黄曲霉毒素多孔芳香族骨架PAF-6分子印迹材料及其应用

本发明属食品检测材料技术领域，涉及黄曲霉毒素分子印迹材料，尤其涉及黄曲霉毒素多孔芳香族骨架paf-6分子印迹材料及其应用。

背景技术：

粮食在生长，收割，晾晒，储存的过程中，在合适的温度，湿度和底物水分活度的影响下，极其容易被真菌污染，这些真菌会产生结构不同的次级代谢产物---真菌毒素。真菌毒素的高稳定性，富集性，特异性和相加协同性的特点，使得真菌毒素极难被身体代谢，真菌毒素对人类和牲畜的健康具有严重威胁。

真菌毒素的种类很多，其中较为常见的真菌毒素有：玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen)，黄曲霉毒素(aflatoxins,afs)，赭曲霉毒素a(ochratoxina，ota)等。不同的毒素具有不同的毒性，黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉产生的最常见和具有剧毒的毒素。其生产受生态和环境因素(包括：高温，高湿度和底物水分活度)的影响。当黄曲霉毒素通过食物链被摄入或吸入生物体内时，它将增加生物体的致癌、致畸和致突变活性。afs有20多种类型，其中最突出的有4种类型(aflatoxinb1，b2，g1，g2)。几种真菌毒素的结构式如下所示：

因此，各国对黄曲霉毒素的含量检测都非常重视。如何对这些真菌毒素进行大规模的常规检测具有重要的意义。

目前针对谷物中zen，afs(afb1，afb2，afg1，afg2)和ota的检测定量方法主要有液相色谱法(荧光检测器)，液相色谱-质谱联用法，毛细管电泳法，酶联免疫吸附法，表面增强拉曼散射法等。在检测之前，必须对样品进行前处理，以免复杂的基质对仪器造成污染，影响仪器检测的灵敏度和精确度。因此，针对谷物，选择合适的样品前处理手段用于分离和富集复杂基质中的zen，afs和ota非常重要。

分子印迹技术(molecularlyimprintedtechnology，mit)作为选择性萃取、富集和分离的识别工具近年来已得到关注和应用。由此科研工作者合成了大量的分子印迹聚合物(molecularimprintedpolymers，mips)，已经有众多研究将mips与spe相结合，将mips作为spe柱中的分离介质，实现对各种复杂基质的分离与富集。由于谷物中的真菌毒素成分更为复杂，更难以分离，用于谷物中的真菌毒素分离与富集的分子印迹聚合物报道不常见。因此，探索合成新型分离介质作为spe中柱填料，用于谷物中的真菌毒素的高效分离与富集是目前迫切需要解决的问题。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种黄曲霉毒素多孔芳香族骨架paf-6分子印迹材料，实现对黄曲霉毒素的高选择性富集，便于对谷物中黄曲霉毒素进行准确定量、定性检测。

针对表面分子印迹聚合物(surfacemolecularimprintedpolymers，smips)一个重要问题是采用何种材料作为聚合物层包裹的核。为实现本发明目的，本发明筛选各种新型材料，最终筛选多孔芳香族骨架(porousaromaticframework，paf)做为载体，以华法林钠作为afs的替代模板，在其表面合成印迹聚合物层，使得印迹位点分布在材料表面，制得黄曲霉毒素多孔芳香族骨架paf-6分子印迹材料。

在此基础上，利用smips与spe相结合，制备新型分离介质用于spe柱的柱填料，从而对谷物中痕量的afs进行特异性分离富集，然后结合高效液相色谱法(荧光检测器)进行分析。

具体技术方案如下：通过如下方法制备而成，

华法林钠

(1)将paf-6和丙烯酰胺加入到无水乙醇中超声混合均匀，加入华法林钠，继续超声，然后加入乙二醇二甲基丙烯酸酯(edma)和偶氮丁腈(aibn)，通氮气，搅拌加热反应，反应结束后，过滤并在真空箱中烘干得粉末物paf-6@smips模板。所述aibn用量为edma和丙烯酰胺质量和的2％。

(2)洗脱华法林钠

将获得的paf-6@smips模板使用滤纸包好，然后将其装入索氏提取器中，使用甲醇对聚合物进行洗脱，使用紫外-可见分光光度计对洗脱液检测，直到未出现吸收峰为止，说明paf-6@smips已经洗脱干净。将paf-6@smips洗脱至中性，以免影响后续实验结果。将洗脱后的paf-6@smips在烘箱中干燥。

通过扫描电子显微镜，红外光谱和粒径分析对合成的paf-6@smips的表面形貌和内部结构进行表征。随后通过等温吸附和吸附速率，探究paf-6@smips的吸附性能，运用langmuir和freundlich拟合，伪一级和伪二级拟合探究paf-6@smips的吸附机理。将paf-6@smips作为spe柱的分离介质，优化spe柱的各项参数性能，进行加标回收实验，建立方法，确定方法的检出限，定量限和线性范围。

spe用于分离和富集不同的样品基质时，分离介质的选择是极其重要的，合适的分离介质能够对目标物质拥有更好的分离效果。将本申请自制paf-6@smips的作为spe柱材料与iac同时对实际样品进行处理，检验所制备的paf-6@smips作为分离介质用于固相萃取中的效果，效果见实施例。

本发明原理：以paf-6作为支撑结构，采用悬挂聚合法制备paf-6@smips，将paf-6与丙烯酰胺(功能单体)相接触，此时，溶液中既含有游离的丙烯酰胺，又有一部分进入paf-6的孔道中，这样聚合反应既能发生在paf-6的孔道内部，又能够发生在孔道的外部。随后加入的华法林钠也会进入paf-6的孔道中，此时，华法林钠与丙烯酰胺之间有氢键和离子偶极力的相互作用，而且由于paf-6内部丰富的芳香基团，能够与华法林钠之间产生π-π相互作用。这就促使了这几种分子之间的结合会更加牢固，在聚合过程中，形成的固定位点也会分布更加均匀。流程图如图1所示。

本发明创新点如下：(1)以多孔芳香族骨架paf-6作为支撑，华法林钠作为afs的替代模板，使用悬挂聚合的方法将聚合物层包裹在paf-6表面，制备新型的分离介质paf-6@smips，用作spe柱的柱填料，用于谷物中afb1，afb2，afg1，afg2的同时分离和富集；(2)采用悬挂聚合的方式，使印迹层分布于支撑材料paf-6的内部和表面(paf-6@smips)，材料的利用率更高。(3)优化自制spe柱的各项参数，开发了高灵敏度，高精密度，且具有特异选择性的前处理方法，结合hplc-fd对粮食中四种黄曲霉毒素进行定量检测；对四种黄曲霉毒素进行加标实验，其回收率在73.67-116.9％之间，rsd值在1.47-10.18％之间，小于国标中要求的15％。与iac比较，本发明paf-6@smips柱制备简单，保存条件仅为室温，能够重复性使用，对四种黄曲霉毒素能同时分离和富集。解决了当前iac处理方法中的价高，单次使用，保存条件苛刻等问题。将其应用于实际样品中，在保证检测结果准确高效的情况下，降低检测成本，为替代商业iac柱提供了可能，有利于真菌毒素检测的普及。

附图说明

图1为本发明paf-6@smips的制备和spe流程图。

图2为sem电镜图，其中，a：paf-6，b：paf-6@smips。

图3为paf-6和paf-6@smips的ft-ir谱图，其中a：paf-6；b：paf-6@smips。

图4为paf-6和paf-6@smips的psd图，其中a：paf-6；b：paf-6@smips。

图5为三种材料的等温吸附评估，其中，a：paf-6@smips；b：paf-6@snips；c：paf-6。

图6为paf-6@smips的吸附速率曲线(a)和伪二级拟合(b)。

图7为paf-6@smips作为分离介质spe柱淋洗液和洗脱液的优化柱状图，其中，a：甲醇，b：乙腈。

图8为paf-6@smips作为分离介质柱洗脱体积的优化柱状图，其中，a：afg2；b：afg1；c：afb2；d：afb1。

图9为paf-6@smips作为分离介质柱的重复使用次数柱状图。

图10为paf-6@smips作为分离介质spe柱与iac分离效果比较，其中，a：iac液相谱图；b：paf-6@smips作为分离介质spe柱液相谱图。

具体实施方式

为对本发明进行更好地说明，举实施例如下：

黄曲霉毒素b1，b2，g1，g2(aflatoxinb1，b2，g1，g2，(afb1，afb2，afg1，afg2))几种试剂均从tanmoqualityinspectiontechnologyco.,ltd(beijing,china)购买；其他试剂均为市售品。

液相色谱条件：流动相为甲醇：水＝45：55(v/v)；流速为0.8mlmin^-1；柱温30℃；激发波长360nm，发射波长440nm。

以下没有特别说明，百分含量均为质量百分含量。

实施例1paf-6@smips的制备

(1)paf-6的合成

称取6mmol(516.78mg)无水哌嗪和12mmol(1.658g)无水碳酸钾加入到含有40ml的1，4-二氧六环的圆底烧瓶中，记为1号烧瓶，超声20min，使两者能够混合均匀。再准备另一个圆底烧瓶，记为2号烧瓶，向其中加入4mmol(738mg)无水哌嗪和三聚氯氰(cc)和20ml的1，4-二氧六环，超声15min。向两个烧瓶中通入n2，控制温度在0℃，将2号烧瓶中的溶液通过滴液漏斗逐滴加入到1号烧瓶中，整个过程在磁力搅拌的装置下进行。然后，升温至60℃，保持4h，再升温至90℃，持续24h。反应完成后，将溶液过滤，依次使用ch2cl2，乙醇，去离子水洗涤，重复三次。在真空箱中60℃下干燥8h，即可获得paf-6。

(2)paf-6@smips的合成

0.6g的paf-6和0.23g(3mmol)的丙烯酰胺加入到含有50ml的无水乙醇中(250ml的三口烧瓶)，超声30min，再向其中加入165.2mg(0.5mmol)的华法林钠，继续超声20min，然后加入4.715ml(25mmol)的edma和103.7mg的aibn(edma和丙烯酰胺质量和的2％)，超声10min使其溶液混合均匀，通氮气，使用机械搅拌，使反应温度保持在86℃，反应6h，过滤并在真空箱中烘干得白色粉末。

(3)洗脱华法林钠

将获得的paf-6@smips使用滤纸包好，然后将其装入索氏提取器中，使用150ml混合溶液甲醇：乙酸＝4：1(v/v)对聚合物进行洗脱，使用紫外-可见分光光度计对洗脱液检测，直到未出现吸收峰为止，说明paf-6@smips已经洗脱干净。然后将洗脱液换成纯甲醇，将paf-6@smips洗脱至中性，以免影响后续实验结果。将洗脱后的paf-6@smips在烘箱中60℃下干燥。

注：在合成过程中未加入模板分子(华法林钠)，使用相同的方法获得相应的表面非分子印迹聚合物(paf-6@snips)，作为对比例。

paf-6和paf-6@smips的形貌特征通过sem进行表征。如图2所示，a为多孔芳香族骨架paf-6的形貌特征，可以清晰的观察到其表面结构非常粗糙，且制备的paf-6聚集在一起，形成了大的块状结构，也就是发生了层状堆积。而b为本发明制备的新型复合材料paf-6@smips的表面形貌图。从图中可以观察到其表面分布较为粗糙，而且大块的支撑材料paf-6被分散开。两者的形貌比较可以了解到聚合物成功包裹在了支撑材料paf-6的表面，且在制备过程中分布较为聚集的paf-6被分散开。

paf-6和paf-6@smips的特征通过ft-ir光谱进行了表征，如图3所示。由图3可知，针对不同的特征峰如下(a)：在1302cm^-1处的特征峰归因于哌嗪中的c-n键；而1490cm^-1处的吸收峰为cc中的c＝n键；2923cm^-1处的吸收峰为哌嗪中的c-h键，这几处的特征峰以及附近的其他拉伸振动带的出现证明了paf-6中存在三嗪和哌嗪单元。同时，比较a和b，对应的paf-6的特征吸收峰出现在了b中，且吸收峰均有不同程度的降低但并没有完全消失，这表明paf-6的表面被聚合物占据，但是并没有被完全包裹，还留有一定的孔隙。b中的1731cm^-1处的吸收峰为c＝o双键引起的，综合这几个结果，表明成功制备了多孔芳香族骨架paf-6，并且聚合物成功包裹在了支撑材料paf-6的表面。

实施例2paf-6@smips的吸附性能测试

(1)paf-6@smips等温吸附实验

为了评估paf-6@smips和paf-6@snips材料的吸附能力，进行了等温吸附实验。如图5所示。从图5中可以得出结论：随着浓度的增加，paf-6，paf-6@smips和paf-6@snips三种材料的吸附量也在增加。而且，在一定的浓度后均达到了饱和状态，但是，比较三种材料的吸附量可知，paf-6@smips在不同浓度下的吸附量均比paf-6和paf-6@snips的吸附量高。paf-6@smips和paf-6@snip的吸附量分别在25μgml^-1和20μgml^-1时趋于稳定。这是由于paf-6@smips对目标分子进行吸附的时候，不仅具备印迹层对目标分子的氢键之间的作用力，而且拥有多孔芳香族骨架paf-6与目标分子之间的π-π相互作用力，因此新型复合材料paf-6@smips对目标分子的吸附能力显现出了较好的效果。而单独的paf-6仅仅是一种简单的物理吸附，paf-6@snips由于印迹位点的缺失，在吸附过程中也显现出了其存在的不足。

(2)paf-6@smips选择性实验

通过动态吸附实验研究了目标分子在paf-6@smips中的传质速率，如图6中a所示，为30min内paf-6@smips的吸附速率变化。在最初的1min内，paf-6@smips的吸附容量迅速增加至平衡，表明吸附过程进行的很快，且随着时间的增加，paf-6@smips对华法林钠的吸附量基本维持稳定，这表明整个吸附过程是相对稳定的且几乎不发生解析。随后，将吸附时间设置为一系列的时间节点，发现整个吸附实验中，吸附容量最高达3.27μgmg^-1。快速的吸附效率，表明paf-6@smips表层的印迹位点能够对目标分子进行特异的选择性吸附和优异的传质效果。

为了进一步研究paf-6@smips的吸附机理，使用伪一级和伪二级动力学模型拟合paf-6@smips的动态吸附数据。如图6中b所示，伪二级模型与吸附过程基本一致，使得paf-6@smips与模板分子华法林钠之间具有良好的相关性，r²值(0.9994)高。结果表明，paf-6@smips的吸附过程中主要由化学相互作用起作用。

通过选择性吸附实验研究了制备的新型复合材料paf-6@smips的选择性效果。

paf-6@smips对afs的特异性通过印迹因子(imprintingfactor，if)进行评估，该if通过(1)计算：

if＝qpaf-6@smips/qpaf-6@snips(1)

qpaf-6@smips和qpaf-6@snips(ngmg^-1)分别代表paf-6@smips和paf-6@snips的吸附量。

paf-6@smips对afs的选择性能力通过选择性因子(selectivityfactor，sf)评估，该sf通过(2)计算：

sf＝ifm/iff(2)

ifm和iff分别是指paf-6@smips吸附的目标物质和竞争物质的量。

根据公式计算所得的印迹因子(if)和选择性因子(sf)的值如表1所示，afb1，afb2，afg1，afg2，ota和溴氰菊酯的if值分别为2.15，2.14，2.97，2.66，1.53，1.12。paf-6@smips的吸附量要大于paf-6@snips的，这表明paf-6@smips对afb1，afb2，afg1，afg2的识别能力最强。从两组物质对几种目标物的吸附量数据中，得出afb1，afb2，afg1，afg2及其结构类似物ota的吸附量均较高，而非结构类似物溴氰菊酯的吸附量较低。paf-6@snips对几种目标物质的吸附几乎没有差异，产生这种结果的原因是所制备的新型复合材料paf-6-smips既具备mips的特异选择性能力，又在吸附过程中不仅有氢键的吸附还具备多孔芳香族骨架paf-6的特性，通过π-π相互作用对目标分子进行吸附。然而paf-6@snips对目标分子的吸附仅仅是物理吸附，通过空穴进行吸附，因此相比较而言，其吸附能力和选择性能力较差。

表1paf-6@smips和paf-6@snips的选择性因子和印迹因子

实施例3spe(paf-6@smips)柱的优化

(1)淋洗溶剂和洗脱溶剂的优化

为了保证新型分离介质paf-6@smips对实际样品的中afb1，afb2，afg1，afg2的分离纯化能力。在淋洗步骤能够洗脱更多的杂质，而对四种目标分子产生最小的影响，使得更多的目标物质留在自制spe柱中，使用了甲醇和乙腈两个体系的溶剂用来探索最佳的淋洗液。得最佳的淋洗条件为质量百分含量10％的乙腈溶液。

同样的，在洗脱步骤中spe柱将目标分子洗脱完全，同样进行了以上两个体系的溶剂探索。实验中，将不同比例下流出的afs进行定量研究，各个比例下洗脱下来的afs的回收率如图7所示。比较图7中a和b时，可以观察到当溶剂为乙腈占比为10％时，回收率最低，而甲醇和乙腈两种溶剂占比在70-100％之间时，两种溶剂的洗脱能力都在增强，通过比较回收率，最终选择纯甲醇作为洗脱溶剂。

为了应用于实际生产中，因此，需要对洗脱所需溶液用量进行研究，合适的洗脱体积，不仅能够最大程度的将afs洗脱完全，而且能够节省时间和溶剂使用成本。使用一系列体积的洗脱溶剂将afs(afb1，afb2，afg1，afg2)从自制spe(paf-6@smips)柱中萃取。如图8所示，使用更加直观的液相谱图显示目标分析物(afb1，afb2，afg1，afg2)被慢慢洗脱下来的过程。从0.5ml到2.0ml，随着洗脱溶剂含量的增加，afs从自制柱中洗脱，而且可以观察到四种黄曲霉毒素，随着洗脱溶剂的增加，不同的afs都被在不同时间段洗脱。例如，afg2刚开始的1.5ml洗脱速度较快，而afg1则在0.5和1.0ml时洗脱较少，在1.5ml时被大量洗脱下来。根据分析的液相谱图电信号的结果，最终选择2.0ml的纯甲醇作为自制新型分离介质paf-6@smips柱填料的洗脱体积。

(2)柱子的重复使用性

spe柱中的分离介质paf-6@smips应拥有吸附-解析-再生-吸附的能力，因此对柱子的再生能力进行了探索研究，如图9所示，可以观察到前5次的回收率均在80％以上，而在第六次的时候回收率低于80％，这样的使用次数，相比于只能单次使用的iac，仍旧显现出了优异的性能，对未来将其替代iac的使用提供了可能。

实施例4

在优化出来的spe(paf-6@smips)色谱柱的条件下，将afs(afb1，afb2，afg1，afg2)从谷物中分离出来。表2中列出了四种黄曲霉毒素的基质匹配曲线的线性方程，相关系数(r²)，lod和loq。针对四种毒素的lod和loq值进行了测定，分别是afg2(0.23μgkg^-1，0.75μgkg^-1)，afg1(0.23μgkg^-1，0.75μgkg^-1)，afb2(0.75μgkg^-1，2.5μgkg^-1)，afb1(0.75μgkg^-1，2.5μgkg^-1)。该方法具有低的lod和loq，这为实际样品中含有的痕量afb1，afb2，afg1，afg2进行检测提供了可靠的方法，较高的灵敏度。

表2基质匹配曲线

此外，为了评估所开发方法的准确度与精密度，将玉米糁样品进行三个加标水平实验，分别是2.5、10和15μgkg^-1，四种真菌毒素的加标水平相同。采用优化后的柱子条件，将afb1，afb2，afg1，afg2添加到实际样品中进行提取(空白实验作对比)。

表3玉米糁样品的加标回收率(n＝6)

所得结果如表3所示，对于四种真菌毒素，三个浓度下的加标回收率分别为afg2(2.5μgkg^-1)73.86-98.46％；(10μgkg^-1)82.89-93.25％；(15μgkg^-1)85.29-89.51％。afg1：(2.5μgkg^-1)84.59-116.9％；(10μgkg^-1)81.74-94.27％；(15μgkg^-1)89.45-96.68％。afb2：(2.5μgkg^-1)81.49-94.40％；(10μgkg^-1)80.59-90.68％；(15μgkg^-1)74.07-96.19％。afb1：(2.5μgkg^-1)73.67-100.25％；(10μgkg^-1)85.18-91.91％；(15μgkg^-1)90.05-97.77％。对于四种黄曲霉毒素的rsd值分别为afg2(2.05-6.16％)；afg1(1.82-10.18％)；agb2(1.47-4.76％)；afb1(4.84-5.84％)。rsd低于国家标准中要求的15％，表明所开发的方法是可行的，可用于复杂样品中四种黄曲霉毒素的同时分离和富集。

为了验证新型分离介质paf-6@smips所制备的spe柱效果，与商品柱iac进行了对比，其结果如图10所示。从图中可以观察到自制的paf-6@smipsspe柱，能对afb1，afb2，afg1，afg2进行同时分离和富集。比较图10中a和b，本发明自制柱对四种黄曲霉毒素的分离和富集能力与iac相差不大，而iac的专一性更强，自制柱对四种毒素分离效果相近。但是自制paf-6@smipsspe柱拥有较低的制备成本，能够重复性使用，具备良好的实用前景。