非结垢组合物以及用于操控和处理包封的微滴的方法与流程

非结垢组合物以及用于操控和处理包封的微滴的方法
1.相关申请的交叉引用
2.本专利申请要求于2019年1月31日提交的美国临时专利申请第62/799,734号(题为“non fouling compositions and methods for manipulating and processing encapsulated droplets”)的优先权，该美国临时专利申请通过引用以其整体并入本文。
3.本专利申请可能与以下相关：于2018年4月4日提交的题为“digital microfluidic apparatuses and methods for manipulating and processing encapsulated droplets”的国际申请第pct/us2018/026095号；于2017年4月4日提交并且题为“digital microfluidics apparatuses and methods for manipulating and processing encapsulated droplets”的美国临时专利申请第62/481,488号；于2017年9月1日提交的题为“digital microfluidics devices and methods of using them”的美国临时专利申请第62/553,743号；和于2017年9月12日提交的题为“digital microfluidics devices and methods of using them”的美国临时专利申请第62/557,714号，其中每一篇都通过引用以其整体并入本文。
4.本专利申请可能与于2016年6月6日提交的题为“air
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matrix digital microfluidics apparatuses and methods for limiting evaporation and surface fouling”的美国专利申请第15/579,455号相关，美国专利申请第15/579,455号要求于2015年6月5日提交的题为“device and methods for limiting evaporation and surface fouling”的美国临时申请62/171,756的优先权，该美国临时申请通过引用以其整体并入本文。
5.通过引用并入
6.本说明书中提及的所有公开和专利申请都通过引用以其整体并入本文，其程度如同每个单独的公开或专利申请被明确地且单独地指示以通过引用并入。
7.领域
8.本文描述了用于在包括空气基质数字微流控(dmf)装置的空气基质电动器件(air
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matrix electrokinetic device)内使用的组合物以及使用其操控和处理包封的微滴的方法。这些组合物还可以有利地用于生物分析实验，诸如pcr和类似实验，以分离含水反应混合物。
9.背景
10.微流控技术已经改变了进行分子生物学、医学诊断和药物发现的传统程序的方式。芯片实验室和生物芯片类型的器件在科学研究应用以及潜在的护理点应用两者中均引起了很大的兴趣，因为它们两者以小的反应体积执行高度重复的反应步骤，既节省了材料又节省了时间。虽然传统的生物芯片型器件利用微米尺寸或纳米尺寸的通道并且通常需要联接到生物芯片的对应的微型泵、微型阀和微通道来操控反应步骤，但这些另外的部件大大增加了微流控器件的成本和复杂性。
11.数字微流控(dmf)已成为一种强大的制备技术，用于广泛的生物应用和化学应用。dmf能够对多种样品和试剂进行实时、精确和高度灵活的控制，而不需要泵、阀或复杂的管
道阵列，该样品和试剂包括固体、液体以及甚至苛性的化学物质。在dmf中，纳升体积到微升体积的离散微滴被分配到包被有疏水性绝缘体的平坦表面上，在这里通过向嵌入的电极阵列施加一系列电势来操控(输送、分离、合并、混合)离散微滴。复杂的反应步骤可以单独使用dmf或使用混合系统进行，在混合系统中dmf与基于通道的微流控一体化。
12.尽管取得了重大进展，但蒸发(特别是在空气基质dmf中蒸发)和表面结垢两者仍然是问题。当来自反应混合物的组分在接触微流控器件或dmf器件的表面之后不可逆地粘附到这些表面时，发生表面结垢。当在较高温度(例如，大于37℃)操作时，表面结垢是特别严重的问题。已经提出了多种策略来防止表面结垢，诸如使用聚合物、玻璃和金属来制造微流控通道或者使用材料表面的化学改性。尽管努力测试和制造抗表面结垢的表面和表面涂层，然而，这些策略的成功有限，特别是在dmf的情况下。在某些情况下，在表面上意图防止表面结垢的涂层可能引起不希望的相互作用，以及与所使用的反应混合物和/或试剂的次级反应。在其他情况下，已经提出将化学添加剂用于在dmf内采用的微滴中使用，但是并不普遍适用于所有的实验条件，因为没有一种添加剂对所有的结垢试剂/反应组分都有效，并且同样地，也没有一种添加剂与诸如酶或细胞的一系列测定成分相容。一般来说，具有一种简单的解决方案来最小化微流控器件和dmf器件中的表面结垢将是合意的。
13.当在空气基质dmf器件中进行反应时，蒸发也是一个问题。通常，空气基质dmf装置可以指的是dmf装置的任何非液体界面，其中由dmf装置操控的液体微滴被空气(或任何其他气体)基质包围。如本文使用的，空气基质也可以并且可互换地被称为“气体基质”dmf装置；气体不一定是空气(虽然可能是空气)。蒸发在空气基质dmf方法中并且加热持续长的时间段(例如，大于30秒)可能尤其是有问题的。蒸发限制了空气基质dmf的效用，因为酶促反应通常对反应物浓度的变化高度敏感。很大程度上是因为这个原因，其他人试图将油基质dmf用于生物化学应用，尽管有许多缺点，包括：并入垫圈或制造的结构以容纳油的增加的复杂性；不希望的进入到周围的油中的反应物的液
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液萃取；与油混溶性液体(例如，有机溶剂诸如醇)的不相容性；以及有效的热消散，这破坏了局部加热并且经常使对温度敏感的反应混乱。解决蒸发的另一种策略是将空气基质dmf器件放置在封闭的加湿室中，但这通常导致dmf表面上不希望的冷凝，难以和/或有限地接近器件，并且需要另外的实验室空间和基础设施。
14.还已经提出了通过将反应微滴从空气基质dmf器件转移到微毛细管来解决蒸发，在微毛细管中，反应微滴可以在专用的芯片外模块(off
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chip module)中加热而没有蒸发问题。然而，这使空气基质dmf器件的设计和制造复杂化，并且引入微毛细管接口和与外围模块协调的增加的复杂性。
15.因此，对于这样的组合物存在需求，该组合物与限制或防止蒸发的组合物组合，用于在空气基质dmf装置和方法中使用，可以防止或限制表面结垢。本文描述了可以解决这一需求的装置和方法。
16.本公开内容的概述
17.本文描述了可动蜡组合物(mobilizing wax composition)，其可以用作例如数字微流控(dmf)方法或系统的一部分以防止或减少含水微滴的蒸发并防止表面结垢。本文描述的可动蜡组合物在具有气隙(air gap)的dmf装置中可能是特别有用的，对于该装置，表面结垢和蒸发两者均是潜在的有问题的。本文描述的可动蜡组合物，通过包含抗结垢剂作
为可动蜡组合物的一部分而不是包含在含水微滴本身中，也可能是有利的。
18.典型的dmf装置可以包括由气隙分开的平行表面(其在本文中可以被称为
‘
板’)；板中的一个(通常是底板)可以与单独可控的激励电极的图案化阵列进行电接触，并且相对的板(例如，顶板)可以包括一个或更多个接地电极和/或与一个或更多个接地电极电接触。一个或更多个接地电极可以设置在与激励(例如，高压)电极相同的板上。气隙中的板的表面可以包括疏水性材料，该疏水性材料可以是电介质材料，或者在一些变型中，可以包括另外的电介质层。疏水性层和/或电介质层可以降低表面的润湿性，并且增加微滴和控制电极之间的电容。当微滴在这些板之间的气隙空间中时，微滴可以被移动或以其他方式被操控。气隙可以被分成多个区域，并且板的一些区域可以包括由热调节器(例如，珀耳帖器件、电阻加热器件、对流加热/冷却器件等)进行的加热/冷却，热调节器与该区域热接触，并且可以定位于该区域。利用空气基质dmf装置进行的反应可以被检测，包括成像或其他基于传感器的检测，并且可以在空气基质dmf装置的一个或更多个局部区域进行反应或者在全部或大部分气隙空间内进行反应。
19.当在气隙中使用微滴时，蒸发是一个挑战，特别是在加热时。为了防止或减少蒸发，疏水性材料的外部鞘(outer sheath)，诸如在操作温度范围内(例如，在约10℃至约120℃之间、在约5℃至约120℃之间、在约1℃至约110℃之间、在约0℃至约100℃之间、在约
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5℃至约120℃之间、或这些中的任何范围，包括
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10℃、
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5℃、
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1℃、0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、10℃、12℃、15℃等的下限温度以及100℃、101℃、105℃、110℃、120℃、130℃等的上限温度)为液体的蜡或其他材料，在本文中被称为液体蜡。即使使用液体蜡来将微滴包封在气隙中以防止蒸发，在一些情况下，在延长的反应时段期间或在掺入易于结垢的材料后，可能难以防止表面结垢。因此，在气隙内移动蜡包封的微滴可能变得越来越困难，包括移动至反应区域(例如，具有温度控制的反应区域)。在反应方案期间或完成后，微滴可能变得不可移动。
20.因此，本文描述了用于使用可动蜡组合物进行一种或更多种微滴操作(包括与另外的含水微滴合并)的组合物、方法和试剂盒，以将含水微滴包被、覆盖、包封、罩住等，这既可以防止或减少蒸发，又可以防止或消除结垢，而不需要添加抗结垢剂来混合在含水微滴本身中。替代地，通常亲脂性的剂(例如，具有约10或更小，例如约9或更小、约8或更小、约7或更小、约6或更小等的亲水
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亲脂平衡hlb的剂)可以被添加到包被微滴的液体蜡材料中，以形成可动蜡。包含液体蜡和通常亲脂性的剂的组合物在本文中可以被称为可动蜡组合物。在本文描述的任何组合物和方法中，组合物(和与组合物一起使用的任何微滴)不包括亲水性聚合物添加剂(例如，非离子型表面活性剂)。
21.本文描述的任何方法可以涉及在空气基质数字微流控(dmf)装置内(例如，在空气基质dmf装置的气隙内)对至少部分地包被在可动蜡组合物中的微滴进行微滴操作的方法。通常，这些方法可以包括从含水微滴开始(例如，将其添加到dmf装置的气隙中)，以及使用电润湿使其在气隙中移动。方法通常还可以包括用如更详细地描述的可动蜡组合物进行包封。这可以用于进行气隙内的任何程序，包括热调节程序。此外，这些方法中的任何方法通常也可以包括从含水微滴中除去大量或大部分可动蜡组合物(例如，通过抽吸、通过使用亲脂性芯吸剂、和/或通过移去微滴，例如，通过电润湿等)。
22.此外，这些方法中的任何方法通常可以包括：通过电润湿移动在空气基质dmf装置
的气隙内(如预期的，气隙可以形成在空气基质dmf装置的第一板和第二板之间)的具有可动蜡组合物的外部涂层(其可以仅仅是至少部分地包被含水微滴的非常薄的层)的含水反应微滴。这些方法中的任何方法还可以包括在气隙中将含水反应微滴与另外的微滴合并，诸如与包含含水微滴的载体微滴合并，以形成组合微滴，所述含水微滴可以是未包被的或者也可以是包被的，例如用如本文描述的液体蜡和/或另一种油或有机溶剂(具有或不具有通常亲脂性的抗结垢剂)包被。油或有机溶剂可以以薄层(例如，单层或更厚的层)包被在第二含水微滴上，但与第一含水微滴上的可动蜡涂层相互作用，并且允许两者合并；在没有这种油或有机溶剂的情况下，两种微滴将不合并。此后，方法可以包括通过电润湿移动在气隙内的组合微滴。第二含水微滴可以包括任何材料(缓冲液、标记物、珠、洗涤液等)。该过程可以重复多次，例如，通过将组合微滴与包含油或有机溶剂的另外的含水微滴组合。
23.在一些变型中，可动蜡、油或有机溶剂材料可以与组合微滴或组合微滴中的靶分子分离。例如，容纳靶分子的珠(例如，磁性珠)可以与包括外部涂层(例如，可动蜡和油/有机溶剂)的组合微滴磁性地分离。然后可以清洗珠以除去任何残余的涂层。可选择地，在一些变型中，涂层可以被机械地除去(例如，通过芯吸)。
24.本文还描述了防止空气基质数字微流控(dmf)装置内的微滴蒸发的方法，该方法可以包括：将反应微滴引入空气基质dmf装置的气隙中，该气隙形成在空气基质dmf装置的第一板和第二板之间；将含水反应微滴与可动蜡材料组合，以将微滴罩在空气基质dmf的气隙内(可选择地，在这些方法中的任何方法中，可动蜡可以在将微滴放置到气隙中之前或同时与含水微滴组合)；移动具有可动蜡的反应微滴或以其他方式对其进行操作，同时可动蜡保护反应微滴以免蒸发，并且允许反应在反应微滴内进行。
25.将反应微滴引入气隙中可以包括将多个微滴组合以在气隙内形成反应微滴；这些中的全部或一些可以包括可动蜡鞘。第一板可以与多于一个相邻的激励电极电接触，并且其中将反应微滴与可动蜡组合包括向多于一个相邻的激励电极的激励电极的子集施加能量以移动反应微滴和可动蜡鞘。
26.如提及的，本文描述的方法和组合物可以与在第一板和第二板之间形成的气隙一起使用；板可以由任何合适的材料形成。在一些变型中，气隙是包括形成底板的电介质片的盒的一部分；该盒可以被插入到包括驱动电极的阵列的器件中，该驱动电极的阵列可以被放置成通过电介质与气隙电连通。可选择地，在一些变型中，第一板可以包括多于一个相邻的激励(驱动)电极。将反应微滴与可动蜡组合物组合可以包括向多于一个相邻的激励电极的激励电极的子集施加能量，以移动反应微滴与可动蜡组合物接触。
27.在一些变型中，允许反应进行可以包括控制微滴的温度；例如，冷却和/或加热包含反应微滴的气隙的至少一部分。如提及的，这些方法中的任何方法可以包括检测反应微滴内的产物。
28.因此，在第一方面中，提供了用于防止表面结垢的组合物，该组合物包括可动蜡组合物。可动蜡组合物可以包含用于包封含水微滴的蜡组分和用于防止表面结垢的亲脂性可动组分。使用这种组合物来至少部分地、大体上或完全地包封含水微滴可以使含水微滴可动。包封还可以防止或减少微滴的蒸发。
29.蜡组分可以是在从约0℃至约120℃；约4℃至约100℃；约7℃至约100℃；约10℃至约100℃或约20℃至约100℃的温度的液体蜡。在一些其他实施方案中，蜡组分可以是在从
约4℃至约100℃、约7℃至约100℃或约10℃至约100℃的温度的液体蜡。
30.在组合物的多种实施方案中，蜡组分的液体蜡可以包括一种或更多种非极性化合物，该非极性化合物包括烃油、硅油、氟化油、基于植物的油或其任何组合。在一些实施方案中，液体蜡可以是液体石蜡油、矿物油或具有多于10个主链碳的线性烃分子。因此，本文描述的术语“蜡”和“蜡组分”不限于石蜡，并且可以包括植物蜡、动物蜡、石油衍生蜡等。在又其他实施方案中，液体蜡可以是液体石蜡油或矿物油。在一些另外的实施方案中，液体蜡可以是液体石蜡油。
31.在组合物的多种实施方案中，液体蜡可以被选择为仅包括在20℃具有从约0.75g/ml至约0.90g/ml的密度的那些液体蜡。在一些实施方案中，液体蜡可以具有约0.77g/ml的密度。在组合物的多种实施方案中，液体蜡可以被选择为仅包括具有从约20度至约65度的接触角的那些液体蜡。在一些实施方案中，液体蜡可以具有约30度至约35度的接触角。
32.在组合物的多种实施方案中，可动蜡组合物的亲脂性可动组分可以包括具有小于约10(例如，小于约9、小于约8、小于约7等)的亲水
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亲脂平衡(hlb)的分子。在一些实施方案中，亲脂性可动组分可以是非离子型表面活性剂。这样的剂在本文中可以被称为通常亲脂性的剂。
33.在一些实施方案中，亲脂性可动组分可以是以下中的一种或更多种：brij 93、span 20、span 40、span 60、span 65、span 80、span 85、1
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硬脂酰
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外消旋
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甘油(1
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stearoyl
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rac
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glycerol)、磷脂酰胆碱(卵磷脂)、脱水山梨糖醇倍半油酸酯、tetronic 90r4、tetronic 701、l
‑
31、l
‑
61、l
‑
81、l
‑
121、31r1、brij 52、a或其任何组合。在一些实施方案中，亲脂性可动组分可以是brij 93。
34.在组合物的多种实施方案中，亲脂性可动组分可以以以下浓度(v/v％)存在：从约0.001％至约10％；约0.001％至约1.0％；约0.001％至约0.10％；约0.01％至约10％；约0.01％至约1.0％；约0.01％至约0.10％，或其间的任何值。在一些实施方案中，亲脂性可动组分可以以从约0.01％至约0.10％的浓度(v/v％)存在。
35.在组合物的多种实施方案中，被可动蜡组合物包封的含水微滴可以包含感兴趣的生物样品、试剂、微物体或其任何组合。在一些实施方案中，微物体可以是一个或更多个珠、一个或更多个生物细胞、细胞的一个或更多个亚细胞部分或其任何组合。
36.提供了防止空气基质数字微流控(dmf)装置内表面结垢的方法，其中该方法包括：通过dmf将含水微滴移动至空气基质dmf装置的气隙中，该气隙形成在空气基质dmf装置的第一板和第二板之间，其中该微滴是在可动蜡组合物的鞘内的包封的含水微滴，该可动蜡组合物包含液体蜡和用于防止表面结垢的亲脂性可动组分。可动蜡的包封的鞘可以是任何厚度或尺寸(例如，等于含水微滴体积的300％和30％之间的体积、含水微滴体积的约250％和40％之间的体积、含水微滴体积的约200％和50％之间的体积，等等)。
37.在另一个方面中，提供了防止空气基质数字微流控(dmf)装置内表面结垢的方法，其中该方法包括：将含水微滴引入空气基质dmf装置的气隙中，该气隙形成在空气基质dmf装置的第一板和第二板之间；以及将含水微滴包封在可动蜡组合物的鞘内，该可动蜡组合物包含液体蜡和用于防止表面结垢的亲脂性可动组分。
38.在防止表面结垢的方法的多种实施方案中，可动蜡组合物可以是本文描述的任何
可动蜡组合物。在一些实施方案中，液体蜡组分可以是液体石蜡，并且亲脂性可动组分可以是brij 93。
39.在多种实施方案中，将含水微滴引入气隙中可以包括将多个微滴组合以在气隙内形成含水微滴。
40.在多种实施方案中，在将含水微滴引入气隙中的同时，可动蜡组合物可以以与含水微滴的混合物被引入。在其他实施方案中，第一板可以包括多于一个相邻的激励电极，并且其中用可动蜡组合物包封含水微滴还可以包括将含水微滴输送至气隙的微滴制备区，其中微滴制备区包含可动蜡组合物。在一些实施方案中，第一板可以包括多于一个相邻的激励电极，并且将含水微滴与可动蜡组合物组合可以包括向多于一个相邻的激励电极的激励电极的子集施加能量，从而移动含水微滴与可动蜡组合物接触。
41.在方法的一些实施方案中，含水微滴可以包含试剂、微物体或其组合。在多种实施方案中，微物体可以是珠、生物细胞、细胞的亚细胞部分或其任何组合。
42.在又一方面中，提供了在空气基质数字微流控(dmf)装置内对至少部分地包被在可动蜡组合物中的微滴进行微滴操作的方法，该方法包括：通过电润湿移动在空气基质dmf装置的气隙内的具有可动蜡组合物的外部涂层的第一含水微滴，该气隙形成在空气基质dmf装置的第一板和第二板之间，其中可动蜡组合物包含液体蜡和用于防止表面结垢的亲脂性可动组分。
43.在进行微滴操作的方法的多种实施方案中，可动蜡组合物可以是如本文描述的任何可动蜡组合物。在一些实施方案中，第一含水微滴可以是反应微滴。
44.在多种实施方案中，其中通过电润湿移动第一含水微滴可以包括：最初将第一含水微滴输送至气隙的微滴制备区，该微滴制备区包含可动蜡组合物；以及用可动蜡组合物至少部分地包封第一含水微滴。在一些实施方案中，其中通过电润湿移动至少部分地包封的第一含水微滴包括将至少部分地包封的第一含水微滴转移远离微滴制备区，使得至少一些可动蜡组合物被留下。
45.在方法的多种实施方案中，方法还可以包括在气隙中将至少部分地包封的第一含水微滴与载体微滴合并，以形成至少部分地包封的组合含水微滴，该载体微滴包括包被有油或有机溶剂的第二含水微滴。载体微滴可以包含珠、试剂、引物、稀释缓冲液、酶、蛋白质、纳米孔、洗涤缓冲液、醇、甲酰胺、洗涤剂或其任何合适的组合。
46.在方法的多种实施方案中，方法还可以包括通过电润湿将至少部分地包封的第一含水微滴或至少部分地包封的组合含水微滴移动至气隙的热区；以及调节至少部分地包封的第一含水微滴或至少部分地包封的组合含水微滴的温度，以在气隙内输送至少部分地包封的第一含水微滴或至少部分地包封的组合含水微滴之前允许在相应的微滴内进行反应。
47.在方法的多种实施方案中，方法还可以包括检测至少部分地包封的含水微滴或至少部分地包封的组合含水微滴内的产物。
48.在方法的多种实施方案中，将至少部分地包封的第一含水微滴与载体微滴合并可以包括：通过电润湿将至少部分地包封的第一含水微滴和载体微滴中的一者或两者移动到彼此接触。
49.在方法的多种实施方案中，当至少部分地包封的第一含水微滴或组合含水微滴包含多于一个珠时，方法还可以包括混合相应的微滴。在一些实施方案中，方法还可以包括固
定珠。在一些其他实施方案中，方法还可以包括将至少部分地包封的组合含水微滴或组合含水微滴移动远离所固定的珠。在又其他实施方案中，方法还可以包括将所固定的珠重新悬浮在反应产物含水微滴中。在另外的实施方案中，方法还可以包括通过以下将珠与至少部分地包封的组合含水微滴分离：移动磁场远离组合微滴以将珠磁性地牵拉远离组合微滴。
50.在另一个方面中，提供了在空气基质数字微流控(dmf)装置内进行反应的方法，该方法包括：将含水反应微滴引入空气基质dmf装置的气隙中，该气隙形成在空气基质dmf装置的第一板和第二板之间，其中含水反应微滴用可动蜡组合物至少部分地包封，该可动蜡组合物包含液体蜡和用于防止表面结垢的亲脂性可动组分；调节至少部分地包封的含水反应微滴的温度，以允许反应在至少部分地包封的含水反应微滴内进行；以及在反应完成之后，将至少部分地包封的含水反应微滴输送远离热区。在多种实施方案中，可动蜡组合物可以是如本文描述的任何可动蜡组合物。
51.在进行反应的方法的多种实施方案中，将含水反应微滴引入气隙中可以包括将多个微滴组合以在气隙内形成含水反应微滴。在一些实施方案中，将含水反应微滴引入气隙中还可以包括将含水微滴以与可动蜡组合物的混合物引入气隙中。在其他实施方案中，将含水反应微滴引入气隙中还可以包括用可动蜡组合物包封含水反应微滴，从而产生至少部分地包封的含水反应微滴。在一些实施方案中，包封含水反应微滴还可以包括：最初将第一含水微滴输送至气隙的微滴制备区，该微滴制备区包含可动蜡组合物；以及用可动蜡组合物至少部分地包封第一含水微滴。在一些实施方案中，第一板包括多于一个相邻的激励电极，并且其中用可动蜡组合物至少部分地包封含水反应微滴可以包括向多于一个相邻的激励电极的激励电极的子集施加能量，以移动含水反应微滴与可动蜡组合物接触。
52.在进行反应的方法的多种实施方案中，方法还可以包括在完成反应之后检测至少部分地包封的含水反应微滴内的产物。
53.在方法的多种实施方案中，至少部分地包封的含水反应微滴还可以包含珠，并且方法还可以包括混合反应微滴。在方法的多种实施方案中，方法还可以包括固定珠。在方法的其他实施方案中，方法还可以包括将至少部分地包封的含水反应微滴移动远离所固定的珠。在方法的又其他实施方案中，方法还可以包括将所固定的珠重新悬浮在反应产物含水微滴中。在方法的另外的实施方案中，方法还可以包括通过以下将珠与至少部分地包封的组合微滴分离：移动磁体远离至少部分地包封的组合微滴。
54.在方法的多种实施方案中，将含水反应微滴引入气隙中还可以包括在气隙中将至少部分地包封的含水反应微滴与载体微滴合并，从而形成至少部分地包封的组合微滴，该载体微滴包括包被有油或有机溶剂的含水微滴；调节至少部分地包封的含水反应微滴的温度以允许反应还可以包括：调节至少部分地包封的组合微滴的温度以允许反应在至少部分地包封的含水反应微滴内进行；以及在反应完成之后将至少部分地包封的含水反应微滴输送远离热区还可以包括：在反应完成之后将至少部分地包封的组合微滴输送远离热区。
55.在方法的多种实施方案中，载体微滴可以包含珠、试剂、引物、稀释缓冲液、酶、蛋白质、纳米孔、洗涤缓冲液、醇、甲酰胺、洗涤剂或其任何合适的组合。在一些实施方案中，当载体微滴包含珠时，方法还可以包括混合反应微滴。在一些实施方案中，方法还可以包括固定珠。在一些实施方案中，方法还可以包括将至少部分地包封的组合微滴移动远离所固定
的珠。在一些实施方案中，方法还可以包括将所固定的珠重新悬浮在反应产物含水微滴中。在一些实施方案中，方法还可以包括通过以下将珠与至少部分地包封的组合微滴分离：移动磁体远离至少部分地包封的组合微滴。
56.在另一个方面中，用于使微滴可动的试剂盒包括可动蜡组合物和载体涂布包衣制剂。可动蜡组合物可以是如本文描述的任何可动蜡组合物。在一些实施方案中，可动蜡组合物的组分可以被提供在一个或更多个单独的容器中。在试剂盒的多种实施方案中，载体包衣制剂可以是油或亲脂性有机溶剂。
57.在试剂盒的多种实施方案中，试剂盒还可以包括珠。在一些实施方案中，珠可以是磁性的。在一些实施方案中，珠可以被配置为结合至选自由dna、rna和蛋白质组成的组的分子。
58.在试剂盒的多种实施方案中，试剂盒还可以包括试剂、引物、稀释缓冲液、酶、蛋白质、纳米孔、洗涤缓冲液、醇、甲酰胺、洗涤剂或其任何合适的组合。
59.尽管本文描述的大多数器件是包括形成气隙的两个平行板的空气基质dmf装置，但任何组合物和/或方法都可以适于作为单板空气基质dmf装置的一部分进行操作。在这种情况下，该装置包括单个板，并且可以在单个(例如，第一)板上方对空气开放；“气隙”可以对应于板上方的区域，其中当一个或更多个微滴在该单个板上时，一个或更多个微滴可以行进。接地电极可以邻近(例如，紧邻)每个激励电极定位，例如，定位在单个板中、单个板上或单个板下方。板可以包被有疏水性层(并且另外的电介质层可以定位在疏水性层和电介质层之间，或者同一层可以既是电介质的又是疏水性的)。与防止蒸发结合的用于校正表面结垢的组合物和方法可能特别适合于这样的单个板空气基质dmf装置。
60.尽管本文描述的大多数器件是包括形成气隙的两个平行板的空气基质dmf装置，但任何组合物和/或方法都可以适于作为单板空气基质dmf装置的一部分进行操作。在这种情况下，该装置包括单个板，并且可以在单个(例如，第一)板上方对空气开放；“气隙”可以对应于板上方的区域，其中当一个或更多个微滴在该单个板上时，一个或更多个微滴可以行进。接地电极可以邻近(例如，紧邻)每个激励电极定位，例如，定位在单个板中、单个板上或单个板下方。板可以包被有疏水性层(并且另外的电介质层可以定位在疏水性层和电介质层之间，或者同一层可以既是电介质的又是疏水性的)。与防止蒸发结合的用于校正表面结垢的组合物和方法可能特别适合于这样的单个板空气基质dmf装置。
61.附图简述
62.特别地，本发明的新颖特征在所附权利要求中阐述。通过参考以下详细描述和附图将获得对本发明的特征和优点的更好理解，该详细描述阐述了利用本发明的原理的说明性实施方案，在附图中：
63.图1a
‑
图1b是空气基质dmf装置的实例的顶视图，示出了多于一个单位单格(由下方的激励电极限定)，并且包括三个示例性微滴，展示出在根据本公开内容的一些实施方案的dmf装置内的可移动性(portability)。
64.图2a
‑
图2c是在空气基质dmf装置的表面上的三个示例性微滴的顶视图，展示出在根据本公开内容的一些实施方案的示例性操控之后的可移动性。
65.图3a
‑
图3c是在空气基质dmf装置的表面上的示例性微滴的顶视图，展示出在根据本公开内容的一些实施方案的示例性操控之后的可移动性。
66.图4a
‑
图4c是在空气基质dmf装置的表面上的示例性微滴的顶视图，展示出在根据本公开内容的一些实施方案的示例性操控之后的可移动性。
67.图5是根据本公开内容的一些实施方案的从示例性微滴中回收的材料的ngs测序结果的图示。
68.图6包括根据本公开内容的一些实施方案的在空气基质dmf装置的表面上包封反应微滴的过程的顶视图。
69.图7a
‑
图7c是根据本公开内容的一些实施方案的微滴操控的顶视图。
70.详细描述
71.本文描述的任何方法(包括用户界面)可以被实现为软件、硬件或固件，并且可以被描述为存储能够由处理器(例如，计算机、平板电脑、智能手机等)执行的一组指令的非暂时性计算机可读存储介质，该指令当由处理器执行时，使处理器控制执行任何步骤，包括但不限于：示出、与用户通信、分析、修改参数(包括定时、频率、强度等)、确定、报警等。
72.本文描述了可以最小化表面结垢和/或蒸发的影响的空气基质数字微流控(dmf)方法和装置。当加热被处理的反应微滴时，如本文描述的空气基质dmf装置可能特别有用。
73.通常，如本文公开的空气基质dmf装置可以具有任何合适的形状或尺寸。如本文使用的，术语“表面结垢”可以指的是固体表面(包括空气基质dmf装置的气隙(例如，上板表面和/或下板表面))上不希望的材料的积聚。表面结垢材料可以由活生物体(生物结垢)或非活物质(无机物质或有机物质)组成。表面结垢通常不同于其他表面生长现象，因为它发生在部件或系统的表面上，并且结垢过程对功能产生阻碍或干扰。
74.本文描述的空气基质dmf装置通常包括至少一个疏水性表面和邻近该表面的多于一个激活电极；疏水性表面也可以是电介质材料，或者另外的电介质材料/层可以定位在激励电极和疏水性表面之间。例如，在一些变型中，空气基质dmf包括在印刷电路板(pcb)上的一系列层，形成第一板或底板。该板的外(顶)表面是疏水性层。在该层上方的是气隙(气隙区域)，沿着气隙可以操控反应微滴。在一些变型中，第二板可以与第一板相对定位，在两者之间形成气隙区域。第二板也可以包括疏水性涂层，并且在一些变型中还可以包括与激励电极相对的一个接地电极或多个接地电极。激励电极可以被配置为用于将微滴从dmf器件内的一个区域移动至另一个区域，并且可以电联接到控制器(例如，控制电路)，用于施加能量以驱动微滴在气隙中的移动。如提及的，该板还可以包括电介质层，用于增加反应微滴和激励电极之间的电容。反应起始材料和试剂以及另外的添加剂试剂可以在贮存器中，该贮存器可以向气隙中分配，在反应期间反应混合物通常保持在气隙中。在一些情况下，后续步骤中所需的起始材料、试剂和组分可以储存在气隙层的单独区域中，使得它们彼此之间的距离防止它们过早地彼此混合。在其他情况下，气隙层可以包括能够分隔不同反应混合物的特征，使得它们可以彼此接近但被物理屏障分开。通常，气隙的底面在第一板中，并且与一系列激励电极电接触。
75.本文描述的气隙dmf装置还可以包括用于提供所需反应条件的其他元件。例如，气隙dmf装置可以包括一个或更多个热调节器(例如，加热或冷却元件，诸如热电模块)，用于加热和冷却气隙的全部或区域(热区)。在其他情况下，加热或冷却可以通过控制吸热反应或放热反应以调节温度来提供。气隙dmf装置还可以包括温度检测器(例如，电阻温度检测器)，用于在反应运行期间监测温度。此外，dmf装置还可以包括一个或更多个磁体，该磁体
可以用于以按需方式操控磁性珠。例如，磁体可以是由控制器控制以产生可以搅动或固定磁性珠的磁场的电磁体。
76.因此，本文描述的气隙dmf装置可以包括一个或更多个热区。热区是气隙dmf装置(例如，气隙)上可以被加热或冷却的区域，其中热区可以通过与该区中的气隙区域接触的一个或更多个表面(例如，第一板)将加热或冷却传递至热区内的微滴。加热和冷却可以通过热调节器诸如热电模块或其他类型的温度调节部件进行。一个或更多个热区的温度可以通过温度检测器或传感器来监测，其中温度信息可以被传送到计算机或其他电信器件。温度通常在4℃和100℃之间调节，如当这些装置被配置为执行一个或更多个反应(诸如但不限于：核酸扩增，如lamp、pcr、分子测定、cdna合成、有机合成等)时。
77.气隙dmf装置也可以包括一个或更多个热空隙。热空隙可以邻近不同的热区设置。热空隙通常是其中热传导受到限制的区域，例如通过移除板(例如，第一板)的一部分(形成“空隙”)。这些空隙可以有策略地放置，以将一个热区与另一个热区隔离，这允许在每个热区内保持正确的温度。
78.图6示出了示例性空气基质dmf装置600的一部分的顶视图。如示出的，dmf器件可以包括由激励电极限定的一系列路径。电极阵列604的单独的激励电极在图6中被示出为一系列多边形，每个多边形限定一个单位单格。这些激励电极可以具有任何合适的形状和尺寸，并且不限于正方形。例如，在第一层中由激励电极形成的单位单格可以是圆形、六边形、三角形、矩形、八边形、平行四边形等。在图6的实例中，代表单位单格的正方形可以指示激励电极在dmf器件中的物理位置，或者可以指示激励电极具有效果的区域(例如，有效区域，使得当微滴位于所指示的区域上时，对应的激励电极可以影响微滴的移动或其他物理性质)。激励电极可以以任何图案放置。在一些实例中，激励电极可以横跨dmf装置的气隙的整个对应的底表面或顶表面。激励电极可以与起始样品室(未示出)以及试剂室(未示出)电接触，用于将不同的微滴移动至气隙内的不同区域，以便与试剂微滴混合或被加热。
79.通常，一种或更多种另外的试剂可以随后手动地或通过自动手段引入气隙中。在一些情况下，气隙的进入孔洞可以是实际的进入端口，其可以通过管联接到试剂或反应组分的外部贮存器，用于在之后的时间引入另外的反应组分或试剂。如提及的，进入孔洞可以紧邻dmf激励电极定位。进入孔洞也可以设置在dmf装置的侧面或底部上。通常，装置可以包括控制器，用于控制激励电极的操作，包括将微滴移入和/或移出反应室。控制器可以与电极电连通，并且它可以以受控的方式施加电力，以协调微滴在气隙内的移动和移入/移出反应室。控制器还可以电连接至一个或更多个温度调节器(热调节器)，以调节热区中的温度。一个或更多个传感器(例如，视频传感器、电传感器、温度传感器等)也可以被包括在内(未示出)，并且可以向控制器提供输入，控制器可以使用来自这些一个或更多个传感器的输入来控制运动和温度。
80.尽管在空气基质dmf装置中进行微滴操控和反应容易使用，但当使用dmf装置时，蒸发是长期存在的问题，并且可能影响微滴操控以及样品制备/测定方案。如果在方案的过程期间未防止蒸发，可能导致反应混合物浓缩。该浓缩可能是有害的，因为试剂可以从溶液中挥发或脱离，改变反应混合物的浓度，并且导致中间反应微滴与随后添加的给定浓度的其他反应材料之间的不匹配的浓度。在一些变型中，诸如在酶促反应的情况下，酶对反应环境的变化高度敏感，并且试剂的损失可能改变某些酶的有效性。当反应混合物必须加热至
高于环境温度持续长时间段时，蒸发尤其是有问题的。
81.此外，表面结垢是困扰微流控(包括dmf器件)的另一个重要问题。当反应混合物的某些成分不可逆地吸附到反应混合物所接触的表面上时，发生表面结垢。表面结垢在含有蛋白质和其他生物分子的样品中也出现得更普遍。温度升高也可能有助于表面结垢。结垢可以导致微滴的污染，并且可以导致无法将微滴从接触或产生结垢的位置移动。
82.dmf器件最近应用于日益复杂的过程，诸如用于ngs测序分析的dna文库制备，以及用于合成生物学和下游细胞培养测定的多步dna组装工作流程(其需要长期驱动含有高浓度的蛋白质的溶液，以及在升高的循环温度的孵育)，这需要更好的生物结垢解决方案，该解决方案可以与简单地起作用以防止蒸发的材料协同工作。
83.申请人已经发现了组合物和方法，该组合物和方法通过将微滴包封在可动蜡组合物中，使表面结垢的影响最小化，同时还对微滴提供保护以免于蒸发，该可动蜡组合物包含用于包封含水微滴的蜡组分以及添加至包封微滴的组合物中使表面结垢的影响最小化的亲脂性可动组分。提供了另外的益处来将包封的微滴与存在于容纳微滴的装置内的其他潜在干扰物质隔离。虽然这种组合物可以有益地用于空气基质dmf装置中，但是当这些组合物用于典型的实验室反应容器中用于杂交、pcr等时，也可以提供蒸发、表面结垢和微滴外部干扰物质的最小化。
84.可动蜡组合物。本文描述了用于防止表面结垢和蒸发的组合物，该组合物包括可动蜡组合物，其中可动蜡组合物包含用于包封含水微滴的蜡组分以及用于防止表面结垢从而使含水微滴可动的亲脂性可动组分。通过这种将微滴封闭在包含亲脂性可动组分的液体蜡的壳中的方法，反应体积和温度保持恒定，而不使用油基质、加湿的室、芯片外加热或微滴补充方法。此外，亲脂性可动组分确保包封的含水微滴在空气基质dmf装置内保持可动。注入有低浓度的亲脂性分子的液体蜡的薄层大体上防止或补救含有有问题材料的微滴的表面结垢倾向。这种可动蜡组合物还大体上防止或补救经受长反应时间段的微滴的表面结垢，特别是在全部或部分反应时间段内使用升高的温度的反应。
85.不受理论束缚，观察到的本文描述的组合物对于不表面结垢的效果可能是亲脂性聚合物层的结果(对于亲脂性可动组分如brij 93，但不限于brij93，亲脂性聚合物层可以聚集在水
‑
液体蜡界面的低能量表面，其中亲脂性聚合物的亲水性头基朝向水，并且疏水性尾朝向液体蜡)。这些由数字微流控操控的微滴层可以防止蛋白质和其他成分的吸附。
86.蜡组分。在本文描述的可动蜡组合物中，蜡组分可以是液体蜡。在一些实施方案中，液体蜡可以在从约0℃至约120℃的温度保持为液体。在其他实施方案中，液体蜡在从约4℃至约100℃的温度保持为液体。在又其他实施方案中，液体蜡在从约7℃至约100℃的温度保持为液体。在一些其他实施方案中，液体蜡在从约10℃至约100℃的温度保持为液体。在另外的实施方案中，液体蜡在从约20℃至约100℃的温度保持为液体。
87.液体蜡可以是油，包括一种或更多种非极性化合物，该非极性化合物包括烃油、硅油、氟化油、基于植物的油或其任何组合。烃油包括矿物油、石蜡油(例如，十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷、十六烷、十七烷、十八烷、十九烷、二十烷)，例如通常具有多于十个碳主链原子的烃分子。烃油可以是一种或更多种饱和烃，或者可以包括一个或更多个不饱和位点。硅油，包括但不限于聚二甲基硅氧烷，可以用于液体蜡组分中。在其他实施方案中，氟化油，包括可从3m获得的fluorinert
tm
，可以用于液体蜡组分中。基于植物的油包括植物
油、种子油和/或坚果油。在一些实施方案中，基于植物的油诸如霍霍巴油(sigma
‑
aldrich目录号w530293)可以用于可动蜡组合物的液体蜡组分中。
88.特别地，本文描述的液体蜡可以是例如十六烷。液体蜡可以是纯的(例如，95％纯或更高、96％纯或更高、97％纯或更高、98％纯或更高、99％纯或更高，等等)。
89.对于可动蜡组合物的液体蜡组分，液体蜡在20℃可以具有从约0.75g/ml至约0.90g/ml的密度。在一些实施方案中，液体蜡组分可以具有约0.75g/ml、0.76g/ml、0.77g/ml、0.78g/ml、0.79g/ml、0.80g/ml、0.81g/ml、0.82g/ml、0.83g/ml、0.84g/ml、0.85g/ml、0.86g/ml、0.87g/ml、0.88g/ml、0.89g/ml或约0.90g/ml的密度。
90.对于可动蜡组合物的液体蜡组分，液体蜡可以与固体表面具有从约20度至约65度的接触角。接触角可以使用静态固着测角术来测量。在一些实施方案中，液体蜡组分可以具有约20度、25度、30度、35度、40度、45度、45度、50度、55度、60度、65度的接触角，或者在这里列举的这些值之间的任何值。例如，液体石蜡具有约30度的接触角。
91.在一些实施方案中，可动蜡组合物的蜡组分可以是液体石蜡、矿物油或霍霍巴油。例如，液体蜡组分可以是十六烷。
92.亲脂性可动组分。在本文描述的可动蜡组合物中，亲脂性可动组分可以包括具有小于7的亲水
‑
亲脂平衡(hlb)的分子。在一些实施方案中，亲脂性可动组分可以是非离子型表面活性剂。在多种实施方案中，亲脂性可动组分可以是例如brij 93、span 20、span 40、span 60、span 65、span 80、span 85、1
‑
硬脂酰
‑
外消旋
‑
甘油、磷脂酰胆碱(卵磷脂)、脱水山梨糖醇倍半油酸酯、tetronic 90r4、tetronic 701、l
‑
31、l
‑
61、l
‑
81、l
‑
121、31r1、brij 52和a或其任何组合。在一些实施方案中，亲脂性可动组分可以是brij 93。
93.可以存在于可动蜡组合物中的亲脂性可动组分的浓度可以是可动蜡组合物的次要组分。在一些实施方案中，亲脂性可动组分以以下浓度(v/v％)存在：从约0.001％至约10％；0.001％至约5％；约0.001％至约1.0％；0.001％至约0.5％；约0.001％至约0.10％；约0.01％至约10％；0.01％至约5％；约0.01％至约1.0％；0.01％至约0.5％；约0.01％至约0.10％，或其间的任何值。在一些实施方案中，亲脂性可动组分可以以从约0.01％至约0.10％存在。在一些实施方案中，亲脂性可动组分可以小于可动蜡组合物的约1.0％v/v、0.9％v/v、0.8％v/v、0.7％v/v、0.6％v/v、0.5％v/v、0.4％v/v、0.3％v/v、0.2％v/v、0.10％v/v、0.09％v/v、0.08％v/v、0.07％v/v、0.06％v/v、0.05％v/v、0.04％v/v、0.03％v/v、0.02％v/v或约0.01％v/v。
94.被可动蜡组合物包封的微滴。被可动蜡组合物至少部分地包封的含水微滴可以包含感兴趣的生物样品、试剂或微物体。当含水微滴包含生物样品时，含水微滴可以被称为反应微滴。反应微滴可以是在准备测定之前含有生物样品的含水微滴、含有正在进行测定的生物样品的微滴或含有测定的产物的微滴，其可以进一步被检测。反应微滴还可以包含用于测定准备、测定反应或检测的试剂，并且还可以包含来自载体微滴的任何组分，载体微滴包括但不限于珠。当被可动蜡组合物至少部分地包封的微滴包含微物体时，微物体可以包括以下中的一种或更多种：珠、生物细胞、细胞的亚细胞部分或其任何组合。珠可以是磁性珠。细胞的亚细胞部分可以是或可以包括细胞核或核糖体。
95.在一些实施方案中，可动蜡组合物包含液体蜡和在可动蜡组合物中以0.05％v/v
浓度的亲脂性可动组分，该液体蜡包括液体石蜡油，该亲脂性可动组分包括brij 93。
96.用途。本文描述的组合物和方法可以用于防止空气基质dmf器件中的结垢和蒸发，并且可以在dmf上能够方便且可靠地执行要求温度高于环境温度的任何化学方案。这些方案包括但不限于，在温度范围(37℃
‑
100℃)和培养时间(≥2hr)的dna/rna消化/片段化、cdna合成、pcr、rt
‑
pcr、等温反应(lamp、滚环扩增
‑
rca、链置换扩增
‑
sda、解旋酶依赖性扩增
‑
hda、切口酶(nicking enzyme)扩增反应
‑
near、基于核酸序列的扩增
‑
nasba、单引物等温扩增
‑
spia、交叉引发扩增
‑
cpa、聚合酶螺旋反应
‑
psr、滚环复制
‑
rcr)，以及基于连接的检测和扩增技术(连接酶链式反应
‑
lcr、与逆转录聚合酶链式反应
‑
rt pcr结合的连接、连接介导的聚合酶链式反应
‑
lmpcr、聚合酶链式反应/连接检测反应
‑
pcr/ldr、连接依赖性聚合酶链式反应
‑
ld
‑
pcr、寡核苷酸连接测定
‑
ola、扩增期间连接
‑
lda，挂锁探针、开环探针和其他可循环探针的连接，以及迭代的缺口连接
‑
igl，连接酶链式反应
‑
lcr)。可以使用本文描述的系统和方法执行的另外的方案包括杂交程序，诸如用于下一代测序(ngs)的文库制备中的杂交捕获和靶富集应用。对于这些类型的应用，杂交可以持续长达约3天(72h)。其他方案包括末端修复，这可以通过例如以下酶的一些或组合来完成：dna聚合酶i大片段(klenow片段)(在25℃活性持续15分钟)、t4 dna聚合酶(在15℃活性持续12分钟)和t4多核苷酸激酶(在37℃活性持续30分钟)。另一个方案包括a
‑
加尾(a
‑
tailing)，这可以用以下酶的一些或组合来完成：taq聚合酶(在72℃活性持续20分钟)和klenow片段(3
’→5’
exo
‑
)(在37℃活性持续30分钟)。另一个方案是通过dna或rna连接酶进行的连接。
97.在其他应用中，本文描述的可动蜡可以可选择地在台式实验中用作多种样品制备、扩增和杂交程序，包括但不限于连接、数字pcr、rt
‑
pcr和本文提及的任何方案中的隔离层。
98.包封的微滴的操控和处理
99.尽管在升高的温度执行化学方案时，将微滴包封在蜡中可以防止或减少蒸发，但是在方案完成之后，已经发现，当微滴被移除并与蜡分离时，例如通过使用dmf装置的电极驱动微滴，即使当含水微滴移动远离蜡时，少量的液体蜡仍作为涂层保留在微滴中，并且该蜡涂层可以防止或干扰反应微滴的后续处理和分析。因此，在一些实施方案中，可以使用本文描述的系统和方法穿过蜡涂层来接近蜡包封的反应微滴，这使得下游生化过程能够容易且可靠地执行。
100.为了在反应微滴已经在加热区中与本体液体蜡分离之后穿过蜡涂层接近反应微滴，包含另外的疏水性(例如，油)材料的微滴可以帮助与蜡包封的反应微滴合并。例如，载体微滴(即，封闭在油的薄层中的含水微滴)可以与包封的反应微滴合并。载体微滴通过使来自载体微滴的油溶解包封反应微滴的薄蜡层和/或与包封反应微滴的薄蜡层合并而接近反应微滴。载体微滴可以使用除油以外的其他材料来突破包封反应微滴的蜡层。例如，可以使用与含水反应微滴不混溶并且能够溶解在蜡中的材料，诸如四氯化碳、氯仿、环己烷、1,2
‑
二氯乙烷、二氯甲烷、乙醚、二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、庚烷、己烷、甲基叔丁基醚、戊烷、甲苯、2,2,4
‑
三甲基戊烷和其他有机溶剂。可以用于将载体微滴合并到蜡包封的微滴中的其他材料包括离子洗涤剂，诸如溴化十六烷基三甲铵、脱氧胆酸钠、正月桂酰基肌氨酸钠盐、正十二烷基硫酸钠、牛磺鹅脱氧胆酸钠；以及非离子洗涤剂，诸如二甲基癸基氧化膦(apo
‑
10)、二甲基十二烷基氧化膦(apo
‑
12)、正十二烷基
‑
β
‑
d
‑
麦芽糖苷正十二烷
酰基蔗糖、elugent
tm
洗涤剂、c
‑
100、正庚基β
‑
d
‑
吡喃葡萄糖苷、正己基
‑
b
‑
d
‑
吡喃葡萄糖苷、正壬基
‑
b
‑
d
‑
吡喃葡萄糖苷、np
‑
40替代物、正辛酰基蔗糖、正辛基
‑
b
‑
d
‑
吡喃葡萄糖苷、正辛基
‑
b
‑
d
‑
硫吡喃葡萄糖苷、f
‑
127、皂角苷、x
‑
100、x
‑
114、20、80、tetronic 90r4。在一些实施方案中，用可动蜡组合物包封的载体微滴也可以用于突破包封反应微滴的蜡。以这种方式，其他材料可以通过与载体微滴合并来添加至反应微滴以形成组合微滴，该组合微滴本身至少部分地包封有可动蜡。
101.例如，图6图示了与图1a
‑
图4c所示的装置类似或相同的装置600。该装置包括与放置在底部dmf基底下方或底部dmf基底内的一个或更多个加热元件互连的dmf器件，因此在底部dmf基底上产生离散的加热区(未示出)，在加热区中可以用本文描述的包封的微滴进行反应。可选择地，加热元件可以被放置在顶部基底上方或顶部基底内，以在顶部基底上形成加热区。然而，在底部基底上形成加热区允许视觉访问。在一些实施方案中，顶板或底板可以是可移除盒的一部分，该可移除盒与另一个板和电子器件组合以形成工作dmf器件。在一些实施方案中，在底部基底上，一个或更多个亲水性区域可以被印刷或者以其他方式形成或设置在电极阵列604中的激励电极周围，该亲水性区域可以用于容纳或控制可以引入到基底上的液体蜡606的量。在一些实施方案中，液体蜡可以保持在该区域，该区域可以另外是微滴制备区602。在其他实施方案中，液体蜡可以以与反应微滴的混合物被引入，例如，例如通过移液管分配的混合流体的等分试样被引入。
102.如本文描述的，在一些实施方案中，反应微滴608可以沿着激励电极的路径被直接输送或引入到包含可动蜡606的微滴制备区602，该路径可以是由激励电极到微滴制备区602的单线形成的相对窄的路径。然后，如图6的框i所示，反应微滴908被蜡606包封，从而防止或减少在反应方案期间反应微滴608的蒸发。取决于反应微滴608中存在的材料，在没有通过可动蜡606包封的情况下，移动性可能非常有限或不存在。围绕微滴制备区602的亲水性区域(如果存在的话)用于将液体可动蜡606钉栓或定位在微滴制备区602内的适当位置，并且允许包封的反应微滴610如下文描述的脱离。
103.如图6(框ii
‑
iv)所示，通过激励微滴制备区602和路径中的激励电极，驱动含水反应微滴608远离微滴制备区602和过量的液体蜡606，可以完成将至少部分地包封的反应微滴608从液体蜡606中脱离或分离的过程。随着含水反应微滴608被激励远离微滴制备区602，围绕液体蜡606的亲水性区域602(如果存在的话)可以有助于在反应微滴608移动远离微滴制备区602时将液体蜡606保持在适当位置，这导致包裹微滴608的液体蜡606开始缩窄并且最终与微滴608脱离，从而在分离的反应微滴608周围留下痕量或少量的液体蜡606，产生至少部分地包封的反应微滴610。
104.因为反应微滴在从微滴制备区602分离之后可以被液体蜡606的薄层包围，所以由于至少部分地包封的反应微滴610的液体蜡涂层可以用作屏障，可能难以将包封的反应微滴610与另一个含水微滴合并。因此，为了促进包封的反应微滴610与另一个微滴的合并，可以使用载体微滴612与包封的反应微滴610合并，如图6的框v(框v)所示。载体微滴612可以是如上文描述的包被有油或另一种有机溶剂的薄层的含水微滴。载体微滴612的含水部分可以包括另外的试剂、包被有(或未包被有)dna/rna探针或抗体或抗原以进行分离的珠、未
包被的珠、磁性珠、包被有结合部分的珠、固相可逆固定(spri)珠、用于稀释反应微滴的水、酶或其他蛋白质、纳米孔、洗涤缓冲液、乙醇或其他醇、甲酰胺、洗涤剂和/或用于促进包封的反应微滴610的进一步处理的其他部分。
105.在图7a(框i
‑
iv)中示出了将包封的反应微滴610与包含磁性珠的载体微滴612合并的一种实施方案。载体微滴612和包封的反应微滴610通过激励电极被移动至相同的位置，围绕载体微滴612的油的薄层可以与围绕包封的反应微滴610的液体蜡的薄层合并，从而促进两个微滴610、612的含水部分的合并，以形成至少部分地包封的组合微滴614。
106.在载体微滴612已经与包封的反应微滴610合并之后，可以进行对至少部分地包封的组合微滴614的进一步处理，诸如从组合微滴614中提取分析物和/或进行其他步骤，诸如杂交捕获探针、使用酶消化反应产物、用一组引物扩增反应产物等。例如，载体微滴612可以携带用于提取分析物(例如，dna或rna或蛋白质)的珠。当微滴合并时，可以是磁性的珠可以用于通过施加磁场来混合组合微滴614。靶分析物结合至珠，珠可以通过磁场固定在基底上以形成珠粒616，如图7b(框i)所示。接下来，可以将组合微滴614移动远离固定的珠粒616，使珠粒616在基底上留下结合的分析物，如图7b(框ii
‑
iii)所示。通过激励电极，可以将组合微滴614移动远离固定的珠粒616。可选择地，当珠粒616移动远离组合微滴614时，组合微滴614可以保持在适当位置。通过例如将与珠粒616接合的磁场移动远离组合微滴614(例如，通过移动产生磁场的磁体)，珠粒616可以移动远离组合微滴614并且与组合微滴614分离。在一些实施方案中，组合微滴614可以通过与微滴接触和/或围绕微滴的电极的激励而被主动地固定。可选择地或另外地，微滴614可以通过微滴和微滴所接触的基底之间的自然粘合力以及物理结构(诸如部分地围绕组合微滴614同时具有用于使珠粒616穿过的开口的保持壁)而被动地固定。如图7c(框i和ii)所示，含水微滴618可以在珠粒616上移动，以重新悬浮珠和结合的分析物。
107.实验
108.装置：dmf器件(例如，图1a
‑
图4c)是用15mm厚的pcb基底制造的，该pcb基底带有铜(43μm厚)，镀有镍(185μm)和金(3.6μm)用于电极和导电迹线。激励电极(每个10mm
×
10mm)通过常规的光刻术和蚀刻形成，并且包被有作为电介质的阻焊膜(～15μm)。用聚酰亚胺胶带(dupont；hayward，ca)遮盖电接触垫，并且将基底旋涂50nm的teflon
‑
af层(在fluorinert fc
‑
40中1％wt/wt，1500rpm持续30秒)，并且然后在100℃烘烤持续3h。dmf器件的顶板由均匀包被有无图案的铟锡氧化物(ito)的玻璃基底(delta technologies ltd；stillwater，mn)和5.5mm直径的pdms塞(旋涂有50nm的teflon
‑
af)组成，如上文描述的。
109.实验1.可移动性测定。dmf测试的可移动性被探测以测试商业可得的试剂sureselect快速杂交缓冲液(agilent)的移动性，该试剂已知使dmf表面结垢。针对dmf的可移动性对三种条件进行测定：1)快速杂交缓冲液微滴(30μl)；2)用蜡微滴(60μl)封闭的快速杂交缓冲液微滴(30μl)；和3)用注入有93(0.05％v/v，sigma aldrich目录号388866)的蜡微滴(60μl)封闭的快速杂交缓冲液微滴。驱动电势通常是～300v，并且激励是自动的，以保持所有三个样品微滴的驱动条件相同。
110.在三个单独的器件上评价每个实验条件的至少三次重复，以说明器件间的差异。可移动性被定义为在一系列的10个电极上移动微滴的能力。如图1a所示，所有三个微滴都具有类似的起点，并且具有等效的行进至期望终点(“终点线”)的路径。微滴102、104、106的
含水部分的体积在所有三个样品中是相等的，并且对于两个包封的微滴104、106，包封蜡的体积或蜡/注入的非离子型表面活性剂的体积保持相等。如图1b所示，在通过dmf激励之后，仅有杂交缓冲液的微滴102和用蜡(不含亲脂性可动组分)包封的杂交缓冲液微滴104是不可移动的。相比之下，用含有0.05％亲脂性可动组分(例如，brij93)的蜡封闭的微滴106在10个电极上是可移动的，并且是唯一能够被驱动到期望终点的微滴。因此，如本文描述的亲脂性可动组分(并且特别是具有小于7的亲水
‑
亲脂平衡(hlb)的亲脂性可动组分)允许移动，即使表面结垢。在示出的所有情况下，这些微滴(或亲脂性可动组分)都不包含亲水性聚合物添加剂(诸如非离子型表面活性剂，例如tween)。在一些变型中，蜡和亲水性可动组分可以包含亲水性聚合物添加剂，该亲水性聚合物添加剂包括非离子型表面活性剂。
111.实验2.孵育后可移动性测定。已知在环境温度和升高的温度进行孵育能够诱导结垢，并且测序前样品制备(包括衔接子连接和pcr扩增)所需的试剂也可以诱导表面结垢。
112.使用已知的结垢溶液来探测在不同温度状况孵育之后通过dmf的可移动性：sureselect快速杂交缓冲液(agilent)和herculase fusion dna聚合酶pcr主混合物(agilent)。
113.测定三种含不同试剂的微滴通过dmf的可移动性，以及2)针对herculase fusion pcr主混合物(95℃持续2min；10次循环：95℃持续30秒，58℃持续30秒；72℃持续60秒；72℃持续5min)和3)sureselect快速杂交混合物(60次循环：65℃持续1min，37℃持续3秒)的热循环后孵育。
114.a.使用等温孵育的连接。将三个微滴(例如“反应微滴”)引入dmf 200表面，每个微滴含有相同量的样品和根据制造商的说明的浓度的kapa hyper连接主混合物(13μl，kappa biosystsems)。第一微滴202未被包封。第二微滴204被包封在液体蜡中，但不包含brij93。第三微滴206被包封在含有亲脂性可动组分(例如，brij93，0.05％v/v)的液体蜡中。对于微滴204和微滴206，包封液体的量是相同的(与实验1中相同)。图2a示出了在引入到表面之后但在施加任何驱动电压之前的微滴202、微滴204和微滴206。施加如实验1中的驱动电压，以沿着相等长度的路径将微滴202、微滴204、微滴206驱动至孵育点。微滴202立即使dmf表面结垢，并且变得不可移动。相反，含有连接试剂/蜡的微滴204和含有连接试剂/蜡(包含brij93)的微滴206是可移动的，以到达孵育区(在室温进行的过程)。图2b示出了从起点驱动之后微滴的位置。孵育在rt进行持续30min。微滴202、微滴204、微滴206都经受如上文的驱动电压，导致仅一个微滴的移动。如图2c所示，微滴202在其第一起始位置保持不可移动；仅包含连接试剂/包封蜡的微滴204也变得不可移动，并且不能从孵育区移开。包含连接试剂/具有亲脂性可动组分的包封蜡的微滴206能够被驱动至预先选择的终点线。
115.b.pcr热循环孵育。将herculase fusion dna聚合酶pcr主混合物(agilent)(50微升)包封在100微升的掺有如上文的亲脂性可动组分(例如，brij93)(0.05％v/v)的液体蜡中，在引入到dmf 200表面上的引入位置时形成微滴306(图3a)。如图3b所示，在与实验1中类似的电压条件下，微滴被成功地驱动至热循环区310。热循环(使用95℃持续2min的循环；10次循环：95℃持续30秒，58℃持续30秒；72℃持续60秒；72℃持续5min)进行持续数小时的延长的时间段。然后微滴306被成功地驱动至dmf 200表面上的预先选择的终点，如图3c所示。包含相等体积(50微升)的相同pcr混合物但包封在100微升的液体蜡(不含亲脂性可动组分)中的微滴，不能移动至热循环区(数据未示出)。
116.c.杂交孵育。在dmf装置200中进行使用sureselect快速杂交缓冲液(agilent)的杂交反应。如图4a所示，将包含杂交混合物(30μl)的微滴406引入到dmf 200表面，所述杂交混合物被包含亲脂性可动组分(例如，brij93)的蜡(60μl)围绕。如图4b所示，微滴406被成功地驱动至热循环区410。进行热循环(60次循环：65℃持续1min，37℃持续3秒)。在反应完成之后，微滴406然后被成功地驱动至预先选择的终点线。含有相同体积的杂交试剂和不含亲脂性可动组分的包封液体蜡的对应的微滴在热循环孵育后不可移动(数据未示出)。
117.这种抗结垢策略不限于这些实例中示出的具体应用，而是可以用于需要将试剂在静态(即，不移动)微滴中孵育持续一段时间，因此允许反应完成同时仍然保持移动性的其他反应。
118.实验4.具有亲脂性分子的液体蜡对测定的影响。为了证实使用注入有亲脂性可动组分(例如，0.05％v/v的brij93)的液体蜡不对测定的活性产生负面影响和/或降低观察到的产物的类型或收率，在杂交溶液有或没有蜡中的亲脂性可动组分的情况下，我们实施了基于杂交的富集反应(用于分析样品中的特定遗传变型)。如图5所示，液体蜡中亲脂性可动组分(例如，brij93)的存在不对杂交效率产生不利影响，如对标准测序指标(重复读段％；在靶％(％on target)；在靶+/
‑
100bp％(％on target+/
‑
100bp)；以及在1x、5x、10x和20x的覆盖率)的检查所指示的，文库的测序数据基本上与在没有亲脂性可动组分的情况下观察到的相同。
119.当一个特征或元件在本文被称为“在另一特征或元件上”时，它可以直接在该另一特征或元件上，或者也可能存在中间的特征或元件。相反，当一个特征或元件被称为“直接在另一特征或元件上”时，没有中间的特征或元件存在。还将理解，当一个特征或元件被称为“连接”、“附接”或“联接”到在另一特征或元件时，它可以直接连接、附接或联接到其他特征或元件，或者可能存在中间的特征或元件。相反，当一个特征或元件被称为“直接连接”、“直接附接”或“直接联接”到另一特征或元件时，没有中间的特征或元件存在。虽然相对于一种实施方案进行了描述或示出，但是如此描述或示出的特征和元件可以应用于其他实施方案。本领域技术人员还将理解，参考“邻近”另一特征设置的结构或特征可以具有与相邻特征重叠或在相邻特征下方的部分。
120.本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明。例如，除非上下文另外明确指示，如本文使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”旨在同样包括复数形式。还将理解，术语“包括(comprises)”和/或“包括(comprising)”当在本说明书中使用时，指定所陈述的特征、步骤、操作、元件和/或组分的存在，但不排除存在或添加一个或更多个其他特征、步骤、操作、元件、组分和/或其组。如本文使用的，术语“和/或”包括一种或更多种相关的所列项目中的任何组合和全部组合，并且可以被缩写为“/”。
121.空间相关的术语，诸如“在...下(under)”、“在...下方(below)”、“低于(lower)”、“在...上(over)”、“上部(upper)”等可以在本文中使用，以便于描述如附图所图示的一个元件或特征与另外的元件或特征的关系。将理解，空间相关的术语旨在包括除了附图中描绘的定向之外器件在使用或操作中的不同定向。例如，如果附图中的器件倒置，被描述为“在其他元件或特征下(under)”、“在其他元件或特征下(beneath)”的元件然后将被定向成“在其他元件或特征上(over)”。因此，示例性术语“在...下(under)”可以包括在...上和在...下的两种定向。器件可以被以其他方式定向(旋转90度或以其他定向)，并且本文使用
的空间相关的描述词被相应地解释。类似地，除非另外特别指示，否则术语“向上(upwardly)”、“向下(downwardly)”、“竖直(vertical)”、“水平(horizontal)”等在本文中用于解释的目的。
122.虽然术语“第一”和“第二”在本文中可以用于描述多个特征/元件(包括步骤)，但是这些特征/元件不应该受这些术语的限制，除非上下文另外指示。这些术语可以用于将一个特征/元件与另一个特征/元件区分开。因此，在不脱离本发明的教导的情况下，下文讨论的第一特征/元件可以被称为第二特征/元件，并且类似地，下文讨论的第二特征/元件可以被称为第一特征/元件。
123.通常，术语“微物体”指的是可以掺入本文描述的微滴中的任何微观物体。微物体的非限制性实例包括：无生命的微物体，诸如微粒；微珠(例如，聚苯乙烯珠、luminex
tm
珠等)；磁性珠、微杆；微丝；量子点等；生物微物体，诸如细胞(例如，胚胎、卵母细胞、卵细胞、精细胞、从组织分离的细胞、真核细胞、原生细胞、动物细胞、哺乳动物细胞、人类细胞、免疫细胞、杂交瘤、培养的细胞、来自细胞系的细胞、癌细胞、感染的细胞、转染和/或转化的细胞、报告细胞、原核细胞等)；生物细胞器；囊泡或复合物；合成囊泡；脂质体(例如，合成的或源自膜制备的)；或者无生命的微物体和生物微物体的组合(例如，附接至细胞的微珠、脂质体包被的微珠、脂质体包被的磁性珠等)。珠还可以具有共价或非共价附接的其他部分/分子，诸如荧光标记、蛋白质、小分子信号传导部分、抗原或能够用于测定的化学/生物物质。
124.在本说明书和所附的权利要求中，除非上下文另外要求，否则词语“包括(comprise)”及诸如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”的变型意味着可以在方法和物品中共同使用各种组分(例如，包括器件和方法的组合物和装置)。例如，术语“包括(comprising)”将被理解为暗示包含任何陈述的元件或步骤，但不排除任何其他元件或步骤。
125.通常，本文描述的任何装置和方法应被理解为包括性的，但是部件和/或步骤的全部或子集可以可选择地是排他的，并且可以表示为“由”或可选择地“基本上由”多种部件、步骤、子部件或子步骤“组成”。
126.如本文在说明书和权利要求书中使用的，包括在实例中使用的，并且除非另外明确说明，否则所有数字可以被领会为以词语“约(about)”或“约(approximately)”为前缀，即使该术语没有明确出现。可以在描述幅度和/或位置时使用措辞“约(about)”或“约(approximately)”，以指示所描述的值和/或位置在值和/或位置的合理预期范围内。例如，数值可以具有为所陈述的值(或值的范围)的+/
‑
0.1％、所陈述的值(或值的范围)的+/
‑
1％、所陈述的值(或值的范围)的+/
‑
2％、所陈述的值(或值的范围)的+/
‑
5％、所陈述的值(或值的范围)的+/
‑
10％等的值。本文给定的任何数值也应被理解为包括约或近似该值，除非上下文另外指示。例如，如果公开了值“10”，那么“约10”也被公开。本文列举的任何数值范围旨在包括包含在其中的所有子范围。还应理解，如技术人员适当地理解的，当公开了值时，“小于或等于”该值、“大于或等于该值”和值之间的可能的范围也被公开。例如，如果公开了值“x”，那么“小于或等于x”以及“大于或等于x”(例如，其中x为数值)也被公开。还应理解，在整个申请中，以多种不同的格式提供数据，并且该数据表示数据点的任何组合的端点和起始点以及范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点“15”，则应理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于、和等于10和15以及在10和15之间被认为被公开。还应理解，
还公开了两个特定单位之间的每个单位。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。
127.虽然上文描述了多种说明性实施方案，但是在不脱离如权利要求所描述的本发明的范围的情况下，可以对多种实施方案进行许多改变中的任一个。例如，在可选择的实施方案中，通常可以改变进行各种所描述的方法步骤的顺序，并且在其他可选择的实施方案中，可以一起跳过一个或更多个方法步骤。多种器件和系统实施方案的任选的特征可以被包括在一些实施方案中而不被包括在其他实施方案中。因此，先前的描述主要被提供用于示例性目的，并且不应被解释为限制如在权利要求中阐述的本发明的范围。
128.本文所包括的实例和说明通过说明而非限制的方式示出其中可以实践主题的具体实施方案。如提及的，可以利用和从其导出其他实施方案，使得可以做出结构和逻辑替换和改变而不脱离本公开内容的范围。仅为了方便，本发明主题的这样的实施方案在本文中可以单独地或共同地由术语“发明”来指代，并且如果实际上多于一个被公开的话，不旨在将本技术的范围主动地限制为任何单个发明或发明概念。因此，虽然本文已经说明和描述了特定实施方案，但是被认为实现相同目的的任何布置可以替代所示的特定实施方案。本公开内容旨在覆盖多种实施方案的任何和全部修改或变型。在阅读以上描述后，以上实施方案的组合以及本文未具体描述的其他实施方案将对本领域技术人员是明显的。