用于形成二维微滴阵列的方法和设备与流程

用于形成二维微滴阵列的方法和设备
[0001]
相关申请的交叉引用
[0002]
本申请要求2018年4月16日提交的美国申请第62/658,172号的优先权，该申请通过引用整体并入本文。


背景技术：
a.技术领域
[0003]
实施方案一般涉及微流体装置。特定的实施方案涉及用于产生均匀的微滴阵列的微流体装置。
[0004]
b.相关技术的描述
[0005]
微流体系统的主要成本动因可以是可消耗的微流体通路部分。在某些方面，每个微流体通路可以具有很多非常小的形貌，该形貌需要在尺寸上相同，方差在约1微米至2微米之内。因此，需要很好地控制制造工艺。鉴于微流体通路是消耗品，用于所述微流体通路的制造工艺需要能够用于大规模制造。
[0006]
用于模塑的母料通常可以用两种方式生产。第一种是通过微铣削。微铣削是还原制造工艺，其中电脑控制的旋转铣刀从钢、黄铜、铝或其他材料的实心块中去除材料。实际上来说，微铣削可产生约10μm的形貌并且保持公差约为+/-1μm。但是，为了实现此公差范围必须控制刀具磨损，和/或原料和刀具的振动和温度。随着形貌数量的增加和微铣削时间的增加，这些事情变得更成问题。例如，使用微铣削生产公差为+/-1μm的包含32个微通道的微流体芯片母料目前还无法在商业上进行。
[0007]
另一种生产母料的方法是使用光刻工艺来蚀刻硅。之后通过电镀工艺将经蚀刻的硅的形貌转移至金属。不论形貌的数量多少，此工艺能够保持+/-1μm的公差，因为它不容易受到如工具磨损、振动和热条件等因素的影响。标准的光刻方法局限于可以掌握到接近90度壁的形貌。斜坡或倾斜区域不能用标准的光刻产生。斜坡可以在光刻中以无限个90度的阶梯来近似，但这成本很高。需要多次蚀刻才能形成斜坡状的阶梯级联。这样的用于制造斜坡状结构的步降过程将很大程度上影响母料制作的成本。
[0008]
仍然需要可以用来成本有效地生产具有低微滴尺寸分散性的二维(2d)微滴阵列的微流体通路设计和制造方法。


技术实现要素：

[0009]
某些实施方案提供了与用于形成基本上均匀的微滴阵列的微流体装置有关的制造问题的解决方案。尤其是，本文描述的微流体装置设计为使其可以通过微铣削和光刻生产方法来高效地和成本有效地制造。例如，发明人设计了进行用于形成低尺寸分散2d微滴阵列的过程的装置。该装置使用了具有喷嘴的微流体通路、阶梯乳化区域、斜坡区域和成像或阵列区域。该设备和工艺生产了具有低尺寸分散性的2d微滴阵列，用于更成本有效的和稳健的分析。
[0010]
实施方案涉及与限制梯度结合的有限阶梯乳化，用于形成具有低尺寸分散性的2d微滴单层阵列。在某些方面，生产了具有小于3％的尺寸分散性的未堆叠的2d微滴单层微滴阵列。某些实施方案涉及配置为形成低尺寸分散性的2d单层阵列的微流体装置。
[0011]
某些实施方案涉及的微流体通路包括：(a)微滴形成区域，其包括具有用于接收样品的进口的通道或喷嘴，所述通道具有恒定的横截面积和通向阶梯区域的出口，所述通道或喷嘴为10μm至1000μm长，矩形的横截面积的高度为1μm至20μm，宽度为2μm至60μm；(b)阶梯区域，其具有从喷嘴延伸的15μm至500μm的长度，高度为5μm至80μm的顶部和底部，所述顶部或底部分别与通道或喷嘴的顶部或底部基本上连续，所述底部和顶部偏离通道或喷嘴的底部或顶部并且与通道或喷嘴的底部或底或顶部或天花板基本上平行，形成配置为用于有限阶梯乳化的阶梯区域；(c)斜坡区域，其相对于所述阶梯区域的底部或天花板的角度为10度至80度(所述斜坡可以根据选择的设计，定位在所述阶梯区域的上方或下方)并且长度为10μm至1000μm，所述斜坡区域开始于阶梯区域的末端并终止于成像区域(在某些方面，斜坡的起始高度为5μm至80μm(由阶梯区域的高度决定)并在由斜坡角度决定的水平长度上，增加至15μm或110μm的高度)；(d)成像区域配置为收集作为二维阵列的微滴并提供二维微滴阵列的成像和评估。该微流体通路可以通过流路流体连通至样品存储器，所述流路配置为提供将由每个喷嘴进口接收的样品。在某些方面，该流路是具有高度为10μm至200μm、宽度为10μm至200μm的横截面积的通道。微流体通路可以流体连通至废弃物存储器，该废弃物存储器配置为接收分析后的样品微滴。在某些方面，喷嘴高度与阶梯区域高度的比小于1:3，尤其是1:2.8。在其它方面，斜坡角度为15至45度，尤其是30度。在某些方面，微流体通路由热塑性聚合物制备。在特定方面，微流体通路是环烯烃聚合物或共聚物、聚碳酸酯或聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)。
[0012]
在其它实施方案中，微流体通路可以是微流体分析系统的一部分，该微流体分析系统可操作地定位或连接到图像分析装置。所述图像分析装置可以配置为检测和分析在微流体通路成像区域中微滴的荧光。所述成像装置可以包括相机和微控制器。
[0013]
某些实施方案涉及有限阶梯乳化的方法，其包括使分散相通过具有恒定横截面积的喷嘴流动到含有连续相的有限阶梯区域并形成受约束的微滴，设置具有增加的横截面积的斜坡区域，通过该斜坡区域受约束的微滴流形成不受约束的微滴，其中不受约束的微滴在阵列区域沉积并形成具有低尺寸分散性的二维微滴阵列。在某些方面，分散相是含水样品。该含水样品可以是生物或环境样品。在其它方面，连续相与分散相不混溶。连续相可以是氟碳化合物。
[0014]
在本申请全文讨论本发明的其他实施方案。所讨论的关于本发明的一方面的任何实施方案也可以应用于本发明的其他方面，反之亦然。本文描述的每个实施方案应理解为适用于本发明所有方面的实施方案。预期本文所讨论的任何实施方案可以针对本发明的任何方法或组合物实施，反之亦然。
[0015]
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”一起使用时，要素前面不使用数量词可以表示“一个”，但是其也符合“一个或更多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的意思。
[0016]
术语“约”或“近似”被定义为本领域普通技术人员所理解的接近于。在一个非限制性实施方案中，该术语定义为10％以内，优选5％以内，更优选1％以内，最优选0.5％以内。
[0017]
术语“基本上”和其变体定义为包括在10％以内、5％以内、1％以内、或0.5％以内
的范围。
[0018]
术语“抑制”或“减少”或“阻止”或这些术语的任何变体包括实现期望结果的任何可测量的减少或完全的抑制。
[0019]
作为本说明书和/或权利要求所使用的术语，术语“有效的”表示适于实现希望的、期望的或预期的结果。
[0020]
术语“重量％”、“体积％”或“摩尔％”分别指基于包含该组分的材料的总重量、总体积或总摩尔，组分的重量百分数、体积百分数或摩尔百分数。在非限制性的实施方案中，在100摩尔材料中有10摩尔组分是10摩尔％的组分。
[0021]
在权利要求中使用的术语“或”表示“和/或”，除非明确地说明是仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，尽管本公开支持仅指替代方案和“和/或”的定义。
[0022]
如本说明书和权利要求所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是包括性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的元素或方法步骤。
[0023]
整个说明书中公开的本发明的组合物以及制备和使用方法可以“包含/包括”特定成分、组分、混合物、方法步骤等，“基本上由其构成”或“由其构成”。
[0024]
从以下详细描述中，本发明的其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应该理解的是，详细描述和具体实施例虽然表明了本发明的具体实施方案，但仅以说明的方式给出，因为根据本详细描述在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。
附图说明
[0025]
以下附图形成本说明书的一部分，并被包含以进一步表明本发明的特定方面。通过参照一个或更多个这些附图结合本文所提供的说明书实施方案的详细说明可以更好地理解本发明。
[0026]
图1是设计用于生产具有低尺寸分散性的2d单层阵列或均匀微滴阵列的微流体装置的一个实施例的俯视图。
[0027]
图2是作为第一微铣削部件和第二光刻(lithographic)部件生产的微流体装置的一个实施例的横截面图，该第一微铣削部件和第二光刻部件可以对齐以形成完全整合的微流体装置。
[0028]
图3显示了微流体设计的四个一般区域：区域1＝喷嘴，区域2＝有限阶梯乳化区域，区域3＝斜坡区域，区域4＝成像或阵列区域。
[0029]
图4显示了当样品移动穿过微流体装置时微滴形成的一个实施例。
[0030]
图5显示了使用当前的设计产生小微滴阵列可能遇到的一些问题。
[0031]
图6是使用本文所述方法产生的阵列的照片。所述图像的微滴尺寸分散性为2.3％(1456个变异系数等于2.32％的微滴)。
具体实施方式
[0032]
在进行二维(2d)阵列分析时，使可以在给定患者样品上运行的测试数量最大化并且使用于进行分析的消耗品成本最小化是有益的。在某些方面，理想情况下，应评估患者样品针对最大数量的相关抗生素或其他化合物/特征，以确定例如患者样品中的一种或多于
一种微生物的易感性。为了使相关查询的数量最大化，患者样品可以分为多个相等容量。之后每一容量分别与测试物质(例如抗生素)混合，然后引入微流体通路，在此产生并分析各个容量的微滴。可以在从其他容量的患者样品分离的微流体通路中，对各个容量的患者样品进行加工。在某些方面，可以采用1个、2个、4个、8个、16个、24个、32个、40个、48个或多于48个(包括其间的所有值和范围)微流体通路。
[0033]
图1提供了微流体通路的一个实施方案的一个实施例的俯视图。该通路包括微滴形成区域，微滴形成区域包括与阶梯区域104流体连通的通道或喷嘴102，该阶梯区域104与斜坡区域106流体连通，斜坡区域106依次连接到成像区或成像区域108。通道102与样品源或存储器112通过流路101流体连通。在某些方面，槽110以及废弃物存储器114可以包括在设计中。
[0034]
图2显示了横截面aa。流路201与通道或喷嘴202流体连通。通道或喷嘴202流至阶梯区域204。阶梯区域204流至斜坡区域206。斜坡区域206流至成像区域208。所述装置可以制造成两个部件：(i)微铣削部分和(ii)通过光刻生产的部分，该微铣削部分和通过光刻生产的部分可以用在本领域内众所周知的方法固定在一起以形成微流体通路。
[0035]
a.微流体通路
[0036]
在某些实施方案中，微流体系统的主要成本动因可以是消耗品的微流体通路部分或包括微流体通路的微流体装置/芯片/一次性部件。在某些方面，每个微流体通路可以具有很多非常小的形貌，该形貌需要在尺寸上相同，方差在约1微米至2微米之内。因此，需要很好地控制制造工艺。鉴于微流体通路是消耗品的一部分，用于所述微流体通路的制造工艺需要成本有效的可实现的大规模制造。在某些方面，用于具有微流体通路的消耗品的制造工艺可以是压缩注射成型。与注射成型一样，压缩注射成型将母料的形貌复制到塑料部件中。区别是压缩注射成型允许更高的精密度和更小的形貌。压缩注射成型产生的部件质量只与用于形成形貌的母料一样好。所以，需要高质量的母料。
[0037]
母料一般地可以通过两种方法(微铣削和光刻)生产。微铣削是还原制造工艺，其中电脑控制的旋转铣刀从钢、黄铜、铝或其他材料的实心块中去除材料。实际上来说，微铣削可以产生约10μm的形貌并保持公差约为+/-1μm。然而，为了获得此范围的公差，必须控制刀具磨损和/或原料和刀具的振动和温度。随着形貌数量的增加和微铣削时间的增加，这些事情变得更成问题。例如，使用微铣削生产公差为+/-1μm的32通路的微流体芯片母体目前还无法商业化。每个芯片的微流体通路越少，需要的芯片数量就越多，导致成本增加。
[0038]
光刻(lithography)是蚀刻硅的工艺。之后通过电镀工艺将经蚀刻的硅的形貌转移至金属。不论形貌的数量多少，此工艺能够保持+/-1μm的公差，因为它不容易受到如工具磨损、振动和热条件等因素的影响。光刻方法能够生产在一个芯片中具有很多通路的芯片，限制将要使用的消耗品的量。然而，标准的光刻方法仅限于可以在接近90度壁上掌握的形貌。在某些实施方案中，本文所述的微流体通路在微流体电路设计中使用的坡度可以但不限于10度至50度左右通路。斜坡可以在光刻中以无限个90度的阶梯来近似，但这将成本很高。用于制造斜坡状结构的步降过程将很大程度上影响母料制作的成本。
[0039]
在某些实施方案中，微流体通路可以通过双部件制造工艺来制造，其中第一部件使用压缩注射成型或类似工艺来产生，其中光刻产生的母料用于形成小的通道和单阶梯区域，所述小的通道和单阶梯区域是使用光刻来容易并成本有效地生产的结构。第二部件可
以使用压缩注射成型或使用用于这些结构的微铣削母料的类似工艺来产生，所述结构是使用微铣削来进行成本有效地生产的结构，其中包括但不限于例如斜坡区域和成像区域的结构。这两个部件可以对齐并结合以形成本文所述的微流体通路。
[0040]
在微滴形成部件(例如图2的ii、图3的区域1和区域2)和阵列形成部件(例如图2的i、图3的区域3和区域4)之间的对准精度可以为约+/-50μm。所述对准不需要严格控制，因为微滴斜坡的位置相对于微滴形成的形貌需要1μm至2μm的精密度以保持一致的微滴尺寸。光刻可以用于形成对微滴形成很关键的设计形貌，微铣削可以用于形成对于微滴形成的非关键形貌，之后被结合到一起以制造具有微流体喷嘴阵列的微流体装置和相关通路，该相关通路从微滴形成的角度看基本上都相同。所述微滴在装置的一部分中形成，该部分以高精度(+/-1μm至2μm)生产，微滴在装置的一部分中完成和加工，该部分可以以更低的精度(+/-5μm至30μm)生产。
[0041]
需要斜坡部分以形成微滴的装置(喷嘴/斜坡配置)将会遇到对准问题，因为斜坡在形成微滴时是一体(integral)的，所以必须以更高的精准定位以形成具有低分散性的微滴。如果斜坡没有几乎完全对准喷嘴/斜坡结构中的小通道出口，微滴尺寸和一致性会受到影响。所以，如果尝试在一个部分中拥有多于1个，更不用说高达32个微流体通路，则可能会看到直接进料给斜坡区域的喷嘴出口的各个部分的显著变化。喷嘴/斜坡(与喷嘴/阶梯/斜坡结构相比)将难以或不可能在所需公差内成本有效地生产。
[0042]
b.低尺寸分散性的微滴乳液
[0043]
有多种方法来形成低尺寸分散性的微滴乳液。最常见的方法是使用两相流动系统。这种方法通常使用由流动的连续相施加的剪切应力以由流动的分散相形成微滴。顾名思义，所述方法需要两个相都流动。另外，为了维持低的微滴尺寸分散性，其中一个流动速率(连续相或分散相)需要精准控制。由于需要两个不同的流动速率，这种方法需要使用更复杂的系统。
[0044]
另一种形成低尺寸分散性的微滴乳液的方式是使用单相流动技术。在单相流动系统中，分散相流动而连续相保持静止。这些系统可以使用laplace压力或浮力的变化以诱导微滴形成。虽然相比于两相流动，单相流动的系统复杂性更低，但如果目标是形成低尺寸分散性微滴的2d单层阵列，则单相流动的系统有其它困难需要解决(一些实例见图5)。
[0045]
使用单相流动技术的第一种方法的其中一种是阶梯乳化。阶梯乳化可以以两种一般方式实现。第一种实施方案可被认为是承载分散相的通道，该分散相被引入包含静止的连续相的半无限阶梯。半无限阶梯定义为显著大于无约束形成的微滴直径的1倍的阶梯。在这种情况下，微滴将通过laplace压力的梯度产生。形成后，取决于分散相相对于连续相的相对浮力，微滴可以上升、下降或保持在喷嘴出口。如果所述浮力不匹配，形成的微滴将从喷嘴漂移或下沉直至到达半无限壁。在半无限阶梯系统形成的微滴由于在喷嘴出口处一致的环境而具有极好的尺寸分散性。然而，如果微滴生产速率足够高，微滴将开始在半无限壁处堆叠，并且不会获得2d单层，直到浮力促使微滴解开堆叠。浮力在皮升微滴上是相对较弱的力，所以解开堆叠花费很长时间。此外，如果堆叠严重，堆叠的微滴将最终聚集在喷嘴的出口，并且阻碍新微滴的形成。这种聚集在喷嘴出口造成了不一致的环境并且因此增加了尺寸分散性。如果分散相和连续相之间的浮力相匹配，所述微滴将聚集在喷嘴的出口并且阻碍新微滴的形成。这种聚集因为上述原因增加了微滴尺寸分散性。因为缺少约束，所述聚
集的微滴也会自由堆叠，会无法获得2d单层。
[0046]
阶梯乳化的第二种实施方案可以被认为是承载分散相(例如水相)的通道，该分散相被引入包含静止的连续相(例如油相)的有限阶梯。有限阶梯定义为显著小于无约束微滴直径的1倍的阶梯。在这个实施方案中，微滴形成后保持压缩，所以浮力不起作用。这个实施方案优于第一种，因为它确保形成的微滴产生2d单层。但是因为没有清理从喷嘴处形成的微滴的机制，微滴聚集在喷嘴出口并且阻碍新微滴的形成，增加了通过有限阶梯乳化形成的2d单层阵列的尺寸分散性。
[0047]
本文所述的方法将有限阶梯乳化与形貌结合以在喷嘴出口处维持一致的环境。结果形成具有低尺寸分散性的2d微滴单层阵列(实例见图6)。
[0048]
由ecole polytechnique的charles baroud带领的研究小组展示了使用约束梯度来创造相对大的低尺寸分散性的2d单层微滴阵列的方法。使用他们的方法，在这些相对大的微滴中，他们能够获得低至3％的尺寸分散性。这里提出的方法不同于baroud，其设计为形成小得多的小微滴，其具有尺寸分散性明显好于许多其他形成2d微滴单层阵列的单相流动系统。目前的装置和方法比baroud的方法生产小得多的微滴，所述baroud的方法使用为大容量阵列设计得更好的微流体通路。所述微流体通路设计结合了四个区域(见图3和图4)，以在微滴产生过程中，在喷嘴的出口创造一致的环境从而获得具有低尺寸分散性的2d单层阵列。
[0049]
c.微流体装置
[0050]
在某些实施方案中，微流体装置设计为生产具有低尺寸分散性的2d微滴阵列。在统计学中，分散性或变化性是分布被拉伸或挤压的程度。常见的统计学分散性量度的例子是方差、标准差和四分位差。如本文所用的低尺寸分散性指分散性小于6％、5％、4％、3％、2％或1％，包括其间所有值和范围。在某些方面，低尺寸分散性指小于3％的分散性。在特定的方面，微滴尺寸分散性约为2.1％至2.5％，或2.3％。
[0051]
本文所述的方法和装置通过使用四个加工区域，创造了具有低尺寸分散性的2d微滴单层阵列。在某些方面，包括如下所述可操作地连接的所有四个区域的装置或装置的一部分，指的是微流体通路。微流体装置可以包括1个、2个、4个、8个、16个、32个、64个、128个或多于128个(包括其间所有值和范围)与第二、第三和第四区域连接的通道区域或喷嘴。在某些方面，所有喷嘴或一些喷嘴将与共同的阶梯、斜坡和阵列区域流体连通。
[0052]
第一加工区域是引入分散相的通道区域或喷嘴。该区域具有恒定的横截面积并具有最高表面能。在某些方面，横截面积可以为1μm2、50μm2、100μm2、150μm2、200μm2、250μm2、300μm2、350μm2、400μm2、450μm2、500μm2、550μm2、600μm2、650μm2、700μm2、750μm2、800μm2、850μm2、900μm2、950μm2至1000μm2，包括其间所有值和范围。
[0053]
第二加工区域是有限乳化阶梯区域。该区域具有恒定的横截面积和第二高的表面能。这两个区域(通道/喷嘴和有限阶梯)是微滴形成处。所述有限阶梯区域还有第二个功能，即将形成的压缩微滴保持在适当位置，直到通道将更多分散相引入到有限阶梯区域。这种另外的分散相将保持在有限区域中的压缩形成的微滴推入第三区域(见例如图4)。
[0054]
第三加工区域是斜坡区域。该斜坡具有增加的横截面积并且其表面能的范围从上游端的第二高到下游端的第三高。当压缩形成的微滴进入该区域，微滴将通过在增加横截面积的方向上解压缩来成比例地逐渐降低其表面能。该表面能的变化推动微滴通过斜坡区
域向下游进入到第四加工区域。该斜坡区域阻止来自第四区域的微滴返回到第二阶梯区域堆叠，以使第二阶梯区域的环境一致并被控制用于一致的微滴形成。
[0055]
第四加工区域是形成2d单层的收集区域。这里完全形成的微滴的表面能最低。在这个区域的表面能也是恒定的，因为横截面积是恒定的。当微滴添加到所述区域时，微滴单层阵列随时间增长。这四个区域结合以在导致具有低尺寸分散的2d微滴单层阵列的微滴生产过程中创造一致的环境。
[0056]
包括这四个区域的微流体通路可以通过共同的流路连接到样品源。所述共同的流路将具有在流路近端的入口和沿着流路连接到通道区域/喷嘴的出口或多个出口。
[0057]
d.阵列形成的方法
[0058]
在某些方面，微滴是在不混溶的流体中。在将含目标的溶液和不混溶流体混合后，它们形成多相-将目标物质保持在溶液中的水滴或分区，和由不混溶流体构成的非水相或连续相。不混溶流体可以是包含含氟表面活性剂的氟碳化合物或烃油，例如矿物油或硅油。在特定方面，微滴可以为0.1pl至10nl。在另一方面，微滴为至少、至多或约0.1pl、0.5pl、1pl、5pl、10pl、20pl、30pl、40pl、50pl、60pl、70pl、80pl、90pl或100pl至200pl、300pl、400pl、500pl、600pl、700pl、800pl、900pl或1000pl，包括其间所有值和范围。在特定的方面，微滴为约40pl至300pl，更具体地说为或约为143pl。在某些方面，微滴的直径为40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm至85μm。在特定方面，微滴为或约为65μm。所述方法还可以包括将微滴排列在2d阵列中。在某些方面，二维阵列是静态二维阵列。
[0059]
可以使用诸如相机等的检测器来执行对微滴的光学特性的监测。在某些方面，光学特性包括微滴的荧光。在某些方面，监测微滴的光学特性还包括用例如光的电磁辐射照射微滴或使微滴暴露于电磁辐射微滴。在某些方面，电磁辐射具有与报告物(reporter)相配的激发波长，即用适当的源照射或辐射微滴。在某些方面，源提供具有500nm、525nm、550nm、575nm、600nm、625nm、650nm、675nm至700nm，包括其间的所有值和范围的激发波长的光。选择源使得电磁辐射激发一种或多于一种报告物，例如染料或其他化合物。在特定方面，光源可以是发光二极管(led)。
[0060]
报告物可以包括“活力染料”或“报告染料”，活力染料或报告染料是检测由于细胞活力、呼吸或代谢活动而导致的分离细胞周围环境变化的部分；或者是在特定条件下表达的可检测蛋白质(例如，绿色荧光蛋白或荧光素酶)。在某些方面，可以转染或设计细胞以表达报告蛋白。可以使用本领域已知的适合于所用报告物的任何方法检测报告物，例如荧光团或比色染料的光发射或吸光度。在一些情况下，来自报告物的信号通过光学显微镜、相机或其他合适的检测器/传感器检测。在某些方面，报告物是荧光染料。在某些方面，报告物是刃天青(resazurin)、基于刃天青的染料、或者是刃天青的衍生物或与刃天青结构相关的染料(7-羟基-3h-吩嗪-3-酮10-氧化物)。刃天青是一种无毒、可透过细胞的化合物，在其氧化状态下呈蓝色，几乎不发荧光。当刃天青与活细胞接触时被还原为试卤灵(resorufin)，一种红色并且高荧光的化合物，并且可以通过荧光或比色法检测。活细胞的代谢活性将刃天青连续转化为试卤灵，增加了细胞周围培养基的总体荧光和颜色。基于刃天青的染料是含有刃天青结构以及其他修饰基团的染料。在其他方面，活力染料是四唑基于四唑的染料、或是四唑衍生物或与四唑结构相关的染料。基于四唑的染料是
含有四唑部分的染料，并且可以含有其他不破坏五元四唑环的修饰基团。
[0061]
在某些方面，微滴的孵育是在恒定温度(等温)下进行的。在其他方面，可以控制温度并且可以使用特定的间隔或速率来逐步升高或线性升高温度，例如从25℃升温至37℃或以每分钟2℃至10℃的速率升温。在其他方面，温度可以以特定的间隔或速率降低，例如以5℃至10℃的间隔或每分钟2℃至10℃的速率降低。在各个方面，温度为20℃至45℃、30℃至40℃或35℃至38℃，包括其间的所有值和范围。在某些方面，将分散部分(partition)在37℃下孵育。
[0062]
在特定方面，微滴可以包含单细胞、微生物、或细胞聚集体或微生物聚集体。在其他方面，微滴可以包含2种、3种、4种或多于4种细胞或微生物类型。该方法还可以包括按种、属、科、目、纲、门、界或其组合对微生物进行分类。可以在基于一个或多于一个条件下的一个或多于一个波形的特征进行分类。在某些方面，微生物是细菌。本发明的某些方面可包括通过革兰氏染色分组或对包括细菌的微生物的公认的其他分类标准对细菌进行分类。在某些情况下，微滴可以包含多于一种目标类型(种、属等)，但是环境应激源或条件可以杀死除了一种目标类型之外的所有目标类型，该目标类型可以使用其特征或波形来识别。
[0063]
该方法还可以包括在形成2d阵列之前将样品分成至少一个对照样品和至少一个测试样品。可以以不同于对照的方式处理或加工每个测试样品。在一些方面，使至少一个测试样品与应激源、细胞毒性、抗癌、抗微生物化合物或条件接触。在一些方面，单个测试样品可以暴露于不同浓度的化合物或变化的条件下。在其他方面，测试样品可以暴露于可以改变或不改变测试样品中包含的细胞的表型的各种温度、环境或化学品。在某些方面，dcc是病理或致病细胞，例如癌细胞。
[0064]
该方法包括使用分散部分的波形(即，检测随时间变化的信号)评估样品(对照样品和测试样品)。在某些方面，评估包括将分散部分波形与储存的或预定的波形(例如，参考波形)库进行比较。
[0065]
某些实施方案涉及用于检测和表征样品中的dcc(例如微生物或癌细胞)的方法，所述方法包括(a)将包含微生物的样品与报告物(例如活力染料)接触，形成样品混合物；(b)将样品混合物分成包括对照样品和至少一个测试样品的至少两个部分或样品；(d)将测试化合物/物质或抗菌药物引入所述至少一个测试样品；(e)将对照样品和至少一个测试样品各自分散成微滴，形成对照样品微滴和测试样品微滴，其中微滴包括平均至多一个目标微生物或微生物自然聚集体；(f)在特定温度下随时间孵育微滴；(g)在孵育期间监测微滴的光学特性，其中光学特性包括由微滴中的报告物与微生物/细胞相互作用产生的光学信号的量；(h)构建微滴的光学信号波形(例如分散部分或微滴波形)；(i)用分散部分波形形状对每个微滴内的微生物/细胞进行分类；并且(j)比较在对照样品分散部分波形和测试样品分散部分波形之间的分散部分波形，并基于分散部分波形比较，评估测试化合物/物质或抗菌药物的敏感性。在某些方面，测试化合物可以包括小分子、肽、纳米颗粒或蛋白质。在其他情况下，测试物质可以包括噬菌体和其他工程化治疗剂。在其他方面，测试化合物/物质可以是被认为是疗法的治疗剂，或者被设计为用于其他疾病病症，例如癌症(例如，化学治疗或抗癌化合物或物质)的治疗剂。
[0066]
如本文所用，术语“微滴”是指一定体积的流体(例如液体或气体)，其是大体积的分离部分。可以将大体积分散为任何合适数量(例如，102、103、104、105、106、107等)的较小体
积或微滴。微滴可以通过物理屏障或物理力(例如，表面张力、疏水排斥等)分开。微滴可以(i)存在于表面上或(ii)由与其不混溶的流体包封，例如连续相的乳液、气体或其组合。微滴在形状上通常为球形或基本上球形，但可以是非球形的。可以通过沉积在表面上来改变球形或基本上球形之外的微滴的形状。微滴可以是“简单微滴”或“化合物微滴”，其中一个微滴包封一个或多于一个另外的较小微滴。本文提供的微滴体积和/或一组微滴的平均体积通常小于约1微升，例如微滴体积可为约1μl、0.1μl、10pl、1pl、100nl、10nl、1nl、100fl、10fl、1fl，包括其间的所有值和范围。本文提供的微滴的直径和/或一组微滴的平均直径通常小于约1毫米，例如1mm、100μm、10μm至1μm，包括其间的所有值和范围。微滴可以通过本文所述的装置和方法形成并通常是单分散或基本上单分散(相差小于6％、5％、4％、3％、2％或1％)。
[0067]
将包含至少一种目标细胞的测试样品与活力染料或报告物染料组合并分散成微滴，使得统计学上大量的微滴包含不超过一种目标细胞或细胞聚集体(一些微生物种倾向于聚集成细胞簇或链)。在优选的实施方案中，活力染料或报告物染料在活细胞存在下从非荧光分子还原为荧光分子，然后如果微滴中的氧化还原电势降至低于通常为-100mv的一定量，则活力染料或报告物染料进一步还原为非荧光分子。随着时间的推移监测每个微滴中产生的荧光特征，并用于鉴别和表征其中包含的细胞。以下提供关于本发明方法的进一步细节。
[0068]
测试样品。测试样品中的目标细胞包括细菌、真菌、植物细胞、动物细胞或来自任何其他细胞生物的细胞。细胞可以是培养的细胞或直接从天然存在的来源获得的细胞。细胞可以直接从生物体获得或来自从生物体获得的生物样品，例如痰、唾液、尿液、血液、脑脊液、精液、粪便和组织。任何组织或体液样品。在一个实施方案中，测试样品包括从包含多种其他组分的生物样品中分离的细胞，其他成分例如非目标细胞(背景细胞)、病毒、蛋白质和无细胞核酸。细胞可以被病毒或另一种细胞内病原体感染。然后可以将分离的细胞重新悬浮在与获得它们的培养基不同的培养基中。在一个实施方案中，测试样品包括悬浮在营养培养基中的细胞，营养培养基使细胞能够复制和/或保持存活。营养培养基可以是具有已知量或所有成分的确定培养基或营养物质是例如酵母提取物或酪蛋白水解物的复杂成分的不确定培养基，其中含有许多未知比例的化学物质的混合物，包括碳源如葡萄糖、水、各种盐、氨基酸和氮。在一个实施方案中，测试样品中的目标细胞包含病原体，并且营养培养基包含常用的用于培养病原体的营养肉汤(液体培养基)，例如溶原性肉汤(lysogeny broth)、营养肉汤或胰蛋白酶大豆肉汤。在任何实施方案中，培养基可以补充有血清或合成血清以促进需要复杂营养的生物体的生长。
[0069]
分隔/分散。本发明的方法包括将包含至少一种目标细胞的测试样品与活力染料或报告物染料组合，然后将测试样品分散成微滴，使得没有微滴含有多于一种目标细胞或细胞聚集体。取决于应用，微滴的数量可以从数百到数百万不等，并且取决于应用，微滴体积也可以在1pl至100nl之间变化，但优选为低尺寸分散性的25pl至500pl。当水相或分散相，即本例中的测试样品，被引入不混溶相(也称为连续相)时，就会形成微滴，以使每个微滴被不混溶的载体流体包围。在一个实施方案中，不混溶相是油，其中油包含表面活性剂。在相关实施方案中，不混溶相是包含氟表面活性剂的氟碳油。使用氟碳油的一个重要优点是它能够相对良好地溶解气体并且具有生物惰性。因此，本文所述方法中使用的氟碳油包
含细胞存活所必需的溶解气体。
[0070]
报告物。各种报告物可以与本文公开的系统和方法一起使用。例如，至少一种小分子代谢报告物可以是荧光团、蛋白质标记的荧光团、包含可光氧化的辅因子的蛋白质、包含另一种插入的荧光团的蛋白质、线粒体活体染色剂或染料、显示至少一种氧化还原电势的染料、膜定位染料、具有能量转移性质的染料、ph指示染料。在另一方面，报告物可以是或包括刃天青染料、四唑染料、香豆素染料、蒽醌染料、花青染料、偶氮染料、呫吨染料、芳基次甲基染料(arylmethine dye)、芘衍生物染料、钌联吡啶络合物染料或其衍生物。某些实施方案使用基于刃天青的染料。也包含在本文使用的术语报告物中的细胞活力染料用作分析试剂，以鉴别和表征包封在微滴内的单个细胞或病原体。自1950年代以来，活力染料一直用于细胞活力检测目的。然而，这些试剂通常用于体积显著大于1微升的样品中和/或用作终点试验以指示活细胞的存在。本发明的方面在1pl至100nl，更具体地在25pl至500pl的微滴中使用活力染料。在此处描述的方法中，由活力染料产生的光学信号通过小体积微滴浓缩并在孵育时间内测量和记录。在含有活细胞的微滴中，这导致光学特性快速产生，并且具有关于包封在微滴内的细胞特征的信息。与例如抗微生物或细胞毒性药物的环境应激源组合，通过随时间监测含有细胞的微滴的光学信号，可以产生其他的特征。来自具有和不具有环境应激源的细胞的光学特性可用于确定细胞的种类和/或特征。此外，从暴露于药物的细胞类型获得的光学特性与未暴露于药物的相同种类的目标细胞的光学特性之间的差异可用于确定从测试样品中获得的目标细胞的表型耐药性谱。因为这些特征是由封装在微滴中的单个细胞产生的，所以它们表示关于每个细胞的个体特征的信息，而不是从包含许多细胞的大量样品产生的细胞群的平均特征。
[0071]
本发明的方法与可与活细胞一起使用的任何活力染料或报告物染料相容(不需要细胞裂解)。在优选的实施方案中，活力染料是基于刃天青的染料或其衍生物。当蓝色、非荧光刃天青被不可逆地还原成粉色且高荧光的试卤灵，它产生荧光信号和比色位移(从蓝色到粉色)。在优选的实施方案中，使用荧光，因为它提供了与比色信号变化相比更好的灵敏度。亚纳升(sub-nanoliter)体积的分泌荧光分子内的有限扩散限制快速浓缩到可检测的信号水平，然后通过下述方法检测。此外，如果氧化还原环境降低到低于通常在-100mv左右的特定氧化还原阈值，试卤灵可逆地还原为非荧光氢化试卤灵。根据微滴的氧化还原电势，不可逆的从刃天青到试卤灵的还原和可逆的试卤灵还原到氢化试卤灵和氢化试卤灵氧化回到试卤灵的组合随着时间的推移在微滴中产生独特的荧光特征，微滴体积足够小以致于在存在单个细胞或细胞聚集体的情况下，氧化还原变化很快发生。可商购获得的基于刃天青的染料的实例是：alamarblue
tm
(各种)、prestoblue
tm
(thermo fisher scientific)、cell-titer blue
tm
(promega)或刃天青钠盐粉末。也可以在该方法中使用并与刃天青结构相关的染料是：10-乙酰基-3,7-二羟基吩噻嗪(也称为amplex red
tm
)、7-乙氧基刃天青和1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基吖啶-2(9h)-酮(ddao染料)。在可选的实施方案中，依赖于四唑还原的染料，例如甲(formazan)染料，可用作细胞活力指示剂。实例包括int、mtt、xtt、mts、ttc或四唑氯化物、nbt和wst系列。
[0072]
细胞(dcc)聚集体。本发明的优选应用是通过鉴别引起感染的微生物以及它们是否对抗微生物药物具有耐药性来诊断微生物感染。因此，在该申请中，dcc可以是单细胞微
生物。然而，一些细菌自然聚集成簇或链。在这些情况下，一些微滴可以包含相同微生物种的细胞聚集体(均质聚集体)而不是单个微生物。在这些情况下，曲线的形状可能受到聚集体中细胞数量的影响。然而，用于对分隔的细胞进行分类的储存的特征波形和调用逻辑可以解释这样的聚集体，其方式与它们可以解释单个细胞的方式相同。此外，如果实施方案包括抗微生物敏感性试验，则包含抗微生物药物的混合物将表现出与排除抗微生物药物的混合物相同的细胞聚集体特征，并且比较仍将是准确的。因此，尽管本发明的方法通常包括在每个微滴中分离单细胞，但它必然适用于在微滴中分离的均质聚集体中单细胞种的情况而非个别细胞的情况。在癌症疾病诊断的情况下，如果它们是循环肿瘤细胞，则目标dcc通常不会聚集。如果从组织获得癌细胞，则在分析之前通常将组织分解成单个细胞。因此，每个微滴最多只包含一个细胞；然而，在一些情况下，还可以使用所述方法分析癌症聚集体。
[0073]
信号检测。一旦微滴产生，就必须将它们呈现给光学系统、传感器或传感器阵列进行分析。在一个优选的实施方案中，微滴以2d阵列呈现，使得可以保持良好的热控制，并且对于许多微滴可以同时(在单个时刻)测量微滴信号。在含有目标细胞的微滴中，报告物将产生浓缩的荧光信号，该信号将升高到不含细胞的背景微滴之上。微滴的浓缩信号使得能够在可比较的时间标准pcr技术中进行单细胞鉴别，这是快速鉴别的黄金标准。在某些方面，通过用特定波长的光来激发还原的报告物并用相机收集带通滤波的斯托克斯位移光来检测信号。使用成像技术的优点是它们可以对保持静止的微滴阵列成像，因此可以容易地随时间监测。基于细胞计量法的方法通常采用终点检测而不是实时检测，因为难以随时间跟踪移动的微滴。对阵列成像的另一个优点是在分析时所有微滴都经历相同的反应条件。因此，可以在等效时间点比较微滴信号，这是重要的，因为信号随时间变化。使用细胞计量法，微滴在不同时间通过检测器。因此，在分析时，一些微滴比其他微滴孵育更长时间。最后，测试样品中可能存在不同的目标细胞种类。对于每个种类，可能存在最佳微滴体积和染料浓度，以在特定时间点使信号最大化。如果使用终点法，则不需要将微滴体积和报告物浓度控制在相同的程度，因为时间可以补偿次优，并且可以在单一染料和微滴浓度通用地表征不同种。
[0074]
多重测定。本文描述的方法包括来自单个测试样品的多个细胞的特异性鉴别。通过将单个细胞分隔成它们专属的分离的微滴，消除了细胞之间资源的竞争。因此，与大多数细胞群体相比，在大量群体中全体作为少数群体存在的各个细胞现在能够进行相同的营养物质获取，这使得对具有多种细胞类型的样品中的低丰度细胞具有更高的敏感性。本发明的多重测定限制取决于区分不同细胞类型之间的活力特征的能力。大多数多重测定方法需要多种染料(荧光团)，而这些染料又需要多组led、激发和发射滤波器。因为在某些情况下，所述分析方法使用形状信息而不是光谱信息，所以该方法可以用于使用仅需要一个led、发射滤波器和激发滤波器的单个染料来多重测试许多目标，从而简化了进行分析所需的硬件。
[0075]
e.实施例
[0076]
包括以下实施例以及附图以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解的是，实施例或附图中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中能够很好地起作用的技术，因此可以认为是构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行
许多改变并仍然获得相同或相似的结果。
[0077]
微通道制造。微滴阵列形成实验在环烯烃共聚物(coc)微流体通路中进行。所述微流体通路通过热压印coc罩盖，然后用coc膜低温黏合以密封热压印的coc罩盖来制造。所述热压印母料用光刻法产生。所述微流体通路几何形状详见图1。所述微通道微滴发生器由通往界限明确的阶梯的微通道组成。然后所述界限明确的阶梯通向界限模糊的斜坡，在这种情况下，该斜坡近似为两个额外的阶梯。
[0078]
试剂和实验方案。使用具有5重量/重量％peg-pfpe表面活性剂作为连续相的氟化油溶液进行试验。分散相是10重量/重量％的基于刃天青的染料在水中的溶液。通过将11μl的连续相引入到入口来填充微流体通路。一旦连续相充满通路之后，通过捕集在连续相和出口密封处之间的可压缩气泡而密封出口。然后将11μl的分散相分配到入口。小心确保在分散相和连续相之间没有引入空气。
[0079]
然后将微流体通路放置到能够在微流体通路成像时控制局部压力的密封系统中。所述系统以固定的速度增加了局部压力，以驱动分散相进入微流体通路，其以每个微通道微滴生成器每秒约1个微滴的速度产生微微滴。
[0080]
拍摄所形成的微滴的图像(见图6)，并计算以下统计数据。微滴平均直径＝53μm。微滴数量＝1456。微滴直径变化系数＝2.3％。