专利名称：用于选择和/或处理粒子、特别是细胞的方法
技术领域：
本发明涉及用于选择和/或处理粒子，特别是由细胞组成的或包括细胞 或细胞物质的粒子的方法，并获得其主要在实现具有单细胞上的拆分的方 案中的应用。通过细胞"处理"，在这里和下文中，应该理解为意指可以 对单粒子或细胞、或它们的组进行的任何类型的操作。
现有技术
授予G. Medoro的PCT/WO 00/69565专利描述了通过利用封闭介电泳 电位(dielectrophoreticpotential)栅格(cages)和集成传感器，若有的话， 对粒子进行操纵和检测/识别的装置和方法。所述方法教导在两维空间中如 何控制独立于所有其它粒子的每一粒子。用来捕获流体介质中的悬浮粒子 的力是负的介电泳。通过对与集成在相同衬底中的电极阵列和传感器的每 一元件关联的存储元件和电路的编程，实现对操纵操作的单独控制。该装 置容许分离细胞，但需要使这些细胞向着第二微室移动，与第一个细胞流 动地分离。而且，没有预见到用于转化细胞的方法。
Becker等的美国6,294,063专利描述了一种方法和装置，其通过可编 程的力的分配来操纵固态、液态或气态生物材料的包装(packages)。该专 利也提及传感器的使用。在该情形中，细胞的分离也仅通过物理地移动细 胞经过整个装置发生。
操纵粒子的又一种力是由电流体动力学(EHD)流产生的粘滞摩擦力， 例如电热流(ETF)或AC电渗透。在NG. Green, A. Ramos和H. Morgan,物 理学杂志D:应用物理学(J.Phys.D: Appl.Phys.) 33(2000)中，EHD用来 移动粒子。例如PCTWO 2004/071668 Al公开了一种通过利用所谓的电流 体动力学流将粒子浓縮在一些电极上的装置。
在Medoro等的意大利专利申请BO2005A000481中，报告了一些用电
6极阵列操纵粒子的方法，以及一些检测它们的方法和装置。此外，在国际
专利申请号PCT/IT02/00524中描述了一种方法，其中，通过使第一生物实 体与第二生物实体(例如，含有DNA的脂质体、或微球体)相接触，而 转化第一生物实体，其中，将第一生物实体固定在第一电极阵列所限定的 表面上，所述电极是至少部分选择地可激活的和可寻址的，朝向至少一个 第二电极安置，并且与借助于介电泳栅格移动的第二生物实体接触。
相同申请人名下的PCT IB 2006000636专利申请涉及利用非均匀时变 力场和集成光学或阻抗计传感器(impedance meter sensor)对粒子进行表 征和/或计数的方法和装置。力场可以是正的或负的介电泳、电泳或电流体 动力学运动，其特征在于粒子(固态、液态或气态)的一组稳定平衡点； 通过利用己知为电介质上的电润湿的效应，同样的方法可适用于操纵小滴 (液态粒子)，其目的是对存在于样本中的每一粒子的位置起控制作用， 以便以确定性和统计学方法使这些粒子移动，以集成光学或阻抗计传感器 检测它们的存在，和/或表征它们的类型，从而以有效的方法对它们进行计 数和操纵。
在相同申请人名下的2006年3月27日的意大利申请号 TO2006A000226中，描述了用于处理(例如洗涤、培养、等)粒子的方法 和装置，其中，在层流方案中，将第一流体中悬浮的粒子引入到至少一个 第一微室或该微室的第一区域中，其中通过不与第一流体相混合的方式， 在层流方案中，将第二流体引入到微室的至少一个第二区域或第二微室 中，并且其中在该微室中激活至少一个作用于粒子的力场(F)，从而引起 粒子仅在预定的方向上移动，并转移第二流体中的悬浮中的该粒子；优选 使用的装置包括以沿着一个方向彼此顺次排列的至少三个微室，并且每个 微室均通过两个与微室序列方向垂直的方向彼此错开的开口，与它前面和 后面紧挨着的微室相连。
近期，在文章"单细胞电穿孔芯片(A single cell electroporation chip)， 芯片上的实验室(Lab on a Chip), 2005， 5 (1), 38 — 43， Michelle Khine， Adrian Lau， Cristian Ionescu-Zanetti， Jeonggi Seo禾口 Luke P. Lee，，中，描述 了如何通过在单细胞上进行的电穿孔增加细胞膜的渗透性；通过这种方 法，可以将以别的方式不能渗透过原生质膜的极性物质(诸如染料、药物、DNA、蛋白质、肽和氨基酸)引入到细胞中。
文章"用于高效的单细胞遗传操纵流经微-电穿孔芯片(Flow-through micro-electroporation chip for high efficiency single-cell genetic manipulation),传感器和执行器A:物理的(Sensors and Actuators A: Physical),巻104，刊3， 2003年5月15日，Yong Huang, Boris Rubinsky"
具体描述了单细胞的遗传操纵，这在诸如生物学和生物工艺学中非常令人 感兴趣，所述细胞是通过利用微-流体通道精确操纵单细胞的电穿孔芯片获 得的；如已知地，电穿孔是使用强电场诱导细胞膜中结构重排的工艺；由 于当跨膜电位超过膜的电介质穿孔电压(0.2-1.5￥)时，穿膜形成孔，这容许
外部物质渗入膜并到达其中包含的细胞质。
单细胞的电穿孔是令人感兴趣的技术，还因为它容许逐个细胞地研究 发生在细胞群中的变化，并还研究细胞内化学，例如，通过为单细胞提供 特异性表型而激活或阻断特异的和单一蛋白质的表达。因此，利用基于使 用装备在芯片上的阵列的工艺，可以实现HTS检验(高通量筛选)的装 置，其与DNA和蛋白质的表达以及指向特异性细胞靶标(例如受体)的 化学化合物(例如药物)均相关。
而且，单细胞电穿孔相对于通常使用的"大量"电穿孔方案而言，是 有利的技术，所述"大量"电穿孔方案需要非常高的电压(>103 V)，并不 容许有效地控制单细胞渗透性，因此，例如，很难重新关闭预先张开的孔。
迄今为了获得单细胞电穿孔而作出的努力包括使用由碳纤维制成的微 电极(Lundqvist等，1998)和其它技术诸如充满电解质的毛细管、微吸移 管和显微加工芯片。
显微加工的芯片对分离单细胞和集中电场均是理想的。
最后，文章"利用介电泳力控制细胞破裂"("Controlling cell destruction using dielectrophoretic forces")， A. Menachery禾卩R. Pethig, IEE 学报-纳米生物技术(IEE Proc.-Nanobiotechnol.)，巻152,第4期，2005年 8月，报告了对齿形或多项式电极中不同类型的细胞进行的细胞溶解研究， 并且提出了混合物中存在的不同类型细胞的溶解和区别性电穿孔(选择这 样的频率和幅度，以使得进行一种类型的溶解或电穿孔，但保存另一种)。
然而，由于电极比细胞大得多，所以没有提议使用该方法，且在独立于其类型的条件下，可能不可以使用该方法选择性破坏/电穿孔单细胞。事 实上，由于关于相对大的电极(和因此对它们起作用的场的强度)的位置 显著变化，所以该方法不能以均匀方式作用于不同的细胞。
优选地，利用处于跨越频率(超过该频率细胞从负的(nDEP)到达正 的(pDEP)介电泳)之间包括的频率范围中的，和低于这样的频率的场诱 导溶解，超过所述频率，膜电位会由于超过膜松弛常数而削弱。
其它近期出版物文献，诸如WO2005/075656和US2005/0070018A1涉 及基于微电极阵歹lj(array)或阵列(matrix)的使用而电穿孔单细胞的装置，在 所述装置上贴壁培养细胞(按照国际专利申请)或装备用于连接待电穿孔 的细胞和电极的导电微丝和用于移动细胞的微流体通道。该装置不提供以 确定的方式组织细胞的可能性，并且细胞相对于电极的位置引起偶然性。 因此，它们在电穿孔时受到的电场引起相当的改变，这样施加的刺激有时 是统计学过量的(引起细胞死亡)，或不足量的，这引起细胞电穿孔的缺 乏。电穿孔过程中的成功百分比则导致次最优的和较低的效率。
发明概述
本发明的目的是提供用于对包含粒子典型地是细胞的流体样品进行操 作的方法，用于进行一个或多个细胞的转化的方法，所述方法没有关于现 有技术所述的局限性和/或缺陷。
具体地，本发明的目的是在样品中存在的每个粒子的位置控制上起作
用，目的是以确定的方式移动所述粒子，从而以选择性方式对每个细胞进 行操作和/或以更有效的方式进行操作，诸如电穿孔。
在此和以下，复数的"粒子"或单数的"粒子"术语意指天然的或人 造的微米或纳米实体，如细胞、亚细胞组分、病毒、脂质体、泡囊(niosomes)、 微球体。有时，将使用术语细胞，但除非另有说明，其应该意指以上述最 广义的方式用于检测和表征粒子的非限制性示例。
因此本发明涉及权利要求1指定的方法。
具体地，利用非均匀、时变力场和集成光学传感器。力场可以是正的 或负的介电泳、电泳或电流体动力学运动，其特征在于关于粒子(固体、 液体或气体的)的一组稳定平衡点。这样，现有技术的局限性可通过本发明予以克服。
按照本发明的方法的实现容许以有效和选择性方式，例如通过引入外 源遗传物质转化细胞。此外，还容许也从以低百分比存在的污染物精确地 纯化细胞样品，所述细胞可能是转化的。最后，容许从多相样品中快速分 离一些目的细胞。通过采用单一技术的全部基于相同的微电极阵列，所述 微电极用于在结合电极阵列的微室内移动细胞并引起其电穿孔。
本发明的其它特点和优点将由本发明的一些非限制性实施方案的以 下描述表现为明显的，这是参考附图的图进行的。
附图简述
图1图解显示了按照本发明的方法的步骤，本发明是在截面图和正视
图中所示的操纵装置中进行的；
图2利用以关于图1中装置的俯视平面图获得的照片序列显示了图1
的方法的实际实施；
图3利用照片序列显示了电穿孔之前和之后的一些细胞；
图4、 5a、 5b概略地显示了按照本发明的方法的可能实施方案。
发明详述
本发明的目的是进行用于操纵和/或转化和/或研究最佳电穿孔条件和/ 或检测粒子的方法。
本发明的方法基于不均匀力场(F)的使用，通过该力场吸引单个粒 子或粒子组(BEADS)趋向稳定平衡位置(CAGE)。该场可以是例如负 的(NDEP)或正的(PDEP)介电泳场(DEP)、电泳场(EF)或电流体 动力学(EHD)运动场。
对细胞进行的处理基于能够导致细胞膜暂时渗透的局部化电场的施加。
该方法，例如在需要检查接近特定电极的粒子类型的全部那些步骤 中，还可以使用集成传感器，优选地，光学和/或阻抗计类型的。备选地， 通过与显微镜相连的非集成光学传感器可以获得类似的信息，所述显微镜 容许检查微室的内容物。力的产生
根据已知的技术，通过提供在衬底上的电极(EL)阵列，存在不同的 方法用于产生移动粒子的力。典型地，按照相同申请人以前的专利权(图
1)，使用覆盖物(LID)，它又可以是电极，它限定微室，在所述微室中粒 子(BEADS)典型地存在于液体悬浮液中。在介电泳(DED)的情况下，施 加的电压以加号(+)标示的是同相周期电压(Vphip)，和以减号(-)标 示的是反相周期电压(Vphin)。术语"反相电压"意指相位差180度的电 压。这个场产生作用于空间区域(CAGE)中的粒子的力，吸引它们趋向 平衡点(PEQ)。在负的DEP (NDEP)的情况下，根据已有技术如果覆盖物 (LID)是导电的电极，则可以产生封闭的力栅格；在这种情况下，将平 衡点(PEQ)建立为对应于每一个与Vphin (-)相连的电极，其条件是如果 相邻电极与反相的Vphip ( + )相连并且如果覆盖物(LID)与相Vphin (-) 相连。这个平衡点(PEQ)通常在液体中与电极隔离，因此，粒子(BEADS) 以静态悬浮。在正的DEP (PDEP)的情况下，平衡点(PEQ)通常处于与在 其上提供电极的表面相对应，并且粒子(BEADS)以静态与其接触。关于 PDEP，在覆盖物(帽盖)中不必需具有其它电极，因为PDEP的平衡点 对应于电场的最大值。关于电流体动力学(EHD)运动，电极的配置产生 某些流动，它们推动粒子趋向流动最小值的点。
以下，为了简便起见，在本发明的方法描述中，使用封闭的负的介电 泳栅格作为粒子移动的执行力仅被认为是为了本发明的目的的本发明的 非限制性实施例(为此原因，需要使用起电极作用的盖子)。对于本领域 的普通技术人员来说，如何概括下述使用不同执行力和不同类型粒子的方 法和装置，是明显的。
通过介电泳操纵协助的粒子电穿孔
借助于上述执行力之一，例如通过对该电极自身通以第一振幅和频率 的正弦电压，将粒子定位在两电极间间隙附近。该间隙优选地小于10拜， 且典型地是1-2,的量级，因此，与集成电路的供给电压(例如，2.5、 3.3或5 V)相当的低电压刺激足够确定能够引起粒子不可逆破裂的跨膜电
ii位。
该刺激优选地由第二振幅和第二频率的正弦脉冲串组成。 图1按照本发明优选的实施方案，在截面图中显示了力场和对电极施 加的电压"模式"(或电极(+ )或(_)状态配置的复合体)的时间发展。
图1 (a)中，细胞(CELL)处于nDEP中，以第一平衡点(MPEQ)以悬浮 状态出于液体中。在图1 (b)中，施加到电极(EL)的电压模式，以及 施加的电压的频率和任选地，振幅发生改变，因此细胞受到的力也改变为 pDEP(FZAP)。然而，由于电压模式的改变，只有待电穿孔的细胞(CELLZ) 受到显著的力，因此，吸引它趋向新的稳定平衡点(ZPEQ)。在该点附近， 电场最高，且频率是这样的，以致确定足以电穿孔细胞的跨膜电位。这样， 以悬浮状态存在的化合物(PL)能够渗透在细胞内。
按照现有技术，所述化合物可以是在其中浸渍粒子的流体溶液中的化 学化合物(染料、药物、肽)，或可以是例如质粒，等，或者理想类型和 数量的第二 PL粒子可以以悬浮状态存在于该流体中。
图2显示单细胞的电穿孔。将细胞，图2 (a)捕获在nDEP (频率=50 kHz，电极的峰-峰电压3.3 V，盖子的峰-峰电压6.6V)中。图2 (b)显示 荧光图像。然后在pEDP(两个500kHz脉冲，电极的峰-峰电压的振幅2V， 盖子的峰-峰电压的振幅4V)中突变所述场，并且选择的细胞经历孔张开， 这引起钙荧光素(为了进行试验，预先装载在细胞中)的释放和荧光降低 (图2 (c))。
利用具有荧光检测的光学-类型集成传感器(参见相同申请人先前的专 利)，例如通过绿色荧光蛋白(GFP)的表达，可以检查有效的转化。
用于优化电穿孔刺激的方法
在电极阵列上，可以安置细胞，并且可以对它们中的每一个或它们的 组试用具有不同振幅和/或频率参数的刺激，以便迅速地确定更有效的刺 激。
例如，如上所述，可以用集成光学传感器，或者利用监测细胞中可能 引入的通常不能穿透膜的染料(染料或颜色物质)(例如，锥虫蓝)来检 査电穿孔。图3显示按照上述方案电穿孔之前图3 (a)和之后图3 (b)锥虫蓝 中的细胞。在图3 (b)中，可以注意到锥虫蓝渗透到细胞内。利用集成光 学传感器，可以检测到染料的入口以及电穿孔的发生。
备选地，可以控制在孔开口处向外的染料扩散引起的细胞内存在的染 料的消散。例如，如上所述，细胞内的荧光钙荧光素可以向外释放，并且 决定细胞荧光的降低。
该方法预见到对单细胞反复施加增长强度的刺激，测量电穿孔的细胞
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用于调节对每个细胞电穿孔刺激的方法
可以将细胞定位在电极阵列上，并可以将增长强度的刺激在其上尝 试，并且可以用集成光学传感器控制通常不能穿透膜的染料的可能入口。
基于上述内容，明显的是，本发明容许进行对外部剌激的施加是灵敏 的第一粒子的选择或处理，并通过施加所述外部刺激提供引起至少一个所
述第一选择的粒子渗透的步骤；具体地，本发明提供下列步骤
a) 使第一粒子(CELL)接近可选择的电极阵列的电极(EL)，所述 电极具有与所述粒子的尺寸相似或更小的尺寸，对其可以施加第一配置
(PMAN)的电压，从而通过由对所述电极(EL)选择性通电引起的第一 力场(FMAN)组织所述第一粒子(CELL);
b) 对所述电极施加第二配置(PZAP)的电压，从而产生第二力场 (FZAP)，所述第二力场基本接近至少一个第一选择的待渗透粒子 (CELL)定位，并且由此引起对所述至少一个第一选择的粒子施加刺激，
所述刺激适合于使所述至少一个第一选择的粒子在渗透状态中达所述刺 激长度的至少一部分。
按照本发明的方法还包括步骤
c) 使处于渗透状态的所述至少一个第一选择的粒子与至少一个第二 粒子接触，其中进行步骤b)和c)，从而引起所述至少一个第二粒子渗透 到处于渗透状态的所述至少一个第一选择的粒子内部，如图1中示意性显 示。
将第一粒子浸渍于流体中，并且通过将第二粒子浸渍在该流体中并且延长步骤b) —段时间而进行步骤C)，所述时间足以容许至少一个所述第 二粒子渗透到处于渗透状态的所述至少一个第一选择的粒子内部。
备选地，将第二粒子浸渍在该流体中，并且然后优选地，通过对至少
所述选择的第二粒子施加力场(FMAN)，将至少一个选择的所述第二粒 子对着保持在渗透状态的所述至少一个第一选择的粒子移动，所述力场是 通过对可选择的电极阵列的电极(EL)进行选择性通电而获得的，对所述 电极施加一系列适当选择的电压配置。
由所述场施加的刺激可以是这样的，用于在去除了刺激本身后，还将 选择的第一粒子在渗透状态保持预定的时间；因此通过将第二粒子浸渍在 浸渍第一粒子的流体中并通过对着施加相同力场(FMAN)的第二粒子移 动处于渗透状态中的第一粒子而进行步骤c)，所述力场(FMAN)是通过 对可选择的电极阵列的电极(EL)进行选择性通电而获得的，对所述电极 施加一系列预定的电压配置。
参考图4、 5a、 5b，可以将第一粒子浸渍于第一流体中，例如它们可 以已经以悬浮状态包含在所述第一流体中；并且可以通过将第二粒子浸渍 在接近第一流体的第二流体中(例如，在所述第二流体中可以已经浸渍了 第二粒子)和通过对粒子施加合适的力场(FMAN)，将第一流体中存在 的处于渗透状态(电穿孔的)粒子，从第一流体移动到第二流体而进行步 骤c)，所述力场通过对电极施加一系列预定的电压配置而对相同的电极通 电。随后，为了在第一粒子内接收第二粒子而转化的第一粒子，可以被引 回到第一流体中，再次对电极施加合适的配置或电压配置的序列。
当将第一粒子浸渍在流体中时，所述方法可以备选地包括下列步骤
c) 向浸渍第一粒子的流体中引入至少一种溶液化合物；和
d) 容许所述化合物渗透到处于渗透状态(预先通过电极电穿孔的) 的第一粒子内部。
当将第一粒子浸渍在装备电极阵列的微室设备中包含的第一流体中 时，按照本发明(图4)的方法包括步骤
c) 通过以层流运动形式操作，将第二流体引入到微室内部，从而使 第二流体不与第一流体混合(图5a);
d) 向所述第二流体中引入至少一种溶解的化合物(在微室中第二流体的引入步骤之前还明显可以进行的操作，图5a);
e) 通过对粒子施加力场(FMAN)，将处于渗透状态的第一粒子从第 一流体移动到第二流体，所述力场是通过对所述可选择的电极阵列的所述 电极进行选择性通电而获得的，这是通过对所述电极施加一系列预定的电
压配置而实现的(图5b);
f) 容许所述化合物渗透在处于渗透状态的选择的第一粒子内，进行所 述选择的第一粒子的电穿孔，所述电穿孔是当所述第一粒子浸渍在第二液 体/流体时可以发生的操作，或者如果给予的刺激适合于在去除刺激后也维 持受其施加的第一粒子处于渗透状态达预定的时间，而第一粒子仍然处于 第一流体中，则从而在它们仍然处于渗透状态下，将它们移动到第二流体 中。
一般而言，可以将第一粒子浸渍在装备了所述电极阵列的微室中的多 种不同流体中，并且通过以层流运动操作将第一粒子引入所述微室中，这 样所述不同流体不混合在一起。
优选地，如上所述，第一粒子是具有可渗透和可溶解膜的生物实体， 例如，细胞，且所述刺激由使选择的粒子的跨膜电位达到引起膜渗透的数 值组成。按照本发明通常选择浸渍待电穿孔粒子的流体具有相对低的电导
率，这样可以传到pEDP，从而在场的最大值中吸引细胞，足以引起产生 孔的跨膜电位。
最后，按照本发明方法的可能变化，提供了对多种所述选择的第一粒 子施加增长强度的刺激，并且针对每种施加的刺激，通过在单芯片上与所 述电极阵列集成的传感器，测量存在于渗透状态中的粒子的数量。例如， 将第一粒子浸渍在流体中，且该流体含有这样的化合物，所述化合物至少 在渗透到那些所述处于渗透状态的第一粒子内部时，适合于通过传感器检 测。
用于调节关于每个细胞的推定电穿孔刺激的方法
如果根据细胞特征能够获得关于刺激最佳值的信息(例如，遵循按照 上述方法的特征)，则可以"推定地"采用下列方法。
在电极阵列上，可以通过传感器(优选地，集成在芯片内的光学和/或阻抗计传感器)预先检测每个待电穿孔的细胞的特征，诸如例如尺寸， 并对局部施加的刺激进行编程，从而逐个位置地，或逐个电极地，局部最 优化关于每个具体细胞的电穿孔成功百分比。
权利要求
1. 用于选择或处理对施加外部刺激敏感的第一粒子的方法，所述方法包括通过施加所述外部刺激获得至少一个选择的第一粒子渗透的步骤，其特征在于所述方法包括下列步骤a)使所述第一粒子(CELL)接近可选择的电极阵列的电极(EL)，所述电极具有与所述粒子的尺寸相似或更小的尺寸，可以对所述电极施加第一配置(PMAN)的电压，用于通过将所述电极(EL)选择性通电产生的第一力场(FMAN)组织所述粒子(CELL)；b)对所述电极施加第二配置(PZAP)的电压，从而提供第二力场(FZAP)，所述第二力场基本定位于接近至少一个选择的待渗透的第一粒子(CELL)处，并且由此对所述至少一个选择的第一粒子产生刺激的施加，所述刺激适合于使所述至少一个第一选择的粒子处于渗透状态达所述刺激长度的至少一部分。
2. 按照权利要求1的方法，其特征在于所述方法还包括下列步骤c) 使所述至少一个选择的处于渗透状态的第一粒子与至少一个第二粒 子接触；进行所述步骤b)和c)，从而引起所述至少一个第二粒子在所述至少 一个选择的处于渗透状态中的第一粒子内部渗透。
3. 按照权利要求2的方法，其特征在于将所述第一粒子浸渍在流体中； 对也浸渍在所述流体中的所述第二粒子进行所述步骤c)并且将所述步骤 b)延长一段时间，所述时间足以容许至少一个所述第二粒子在所述至少 一个选择的第一粒子内部渗透，所述第一粒子处于渗透状态。
4. 按照权利要求2的方法，其特征在于将所述第一粒子浸渍在流体中； 对也浸渍在所述流体中的所述第二粒子进行所述步骤c)，并通过对至少所 述选择的第二粒子施加力场(FMAN)，对着保持在渗透状态中的所述至 少一个选择的第一粒子移动至少一个所述选择的第二粒子，所述力场是通 过对所述可选择的电极阵列的所述电极(EL)的选择性通电获得的，对所 述电极施加一系列预定的电压配置。
5. 按照权利要求2的方法，其特征在于所述刺激适合于在去除所述刺 激后，还将所述至少一个选择的第一粒子在渗透状态中保持预定的时间； 所述第一粒子浸渍在第一流体中；对也浸渍在所述第一流体中的所述第二 粒子进行所述步骤c)，并对着所述第二粒子移动至少一个选择的处于渗透 状态的第一粒子，对所述粒子施加力场(FMAN)，所述力场是通过对所 述可选择的电极阵列的所述电极(EL)的选择性通电获得的，对所述电极 施加一系列预定的电压配置。'
6. 按照权利要求2的方法，其特征在于所述第一粒子浸渍在第一流体 中；且通过将所述第二粒子浸渍在接近所述第一流体的第二流体中而进行 步骤c)，并且通过对所述粒子施加力场(FMAN)，将所述至少一个选择 的第一粒子，从所述第一流体移动到所述第二流体，所述力场是通过对所 述可选择的电极阵列的所述电极(EL)的选择性通电获得的，对所述电极 施加一系列预定的电压配置。
7. 按照权利要求6的方法，其特征在于当所述至少一个选择的第一粒 子浸渍在所述第二流体中时，在所述至少一个选择的第一粒子上进行步骤 b)和c);或备选地，当所述至少一个选择的第一粒子浸渍在所述第一流 体中时，进行步骤b)和c)，只要所述刺激适合于在也去除所述刺激后将 所述至少一个选择的第一粒子在渗透状态中保持预定的时间，足以容许将 所述粒子从第一流体移动到所述第二流体。
8. 按照权利要求l的方法，其特征在于所述第一粒子浸渍在流体中； 所述方法还包括下列步骤c) 浸渍第一粒子的流体中具有至少一种溶液化合物；和d) 容许所述化合物渗透在处于渗透状态中的所述至少一个选择的第 一粒子内部。
9. 按照权利要求1的方法，其特征在于所述第一粒子浸渍在装备有所 述电极阵列的微室中包含的第一流体中；所述方法还包括下列步骤c) 通过处于层流运动形式的操作，在所述微室中引入第二流体，从 而使所述第二流体不与所述第一流体混合，所述第二流体含有至少一种溶 解的化合物；d) 通过对所述至少一个第一粒子施加力场(FMAN)，将所述粒子从所述第一流体移动到所述第二流体，所述力场是通过对所述可选择的电极阵列的所述电极(EL)的选择性通电而获得的，对所述电极施加一系列预 定的电压配置；e)容许所述化合物渗透在所述至少一个处于渗透状态中的第一粒子 内部；当所述至少一个第一粒子在所述第二流体中时，进行所述步骤a) 和b)，或备选地，只要所述刺激适合于在去除所述刺激后还将所述至少一 个选择的第一粒子在在渗透状态中保持预定的时间，足以容许从所述第一 流体到所述第二流体的移动，当所述至少一个第一粒子在所述第一流体内 时，进行所述步骤a)和b)。
10. 按照以上权利要求中任一项的方法，其特征在于所述第一粒子浸 渍在装备有所述电极阵列的微室中包含的多种不同的流体中，并且通过层 流运动形式的操作将其引入到所述微室中，以致所述不同的流体不混合在 一起。
11. 按照以上权利要求中任一项的方法，其特征在于所述第一粒子是 具有可渗透和可溶解膜的生物实体，例如，细胞，其中所述刺激由使所述 至少一个选择的粒子的跨膜电位在引起膜渗透的这样一种数值组成。
12. 按照以上权利要求中任一项的方法，其特征在于所述方法包括检 查所述至少一个选择的粒子是否发生渗透的步骤，优选地，通过在单芯片 中与所述电极阵列集成的传感器进行。
13. 按照权利要求2或8的方法，其特征在于所述方法包括检査所述 至少一个所述第二粒子或所述至少一个选择的第一粒子中的所述化合物 是否发生渗透的步骤，优选地，通过在单芯片中与所述电极阵列集成的传 感器进行。
14. 按照以上权利要求中任一项的方法，其中所述粒子悬浮在流体中， 其特征在于以这样一种方式选择所述流体，即提供相对低的电导率。
15. 按照以上权利要求中任一项的方法，其特征在于所述方法提供将 具有增长强度的刺激施加到多种所述选择的第一粒子，并且对于每种施加 的刺激，通过在单芯片中与所述电极阵列集成的传感器，测量渗透状态中 存在的粒子的数量。
16. 按照权利要求15的方法，其特征在于所述第一粒子浸渍在流体中，且所述流体含有这样的化合物，所述化合物至少在处于渗透状态的那 些所述第一粒子内部渗透时，适合于从所述传感器检测。
17.按照权利要求1-15中任一项的方法，其特征在于提供下列步骤 -根据所述第一粒子的已知特征，收集关于通过所述电极施加的刺激的最佳数值的信息；-通过优选地集成在芯片上的传感器，预先检测所述已知的特征，用于确定选择的第一粒子；和-编程待局部施加的刺激，以便优化每个特异性选择的第一粒子渗透的 成功百分比。
全文摘要
用于选择或处理对施加外部刺激敏感的第一粒子的方法，所述方法包括通过施加外部刺激引起至少一个选择的第一粒子渗透的步骤，其存在于通过第一力场(FMAN)组织第一粒子(CELL)，从而产生第二力场(FZAP)，所述第二力场基本位于接近至少一个选择的待渗透第一粒子。
文档编号B03C5/00GK101479044SQ200780021606
公开日2009年7月8日 申请日期2007年4月13日 优先权日2006年4月13日
发明者尼科洛·马纳雷西, 梅拉尼·阿博南, 詹内伊·梅多罗 申请人:硅生物系统股份公司