微流控芯片和细胞筛选方法与流程

本发明涉及细胞分析技术领域，具体涉及一种微流控芯片和细胞筛选方法。

背景技术：

分子生物学和临床研究表明，部分诊断为早期的癌症实际上已有远处转移，即肿瘤微转移，而常规影像学、组织学或细胞学方法难以发现。肿瘤微转移可通过血行及淋巴途径在全身组织和器官中形成微小转移病灶，而淋巴结转移发展最终也要进入血液循环中形成循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells，ctcs)，导致原发肿瘤转移的全身化倾向。ctcs的检测有助于早期发现肿瘤微转移、监测术后复发、评估疗效及预后或选择合适的个体化治疗。

目前，在乳腺癌中，人们已经积累了已经有关于ctcs作为预后标记的证据。不仅对乳腺癌，循环肿瘤细胞的发现与检测也与其他不同癌症的肿瘤转移和发展有关，包括前列腺癌、肺癌和结直肠癌。目前ctcs用于治疗决策的临床效用正在被评估。在过去的几年里，ctcs作为一种实时液体活检的检测对象，受到了临床研究的广泛关注。然而，在癌症患者的体内，循环肿瘤细胞在外周血中浓度非常低，通常每1ml血液中低至1-10个癌细胞。从血液样本中准确地捕获到所需的癌细胞，是目前ctcs临床研究的一个技术瓶颈。

而最近的研究表明，在癌症病人体内，不仅仅存在着循环肿瘤细胞，还存在有循环肿瘤细胞团或循环肿瘤细胞簇(ctcclusters)。ctcclusters由多个ctcs、白细胞以及其他与癌细胞相关的其他细胞组成，大小不一。科学研究发现，与ctcs相比，ctcclusters显示出更高的转移能力，且进一步显示与预后不良有关。比如在肺癌中，ctcclusters与预后不良有关。

肿瘤细胞可以在原发性肿瘤生长的早期阶段进入血液，而这些所谓的循环肿瘤细胞可能会引起肿瘤的远端转移。因此，检测ctc的存在，可以为恶性转变的存在提供一个很好的指示。ctc的分离和分析，对于进一步了解它们的性质，它们引发肿瘤转移的能力，以及对下一代癌症治疗的有效发展有重要意义。原发性肿瘤通常通过非侵入性的成像技术，如传统的放射学(x射线)、磁共振成像(mri)、计算机断层扫描(ct)和超声，或带有侵入性活组织检查的方法，在出现临床症状的阶段被检测出来。例如，从原发性肿瘤中脱落的细胞可以在骨髓中积累，因此需要进行侵入式的肿瘤活组织检查，以观察它们的存在，并监测治疗的效果。ctc检测技术可以通过简单的抽取外周血样本进行检测，帮助替代侵入性活组织检查，也可以称为液体活检。

目前，ctc检测方法并没有被临床医生用来作为治疗决策，主要是因为基于ctc的治疗方法尚且缺乏随机数据来显示预后的改善。正如美国食品药品管理局(fda)最近发表的指导方针所强调的那样，ctc检测系统的分析有效性对于其临床接受度是至关重要的。到目前为止，fda唯一批准的ctc检测仪器是cellsearch^tm系统，该系统是基于对epcam阳性细胞的免疫磁珠检测。ctc的有效分析中最具挑战性的部分是细胞捕获设计，因为这些细胞极低的丰度或罕见性。举例来说，在人体血液中，通常每毫升血液中含有10⁹个红细胞和10⁶个白细胞，而每毫升血液中含有0-10个ctc是具有非常重要的临床意义的。

基于微流体的循环肿瘤细胞捕获技术已被应用于循环肿瘤细胞分子和功能研究多年，然而新的ctc标志物的发现和验证还处于初级阶段。理想的ctc标志物将在所有ctcs上表达，但不会在自身的血细胞(白细胞、内皮细胞、造血干细胞hscs和骨髓间充质干细胞)上表达，且在入侵和循环过程中不会被抑制。基于细胞表面蛋白标记物的ctcs富集技术会运用到微柱或者磁性材料的设备，在芯片或设备内部结构表面上连接癌细胞表面抗原来靶向捕获ctcs，并且富集的ctcs都可以被用于后续的检测和表征的步骤。为了对ctcs进行精准的检测，通过免疫染色或反转录pcr(rt-pcr)的方法进行表型分析是对基因组分析的额外补充(如，荧光原位杂交fish或单个细胞分析)，这样有助于避免假阳性的出现。通过使用抗体组合来对抗各种不同的标记，以减少ctcs的复杂异质性的影响，这样可以避免假阴性结果。基于rt-pcr的特定转录本检测与完整ctcs的捕获和可视化有很大的不同，而目标转录本的低水平不合理表达可能导致假阳性结果。目前，基于微流控筛选细胞的方法主要包括：

(1)基于ctcs表面蛋白标记物的免疫荧光技术。该技术主要依赖能被抗体检测到的特定标志物。上皮细胞标志物在正常上皮细胞和上皮肿瘤(即癌组织)上表达，但在间充质白细胞上不表达，因此常常被用于区分癌细胞与正常血细胞。上皮细胞粘附分子(epcam)是最常用于富集的阳性上皮循环肿瘤ctc细胞的细胞表面标志物，并且是细胞角蛋白(即ck8，ck18和ck19)-细胞支架蛋白质类家族的成员，这是上皮细胞所特有的。这种上皮细胞特异性蛋白标记物已经成为了检测癌症患者循环上皮细胞表现型的“金标”的标记物。然而，应该指出的是，目前已经有研究报道了在良性结肠疾病患者中可检测到循环上皮细胞的存在，而这些细胞可能是假阳性结果的来源。

(2)基于物理性质的技术。循环肿瘤细胞富集的另一种方法是利用其物理特性将其与正常血细胞区分开来。例如，最初认为肿瘤细胞比造血细胞更大(>8μm大小)并且更不易变形；因此，在过去几年里已经开发了基于细胞过滤和离心力的不同装置。然而，系统(janssendiagnostics，beerse，belgium)以及其他ctcs检测系统已经能鉴定识别出不同大小的ctcs，并且经历上皮细胞-间充质转化的ctcs也可能像白细胞一样可变形。因此，近来已经使用了更复杂的无标记方法，例如光声流式细胞术或涉及介电泳(dep)技术。除了列举的ctcs外，还需要进一步的分子鉴定来确定这些细胞的性质。因此，过去几年中，关注四氯化碳特性研究的数量有所增加。

(3)以硅基微粒子捕获或分离的方法可将循环肿瘤细胞从血细胞中分离出来，并将其与其他正常细胞分离。基于硅基微粒子的技术为ctcs的分离提供了有利的条件，因为它们不需要先了解这些细胞的表面生物标记，而特定的表面抗原不能识别所有的ctcs类型，ctcs也可以经受emt和避免抗体的识别检测，因此，通过大小分离是分离这些ctcs的一种很有价值的方法。微制造技术使具有三维微结构或可控的孔尺寸的小型设备的制作成为可能，这种微结构可以设计成微阵列，用于ctcs的高通量捕获和分离。在这些间隙结构中，对ctcs细胞活性的保持使其成为ctcs分离的一种很有吸引力的方法。

然而，现有技术主要针对单个ctcs，并且对于捕获细胞簇具有较低的灵敏度和特异性。大多数方法都是使用诸如抗epcam的抗体，来捕获基于特定表面标记的ctcs。然而，即使是来自同一肿瘤的癌细胞也可能不具有相同的表面标记物。综上所述，目前虽有多种方法可实现ctcs的筛选，但每种方法均存在一定的缺点与不足，直接影响了细胞筛选的效率和细胞的活性，难以达到对癌症转移的早期诊断。因此，还需要开发一种高效、准确、并行、无损伤的分选方法。

在医疗和诊断领域，对于监测癌症治疗过程中的进展，更重要的，对于早期癌症检测，具有高通量、高效率和最小假阳性率的捕获系统是非常需要的。ctcs的分子生物学分析也有助于确定新的靶点，从而有助于开发新的治疗药物。为了能够更广泛的被接受，针对微流控检测和捕获ctcs的能力应该在多种癌症类型上得到验证。此外，为了获得相关的监管批准，ctcs检测的分析有效性应根据临床实验室改进修正案(clia)或药物非临床研究质量管理规范(glp)标准进行严格的测试。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种微流控芯片和细胞筛选方法，旨在解决现有基于微流控技术捕获细胞的效率低、灵敏度差、活性差的技术问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明一方面提供一种微流控芯片，用于捕获目标物，包括基底和位于所述基底内的微流体通道，所述微流体通道终端设置有样品入口和样品出口，所述微流体通道内设置有捕获单元阵列，所述捕获单元阵列包括多个空间物理捕获单元，所述空间物理捕获单元包括位于所述微流体通道内壁上的相邻两微柱和所述相邻两微柱之间的捕获空间；其中，所述相邻两微柱的高度小于所述目标物的尺寸；

当含有所述目标物的样品溶液从所述样品入口注入并从所述样品出口流出时，所述样品溶液中的目标物因物理空间结构而嵌入所述捕获空间中。

本发明另一方面提供一种细胞筛选方法，包括如下步骤：

提供含有目标细胞的样品溶液；

将所述样品溶液注入本发明的上述微流控芯片中，利用所述微流控芯片中的空间物理捕获单元捕获所述目标细胞。

本发明提供的微流控芯片的微流体通道内设置有含有多个空间物理捕获单元的捕获单元阵列，每个空间物理捕获单元设有高度小于所述目标物尺寸的微柱，因空间物理捕获单元中微柱结构的存在，而可以将注入微流控芯片中的样品溶液中的目标物捕获，而小于该微柱高度的其他物质则不会被捕获；因此，该微流控芯片可以快速、简便、廉价以及高效地从大量样品溶液中筛选目标物，并以此为基础对所捕获的目标物进行观察、表征和分析。

本发明提供的细胞筛选方法利用本发明特有的微流控芯片对细胞进行筛选，这样可以将细胞尺寸大于芯片中空间物理捕获单元中微柱高度的目标细胞捕获住，而且富集效率高；该细胞筛选的方法具有快速、简便、廉价以及高效的特点，后续可以对捕获的目标细胞进行观察、表征和分析。

附图说明

图1为本发明实施例1的微流控芯片的设计图；其中，a示意性地展示出芯片的内部结构，包括入口、出口和捕获区域(即为捕获单元阵列)，b示意性地示出了具有一定微柱高度的空间物理捕获单元的捕获空间结构；c示意性地示出了用于捕获不同目标物(如单个ctc细胞、小尺寸ctc细胞簇和大尺寸ctc细胞簇)的空间物理捕获单元的三维示意图；

图2为本发明实施例1的微流控芯片制作特性图；其中，a展示了置于载玻片上的微流控芯片，b中示意性地示出了不同高度规格的空间物理捕获单元，c示意性地示出了不同的蚀刻时间具有不同的间隙结构尺寸的空间物理捕获单元，d中示意性地示出了主要的刻蚀时间与通道尺寸之间的关系；

图3为本发明实施例2的微流控芯片捕获单个ctc和ctc簇的捕获效率和灵敏度图；其中，a中示意性地示出了在不同的细胞密度中，单个ctc细胞可被7μm高度尺寸的微流控芯片捕获，b示意性地示出了不同高度规格的微流控芯片捕获单个ctc细胞的捕获效率，c示意性地示出了ctc细胞群和稀有单细胞被微流控芯片捕获的效果图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。一方面，本发明实施例提供了一种微流控芯片，用于捕获目标物，包括基底和位于所述基底内的微流体通道，所述微流体通道终端设置有样品入口和样品出口，所述微流体通道内设置有捕获单元阵列，所述捕获单元阵列包括多个空间物理捕获单元，所述空间物理捕获单元包括位于所述微流体通道内壁上的相邻两微柱和所述相邻两微柱之间的捕获空间；其中，所述相邻两微柱的高度小于所述目标物的尺寸；

当含有所述目标物的样品溶液从所述样品入口注入并从所述样品出口流出时，所述样品溶液中的目标物因物理空间结构而嵌入所述捕获空间中。

本发明实施例提供的微流控芯片的微流体通道内设置有含有多个空间物理捕获单元的捕获单元阵列，每个空间物理捕获单元设有高度小于所述目标物尺寸的微柱，因空间物理捕获单元中微柱结构的存在，而可以将注入微流控芯片中的样品溶液中的目标物捕获，而小于该微柱高度的其他物质则不会被捕获；因此，该微流控芯片可以快速、简便、廉价以及高效地从大量样品溶液中筛选目标物，并以此为基础对所捕获对目标物进行观察、表征和分析。具体地，用含有该微流控芯片的装置或系统可以提供快速、高通量的ctc富集与检测和临床肿瘤治疗。

本发明实施例的微流控芯片具体具有如下优点：(1)不需要鞘流，不会稀释细胞，可以避免鞘流引起的剪切应力损伤细胞带来的负面效应。(2)分选效率高：根据目标物如单个ctcs与ctc细胞团的物理大小，通过设计不同的空间尺寸大小与控制流体流速便可将单个ctcs与ctc细胞团从血液中分选，得到较高的分选效率。(3)保持目标物如细胞的生物活性：分选后单个ctcs与ctc细胞团保持了细胞的生物活性。(4)可捕获的目标物种类多样，具有普遍适用性。(5)可进一步进行后续的实验验证与研究：如将捕获的单个ctcs与ctc细胞团用于进行特异细胞表面特有的表面标记物进行免疫组化分析。(6)芯片成本低。芯片制备工艺为标准的mems技术，工艺成熟器件的性能一致性良好，并且成本低廉，可大量生产。

进一步地，本发明实施例的微流控芯片中，所述捕获单元阵列包括多排所述空间物理捕获单元，且位于同一排的空间物理捕获单元的微柱高度相同，即同一排的空间物理捕获单元可以捕获尺寸大于微柱高度的目标物。优选地，所述捕获单元阵列包括多排(如3-5排)所述空间物理捕获单元，且所述空间物理捕获单元的微柱高度根据排数顺序呈梯度减小。即通过多排微柱高度不同的空间物理捕获单元，可以从样品溶液中捕获不同尺寸的目标物(根据每排的微柱高度梯度减小，依次捕获到尺寸逐渐减少的目标物)。在本发明实施例的描述中，“多排”的含义没有具体限定，可以是两排或两排以上，除非另有明确具体的限定。如本发明实施例1中，微流控芯片中设置4条线路，即四排不同微柱高度的空间物理捕获单元，从而捕获不同尺寸的癌症细胞。

进一步地，所述相邻两微柱的高度为6-21μm。即捕获到的目标物尺寸大于6-21μm；具体实施例中，每排空间物理捕获单元中的微柱高度具体确定，从而捕获到尺寸大于该具体确定微柱高度的目标物。

进一步地，所述微流控芯片的材料为聚二甲基硅氧烷。

更进一步地，所述目标物包括微球、微珠、单个细胞和细胞团中的至少一种。优选地，利用该微流控芯片可以对特异性细胞与细胞团进行筛选与捕获。

另一方面，本发明实施例还提供了一种细胞筛选方法，包括如下步骤：

提供含有目标细胞的样品溶液；

将所述样品溶液注入本发明实施例的上述微流控芯片中，利用所述微流控芯片中的空间物理捕获单元捕获所述目标细胞。

本发明实施例提供的细胞筛选方法利用本发明实施例特有的微流控芯片对细胞进行筛选，这样可以将细胞尺寸大于芯片中空间物理捕获单元中微柱高度的目标细胞捕获住，而且富集效率高；该细胞筛选的方法具有快速、简便、廉价以及高效的特点，后续可以对捕获的目标细胞进行观察、表征和分析。

微流控芯片的体积小，处理速度快，重复使用能力强，有较大的比表面积，为体外细胞提供了分选、检测和单细胞分析的选择；基于这些优点，利用本发明实施例的微流控芯片对包括ctc在内的目标细胞捕获，可以快速、简便、廉价以及高效地从大量样品溶液中筛选目标细胞，并对所目标细胞进行观察、表征和分析。进一步地，所述目标细胞包括单个循环肿瘤细胞和/或循环肿瘤细胞团。

进一步地，所述样品溶液注入的流量速度为10-15ul/min，优选为12.5μl/min的流量速度。更进一步地，将所述样品溶液注入所述微流控芯片中的步骤之后，还包括向所述微流控芯片内注入能表征所述目标细胞的表面标记物，以验证是否捕获所述目标细胞。

本实施例的微流控芯片由于声波激励源的两部分的声波共振频率不相同，即可得到非对称声场，藉此通过形成的声流效应可以实现对特异性细胞例如ctcs的分离。

本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。

实施例1

微流控芯片的制造：

本实施例的微流控根据软蚀刻技术制造，它是由成型的聚二甲基硅氧烷(pdms)(10:1的硅橡胶和固化剂，sylgard184,dowmidland,mi)结合印制电路板(pcb,75×125×1.6mm,pty.ltd.)制成。该微流控芯片由两层结构组成，第一层pdms是由三氯化铁溶液(1.56×10-3mol/ml)通过不同的时间在pcb主板上蚀刻，第二层pdms的进口和出口是由直径为1.22mm的圆孔打孔机钻孔。两个pdms层被空气等离子处理了2min(等离子清洁器/杀菌器，ppc-3xg,ny,us)，并在显微镜下将两层pdms层结合在一起。

我们的目标是通过癌细胞和非癌细胞之间的物理特性不同来捕获癌细胞，基于上述制备方法制备可以通过一定物理结构来捕获单个ctc和ctc簇的pdms的微流控芯片，如图1所示，该微流控芯片由4条线路(即四排空间物理捕获单元)组成，其中有1个进口和1个出口。捕获区域即为捕获单元阵列，包括四排空间物理捕获单元，每个空间物理捕获单元包括两微柱以及之间的间隙(即捕获空间)，如1b所示，通过捕获空间物理捕获单元轮流将细胞捕获。流动的癌细胞被如图1b所示的间隙结构所捕获，间隙和微柱的宽度都是100μm。通过调整间隙即相邻两微柱的高度，ctc和ctc簇可以被单独地隔离。

四排空间物理捕获单元的微柱高度分别为21μm、12μm、10μm、7μm。由于悬浮细胞的大小大约有13μm，低于10μm的微柱高度可以捕获流体中的单个细胞(如图1c左图)，微柱高度为12μm的可以捕获包含2-3癌细胞的ctc簇(如图1c中图)，微柱高度为21μm的可以捕获含有4个以上癌细胞的ctc簇(如图1c右图)。捕获单元阵列的4条线路保证了不会错过任何癌症细胞，因而具有较高的癌症细胞捕获效率。

微流控芯片由两层pdms组成，形成间隙和微柱结构的工艺特性如图2所示。为了能捕获不同大小的ctc和ctc簇，我们分别制备了不同的微柱尺寸，例如7μm、12μm和21μm(图2b)。在制备过程中，选择不同的蚀刻时间可以达到不同的微柱高度(图2c)，通常情况下，1小时范围内在氯化铁溶液中蚀刻，微柱高度随着时间的增加而增加(图2d)。

实施例2

非小细胞肺癌(a549细胞和h1975细胞)，常常被用来测试ctc捕获芯片的可行性。癌细胞使用dmem培养基进行培养并使其悬浮。将1毫升不同密度的细胞悬液通过数字注射器泵以12.5μl/min的流量从实施例1中的微流控芯片的入口注入。结果如图3所示，图3a中的结果我们可以看到，在高通量细胞密度情况下，使用微柱高度为7μm的芯片能捕获几乎所有的单个ctc细胞，无论其细胞密度通量高至5×10⁴cells/ml还是低至5×10²cells/ml。在高细胞密度中，在芯片中所有的空间物理捕获单元中都可以发现被红色荧光免疫染色的癌细胞。由于癌细胞具有较高的弹性，在高细胞密度的情况下，所有的空间物理捕获单元都能找到癌细胞。第一排空间物理捕获单元常常有更多的细胞被捕获，因为它被阻滞在入口。被阻滞的癌细胞可以挤压通过第一排空间物理捕获单元而被其他结构单元线捕获(图3a左)。当载入的细胞数量很低时，癌细胞就会被第一排空间物理捕获单元所捕获(图3a右)。我们测量并分析了具有不同微柱高度的微流控芯片的单细胞捕获效率(图3b)，随着微柱高度的增加，随着更多的细胞穿过间隙结构，单个细胞的捕获效率也降低了。因此，较高的微柱更可能捕获较大的癌细胞集群。对于21μm的微柱高度，我们可以观察到ctc集群被困在微流体芯片中(图3c左)。

对于我们设计的芯片，我们在培养基中制备了每毫升含1-10个癌细胞的低密度细胞悬液。结果表明，在这种低密度细胞悬液中，单ctc仍然可以被我们的芯片捕获，表明应用于ctc捕获的间隙结构具有较高的灵敏度(图3c)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。