凝胶模式化的表面的制作方法
【专利说明】凝胶模式化的表面
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请要求2013年2月26日提交的美国临时申请号61/769, 289和2013年3月 6日提交的美国申请号13/787, 396的权益。以上申请的每一个在此通过引用以其整体被并 入。
[0003] 置量
[0004] 本公开内容一般涉及固相分析化学并且对用于高通量基因组分析的核酸阵列具 有特定的适用性。
[0005] 将人类遗传变异编目和将此变异与对疾病的敏感性相关联的任务坚持从基因组 广泛测序方法学的发展中获益。此编目尝试为鉴定每一个人的基因组中的标志物带来希 望，其将有助于医学专业人士确定该人对疾病的敏感性、对例如处方药物的特定治疗的响 应性、对危险药物副作用的敏感性和其他医学上可操作的特征。编目尝试正在顺利进行中。 这很大程度上是由于商业上可得的基因组测序方法学，该方法学是足够具有成本有效的以 允许在研宄环境中测试被评价的受试者。需要测序方法学的改进以加速编目尝试。此外， 测序的相对高成本阻止了技术超越研宄中心并进入诊所，其中医生可以获得一般人群中患 者的序列。
[0006] 测序方法学和用于实施其的系统利用复杂的技术集合。这些技术的一些中的改进 已经显示提供大幅度成本降低。然而，难以预测哪些（如果有的话）对成本降低改进负有 责任。考虑到测序系统中的技术之间的依赖性，甚至更加难以预测哪些可以被修改而对方 法学或系统的整体性能没有不利影响。因此，对鉴定可以给诊所带来基因组研宄的希望的 改进存在需要，在诊所中生命可以被改善并且在许多情况下被拯救。本发明满足这种需要 并且也提供相关优势。
[0007]
[0008] 本公开内容提供了一种阵列，所述阵列包括具有表面的固体支撑体，所述表面具 有多个孔，所述孔含有凝胶材料，所述孔被所述表面上的空隙区彼此分开，所述空隙区将 所述孔的每一个中的凝胶材料与其他多个孔中的凝胶材料分离；和所述凝胶材料中的靶 标核酸的文库，其中所述孔的每一个中的凝胶材料包含所述文库的靶标核酸的单一物质 (species)〇
[0009] 在一些实施方案中，基底被配置为孔的阵列并且分析物是核酸。相应地，本公开内 容提供了一种阵列，所述阵列包括具有表面的固体支撑体，所述表面具有多个孔，所述孔含 有凝胶材料，所述孔被所述表面上的空隙区彼此分开，所述空隙区将所述孔的每一个中的 凝胶材料与其他多个孔中的凝胶材料分离；和所述凝胶材料中的靶标核酸的文库，其中所 述孔的每一个中的凝胶材料包含所述文库的靶标核酸的单一物质。
[0010] 本公开内容还提供了制备基底的方法。所述方法可包括以下步骤：(a)提供具有 平面表面的固体支撑体，其中所述平面表面被一个或更多个凹特征中断并且其中所述平面 表面上的一个或更多个空隙区形成所述一个或更多个凹特征的边界；(b)用凝胶材料包被 至少一部分固体支撑体，其中所述部分包括至少一个凹特征和至少一个空隙区；以及（C) 抛光所述平面表面以从所述至少一个空隙区移除所述凝胶材料并且维持所述凝胶材料在 至少一个凹特征中。
[0011] -种制备阵列的方法，所述方法可包括以下步骤：(a)提供具有表面的固体支撑 体，所述表面具有多个孔，所述孔含有凝胶材料，所述孔被所述表面上的空隙区彼此分开， 所述空隙区将所述孔的每一个中的凝胶材料与其他多个孔中的凝胶材料分离；(b)将靶标 核酸的文库递送至所述固体支撑体的孔以产生具有附接至每一个孔中的凝胶材料的靶标 核酸的单一物质的孔的阵列，其中所述阵列中的不同的孔具有来自所述文库的不同靶标核 酸物质；以及（c)扩增附接至所述阵列的孔中的凝胶材料的所述靶标核酸以在所述阵列的 孔的每一个处产生个体靶标核酸的克隆群体。
[0012] 本公开内容还提供了检测分析物的方法。所述方法可包括以下步骤：(a)提供具 有平面表面的固体支撑体，其中所述平面表面被一个或更多个凹特征中断，其中所述凹特 征包含凝胶材料，其中所述平面表面上的一个或更多个空隙区形成所述一个或更多个凹特 征的边界，所述空隙区基本上没有所述凝胶材料，并且其中所述凝胶材料被附接至或包含 靶标分析物；(b)在其中所述靶标分析物与探针特异性相互作用的条件下将所述固体支撑 体与所述探针接触；以及（c)检测所述固体支撑体以区分与一个或更多个探针相互作用的 所述靶标分析物的至少一个子集。
[0013] 在特定的实施方案中，核酸是被检测的分析物并且凹特征是孔。例如检测核酸的 方法可包括以下步骤：(a)提供具有表面的固体支撑体和核酸的文库，所述表面具有多个 孔，所述孔含有凝胶材料，所述孔被所述表面上的空隙区彼此分开，所述空隙区将所述孔的 每一个中的凝胶材料与其他多个孔中的凝胶材料分离，所述文库的靶标核酸的单一物质被 附接至所述孔的每一个中的凝胶材料；(b)将所述固体支撑体与结合至所述靶标核酸的至 少一种探针接触；以及（c)检测所述固体支撑体以区分具有结合至所述至少一种探针的靶 标核酸物质的孔。
[0014] 本公开内容的组合物、设备和方法在本文就凝胶材料而言被示例。将被理解的是， 凝胶材料是示例性的并且可以用其他有机材料来替代，所述其他有机材料包括，例如可以 形成表面包被并且可以不必然被认为是凝胶自身的聚合物。本文列出的用于向表面应用凝 胶材料、从空隙区移除凝胶材料、将分析物附接至凝胶材料、在分析或制备方法中使用获得 的阵列等的方法可以通过用非凝胶材料替代凝胶材料容易地修改。
[0015] 附图简沐
[0016] 图1显示了用于制备和使用DNA特征的模式化的阵列的方法的图解表示，其中每 一个特征是具有被附接至DNA簇的凝胶材料的孔并且阵列在测序技术中被使用。
[0017] 图2显示了来自被修改为具有凝胶材料而不是珠在孔中的BeadChip基底的图像。 图A :抛光之前获得的明视野图像。图B-C :抛光之后和杂交至荧光标记的寡核苷酸之后获 得的荧光图像。
[0018] 图3显示图A中：利用光刻术和Cr硬掩膜与反应性离子蚀刻一起以制造基底中的 凹特征的图解过程流；图B中，玻璃基底中的孔和基准（fiducial)部分的示例SEM图像；以 及图C中，薄片（wafer)的图像、包括基准和孔的阵列的薄片的部分的图像、以及来自包括 孔的阵列的部分的图像。
[0019] 图4显示了纳米孔基底的高分辨率荧光显微镜图像，显示了基底用PAZAM包被并 且用硅珠浆料抛光之后纳米孔基底上的模式化的凝胶特征。PAZAM用染料标记用于可视化 目的。
[0020] 图5显示了从具有模式化的簇的1. 5 μπι孔距纳米孔基底的HiSeq测序循环获得 的多色图像融合。图A :显示含有凝胶的孔中模式化的簇以及四个靶眼（bulls-eye)基准 的视野的图像。图B :显示单个靶眼基准中颜色的混合（由于扩增子的混合的群体）的更 高分辨率图像。
[0021] 图6显示了图A中：用750nm孔距纳米孔基底运行的Hiseq测序中模式化的簇的 多色融合；图B :显示阵列被排序并且簇正通过质量滤器的最邻近曲线（nearest neighbor curve);以及图C :测序质量度量，显示以1，600, 000簇/mm2的密度，成功通过质量滤器。
[0022] 图7显示了克隆分数（Fraction clonal)对占据的分数（Fraction occupied)的 图，具有针对泊松分布预计的曲线、针对理想克隆性和占据预计的直线、以及X代表从用具 有含有凝胶的纳米孔的模式的基底的测序运行获得的平均量度。
[0023] 详沭
[0024] 本公开内容提供了结构化的基底（structured substrate)、用于制备结构化的基 底的方法和用于使用结构化的基底的方法。在特定的实施方案中，基底包括固体支撑体，所 述固体支撑体具有含有凝胶材料（例如被凝胶材料包被）的凹区例如孔。凝胶材料可以转 而被附接至感兴趣的分析物，例如核酸。在特定的实施方案中，含有凝胶的区是离散的，被 缺少附接感兴趣的分析物的能力的空隙区分开。例如，空隙区可以缺少凝胶材料。可选地， 空隙区中的凝胶材料可被灭活或以其他方式被修饰以缺少凹区中凝胶材料的活性或特征， 例如支持分析物附接的能力。当在分析物上进行反应和/或检测分析物时，所得凝胶区的 分离提供优势。示例性优势可以在分布在含有凝胶的孔中的靶标核酸的阵列的实例中来展 示。这里，扩增反应可以使用核酸作为模板在结构化的基底上来实施以形成在凝胶中或凝 胶上生长的核酸集群（colony)(例如阵列的核酸特征）。空隙区功能为限制用于集群生长 的区域。由于由含有凝胶的孔创建的离散模式，所得阵列的个体特征可以相对容易地区分。 相比于核酸的随机阵列，模式还可以提供提高特征的密度和降低用于图像配准的处理要求 的益处。
[0025] 用于制备模式化的核酸阵列的示例性过程显示在图1中。孔模式化的基底的侧 面图被图解显示。孔具有1.5 μπι的孔距（中心距）并且在该实例中每一个孔的直径是 0.5 μπι。孔模式化的基底可以用凝胶材料来包被使得材料进入孔并且包被空隙区。所得凝 胶包被的基底可以被抛光以从空隙区移除凝胶材料，将凝胶材料留在孔中，从而形成凝胶 模式化的基底。凝胶可以具有支持捕获DNA模板和扩增模板的功能。例如，在表面包被之 前、表面包被之后和抛光之前或抛光之后，凝胶可以用寡核苷酸引物来接枝。引物可以具有 捕获DNA模板和使用捕获的模板引发扩增的功能。所得DNA模式化的基底可以被例如在测 序技术中分析。
[0026] 模式化的含有凝胶的孔中的核酸阵列提供用于DNA测序的多种优势。相比随机阵 列（即，具有随机的特征模式的阵列）的优势的实例包括提高的特征堆积的密度、增强的使 用浓度不依赖的模板接种的特征密度的控制和调整、减少的用于图像配准的处理需求和提 高的信号提取的容易性。另外的优势可以源于由每一个特征提供的核酸群体的空间限定。 本公开内容的模式化的阵列的特征可以具有限制其中核酸集群将会生长（例如，经由簇扩 增）的面积或体积的功能。缺乏面积或体积限制时，由于影响相对扩增速率的其序列中鸟 嘌呤和胞嘧啶的百分含量（即，GC含量）的差异，一些核酸集群可以扩增至比其他的更大 尺寸。对于本文列出的方法和组合物，个体特征的体积或面积可以被选择以阻止或最小化 核酸集群尺寸的差异，所述核酸集群尺寸的差异否则由于被扩增的模板物质之间的GC含 量不同，会从扩增反应发生。例如，特征的体积或面积可以是足够小以完成最快生长集群的 生长同时允许较慢生长的集群在完成扩增反应后有效填充特征。
[0027] 在特定的实施方案中，本公开内容提供了玻璃、硅、塑料或其他合适的固体支撑体 上的具有模式化的、共价连接的凝胶例如聚（N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基）丙烯酰胺共丙烯 酰胺）（PAZAM，参见，例如美国临时专利申请序列号61/753, 833,其通过引用并入本文）的 孔（例如微米孔和纳米孔）的制备。该过程创建了用于测序的凝胶垫（gel pad)，其经过运 行大量循环的测序可以是稳定的。将聚合物共价连接至孔对在多种使用过程中结构化的基 底的整个寿命期间维持凝胶在结构化的特征中是有益的。然而，在许多实施方案中，凝胶不 需要被共价连接至孔。例如，在一些条件下，无硅烷丙稀酰胺（silane free acrylamide) (SFA，参见，例如美国专利申请公布号2011/00598651 A1，其通过引用并入本文）可以被用 作凝胶材料，所述无硅烷丙烯酰胺未共价附接至结构化的基底的任何部分。
[0028] 在特定的实施方案中，结构化的基底可以通过以下来制备：用孔（例如微米孔或 纳米孔）模式化固体支撑材料、用凝胶材料（例如，PAZAM、SFA或其化学改性的变体例如 SFA的叠氮化变体（叠氮SFA))包被模式化的支撑体以及抛光凝胶包被的支撑体，所述抛光 例如经由化学或机械抛光，从而将凝胶保留在孔中但是从结构化的基底的表面上、孔之间 的空隙区基本上移除或灭活所有凝胶。引物核酸可以被附接至凝胶材料。然后，靶标核酸 (例如片段化的人类基因组）的溶液可以与抛光的基底接触使得个体靶标核酸将经由与附 接至凝胶材料的引物的相互作用接种个体孔；然而，由于凝胶材料的缺乏或失活，靶标核酸 将不会占据空隙区。靶标核酸的扩增将会被限制于孔，因为空隙区凝胶的缺乏或失活阻止 生长中的核酸集群向外迀移。该过程是方便可制造的，是可扩展的（scalable)并且利用传 统的微米或纳米制备方法。
[0029] 在特定的实施方案中，基准标志物（fiducial marker)被包括在结构化的基底上 以辅助识别和定位个体特征（例如，孔或其他含有凝胶的凹特征）。基准标志物对于具有 空间有序的特征模式的结构化的基底是特别有用的，因为基准标志物提供用于其他特征的 相对位置的参照点。基准标志物也可以被用于配准随机阵列的图像，但是固有的无序的簇 可以被替代使用，例如如在商业测序平台上产生的随机阵列使用的，所述商业测序平台例 如来自 Illuminate，Inc. (San Diego，CA)的 HiSeq、Genome Analyzer 或 MiSeq 平台。基 准标志物对于其中结构化的基底被重复检测以追踪随时间推移在个体特征处发生的变化 的应用是尤其有益的。基准标志物允许通过经多重测序循环获得的连续图像追踪个体核酸 簇，使得个体簇的序列可以被分开地确定。
[0030] 本公开内容提供了具有凹区和空隙区的模式的基准标志物。用于基准标志物的示 例性设计是一组具有两种或更多种以下的交替模式的同心圆：凹环、空隙环和孔的环或其 他凹特征（例如"靶眼"）。在一些实施方案中，基准标志物的凹区含有凝胶材料，而空隙区 则不含。凝胶在表面上的此不同定位可以使用本文列出的凝胶包被和抛光方法来实现。通 常使用可以区分含有凝胶的区和空隙区的检测方法。在一些情况中，该区分可以基于凝胶 区中特定分析物的存在，所述特定分析物不存在于空隙区。例如，在核酸阵列的情况中，基 准标志物的含有凝胶的区可以含有经由被用于标记阵列上靶标核酸的相同方法被标记的 核酸。因此，基准标志物可以使用用于制造分析物特征的相同方法来方便地制造。相应地， 如果需要，基准标志物和分析物特征可以通过一个或更多个步骤同时制造。可以被用于本 文中列出的结构化的基底和方法中的另一种有用的基准标志物是具有亚区的基准标志物， 其中在一个亚区中孔（或其他凹特征）的模式相对于另一个亚区中的模式被旋转。这样的 基准栅格可以被配置并用于图像配准，如美国序列号13/267,565中列出的，其通过引用并 入本文。
[0031] 作为另外的实例，珠可以被用作基准。珠可包括标记物例如，荧光团。在这种情况 中，表面可以具有至少两种类型的孔（或其他凹特征）。相对大的孔可以容纳一个或更多个 基准珠，而较小的孔，太小不含珠，仅具有凝胶材料。因此，较小的孔具有作为用于分析的分 析特征的功能并且较大的、填充珠的孔具有作为基准的功能。作为孔的替代物，基准特征可 以是通道，例如存在于以上示例的靶眼装置中的那些，并且通道可以具有容纳珠的尺寸。如 此，若干珠可以被置于通道中以创建基准，例如以一串珠的外观形状。
[0032] 模式化的阵列，用于其制造的方法和用于其使用的方法在本文就被用于附接感兴 趣的分析物的凝胶材料而言被示例。将要理解的是，凝胶材料是示例性的并且可以用其他 有机材料来替代，所述其他有机材料可以被用以介导分析物至表面上特征的定位。这样的 有机材料包括例如，可以形成表面包被并且可以不必需被认为是凝胶自身的聚合物。特定 的实例是由ATRP(原子转移自由基聚合）或表面引发的聚合过程形成的聚合物。本文列出 的用于向表面应用凝胶材料、从空隙区移除凝胶材料、在分析或制备方法中使用获得的阵 列等方法可以容易地被调整用于使用非凝胶材料。
[0033] 除非另外指定，本文使用的术语将被理解为采用其在相关领域中的普通含