容至1L，pH值调至6.8。本发明中所提供的去除甲烷的方法操作简单，去除甲垸的能力强，应用范围广。本发明中采用了甲烷氧化菌。甲烷氧化混合菌是以甲垸氧化菌为主体的不同共生菌体的组合，相比纯菌更容易操作，稳定性高、可控性强，更有利于工业应用。甲烷4氧化混合菌中的甲烷氧化菌是启动甲垸转化的主体微生物，使得底物转化为更适合于其他非甲烷氧化菌进一步转化利用的中间产物，因此可以形成利用甲烷的稳定微生物生态系。本发明对于煤矿瓦斯气体去除和垃圾填埋场填埋气减排等有广阔的应用前景。图1为应用甲烷氧化混合菌制剂的生物过滤系统。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。甲烷去除率的检测方法如下在250ml的可密封的玻璃培养瓶中分装50mlNMS液体培养基，在液体培养基中接种lmlOD6^1.0的甲垸氧化混合菌，加盖密封橡胶塞，在上层空气中置换入30ml甲烷(使瓶中空气与甲烷的体积比约为5:1)。30°C、170rpm空气浴摇床培养，每24小时用气相色谱检测甲烷的剩余量(％，体积百分含量)。每次检测完甲垸剩余含量之后，打开密封盖，使内部气体与外部气体流通，然后重新加盖密封橡胶塞，并重新在上层空气中置换入30ml甲烷(使瓶中空气与甲垸的体积比约为5:1)，同时用气相色谱检测甲垸起始量(％，体积百分含量)。甲垸去除率^(甲垸起始量-甲垸剩余量)/甲垸起始量xioo呢。实施例l、去除环境中甲烷一、土样采集和培养基配制土壤样品从河南省新峰矿物局的一个高瓦斯煤矿四矿采样，样品取自该煤矿排风口处表层5cm深土壤,土壤样品的基本性质见表l。表1新峰煤矿土壤样品性质(取样日期2006年10月9日)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>用于培养和筛选甲烷氧化混合菌的培养基为NMS培养基，配制方法如下溶液A(每升):跳10g，MgS04.7H2010g，CaCl2'2H202g，去离子水定容至1L;溶液B(每升):Fe-EDTAO.38g，NaMo040.26g，FeS040.5g,MnCl2.4H200.02g，CoCl2-6H200.05g，H3BO30.015g，Na—EDTA0.25g，ZnS04-7H200.4g，NiCl2-6H200.Olg，CuS(V5H200.025g，去离子水定容至IL;溶液C(每升):Na2HP04.12H2071.6g，KH2P0426g，去离子水定容至1L，pH值调至6.8，高温(121°C)灭菌；NMS培养基100ml溶液A，lml溶液B，去离子水定容至1L，高温(12rC)灭菌；在高温灭菌后的混合液中加入10ml灭菌后的溶液C(如配置固体培养基则加入15g琼脂粉)。二、甲垸氧化混合菌的培养摇瓶培养采用250ml螺口摇瓶，装50ml醒S液体培养基，加入5g土壤样品，利用带有聚四氟乙烯密封垫的瓶盖密封，在上层空气中置换入30ml甲烷(使瓶中空气与甲垸的体积比约为5:1);30°C，170rpm空气浴摇床培养；每48小时重新置换入30ral甲烷(使瓶中空气与甲垸的体积比约为5:1)。三、甲垸氧化混合菌的传代每10天接种10y。的培养液至新的NMS培养基中，作为一次传代，培养方法同步骤二。对传至第10代的甲垸氧化混合菌进行群落多样性鉴定，方法为对稳定菌群的部分变性梯度凝胶电泳(DGGE，DenaturingGradientGelElectrophoresis)条带进行测序，并使用RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)方法进行克隆建库分析，通过序列比对分析，表明甲烷氧化混合菌中包括的细菌至少包括下面的菌属甲基单胞菌属(lef力/AMO/as)、嗜甲基菌属(ifefAK7o/7^7M)、甲基孢囊菌属(ifetAj/iocys"50、J/ef力y7o577"51、甲基杆菌属(ifet/^r7oZacfei")、噬氢菌属(坊^n^e/7叩力^a)、类芽胞杆菌属(尸se72iteci""s)、鞘脂单胞菌属(5^z7^。/BO/7as)、芽孢杆菌属(勘"'77〃50。四、应用甲烷氧化混合菌去除甲垸检测步骤三得到的第10代甲垸氧化混合菌的甲垸去除率。试验设置3瓶重复，结果取平均值，结果见表2。_表2培养6天期间的甲垸去除率_时间(d)123456甲烷去除率(％)9775539788966五、应用甲垸氧化混合菌去除甲烷应用生物过滤装置考察步骤三得到的第10代的甲烷氧化混合菌去除甲烷的能力。生物过滤装置见图l。生物过滤装置的直径为15cm;高为45cm，其中填料的高度为30cm;填料选取的是泥炭土和陶粒，泥炭土中富含有机质，而陶粒主要起到支撑和降低运行压降的作用。将甲烷氧化混合菌进行培养(采用NMS培养基)，0De6(Pl.0时，进行以下试验同步运行三个生物滤器生物滤器l中填料未灭菌，添加100mlNMS培养基；生物滤器2中填料灭菌，添加100ml甲烷氧化混合菌(OD腳-l.O);生物滤器3中填料未灭菌，添加100ml甲垸氧化混合菌(0D66。=1.0)。生物滤器的运行温度为28t:。空气流量100ml/min，甲垸流量3ml/min，即甲垸浓度约为3%，气体停留时间为25min。生物滤器运行一天后，通过气相色谱检测气体通过生物滤器后氧气和甲烷的消耗量。氧气消耗率=(氧气起始量(%)-氧气剩余量(%))/氧气起始量(％)X100%。试验设置三次重复，结果取平均值，结果见表3。结果如表3所示，生物滤器l为未加菌液的对照，可以看出其对甲垸没有消耗，有少量的氧气消耗。而生物滤器2和3对比，2对氧气和甲烷的消耗都要高一些，分别为36%和98%，甲垸排出量已经非常少了。由于2号滤器中的填料经过灭菌，不含土著微生物，由此竞争抑制作用明显减弱，所以2号滤器的效果好。表3生物滤器中的气体消耗<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求1、一种去除环境中甲烷的方法，包括如下步骤1)采集煤矿或垃圾填埋场的土样；2)将步骤1)的土样加入NMS培养基中，于密封瓶中培养；初始时，所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为(5-30)∶(5-40)∶(30-80)；每24-72小时向密封瓶中置换入甲烷，使所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为(5-30)∶(5-40)∶(30-80)；3)每8-12天接种步骤2)的培养液至新的NMS培养基，进行传代；步骤2)的培养液与NMS培养基的体积比为(5-15)∶(95-85)；传至10代以上，得到甲烷氧化混合菌；4)在含有甲烷的环境中培养步骤3)得到的甲烷氧化混合菌，从而去除环境中的甲烷。2、如权利要求l所述的方法，其特征在于所述步骤2)中，初始时，所述密封瓶中，醒S培养基、甲烷和空气的体积比为5:(2.5-3.5):(15-18);每48小时向密封瓶中置换入甲烷，使所述密封瓶中，丽S培养基、甲垸和空气的体积比为5:(2.5-3.5):(15-18)。3、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤3)中，每10天接种步骤2)的培养液至新的丽S培养基，进行传代；步骤2)的培养液与丽S培养基的体积比为10:90;传至第10代，得到甲烷氧化混合菌。4、如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于所述NMS培养基配制方法如下将100ml溶液A和lml溶液B混合并用水定容至lL，灭菌后加入10ml灭菌后的溶液C，得到丽S培养基；每升所述溶液A的配制方法为将KN03l0g，MgS047H2010g，CaCl2'2H202g，水定容至1L;每升所述溶液B的配制方法为Fe-EDTAO.38g，NaMo040.26g，FeS040.5g，MnCl2'4H200.02g，CoCl2-6H200.05g，H3B030.015g，Na—EDTA0.25g，ZnS0,7H200.4g,NiCl2.6H20O.Olg，CuS04'5H200.025g，水定容至1L;每升所述溶液C的配制方法为Na2HP04.12H2071.6g，KH2P0426g，水定容至1L，pH值调至6.8。全文摘要本发明公开了一种去除环境中甲烷的方法。本发明提供的方法包括如下步骤1)采集煤矿或垃圾填埋场的土样；2)将步骤1)的土样加入NMS培养基中，于密封瓶中培养；初始时，所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为(5-30)∶(5-40)∶(30-80)；每24-72小时向密封瓶中置换入甲烷，使所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为(5-30)∶(5-40)∶(30-80)；3)每8-12天接种步骤2)的培养液至新的NMS培养基，进行传代；步骤2)的培养液与NMS培养基的体积比为(5-15)∶(95-85)；传至10代以上，得到甲烷氧化混合菌；4)培养步骤3)得到的甲烷氧化混合菌，从而去除环境中的甲烷。本发明中所提供的去除甲烷的方法操作简单，去除甲烷的能力强，应用范围广。本发明对于煤矿瓦斯气体去除和垃圾填埋场填埋气减排等有广阔的应用前景。文档编号B01D53/84GK101670238SQ20091009234公开日2010年3月17日申请日期2009年9月7日优先权日2009年9月7日发明者昊吴,翀张,程杨,皓江,邢新会,冰韩申请人:清华大学