数字PCR液滴或单细胞液滴的生成装置及液滴生成管的制作方法

数字pcr液滴或单细胞液滴的生成装置及液滴生成管
技术领域
1.本实用新型属于液滴生成技术领域，具体涉及一种用于数字pcr液滴或单细胞液滴的生成装置，同时还涉及一种用于生成数字pcr液滴、单细胞液滴的液滴生成管。


背景技术：

2.聚合酶链式(pcr)反应技术是现代生物学最重要的工具之一，它广泛应用在医学诊断、个体化医疗、食品检验、转基因生物检测、病原体鉴定、免疫分析、法医科学等方面。而作为pcr技术的最新一代，基于微流控技术发展产生的数字pcr(dpcr)，具有比传统qpcr更小的反应体积、更快的反应速度、更低的系统噪声和更高的灵敏度。
3.微滴式数字pcr系统在传统的pcr扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经pcr扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。微滴技术让数字pcr更低成本，且更实用。
4.微滴式数字pcr系统通常包括生成装置、核酸扩增控温装置以及产物信号采集和分析装置。现有技术中，数字pcr生成装置通常采用微流控芯片技术或者微管道振动技术。不管哪种方式，对于装置的加工精度要求非常高，例如一些专利中所公开的，为了实现液滴较为均一的制备，要求微管道的壁厚、内径，以及插入液面的角度和深度都有严格要求，由此相应导致高的成本以及液滴制备时因为装置例如微管道精度、一致性差以及操控性差等不足带来的液滴生成均一性问题。


技术实现要素：

5.本实用新型所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种不仅液滴生成效果好且制造成本降低的数字pcr或单细胞液滴的生成装置及液滴生成管。
6.为达到上述目的，本实用新型采用的一种技术方案是：
7.一种数字pcr液滴或单细胞液滴的生成装置，其包括容积可变化的容纳腔、用于控制所述容纳腔容积使其呈周期性变化的控制机构、液滴生成管以及用于向所述容纳腔内通入驱动流体的驱动流体机构，其中液滴生成管包括锥形管部，锥形管部具有相对远离的第一端口和第二端口，第一端口的内径大于第二端口的内径，锥形管部的锥度为0.05~0.2，第一端口与容纳腔连通，第二端口为液滴出口，第二端口的内径为0.1毫米以上。
8.根据本实用新型的进一步优选方案，第二端口的内径不低于0.1毫米。优选地，第二端口的内径大于0.2毫米，具体优选为0.2毫米-1毫米。更优选地，第二端口的内径为0.3-0.6毫米。这是非常独特的，相比之下，现有技术中为了获得微液滴，微管道的出口内径总是在0.1毫米以下。该独特的特点给本实用新型方案带来了显著优势，一是，由于均一液滴的制备受微管道加工精度的影响减小，液滴均一可控性明显提高，二是，加工制造成本显著降低。该独特特点是由于本实用新型液滴生成原理与现有液滴生成原理截然不同带来的。基
于本实用新型的液滴生成原理，第二端口的内径不能低于0.1毫米，否则无法生成液滴，而超过0.2毫米是优选的，基本上，当第二端口的内径超过0.2毫米，则在一个相当宽泛的条件范围下均可以稳定获得均一的小体积液滴，特别是在0.3毫米-0.6毫米时，此时可适用的条件范围是最为宽泛的。
9.根据本实用新型，锥度是指锥形管部的第一端口的内径与第二端口的内径的差值与锥形管部的长度的比值。发明人发现，锥形管部的锥度的合理控制可以使得即使在较高的变化频率（例如振动频率）下，也能够获得稳定的液滴。因此，通过锥度的设计可以扩大装置适用的频率范围，满足更广泛的需求。
10.根据本实用新型的一些优选方面，锥形管部的锥度进一步优选为0.05~0.15。在一些具体实施方式中，所述锥形管部的锥度为小于0.12。
11.根据本实用新型，振动机构的类型例如可以是现有技术中已经使用的那些，本实用新型对此并无特别要求。但作为本实用新型优选的实施方式，在进行液滴生成时，可采用的振动频率为10hz-1khz；可采用的振动幅度为5微米-1000微米。进一步优选地，振动频率为50hz-600hz，进一步优选地，振动频率为80hz-600hz，更进一步优选地，振动频率为100hz-600hz，还进一步优选为150hz-600hz，更进一步优选为150hz-500hz，还进一步优选为150hz-300hz。在一些具体实施方式中，振动的频率为100-300hz。所述振动的幅度优选为5微米-600微米，更优选为5微米-300微米，进一步优选为5微米-100微米，更进一步为5微米-60微米。在一些实施方式中，振动的幅度为5微米-50微米，在另一些实施方式中，振动的幅度为20微米-60微米。
12.优选地，容纳腔为环形腔体，优选将容纳腔的内周侧壁设置为沿竖直方向延伸。而且还优选地，容纳腔的内壁表面为光滑表面。
13.优选地，液滴为数字pcr液滴或单细胞液滴。液滴的直径为50-250微米，优选为200微米以下，更优选为150微米以下，进一步优选为120微米以下，更进一步优选为110微米以下。
14.进一步地，所述液滴生成管的容积可以为10-200微升。实验表明，液滴生成管的容积对于液滴生成效果的影响较小，这也是本实用新型的优势之一。
15.根据本实用新型的一个具体实施和优选方面，周期性变化为压缩-恢复的往复变化，或者为膨胀-恢复的往复变化，或者为压缩-恢复-膨胀-恢复的往复变化。
16.根据本实用新型的一个具体实施和优选方面，所述的容纳腔的顶部或四周侧壁中的一个或者多个中设有活动部，所述驱动流体机构与所述活动部二者之间通过连接机构连接或者相接触，当驱动流体机构工作时其带动所述活动部向内或向外运动从而相应减小或增加所述容纳腔体积。
17.进一步地，所述活动部由弹性膜片组成；
18.优选地，所述的容纳腔的单侧壁上设有所述活动部。进一步优选地，该活动部设置在容纳腔的顶侧，构成所述容纳腔的顶壁。
19.根据本实用新型的一个具体方面，所述驱动流体机构包括泵和流体通路，所述液滴生成装置包括基体，基体提供柱形孔，柱形孔是上下均开口的圆柱形，在各柱形孔上覆设有膜片，柱形孔和所述膜片共同构成所述容纳腔，驱动流体机构与膜片通过连接件连接。该种结构设计下，驱动流体机构可以精准控制容纳腔的容积发生周期性变化，有助于提升液
0.6毫米。在一些具体实施方式中，所述锥形管部的锥度为小于0.12。
35.优选地，所述锥形管部的锥度为0.05~0.15；和/或，所述锥形管部的容积为10-200微升。优选地，锥形管部的内壁表面为光滑表面。
36.利用本实用新型装置生成液滴的一个示例性过程如下：
37.在一液滴接收器内放置第一液体（油相），将与第一液体不混溶的第二液体（待检测的水相）自第二端口吸取至所述液滴生成管中，之后再吸取一部分第一液体，接着，将液滴生成管插入到第一液体中，使液滴生成管的第二端口位于第一液体的液面之下（插入深度没有限制），最后启动驱动流体机构和流体驱动流体机构，控制容纳腔使其容积发生周期性变化的同时向容纳腔内注入驱动流体以驱动第二液体运动，这样，在液滴生成管内形成液滴，随后所形成的液滴经过液滴生成管的第二端口流出并进入到液滴接收器中。采用该装置进行液滴生成的方式是非常独特的，相比之下，现有技术中的液滴生成方法，总是在微管道之外才会形成液滴。
38.由于上述技术方案的运用，本实用新型与现有技术相比具有下列优点：
39.本实用新型提供的生成装置，基于全新的液滴生成原理，突破现有纳升量级液滴生成技术必须采用0.1毫米以下微管道的限制，用显著降低的成本即可实现小体积均一液滴的制备。在制备时，液滴生成管与液滴接收器二者之间保持相对静止即可，不需要如现有技术那样必须驱动液滴生成管使其往复振动。
40.本实用新型提供的生成装置和液滴生成管，结构简单，加工成本相比现有技术可以显著降低，适用于在各种工作频率下制备液滴。
附图说明
41.图1为实施例1中数字pcr液滴或单细胞液滴的生成装置的剖视示意图；
42.图2为图1中基体结构剖视示意图；
43.图3为图1中生成装置所形成液滴的显微镜图；
44.图4为图3中显微镜图的局部放大示意图；
45.图5实施例2中数字pcr液滴、单细胞液滴的液滴生成管的剖视示意图；
46.图6为显示了液滴生成管靠近出口处的速度场分布的示意图；
47.其中：1、液滴生成装置；10、基体；10a、下凹部位；10b、凸起边缘部位； 100、柱形孔；101、连接部；t、通道；11、液滴生成单元；110、容纳腔；111、控制机构；112、液滴生成管；a1、第一端口；a2、第二端口；c1、连接管部；c2、锥形管部；113、驱动流体机构；d1、泵；d2、流体通路；d21、竖直通路；d22、水平通路；d3、引流部；114、膜片；b1、主体部；b2、活动部；115、连接件；116、密封圈；
48.2、液滴接收器。
具体实施方式
49.在本实用新型的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本实用新型和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本实用新型的限制。此外，术语“第
一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
50.在本实用新型的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体的连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本实用新型中的具体含义。
51.现有技术中，用于生成微液滴的微管道普遍被认为较小是有利的，因此，实际采用的微管道的内径通常都在0.1毫米以下。同时，现有技术中微液滴的生成技术主要包括共流聚焦方式和微管道振动方式，对于共流聚焦方式而言，分散相液体被振动喷射到连续相中并被连续相包裹后，一起从喷射孔喷射出形成液滴，对于微管道振动方式而言，则需要微管道（加样管）本身做往复振动以产生液滴。
52.本实用新型的发明人在大量的实验研究中发现，仅仅是结合分散相振动和适当内径的微管道就实现了均一液滴的制备。基于此发现，发明人进一步对于其机理进行了研究，对影响液滴生成的关键影响因素进行了仿真结构分析，并通过进一步实验进行了验证。研究表明，本实用新型的液滴生成具有显著不同于现有技术的任一种液滴生成方式的全新生成原理，相比现有的液滴生成方式，该液滴生成方式可以在真正意义上实现非微流控尺度的结构（本实用新型披露的所有与生成过程相关的腔体和耗材的几何尺度都在0.1毫米尺度以上；一般来说0.1毫米为区分微流控的关键尺寸）生成纳升体积微滴。而现有技术中在数字pcr、单细胞分选等领域的微滴生成技术所实际能够真正使用的结构尺度都是小于或者接近纳升微滴的直径0.1毫米的。利用该液滴生成技术可以用远远大于纳米微滴尺寸的结构产生纳米级微滴，是实现微滴式数字pcr使用成本的核心技术突破。基于该液滴生成技术，甚至可以直接采用一般的移液枪头作为关键的生成耗材。该液滴生成技术，除了分散相的微运动外，无其他机械运动，我们将该技术定名为无振弹射技术（non-vibrational ejection）。本实用新型披露了一种通过液滴生成管道内的速度梯度造成分散相失稳而生成液滴的技术，实现了纳升精度的控制。
53.本实用新型的液滴生成原理描述如下：
54.驱动流体机构（例如振动机构）通过与活动部（例如弹性薄膜）的直接相连来推拉活动部或者通过与活动部的接触来触动活动部，使得活动部产生周期性振动，带动容纳腔体里面的液体（第二液体/分散相/水相）产生周期性运动，同时持续向腔体注入驱动流体（驱动油），则在液滴生成管出口（第二端口）的油水界面（第一液体与第二液体之间的界面），产生包括前推弹射与回抽运动的周期性运动。在前推弹射阶段，根据管状流体特性，由泊肃叶流动可知，管中间的流速会大于近壁面的流速（如图6所示，其中显示了液滴生成管出口的速度场分布，亮度表示速度大小，可见出口中心的速度为最大，这会拉伸油水界面），导致中间界面的移动速度，大于靠近壁面的界面的移动速度，从而导致油水界面形成锥形界面，界面不断被拉长，由于油水界面处的表面张力具有收缩趋势，将界面切断成液滴的趋势，当拉伸的界面逐渐细长，根据拉普拉斯方程可知，界面张力逐渐增大，超过一定临界值即可切断界面，发生瑞利泰勒不稳定性现象，形成液滴。这也是液滴生成管出口远远大于微滴直径(~0.1mm)时还可以生成的关键原因。后续的回抽运动会拉回锥形界面完成一个周期运动。另外一点需要指出的是，研究发现，液滴生成的确切位置在液滴生成管道内（在一些
具体的实验中，液滴在距离出口大约0.5mm处生成），与其他生成技术中液滴形成在管道出口外不同。这也体现了本实用新型技术的独特性。
55.本实用新型所基于的无振弹射技术，相比采用微管道在油性液体中不断高频振动的液滴生成方法来说，具有明显优势，一方面，对微管道伸入油相液体的深度无需严格的要求，并且不会对已经生成的液滴产生破坏，整体生成过程中液滴的品质和生成的操作均更加可控；另一方面，现有技术中对于微管道内径的要求均在0.1毫米以内，内径越大，要求施加的高频摆动频率越高，控制要求高，稳定性较差，同时对于微管道本身制造时一致性的要求也越高，本实用新型通过对水相液体施加振动，实现液滴的生成，对于微管道的液体进出口内径的要求降低（可以大于0.1毫米，优选大于0.2毫米，更优选0.3毫米以上），既可以保证液滴均一、控制也更加容易，显著降低了加样管加工难度和降低了加工成本。而相比共流聚焦方式来说，本实用新型在实现液滴生成的均一性和稳定性的前提下，系统的结构可以大大简化，结构更加简单、操作更加方便，成本显著降低。
56.下面将结合附图对本实用新型的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。
57.实施例1
58.如图1所示，数字pcr液滴或单细胞液滴的液滴生成装置1，可结合液滴接收器2来生成液滴。
59.液滴生成装置1包括基体10、设置在基体10上的液滴生成单元11，其中液滴生成单元11可以是单个，也可以是多个，且多个并排设置在基体10上，这样一来，所形成的液滴生成装置1可以实现单路或多路同时生成液滴。
60.结合图2所示，基体10为铝块且呈长条形，同时自表面向下凹陷形成下凹部位10a和凸起边缘部位10b，当有多个液滴生成单元11时，多个液滴生成单元11沿着基体10的长度方向并排且均匀间隔分布。
61.基体10的下凹部位10a上开设有上下延伸的柱形孔100、在每个柱形孔100的下方对应设有连接部101。
62.液滴生成单元11具体包括容积可变化的容纳腔110、用于控制容纳腔110容积使其呈周期性变化的控制机构111、具有相对远离的第一端口a1和第二端口a2的液滴生成管112、用于向容纳腔110内通入驱动流体的驱动流体机构113。
63.本例中，在柱形孔100上覆设有膜片114，柱形孔100和对应的膜片114共同形成容纳腔110。控制机构111为振动机构，其安装在柱形孔100上方且通过连接件115与膜片114连接，从而控制膜片114的运动实施容纳腔110的容积变化。液滴生成管112竖直设置，其中上端部与连接部101连通，下端部形成液滴出口。驱动流体机构113设置在柱形孔100所靠近的凸起边缘部位10b上。
64.容纳腔110的中心线、液滴生成管112的轴心线、第一端口a1的中心线、第二端口a2的中心线重合，且均沿着竖直方向延伸。容纳腔110为环形腔体，内径约5毫米，且内周侧壁沿竖直方向延伸。构成容纳腔110的顶部的膜片114（不锈钢材质）分别包括主体部b1和活动部b2，其中主体部b1与基体10相固定连接，活动部b2位于柱形孔100的正上方，且活动部b2
通过连接件115连接于控制机构111。控制机构111具体包括压电陶瓷，其可提供上下往复振动，当其往复振动时，会带动活动部b2相对于容纳腔110向内或向外运动，从而相应周期性地改变容纳腔110的容积，相应地，位于容纳腔110内的液体则因该周期性地体积改变而扰动。进一步地，周期性变化可以为压缩-恢复的往复变化，或者为膨胀-恢复的往复变化，或者为压缩-恢复-膨胀-恢复的往复变化。在本例中，至少可以提供的周期性变化包括压缩-恢复的往复变化。进一步的压电陶瓷为40vs12（具有与连接件115相对接的内螺纹）。
65.液滴生成管112包括连接管部c1和锥形管部c2。锥形管部c2具有第一端口a1和第二端口a2。锥形管部c2的内径自第一端口a1向着第二端口a2逐渐减小，该内径的变化呈现的锥度对于液滴的生成效果有重要的影响。设第一端口a1的内径为r1，第二端口a的内径为r2，第一端口a1和第二端口a2之间的距离（即锥形管部的长度c1）为l，锥度为r1-r2/l。则本例中，采用的锥形管部c2的锥度为0.12，第二端口a2的内径r2为0.5
±
0.1mm。液滴生成管112的容积为10微升左右。
66.连接管部c1与锥形管部c2在第一端口a1处相交，其用于可拆卸地套接在连接部101上上，其锥度没有特别要求，但优选大于锥形管部c2的锥度。其中连接部101的中部形成有与容纳腔110相连通的流道t。在将液滴生成管112安装于连接部101上后，容纳腔110通过流道t与液滴生成管112连通。
67.驱动流体机构113包括泵d1和流体通路d2，其中流体通路d2包括在基体10的左凸起边缘部位10b上形成的竖直通路d21和将该竖直通路d21与柱形孔100对应连通的水平通路d22。为了有助于排出系统腔体内的气泡，在水平通路d22的端口与容纳腔110的内周侧壁之间形成引流部d3，以使来自水平通路d2的液体以正切于容纳腔110的周向进入容纳腔110，如此，流体便在容纳腔110及液滴生成管112内形成沿容纳腔110及液滴生成管112的周向转动的涡流，由此可以容易地排走气泡。在另外一些实施例中，引流部的设置不是必需的，只要是能够使流体从流体通路d22排出的方向偏离容纳腔的轴心线，都可以较好地实现排泡的效果。
68.本例中，分别采用容积大小不同的两个柱塞泵来控制驱动流体，结合三通阀来进行切换控制，其中体积较大的柱塞泵用来在清洗和/或排泡的步骤中使用，体积较小的柱塞泵用于在形成液滴的步骤中使用。
69.本例中，还在膜片114与基体10之间设置有密封圈116以提高容纳腔110的密封性。
70.综上，本实施的数字pcr液滴或单细胞液滴的生成装置，实施过程如下：
71.s1、采用体积较大的泵（柱塞泵）将流体（动力油）充满流体通路、容纳腔及液滴生成管的内腔，接着将待测水相经过第二端口吸入液滴生成管内，然后再吸入一段配方油，这样，液滴生成管内的液体就包括了三段结构，自上而下依次为动力油段、水相段、配方油段；
72.s2、将液滴生成管插入到配方油中，使液滴生成管的第二端口位于配方油液面下方2mm左右；
73.s3、在压电陶瓷的振动驱动下，带动膜片的活动部同步上下往复振动，控制容纳腔使其容积发生周期性变化，以及向流体通路内注入驱动油以驱动水相运动，随后所形成的液滴经过液滴生成的第二端口流出并进入到液滴接收器中，完成液滴生成过程，此过程中无需驱动液滴生成管运动，液滴生成管与液滴接收器二者之间保持相对静止。
74.本例中，按上述步骤，在流体的注入速度为36.5微升/分钟，压电陶瓷的振动频率
150hz，振动幅度50微米，输入电压2.5v，采pcr 试剂（伯乐supermix 10ul+伯乐demo kit dna 1ul+ fam探针1ul + hex探针1ul +水7ul）作为水相，所制备的液滴如图2、图3所示，其中可见，成功制备了非常均一大小的液滴，且液滴的直径在104.00微米~107.00微米之间。
75.实施例2
76.如图5所示，本实施例涉及的数字pcr液滴、单细胞液滴的液滴生成管，其结构与实施例1中所涉及的液滴生成管112基本相同，不同的是，其中液滴生成管的第一端口a1至第二端口a2的长度为2l，其他尺寸不变，因而液滴生成管112的锥形管部c2所对应的锥度为0.06。
77.同时，采用本实施例的液滴生成管替换实施例1中的液滴生成管112，在不同振动频率下进行了实验，结果表明，在压电陶瓷的振动频率为600hz时，能够得到均一的液滴，液滴的均一性和稳定性优于实施例1同等频率下的效果，而与实施例1在150hz下制备液滴的效果相当。
78.综上所述，本实用新型涉及的液滴生成装置，相比现有技术具有多方面优势，包括但不限于以下方面：
79.1、通过简单的结构即可形成均一微量的液滴，具有可重复连续制备等技术优势，在临床诊断、基因表达分析、微生物检测等场合中均能够应用，具有很好的实用性；
80.2、液滴在液滴生成管内即生成，在装置既定的情况下，液滴的生成效果主要受振动频率影响，对液滴生成管内径的微小变化、对于液滴生成管插入油相界面以下的位置、对于油相的配方组成等等均不敏感，因此，液滴生成的一致性和可控性得到显著提升；
81.3、装置本身内设排泡结构和功能，在清洗的同时有效实现排泡，避免由于气泡存在对于液滴生成产生干扰；
82.4、对液滴生成管的内径控制要求显著下降，相应地可以明显降低成本，因此，液滴生成管可作为耗材，防止所生成样品间的相互污染，可以采用一次性液滴生成管；
83.5、所制备的液滴直接保存在液滴接收器中，无需进行转移，制备完的液滴可以直接进行pcr扩增以及分析，实现液滴生成、分析的一体化；
84.6、上述应用可将样本分割成大小均一的微量微液滴进行检测，具有检测结果特异性高、灵敏度高、精准度高等优势；同时还可以通过对单个微液滴的检测更利于在微观层面对样本进行分析研究。
85.上述实施例只为说明本实用新型的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本实用新型的内容并加以实施，并不能以此限制本实用新型的保护范围，凡根据本实用新型精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本实用新型的保护范围内。