微流控芯片及外泌体提取方法与流程

1.本发明涉及微流控技术领域，特别是涉及一种微流控芯片及外泌体提取方法。


背景技术：

2.外泌体是细胞经过“内吞-融合-外排”过程而形成的细胞外纳米级小囊泡，尺寸在30nm～150nm之间，在血液中含量高。外泌体具有穿过血脑屏障、转运核酸(mirna)、蛋白质和脂质等生物活性分子的特性及功能。外泌体作为一种在细胞间交流、传递物质的载体，在受体细胞中发挥着调控作用，经研究发现在一系列生理和病理过程中起到了至关重要的作用。目前外泌体的提取主要来自血液、唾液、尿液、脑脊液、精液、唾液、胸腔积液和乳汁等体液。
3.外泌体的提取方法主要包括：超速离心法、密度梯度离心法、聚合物沉淀法(peg-base沉淀法)、超滤法、磁珠免疫法、试剂盒提取等。超速离心法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。密度梯度离心法是利用超速离心形成密度阶层，富集外泌体进行富集。peg-base沉淀法利用聚乙二醇(peg)可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀的特性，早先应用于从血清等样本中收集病毒，现在也被用来沉淀外泌体，其原理可能与竞争性结合游离水分子有关。超滤离心法是采用不同截留相对分子质量的超滤膜进行选择性分离。磁珠免疫法是利用外泌体表面有其特异性标记物(如cd63、cd9蛋白)，用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合后，可将外泌体吸附并分离出来。
4.然而，上述外泌体提取方法提取外泌体的方法通常具有时间长、操作复杂，需要大型仪器、成本高等不足。因而随着科学的进步，逐步出现了一些采用微流控技术实现外泌体提取的微流控芯片。例如，中国专利cn112517092a中的微流控芯片。采用这些微流控芯片提取外泌体时，操作简单、无需多次加样及换样，但外泌体的损失量较高，收获的外泌体的量较低。


技术实现要素：

5.基于此，有必要提供一种能减小外泌体损失量的微流控芯片。
6.此外，还提供一种能减少损失量的外泌体提取方法。
7.一种微流控芯片，包括旋转中心和至少一个提取机构，所述提取机构包括进样单元、捕获单元和收集单元；
8.所述进样单元包括进样池和分离池，所述进样池相较所述分离池更靠近所述旋转中心；
9.所述捕获单元与所述进样单元连接并位于所述进样单元的下游，所述捕获单元包括孵育池、载体过滤池、装载液池、装载液定量池和洗脱液池，所述进样池、所述分离池、所述孵育池和所述载体过滤池依次连通，所述装载液池、所述装载液定量池连通和所述孵育池依次连通，所述洗脱液池包括依次连通的洗脱液储腔、洗脱液定量腔、洗脱液一级腔和洗
脱液二级腔，所述洗脱液储腔较所述洗脱液定量腔更靠近所述旋转中心，所述洗脱液二级腔与所述载体过滤池连通；
10.所述收集单元与所述捕获单元连接并位于所述捕获单元的下游，所述收集单元包括废液池、目标物池和三通微流道，所述废液池和所述目标物池通过所述三通微流道与所述载体过滤池连通；当洗脱液流入所述三通微流道时，所述三通微流道的与所述目标物池连接的支路的压强低于所述三通微流道的与所述废液池连接的支路的压强，以使含有目标物的洗脱液流向所述目标池。
11.经本技术研究发现，传统微流控芯片是利用流体在加速状态下自身的偏移完成液体导向，通过改变旋转方向实现不同流向的控制，但这种方式容易发生分离不彻底，废液池中往往含有比较多的目标物。因此，上述微流控芯片通过当洗脱液流入三通微流道时，三通微流道的与目标物池连接的支路的压强低于三通微流道的与废液池连接的支路的压强的设计，使得含有目标物的洗脱液流向目标池，而不进入废液池，进而使得目标物池中的目标物更多，降低了目标物的损失量，提高了目标物的得率。
12.在其中一个实施例中，所述三通微流道的分支点与所述废液池之间的流道呈s形弯折结构。
13.在其中一个实施例中，所述分离池包括第一腔室、第二腔室和用于连接所述第一腔室和所述第二腔室的连接部，所述第一腔室与所述进样池连通，所述连接部具有连通所述第一腔室和所述第二腔室的连接通道，连通所述分离池与所述孵育池的微流道靠近所述连接通道且其深度小于所述连接通道的深度。
14.在其中一个实施例中，所述微流控芯片具有盖合面，所述连接通道内设有台阶结构，所述台阶结构靠近连通所述分离池与所述孵育池的微流道，所述台阶结构的靠近所述盖合面的表面与连通所述分离池与所述孵育池的微流道的底面相接。
15.在其中一个实施例中，所述连接通道内设有斜坡结构，所述斜坡结构靠近连通所述分离池与所述孵育池的微流道，所述斜坡结构的斜坡面与连通所述分离池与所述孵育池的微流道的底面相接。
16.在其中一个实施例中，所述孵育池包括滤膜室和与所述滤膜室连通的混合室，所述滤膜室与所述分离池连通，所述装载液定量池与所述混合室连通，所述滤膜室设置有第一滤膜结构，所述第一滤膜结构包括与所述滤膜室相匹配的第一基框和位于所述第一基框上的第一滤膜，所述第一滤膜靠近所述滤膜室的进液口，所述第一基框靠近所述滤膜室的出液口；
17.及/或，所述载体过滤池内设有第二滤膜结构，所述第二滤膜结构包括与所述载体过滤池相匹配的第二基框和位于所述第二基框上的第二滤膜，所述第二滤膜靠近所述载体过滤池的进液口，所述第二基框靠近所述载体过滤池的出液口。
18.在其中一个实施例中，所述第一基框和所述滤膜室的出液口之间和/或所述第二基框与所述载体过滤池的出口之间设置有助流结构，所述助流结构呈台阶状或斜坡状。
19.在其中一个实施例中，所述分离池与所述孵育池、所述装载液定量池与所述孵育池、所述孵育池与所述载体过滤池、所述洗脱液储腔与所述洗脱液定量腔、所述洗脱液定量腔与所述洗脱液一级腔、所述洗脱液一级腔与洗脱液二级腔、和所述洗脱液二级腔与所述载体过滤池中的至少一组是通过虹吸流道连通。
20.在其中一个实施例中，所述虹吸流道的宽度为150μm～500μm，所述虹吸流道的深度为100μm～500μm。
21.在其中一个实施例中，所述三通微流道的分支点与所述废液池之间的流道的宽度为0.5mm～5mm，深度为150μm～700μm。
22.一种外泌体的提取方法，使用上述的微流控芯片进行提取，所述提取方法包括以下步骤：
23.将含有外泌体的原料加至进样池；
24.控制所述微流控芯片的转速，以使所述原料依次经分离池、孵育池及载体过滤池后，在洗脱液的作用下所述原料中的外泌体进入目标池。
25.在其中一个实施例中，控制所述微流控芯片的转速，以使所述原料依次经过分离池、孵育池及载体过滤池后，在洗脱液的作用下所述原料中的外泌体进入目标物池的步骤包括：
26.s1：控制所述微流控芯片在第一转速下离心，使原料从进样池中流入分离池、装载液从装载池进入装载定量池、洗脱液从洗脱液储腔进入洗脱液定量腔；
27.s2：将所述微流控芯片静置第一时间后，控制所述微流控芯片在第二转速下离心，使原料进入孵育池、装载液从装载定量池进入孵育池、洗脱液从洗脱液定量腔进入洗脱液一级腔；
28.s3：控制所述微流控芯片在第三转速和第四转速之间交替转动，以混合孵育池中的原料与装载液；
29.s4：将所述微流控芯片静置第二时间后，控制所述微流控芯片在第五转速下离心，使载体过滤池中的液体进入废液池、洗脱液从洗脱液一级腔进入洗脱液二级腔；
30.s5：将所述微流控芯片静置第三时间后，控制所述微流控芯片在第六转速下离心，使洗脱液二级腔中的洗脱液进入载体过滤池后携外泌体进入目标物池。
附图说明
31.图1为一实施例的微流控芯片(不含盖板)图；
32.图2为图1所示的微流控芯片的盖板；
33.图3为图1所示的微流控芯片的立体图；
34.图4为图1所示的微流控芯片的a部放大图；
35.图5为图3所示的微流控芯片的c部放大图；
36.图6为图1所示的微流控芯片的第一滤膜结构的组装流程图；
37.图7为图1所示的微流控芯片的局部放大图；
38.图8为另一实施例的微流控芯片(不含盖板)的立体图；
39.图9为实施例1的nta测试图；
40.图10～图11为实施例1的外泌体的电镜图；
41.图12为对比例1的nta测试图；
42.图13～图14为对比例1的外泌体的电镜图。
43.附图标记：
44.10、微流控芯片；101、旋转中心；102、底板；103、盖板；102a、盖合面；111、进样池；
112、分离池；112a、第一腔室；112b、第二腔室；112c、连接通道；131、孵育池；131a、滤膜室；131b、混合室；131c、第一滤膜结构；131d、第一基框；131e、第一滤膜；131f、第一固定件；132、载体过滤池；133、装载液池；134、装载液定量池；135、洗脱液储腔；136、洗脱液定量腔；137、洗脱液一级腔；138、洗脱液二级腔；151、废液池；152、目标物池；152a、进口部；152b、集液部；153、三通微流道；161、洗脱液废弃池；162、全血废弃池；163、装载液废弃池；164、减重配平腔；103a、进样口；103b、洗脱液加样口；103c、装载液加样口；103d、目标物取液口；103e、气孔。
具体实施方式
45.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
46.需要说明的是，当元件被表述“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上、或者其间可以存在一个或多个居中的元件。当一个元件被表述“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件、或者其间可以存在一个或多个居中的元件。当使用术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”、“上”、“下”、“内”、“外”、“底部”等指示方位或位置关系时，是为基于附图所示的方位或位置关系，仅为了便于描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本技术的限制。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。另外，在本文中，各腔、腔室、池及流道的深度均是指对应的元件的底部到盖合面的距离。
47.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
48.请参阅图1和图2，本技术一实施方式提供了一种微流控芯片10，包括至少一个提取机构和旋转中心101，提取机构包括进样单元、捕获单元和收集单元。
49.具体地，上述微流控芯片10包括底板102和盖合于底板102上的盖板103，底板102具有盖合面102a，盖板103盖合在盖合面102a上。旋转中心101和提取机构设置在底板102上。在一些实施例中，底板102和盖板103的材料分别独立地选自聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯(pc)及聚氯乙烯(pvc)中的至少一种。在一个可选地具体示例中，底板102和盖板103的材料均为pc。在一些实施例中，底板102和盖板103通过粘合剂(例如双面粘胶)粘合。在另一些实施例中，底板102与盖板103通过热压键合。在一些实施例中，底板102与盖板103的材料相同。在另一些实施例中，底板102与盖板103的材料不相同。在其中一个实施例中，盖板103为具有粘合能力的覆膜。底板102与盖板103通过盖板103的粘合力粘合。具体地，盖板103包括基膜及位于基膜上的胶层，粘胶层靠近底板102。在一个可选地具体示例中，胶层为疏水性胶层。在一个可选地具体示例中，底板102上供液体流动的流路表面由改性剂进行亲水性改性。将流路进行亲水性处理利于液体流动。可以理解的是，在其他实施例中，底板102和盖板103的材料不限于上述。
50.在其中一个实施例中，底板102的厚度为5mm。可以理解的是，底板102的厚度不限
于此，还可以根据具体情况进行调整。在图示的实施例中，底板102呈圆盘状，盖板103呈圆盘状。
51.请一并参阅图3～图5，进样单元用于加样并进行初步纯化。进样单元包括进样池111和与进样池111连通的分离池112，进样池111较分离池112更靠近旋转中心101。进样池111用于加样并存储原料；分离池112用于初步纯化由进样池111进入的原料。在一些实施例中，分离池112包括第一腔室112a、第二腔室112b和用于连接第一腔室112a和第二腔室112b的连接部。第一腔室112a靠近进样池111，第一腔室112a较第二腔室112b更靠近旋转中心101，第一腔室112a与进样池111连通；连接部具有用于连通第一腔室112a与第二腔室112b的连接通道112c。在其中一个实施例中，连接通道为凹槽。
52.在一些实施例中，第一腔室112a内还设置有助流件，助流件靠近连接部。通过助流件的设置，使得原料能更加顺畅地向第二腔室112b流动，利于分离。可选地，助流件呈台阶状或斜坡状。
53.在图示的实施例中，进样池111大致呈弧形带状，绕旋转中心101设置；分离池112大致呈沙漏状；连接通道112c大致呈长条状凹槽；助流件大致呈台阶状，且台阶数为三。可以理解的是，在其他实施例中，进样池111、分离池112、连接通道112c及助流件的形状均不限于上述，还可以是其他形状。
54.捕获单元与进样单元连接并位于进样单元的下游。捕获单元通过载体与目标物相结合而形成复合体的方式捕获目标物并纯化目标物。具体地，捕获单元包括孵育池131、载体过滤池132、装载液池133、装载液定量池134和洗脱液池。
55.孵育池131位于分离池112的下游并与分离池112和装载液定量池134分别连通，是进一步纯化、以及目标物与其特异性载体相结合而形成复合体的场所。在一些实施例中，连通分离池112与孵育池131的微流道靠近连接通道112c，并且该微流道的深度小于连接通道112c的深度。通过将连通分离池112与孵育池131的微流道的深度设置为小于连接通道112c的深度，使得位于第二腔室112b的液体不容易在回流时进入连通分离池112与孵育池131的微流道，而影响分离池112的纯化效果，进而提高目标物的提取量。
56.以全血中提取外泌体为例，全血进入进样池111后，含有外泌体的血浆由于离心作用进入第一腔室112a并留在第一腔室112a，而血细胞会在离心作用下通过连接通道112c进入第二腔室112b，从而实现血浆与血细胞的分离。经本技术的研究发现，传统微流控芯片的第二腔室中的血细胞在受到的离心作用在减小至无的过程中及后续不受离心作用时，容易回流到连接通道处，而此时由于连通分离池与孵育池的微流道的深度与连接通道相同，而使得血细胞容易从微流道进入孵育池，从而影响孵育池的纯化效果及外泌体与载体的结合，进而影响外泌体提取效果。因此，在本技术的一些实施例中，将连通分离池112与孵育池131的微流道的深度设置为小于连接通道112c的深度，使得位于第二腔室112b的血细胞不容易在回流时进入连通分离池112与孵育池131的微流道，从而减小其对孵育池131的纯化效果的影响，提高外泌体的提取量。此外，由于连通分离池112与孵育池131的微流道的深度设置为小于连接通道112c的深度的设置，使得进入孵育池131的血浆更容易过滤。此时，不必在上述微流控芯片10上设置用于存放稀释血浆的稀释液的腔室及流道，简化上述微流控芯片10设计。
57.进一步地，在其中一个实施例中，连接通道112c内设有台阶结构，台阶结构靠近连
通分离池112与孵育池131的微流道，台阶结构的靠近盖合面102a的表面与连通分离池112与孵育池131的微流道的底面相接。在连接通道112c中设置台阶结构，使得连接通道112c形成了供比重较大的组分流通的第一流道和供比重较小的组分流通的第二流道(第一流道的深度大于第二流道的深度)，从而使得比重较大的组分不容易进入连通分离池112与孵育池131的微流道。以全血提取外泌体为例，血细胞在从第二腔室112b回流时，从台阶结构与连接通道112c形成的第一流道流过，血浆主要从第二流道流过，从而使得血细胞不容易进入连通分离池112与孵育池131的微流道。
58.在一个可选地具体示例中，连接通道112c为长条凹槽，连接通道112c的深度为500μm，连接通道112c的宽度为1500μm；台阶结构的高度为200μm，台阶结构的宽度为750μm。台阶结构的高度是指台阶结构的靠近盖合面102a的一侧到连接通道112c的底面的距离；台阶结构的宽度是指台阶结构在连接通道112c的宽度方向上的长度。
59.在另一个实施例中，连接通道112c内设有斜坡结构，斜坡结构靠近连通分离池112与孵育池131的微流道，斜坡结构的斜坡面与连通分离池112与孵育池131的微流道的底面相接。斜坡结构的设置与台阶结构的设置原理相同，均是使得连接通道112c的底面到盖合面102a的距离大于与连通分离池112与孵育池131的微流道的底面到盖合面102a的距离，从而使得比重较大的组分不容易进入连通分离池112与孵育池131的微流道而影响孵育池131的纯化效果。
60.在一些实施例中，孵育池131包括滤膜室131a和与滤膜室131a连通的混合室131b，滤膜室131a较混合室131b更靠近旋转中心101，滤膜室131a较第一腔室112a更远离旋转中心101；滤膜室131a与分离池112连通。在其中一个实施例中，滤膜室131a与分离池112通过虹吸流道连通。滤膜室131a与分离池112通过虹吸流道连通，可以使得第一腔室112a中的液体在静置后经过毛细作用填充虹吸流道，进而在离心作用下可以使得第一腔室112a中的液体进入滤膜室131a，而未静置时第一腔室112a中的液体无法进入滤膜室131a。滤膜室131a与分离池112之间虹吸流道的设置使得滤膜室131a与分离池112不需要额外设置毛细阀就可以实现流体的控制。
61.在本实施方式中，虹吸流道的宽度为150μm～500μm，虹吸流道的深度为100μm～500μm。在一个可选地具体的示例中，虹吸流道的宽度为360μm，虹吸流道的深度为300μm。在一些实施例中，虹吸流道呈u形，虹吸流道设置有毛细阀。在另一些实施例中，虹吸流道呈v形，虹吸流道上无毛细阀。在无毛细阀时，通过控制离心转速，使得液体受到的向心力大于毛细作用力，则液体不会流向虹吸流道内，从而实现无毛细阀的作用。与u形虹吸流道相比，v形虹吸流道中的毛细效应更弱，而使其流路控制更加稳定可靠。当然，下文提及的虹吸流道的尺寸及是否设置毛细阀可参考此处。可以理解的是，在其他实施例中，滤膜室131a与分离池112还可以通过其他方式连通。
62.滤膜室131a设置有第一滤膜结构131c。第一滤膜结构131c包括与滤膜室131a相匹配的第一基框131d和安装于第一基框131d上的第一滤膜131e。第一滤膜131e靠近滤膜室131a的进液口，第一基框131d靠近滤膜室131a的出液口。第一滤膜131e用于对第一腔室112a中液体的进步一纯化。在一些实施例中，第一滤膜结构131c可拆卸地位于滤膜室131a内。通过将第一滤膜结构131c可拆卸地设置在滤膜室131a内，使得第一滤膜131e的安装更方便。并且，第一基框131d与第一滤膜131e的配合，使得液体能垂直过膜，提高了滤膜的使
用效率。在另一些实施例中，第一滤膜结构131c与滤膜室131a一体成型。
63.请参阅图6，在一些实施例中，第一滤膜结构131c还包括用于将第一滤膜131e固定在第一基框131d中的第一固定件131f。在图示的实施例中，第一基框131d呈底部有孔的条形凹槽状，第一固定件131f呈框状。如此设置，使得液体流过第一滤膜131e时，第一基框131d给予第一滤膜131e更好的支撑，进一步提高滤膜的使用效率；第一滤膜结构131c的各部件为可拆卸连接时组装便捷。在使用时，先将第一滤膜131e放入第一基框131d内，然后将第一固定件131f放入第一基框131d内，以将第一滤膜131e固定在第一固定件131f与第一基框131d之间，从而形成第一滤膜结构131c。可以理解的是，在其他实施例中，第一基框131d和第一固定件131f的形状不限于上述。
64.在其中一个实施例中，滤膜室131a设置有用于放置第一基框131d的滤膜槽，滤膜槽的深度大于滤膜室131a的深度，第一滤膜131e靠近滤膜室131a的底部一侧位于滤膜槽内。如此设置可以使得滤膜室131a的第一滤膜131e的有效面积更大，利于过滤。进一步地，第一滤膜结构131c可拆卸地位于滤膜槽内。可以理解的是，在其他实施例中，第一基框131d可以省略。
65.需要说明的是，“与滤膜室131a相匹配的第一基框131d”是指第一基框131d的形状设置能与滤膜室131a相适应，使得第一滤膜结构131c与滤膜室131a的配合能起过滤作用。下文“与载体过滤池132相匹配的第二基框”同理。在一个可选地具体示例中，第一滤膜131e的孔径为220nm。可以理解的是，在其他实施例中，第一滤膜131e的孔径可以根据具体需要去除的物质进行选择。
66.进一步地，在一些实施例中，在第一基框131d和滤膜室131a的出液口之间还设置有助流结构。在第一基框131d和滤膜室131a的出液口之间设置有助流结构，可以使得经过第一滤膜131e的滤液进入混合室131b更加顺畅。可选地，助流结构靠近混合室131b并呈台阶状或斜坡状。在图示的实施例中，滤膜室131a的靠近混合室131b的一侧的宽度逐渐减小。如此设置利于滤膜室131a中的液体进入混合室131b。
67.装载液池133用于承装装载液(装载液是含有能与目标物特异性结合的载体的溶液)。装载液定量池134位于装载液池133的下游，用于定量装载液。较装载液池133，装载液定量池134更远离旋转中心101。装载液定量池134与孵育池131连通，以使定量之后的装载液能进入孵育池131与目标物结合。具体地，装载液定量池134与混合室131b连通，装载液定量池134较混合室131b更靠近旋转中心101。在其中一个实施例中，装载液定量池134与混合室131b通过虹吸流道连通。
68.载体过滤池132位于孵育池131的下游，用于过滤载体。具体地，载体过滤池132与混合室131b连通。在其中一个实施例中，载体过滤池132与混合室131b之间设置有虹吸流道。在图示的实施例中，混合室131b、虹吸流道、混合液流道和载体过滤池132依次连通。在一些实施例中，载体过滤池132内设有第二滤膜结构，第二滤膜结构包括与载体过滤池132相匹配的第二基框和位于第二基框上的第二滤膜。第二滤膜靠近载体过滤池132的进液口，第二基框靠近载体过滤池132的出液口。第二基框的设置利于液体垂直过膜。第二滤膜结构用于拦截载体。在其中一个实施例中，第二滤膜的孔径为2μm～4μm。可以理解的是，在其他实施例中，第二滤膜的孔径可以根据具体需要去除的物质进行选择。在一些实施例中，第二滤膜结构可拆卸地位于载体过滤池132内。通过将第二滤膜结构可拆卸地设置在载体过滤
池132内，使得第二滤膜的安装更方便。在另一些实施例中，第二滤膜结构与载体过滤池132一体成型。
69.在一些实施例中，第二滤膜结构还包括用于将第二滤膜固定在第二基框中第二固定件。在其中一个实施例中，第二基框呈底部有孔的条形凹槽状，第二固定件呈框状。如此设置，使得液体流过第二滤膜时，第二基框给予第二滤膜更好的支撑，进一步提高滤膜的使用效率；并且第二滤膜结构的各部件为可拆卸连接时组装便捷。在使用时，先将第二滤膜放入第二基框内，然后将第二固定件放入第二基框内以将第二滤膜固定在第二固定件与第二基框之间，从而形成第二滤膜结构。可以理解的是，在其他实施例中，第二基框和第二固定件的形状不限于上述。
70.进一步地，第二基框与载体过滤池132的出口之间也设置有助流结构。第二基框与载体过滤池132的出口之间设置有助流结构利于载体过滤池132的滤液向下游流动。可选地，助流结构靠近三通微流道153，呈台阶状或斜坡状。
71.洗脱液池包括依次连通的洗脱液储腔135、洗脱液定量腔136、洗脱液一级腔137和洗脱液二级腔138，洗脱液储腔135靠近旋转中心101，洗脱液二级腔138与载体过滤池132连通。洗脱液储腔135用于承装洗脱液；洗脱液定量腔136用于定量洗脱液；洗脱液一级腔137用于承装定量后的洗脱液；洗脱液二级腔138用于承装来自洗脱液一级腔137的洗脱液。通过将洗脱液池按照如上设置，使得在使用微流控芯片10时洗脱液能在指定时间阶段释放以发挥分离载体与目标物的作用。在一些实施例中，洗脱液储腔135与洗脱液定量腔136、洗脱液定量腔136与洗脱液一级腔137、洗脱液一级腔137与洗脱液二级腔138、和洗脱液二级腔138与载体过滤池132均是通过虹吸流道连通。在图示的实施例中，虹吸流道均呈v形。当然，在其他实施例中，洗脱液储腔135与洗脱液定量腔136、洗脱液定量腔136与洗脱液一级腔137、洗脱液一级腔137与洗脱液二级腔138、和洗脱液二级腔138与载体过滤池132的连通不限于虹吸流道。
72.可以理解的是，在其他实施例中，洗脱液池还可以在图示的实施例的基础上增加或减少腔室以实现洗脱液转运的控制。例如在图示的实施例的基础上原料的纯化次数增加或减少时，洗脱液池的腔室也对应增加或减少，以实现在洗脱液到达载体过滤池132时，不含混合液中的液体已经到达废液池151而复合体被截留在载体过滤池132。
73.请参阅图7，收集单元与捕获单元连接并位于捕获单元的下游，收集单元主要用于收集目标物。收集单元包括废液池151、目标物池152和三通微流道153，废液池151和目标物池152通过三通微流道153与载体过滤池132连通。废液池151用于存放载体过滤池132过滤目标物与载体形成的复合体时形成的滤液；目标物池152用于收集含有目标物的洗脱液；三通微流道153用于载体过滤池132分别连通废液池151和目标物池152。经本技术研究发现，传统微流控芯片是利用流体在加速状态下自身的偏移完成液体导向，通过改变旋转方向实现不同流向的控制，但这种方式容易发生分离不彻底，废液池中往往含有比较多的目标物。因此，本技术通过在废液池151填充不含洗脱液的废液后，当洗脱液流入三通微流道153时，三通微流道153的与目标物池152连接的支路的压强低于三通微流道153的与废液池151连接的支路的压强的设计，而使得含有目标物的洗脱液流向目标池，而不进入废液池151，进而使得目标物池152中的目标物更多，降低了目标物的损失量，提高了目标物的得率。在一些实施例中，当洗脱液流入三通微流道153时，三通微流道153的与目标物池152连接的支路
的压强低于三通微流道153的与废液池151连接的支路的压强，通过废液池151上无气孔103e实现。载体过滤池132过滤目标物与载体结合而形成的复合体的滤液填满废液池151。此时，含有目标物的洗脱液无法再进入废液池151而进入目标物池152。
74.进一步地，三通微流道153的分支点与废液池151之间的流道呈s形弯折结构。通过将三通微流道153的分支点与废液池151之间的流道设置成s形弯折结构，增加了流路的长度，并减轻了洗脱液进入废液池151的混合程度。随着废液对废液池151的填充，含有目标物的洗脱液更难进入废液池151，同时即使有含有目标物的洗脱液进入该流道，其量也是极少的。在其中一个实施例中，三通微流道153的分支点与废液池151之间的流道的宽度为0.5mm～1.5mm，深度为150μm～700μm。在一个可选地具体示例中，三通微流道153的分支点与废液池151之间的流道的宽度为1mm，深度为500μm。
75.在一些实施例中，三通微流道153的与载体过滤池132连接的支路，与三通微流道153的与目标物池152连接的支路的夹角(图中α)为30
°
～90
°
。在一个可选地具体示例中，三通微流道153的与载体过滤池132连接的支路，与三通微流道153的与目标物池152连接的支路的夹角为60
°
。在图示的实施例中，目标物池152及三通微流道153的与目标物池152连接的支路，位于三通微流道153的与废液池151连接的支路的右侧。可以理解的是，在其他实施例中，目标物池152及三通微流道153的与目标物池152连接的支路还可以位于三通微流道153的与废液池151连接的支路的左侧。
76.请参阅图3，在一些实施例，目标物池152的各个部分的深度大致相同。
77.请参阅图8，在另一些实施例中，目标物池152包括进口部152a和与进口部连通的集液部152b，进口部152a与三通微流道153连通，集液部152b的深度较进口部152a更深。目标物经三通微流道153连通、进口部152a到达集液部152b，集液部152b用于收集目标物。将集液部152b的深度设置为较进口部152a更深，便于从目标物池152取出目标物。在图8的实施例中，集液部152b大致呈圆柱形。可以理解的是，在其他实施例中，集液部152b的形状不限于圆柱形，还可以是其他形状。
78.在一些实施例中，上述微流控芯片10还包括洗脱液废弃池161、全血废弃池162和装载液废弃池163。洗脱液废弃池161与洗脱液定量腔136连通，用于承装超过洗脱液定量腔136容量的洗脱液。全血废弃池162与第一腔室112a连通，用于承装超过第一腔室112a容量的原料。装载液废弃池163与装载液定量腔连通，用于承装超过装载液定量腔容量的装载液。进一步地，洗脱液废弃池161与洗脱液定量腔136采用宽口流道连通，以避免虹吸效应而使得洗脱液定量不准确。全血废弃池162与第一腔室112a采用宽口流道连通，以避免虹吸效应而使得用于分离的原料量少于理论量。装载液废弃池163与装载液定量腔采用宽口流道连通，以避免虹吸效应而使得装载液定量不准确。在一个可选地具体示例中，宽口流道的宽度为2mm，宽口流道的深度为500μm。
79.在一些实施例中，上述微流控芯片10还包括减重配平腔164室。通过减重配平腔164室的设置使得上述微流控芯片10在加样之后能够在离心机中平衡旋转。在图示的实施例中，减重配平腔164室有多个。
80.在图示的实施例中，盖板103上设置有进样口103a、洗脱液加样口103b、装载液加样口103c、目标物取液口103d和气孔。通过气孔的设置使得流体在需要流动时能更加顺畅。可以理解的是，在其他一些实施例中，洗脱液加样口103b和装载液加样口103c可以省略。
81.在图示的实施例中，提取机构为一个。可以理解的是，在其他实施例中，提取机构还可以是多个。
82.此外，本技术一实施方式还提供了一种外泌体的提取方法，该提取方法采用上述任一实施例的微流控芯片10进行提取。
83.在一些实施例中，上述提取方法包括以下步骤：将含有外泌体的原料加至进样池111；及控制微流控芯片10的转速，以使原料依次经过分离池112、孵育池131及载体过滤池132后，在洗脱液的作用下，原料中的外泌体进入目标池。
84.在其中一个实施例中，原料的加样量为250μl～550μl。例如500μl。在一些实施例中，洗脱液没有预置于洗脱液储腔135；装载液没有预置于装载液池133。在使用时，向洗脱液储腔135加入适量(例如100μl～250μl)洗脱液；向装载液池133加入适量(例如130μl～250μl)装载液。当然，在芯片已经预置有相关试剂时，则不必再添加。
85.在一些实施例中，控制微流控芯片10的转速，以使原料依次经过分离池112、孵育池131及载体过滤池132后，在洗脱液的作用下，所述原料中的外泌体进入目标池步骤包括：
86.s1：控制微流控芯片10在第一转速下离心，使原料从进样池111中流入分离池112、装载液从装载池进入装载定量池、和洗脱液从洗脱液储腔135进入洗脱液定量腔136。
87.在第一转速离心作用结束后，原料从进样池111中流入分离池112，其中血浆进入第一腔室112a，血细胞进入第二腔室112b，多余的血液进入全血废弃池162；装载液从装载池进入装载定量池，多余的装载液进入装载液废弃池163；洗脱液从洗脱液储腔135进入洗脱液定量腔136，多余的洗脱液进入洗脱液废弃池161。
88.在其中一个实施例中，第一转速为2500转/min～5500转/min，对应的离心时间为120s～480s。
89.s2：将微流控芯片10静置第一时间后，控制微流控芯片10在第二转速下离心，使原料进入孵育池131、装载液从装载定量池进入孵育池131、洗脱液从洗脱液定量腔136进入洗脱液一级腔137。
90.在微流控芯片10静置第一时间后，第一腔室112a的血浆经毛细作用进入分离池112与滤膜室131a之间的虹吸流道，装载液定量池134中的装载液经毛细作用进入装载液定量池134与混合室131b之间的虹吸流道，洗脱液定量腔136中的洗脱液经毛细作用进入洗脱液定量腔136与洗脱液一级腔137之间的虹吸流道，进而为血浆能进入滤膜室131a、装载液能进入混合室131b及洗脱液能进入洗脱液一级腔137提供条件(若分离池112与滤膜室131a之间的虹吸流道无液体，分离池112中的液体即使离心速度大也难以进入滤膜室131a；若装载液定量池134与混合室131b之间的虹吸流道无液体，则装载液定量池134中的液体也难以进入混合室131b；若洗脱液定量腔136与洗脱液一级腔137之间的虹吸流道无液体，则洗脱液定量腔136的液体也难以进入洗脱液一级腔137)。然后在第二转速的作用下，第一腔室112a中的血浆进入滤膜室131a并经第一滤膜131e的过滤，滤液进入混合室131b；装载液定量池134中的装载液进入混合室131b；洗脱液定量腔136中的洗脱液进入洗脱液一级腔137。可选地，第一时间为5s～50s。第二转速为2000转/min～4500转/min，对应的离心时间为15s～120s。
91.s3：控制微流控芯片10在第三转速和第四转速之间交替运行，以混合从分孵育池131中的原料与装载液。
92.可选地，第三转速为2500转/min～4000转/min，对应的离心时间是3s～20s。第四转速为300转/min～2000转/min，对应的离心时间t5是3s～20s。当然，交替转动的方向没有特别限制，可以是同向也可以是方向。可选地，交替运行的次数为3次～15次。
93.s4：将微流控芯片10静置第二时间后，控制微流控芯片10在第五转速下离心，使载体过滤池132中的液体过第二滤膜后进入废液池151、洗脱液从洗脱液一级腔137进入洗脱液二级腔138。
94.在微流控芯片10静置第二时间后，混合腔室的混合物经毛细作用进入载体过滤池132与混合室131b之间的虹吸流道为混合室131b中的混合物进入载体过滤池132提供条件；洗脱液一级腔137中的洗脱液经毛细作用进入洗脱液一级腔137与洗脱液二级腔138之间的虹吸流道，为洗脱液进入洗脱液二级腔138提供条件。然后在第五转速的作用下，载体过滤池132中的液体进入废液池151，复合体截留在载体过滤池132；洗脱液一级腔137中的洗脱液进入洗脱液二级腔138。
95.可选地，第二时间为5s～50s。第五转速为2000转/min～5000转/min，对应的离心时间是20s～120s。
96.s5：将微流控芯片10静置第三时间后，控制微流控芯片10在第六转速下离心，使洗脱液二级腔138中的洗脱液进入载体过滤池132后携外泌体进入目标物池152。
97.在微流控芯片10静置第三时间后，洗脱液二级腔138中的洗脱液经毛细作用进入洗脱液二级腔138与载体过滤池132之间的毛细流道，为洗脱液进入载体过滤池132提供条件。然后在第六转速的作用下，洗脱液二级腔138中的洗脱液进入载体过滤池132后作用于复合体，使复合体分为载体和外泌体，其中，载体截留在载体过滤池132中，而外泌体随洗脱液进入目标物池152。
98.可选地，第三时间为5s～40s。第六转速为2500转/min～6500转/min，对应的离心时间是30s～120s。
99.上述外泌体的提取方法采用上述微流控芯片10进行提取，整个提取过程仅需一次加样，并且所用试剂量小；芯片自动进行了全血分离、外泌体装载、外泌体洗脱以及废液分离等操作步骤，芯片整体提取时间最少可以低至5min，最长也只需13min(传统方法一般需要3h20min)即可完成提取；并且与采用cn112517092a中的微流控芯片提取外泌体相比，采用上述微流控芯片10提取外泌体时，外泌体的浓度提高了36.7％左右，得到的外泌体量更大。此外，与采用cn112517092a中的微流控芯片提取外泌体相比，采用上述微流控芯片10提取外泌体时，离心速度更低(将洗脱液和装载液进入对应定量腔和全血进入分离池的离心速度由4000rpm～7000rpm降至2500rpm～5500rpm；将血浆和装载液进入孵育池和洗脱液进入洗脱液一级腔的离心速度由原来3000rpm～5000rpm降至2000rpm～4500rpm；将洗脱液进入载体过滤池后进入目标池的离心速度由原来7000rpm～9000rpm降至2500rpm～6500rpm)，安全性更好。
100.具体实施例
101.以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
102.实施例1
103.本实施例采用的微流控芯片的结构如图1所示，其中，本实施例的微流控芯片的部分参数如下：装载液定量池(120μl)、洗脱液定量腔(200μl)。
104.连接通道的深度为500μm，连接通道的宽度为1500μm；台阶结构的高度为200μm，台阶结构的宽度为750μm。v形虹吸流道的宽度为360μm，v形虹吸流道的深度为300μm。
105.本实施例采用全血提取外泌体，具体步骤参数如表1所示。
106.表1
[0107][0108]
经测量，200μl洗脱液进行洗脱，目标物池中最后得到约190μl的外泌体收集液；对收集液进行nta(nanoparticle tracking analysis)追踪外泌体，如图9所示，平均粒径在93.7nm左右，外泌体浓度约为4.1e+6particles/ml。对收集液进行电子显微镜检测(sem)，结果如图10和图11所示。
[0109]
实施例2
[0110]
本实施例采用的微流控芯片的结构与实施例1大致相同，其不同在于，本实施例采用的微流控芯片的洗脱液定量池的容积为250μl，提取方法中的参数不同，本实施例的提取方法的参数如表2所示。
[0111]
表2
[0112]
[0113][0114]
经测量，250μl洗脱液进行洗脱，目标物池中最后得到约240μl的外泌体收集液；对收集液进行nta(nanoparticle tracking analysis)追踪外泌体，平均粒径在103.5nm左右，外泌体浓度约为4.0e+6particles/ml。
[0115]
实施例3
[0116]
本实施例采用的微流控芯片的结构与实施例1大致相同，其不同在于，本实施例采用的微流控芯片的洗脱液定量池的容积为250μl，提取方法中的参数不同，本实施例的提取方法的参数如表3所示。
[0117]
表3
[0118][0119]
经测量，250μl洗脱液进行洗脱，目标物池中最后得到约240μl的外泌体收集液；对样本溶液进行nta(nanoparticle tracking analysis)追踪外泌体，平均粒径在100.9nm左右，外泌体浓度约为3.7e+6particles/ml。
[0120]
对比例1
[0121]
采用超离提取血浆中的外泌体，具体步骤包括：
[0122]
1.取200μl血浆，加10mlpbs稀释后以220g，4℃离心t1＝10min，收集上清。
[0123]
2.将步骤1得到的上清以2000g，4℃离心t2＝20min，收集上清。
[0124]
3.将步骤2得到的上清以15000g，4℃离心t3＝30min，收集上清。
[0125]
4.将步骤3得到的上清以0.22μm针头滤器过滤除去直径220nm以上的颗粒。
[0126]
5.将步骤4得到的上清转移至超速离心管内，以120000g，4℃离心t4＝70min。
[0127]
6.弃上清，加入适量pbs(100μl)重悬外泌体沉淀，重复步骤5(t5＝70min)。
[0128]
7.弃上清，加入适量pbs(100μl)重悬外泌体沉淀后得到外泌体溶液。
[0129]
对比例收集的外泌体的测试结果如下：
[0130]
对收集液进行nta(nanoparticle tracking analysis)追踪外泌体，结果如图12所示，在粒径133.9nm左右，外泌体浓度约为2.3e+6particles/ml。收集液进行电子显微镜检测(sem)，结果如图13和图14所示。
[0131]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0132]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。