一种修饰杂化整体材料及其制备和应用的制作方法

本发明涉及一种毛细管液相色谱固定相材料，具体是一种双键功能化的杂化整体材料以及用修饰青霉胺和十八硫醇修饰的杂化材料的制备，以及其在色谱分离中的应用。

背景技术：

近二十年来整体材料受到越来越多的关注，已广泛用于催化、吸附、分离介质和储存载体等领域。毛细管整体柱是一种在毛细管内部原位聚合形成连续多孔结构的整体材料(主要包括有机整体材料、无机硅胶整体材料和有机-无机杂化整体材料)(文献1zouh.f.,huangx.d.,yem.l.,luoq.z.monolithicstationaryphasesforliquidchromatographyandcapillaryelectrochromatography.j.chromatogr.a.2002,954(1-2):5-32.)，在分离分析小分子和生物大分子等样品中具有一定的优势。其中，有机整体材料容易制备且具有较好的ph稳定性，但在某些有机溶剂中易溶胀，(文献2oberacherh.,premstallera.,huberc.g.,characterizationofsomephysicalandchromatographicpropertiesofmonolithicpoly(styrene–co-divinylbenzene)columns.j.chromatogr.a.2004,1030(1-2),201-208.)柱效偏低；无机硅胶整体材料具有比表面积大、柱效高等优点，但其制备过程繁琐且操作技术要求高(文献3maj.,liangz.,qiaox.q.,dengq.l.,taod.y.,zhangl.h.,zhangy.,organic-inorganichybridsilicamonolithbasedimmobilizedtrypsinreactorwithhighenzymaticactivity.anal.chem.2008,80,2949-2956.)。有机–无机杂化整体柱同时具有硅胶整体柱和有机聚合物整体柱的优点，又在一定程度上克服了两者的缺点，近年来受到越来越多的关注(文献4zhu,t.,row,k.h.,preparationandapplicationsofhybridorganic-inorganicmonoliths:areview.j.sep.sci.2012,35(10-11),1294-302.)。

为了实现简单、快速和高效制备杂化整体材料，并有效地控制其内部微观结构，本发明发展了一种新型光引发聚合反应快速制备整体材料的方法。

该方法所制备的杂化整体材料不仅具有有序的三维骨架，而且机械强度高，热稳定好。此外，该方法还具有以下特点：1、制备步骤更加简便；2、制备过程耗时短，一般10min左右即可完成制备；3、反应条件温和，易于控制，重现性好；4、与其他可修饰的材料相比，所制备的杂化整体材料表面含有大量双键修饰效率更高。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种双键功能化生物杂化整体材料、一种青霉胺或十八硫醇修饰的杂化整体材料的制备及应用，其可用作色谱的固定相高效快速地完成对生物小分子和细胞酶解液等复杂样品的分离分析。

为实现上述目的，可按如下步骤操作，

该材料是利用八丙烯酸酯多面体低聚倍半硅氧烷(acrylopropylpolyhedraloligomericsilsesquioxane，acryl-poss)表面的丙烯酸酯与双官能团单体中的丙烯酸酯在光引发剂的条件下进行自由基聚合，聚合完成后双官能团单体中的双键残留在整体材料表面，可与青霉胺和/或十八硫醇在光引发的条件下发生点击化学反应进行修饰，制备出具有不同物理和化学性质的杂化整体材料。

反应按两步进行，

第一步将acryl-poss、双官能团单体、光引发剂溶解在溶剂中，在光照条件下发生自由基反应，从而得到表面含有双键的杂化整体材料；

第二步将杂化材料加入青霉胺和/或十八硫醇的溶液(含光引发剂)在光照条件下发生点击化学反应，得到青霉胺和十八硫醇修饰的杂化整体材料；

光引发剂为2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮(2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone,dmpa)；

双官能团单体分别为3-(三烯丙基硅烷基)丙烯酸丙酯(tapa)和甲基丙烯酸烯丙酯中的一种或二种；

所述溶剂为四氢呋喃(tetrahydrofuran，thf)和正丁醇(1-butanol)。

1)向反应容器中加入40～65mg八丙烯酸酯多面体低聚倍半硅氧烷；

2)向反应容器中加入5～25mg双官能团单体；

3)向反应容器中加入2～20μl四氢呋喃和140～160μl正丁醇；

4)将上述混合体系在常温下超声使其形成均匀的溶液；

5)向反应容器中加入0.01～0.1mg催化剂；

6)将反应容器置于紫外灯下照射，形成固体；

7)将杂化材料分别加入10～15ml的青霉胺和十八硫醇的乙醇溶液(0.4～0.7mg/ml)含2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮(2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone,dmpa)(0.4～0.7mg/ml)，放在紫外灯下照射15-30min，然后用乙醇/水(1/1～1/2,v/v)溶液洗涤得到的材料，以去除剩余的青霉胺和十八硫醇，最后置于40～80℃的真空干燥箱中干燥2～12小时得到青霉胺和十八硫醇修饰的杂化整体材料。

所述步骤1)，2)，3)，4)，5)和6)中所用的反应容器为紫外透明离心管；所述步骤2)中的双官能团单体为3-(三烯丙基硅烷基)丙烯酸丙酯(tapa)和甲基丙烯酸烯丙酯；所述步骤5)中所采用的催化剂为2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮(2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone,dmpa)。

本发明具有如下优点：

(1)该制备过程简单，原料易得，成本低廉。

(2)所制备材料可直接用于色谱固定性。

(3)所制备的材料表面含有双键官能团可根据不同需求进行功能化修饰。

如可用青霉胺或十八硫醇进行衍生，分别生成亲水性和疏水性整体材料。因此，预期根据不同的需求在整体材料上进行其它功能化修饰，制备出多种具有不同物理和化学性质的杂化整体材料。

附图说明

图1为tapa杂化整体材料(实施例1)的制备示意图。

图2为tapa杂化整体材料、制备功能单体(实施例1)以及青霉胺和十八硫醇修饰后整体材料的傅里叶变换-红外光谱对比图。a为3-(三烯丙基硅烷基)丙烯酸丙酯，b为八丙烯酸酯倍半硅氧烷，c为双键杂化整体材料，d为青霉胺修饰的杂化整体材料，e为十八硫醇修饰的杂化整体材料。

图3为双键功能化杂化整体材料(实施例1)的扫描电镜图。

图4为tapa杂化整体材料修饰前后的水接触角对比图(实施例1)。a为双键杂化整体材料，b为青霉胺修饰的杂化整体材料，c为十八硫醇修饰的杂化整体材料。

图5为甲基丙烯酸烯丙酯杂化材料修饰青霉胺前后的水接触角对比图。a为甲基丙烯酸烯丙酯杂化材料，b为青霉胺修饰的甲基丙烯酸烯丙酯杂化整体材料。

图6为tapa和甲基丙烯酸烯丙酯杂化整体材料作为色谱固定相分离苯系物的对比色谱图。a为tapa杂化材料，b为甲基丙烯酸烯丙酯杂化材料。()为硫脲，2为苯，3为甲苯，4为乙苯，5为丁苯)。

图7为修饰前后tapa杂化材料(实施例1)作为色谱固定相分离8种苯酚类物质的对比色谱图。(1为间苯三酚，2为邻苯三酚，3为苯酚，4为邻甲酚，5为2,6-二甲苯酚，6为萘酚，7为双酚a，8为对叔丁基酚)，a为双键杂化整体材料，b为青霉胺修饰的杂化整体材料，c为十八硫醇修饰的杂化整体材料。

图8为青霉胺和十八硫醇修饰前后杂化材料(实施例1)对牛血清白蛋白(bsa)酶解液的质谱对比图，a为杂化整体材料，b为青霉胺修饰的杂化整体材料，c为十八硫醇修饰的杂化整体材料。

具体实施方式

实施例1：

1.双键功能化的杂化整体材料的制备：

1)在离心管中，加入54mg八丙烯酸酯倍半硅氧烷(acrylopropylpolyhedraloligomericsilsesquioxane，acryl-poss)；

2)向上述离心管中加入12.4mg的3-(三烯丙基硅烷基)丙烯酸丙酯；

3)向上述离心管中加入2.0μl氢呋喃和158μl的正丁醇；

4)将上述混合体系常温下2.0min超声溶解混匀；

5)向上述离心管中加入再加入0.01mg的2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮；

6)将步骤5)中得到的混合溶液用注射器引入到已预先经过3-(甲基丙烯酰氯)丙基三甲氧基硅烷活化处理的75μm(内径)的毛细管中，随后毛细管两端用硅胶封口，然后将装有剩余混合液的离心管密封；7)将步骤6)中的毛细管和离心管置于紫外灯下(λ＝365nm)，反应10min，反应结束后离心管中的混合液成白色的固体；。

8)用乙醇冲毛细管，将其中的致孔剂及一些未参与反应的物质冲出即得到毛细管杂化整体柱。对离心管中的则用乙醇反复浸泡洗涤即得到杂化整体材料。

2.青霉胺或十八硫醇修饰的杂化整体材料的制备：在1所得的整体材料中加入10ml的青霉胺或十八硫醇的乙醇溶液(0.5mg/ml)含2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮(2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone,dmpa)(0.5mg/ml)，放在紫外灯下照射20min，然后用乙醇/水(1/1,v/v)溶液洗涤得到的材料，以去除剩余的青霉胺或十八硫醇，最后置于60℃的真空干燥箱中干燥12小时得到青霉胺或十八硫醇修饰的杂化整体材料。

3.青霉胺或十八硫醇修饰的色谱固定相的制备：将0.5mg的青霉胺或十八硫醇溶解在1ml乙醇中，再加入0.5mg的2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮(2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone,dmpa)，然后将混合溶液引入1所得的紫外透毛细管中，放在紫外灯下照射20min，反应结束后用乙醇/水(1/1,v/v)溶液冲洗毛细管柱，以去除剩余的青霉胺或十八硫醇得到修饰后的整体柱。

bsa酶解样品的制备：牛血清白蛋白(bsa)2mg溶解在含8m尿素的100mm的碳酸氢铵溶液中(ph＝8.2)，加入20μmol二硫苏糖醇，在60℃恒温1h，再加入40μl(40mmol/l)碘代乙酰胺，避光40min，用100mm的碳酸氢铵溶液将蛋白溶液稀释10倍，按照的质量比为1:25的比例加入胰蛋白酶，在37℃的水浴中反应时间16h，获得的酶解液除盐，冻干后保存在-20℃的冰箱中备用。

实施例2：

1.双键功能化的杂化整体材料的制备：

1)在离心管中，加入54mg八丙烯酸酯倍半硅氧烷；

2)向上述离心管中加入12.4mg的甲基丙烯酸烯丙酯；

3)向上述离心管中加入2.0μl氢呋喃和158μl的正丁醇；

4)将上述混合体系常温下2.0min超声溶解混匀；

5)向上述离心管中加入再加入0.01mg的2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮；

6)将步骤5)中得到的混合溶液用注射器引入到已预先经过3-(甲基丙烯酰氯)丙基三甲氧基硅烷活化处理的75μm(内径)的紫外透明毛细管中，随后毛细管两端用硅胶封口，然后将装有剩余混合液的离心管密封；

7)将步骤6)中的毛细管和离心管置于紫外灯下(λ＝365nm)，反应10min，反应结束后离心管中的混合液成白色的固体。

8)用乙醇冲洗毛细管柱，将其中的致孔剂及一些未参与反应的物质冲出即得到毛细管杂化整体柱。对离心管中的则用乙醇反复浸泡洗涤即得到杂化整体材料。

产物表征

实施案例1制备tapa杂化整体材料的红外图如图2c所示，波数1730cm^-1左右的吸收峰为α,β-不饱和羰基(c＝o)的伸缩振动，波数1630cm^-1的吸收峰为c＝c键的称伸缩振动峰，波数3077cm^-1的振动峰则为＝ch的吸收峰，说明在材料中同时存在α,β-不饱和羰基，c＝c键和＝ch键。分别修饰了青霉胺(图2d)和十八硫醇(图2e)后，1630cm^-1处的吸收峰减弱，3077cm^-1处的吸收峰甚至消失，说明修饰成功。

tapa杂化整体材料扫描电镜如图3(a，b)，可以清晰看到整体材料中存在不同尺寸的孔，且孔分布比较均匀，基质与毛细管内壁结合紧密，无脱壁现象。

tapa的杂化整体材料修饰前后水接触角如图4所示，其中a为修饰前的杂化整体材料的水接触角，b为青霉胺修饰的杂化整体材料，c为十八硫醇修饰的杂化整体材料，对比发现修饰青霉胺修饰后杂化材料的接触角明显变小，亲水性有明显增加；而修饰青霉胺修饰后杂化材料的接触角明显变大，疏水性增加。

图5为甲基丙烯酸烯丙酯杂化材料修饰十八硫醇前后的水接触角对比图；a为修饰前的杂化整体材料的水接触角，c为十八硫醇修饰的杂化整体材料；通过对比图4和5，十八硫醇修饰前后材料的水接触角的变化，明显发现引入tapa的杂化整体材料的修饰效果较含有一个双键的甲基丙烯酸烯丙酯的杂化整体材料的修饰效果好。

产物应用

将整体材料用作色谱的固定相，对生物小分子和细胞酶解液等复杂样品的进行了分离分析。

图6为tapa和甲基丙烯酸烯丙酯杂化整体材料作为色谱固定相分离5种苯系物的对比色谱图。通过对比发现tapa作为色谱固定相对苯系物实现了基线分离，而甲基丙烯酸烯丙酯杂化整体材料作为色谱固定相在分离中出现了明显的拖尾现象，且没有实现基线分离；因此tapa杂化整体材料作为色谱固定相较甲基丙烯酸烯丙酯杂化整体材料分离效果更好。

图7为修饰前后tapa杂化材料(实施例1)作为色谱固定相分离8种苯酚类物质的对比色谱图。(1为间苯三酚，2为邻苯三酚，3为苯酚，4为邻甲酚，5为2,6-二甲苯酚，6为萘酚，7为双酚a，8为对叔丁基酚)，a为双键杂化整体材料，b为青霉胺修饰的杂化整体材料，c为十八硫醇修饰的杂化整体材料；对比三组色谱图发现青霉胺修饰的杂化整体材料对苯酚类化合物的选择性大于未修饰的杂化整体材料，大于十八硫醇修饰的杂化整体材料。

图8为青霉胺和十八硫醇修饰前后杂化材料(实施例1)对牛血清白蛋白(bsa)酶解液的质谱对比图，a为杂化整体材料，b为青霉胺修饰的杂化整体材料，c为十八硫醇修饰的杂化整体材料。从色谱图中可以明显看出，b(青霉胺修饰的杂化整体材料)中明显数出的色谱峰较a和c更高，说明青霉胺姿势的杂化整体材料对复杂样品的分离度较杂化整体材料和十八硫醇修饰的杂化整体材料更高。