诊断食道癌的方法

专利名称：：诊断食道癌的方法
技术领域：
：本发明涉及食道癌，例如食道鳞状细胞癌(esophagealsquamcHis-cellcarcinoma,ESCC)，和肺癌的检测、诊断和提供预后的方法，以及治疗和预防食道癌、食道癌转移和食道癌复发的方法。或者，本发明还提供包括食道癌或肺癌在内的癌症的诊断、治疗和提供预后的方法。
背景技术：
：肺癌是世界上癌症相关死亡的主要原因。尽管其早期检测方面有一些进展，近来其治疗方法也有所改进，但肺癌患者的预后仍然不佳(Parkinetal,LancetOncol.2001Sep;2(9):533-43)。另一方面，食道鳞状细胞癌(ESCC)是胃肠道癌家族中最致命的恶性肿瘤之一。大多数食道癌在显示和诊断时已是晚期的，使得治愈，尤其是仅通过手术治愈已不可能(Shimadaetal.，Surgery.2003;133(5):486-94)。虽然现代外科技术与多重治疗(multi-treatment)方式例如放疗和化疗的组合已得到使用，但总体5年存活率仍维持在40-60°/。(Tamotoetal.,ClinCancerRes.2004;10(11):3629-38),而肺癌的5年存活率^f又为15%(Parkinetal，LancetOncol.2001Sep;2(9):533-43)。事实上，报道称在中值37.3个月的随访中，几乎有半数接受了明显治愈性切除的患者发生了ESCC复发(Marietteetal.,Cancer.2003;97(7):1616-23)。因此，人们投入了大量的努力来研究辅助化学疗法和化学放射疗法(chemoradiation)，尤其是从有效性和毒性最小的出发点上确定最佳治疗方案方面，以及在尝试预测响应方面投入了大量努力。但是，新辅助疗法和辅助疗法的发展带来了纷杂不一的结论。总的来说，过去的研究并没有显示从存活益处方面看最优的新辅助治疗或辅助治疗方案。因此，现在亟需用于癌症早期检测的新诊断工具，以及包含基于小分子及抗体的手段的分子靶向疗法。在这个方向上，有数种肿瘤标志物用于ESCC患者的诊断和随访，例如SCC(鳞状细胞癌抗原)，CEA(癌胚抗原)和CYFRA21-1。近来，有报道称ESCC患者中血清MK(中肾蛋白(midkine))、CD147、MMP-2(基质金属蛋白酶-2),MMP-26和MMP-9与不良预后相关(Shimadaetal.，CancerSci.2003;94(7):628-32;Kawaguchietal"Cancer.2000;89(7):1413-7;Ishibashietal.,Cancer.2004;101(9):1994-2000;Yamamotoetal"Carcinogenesis.2004;25(12):2353-60)。但是，尚没有对早期且有治愈潜力的阶段的ESCC检测临床上有用的特异性肿瘤标志物。因此，亟需新的诊断和治疗策略，如开发分子靶标作用物质和抗体，以及癌症疫苗。若干肿瘤标志物，例如proGPP、NSE、细胞角蛋白19-片段(CYFRA21-1)、鳞状细胞癌抗原(SCC)和癌胚抗原(CEA)在肺癌患者血液循环中增加(CastaldoG，etal.，JClinOncol.1997Nov;15(11):3388-93.;Pecketal.,CancerRes.1998Jull;58(13):2761-5.;Salernoetal"Chest.1998Jun;l13(6):1526-32.)，而针对ESCC的SCC、CEA和CYFRA21-1在临床上用于诊断以及患者的随访(Shimadaetal"Surgery.2003May;133(5):486-94，Kawaguchietal"Cancer.2000Octl;89(7):1413-7)。在NSCLC患者中，CEA灵敏度在鳞状细胞癌中为25%,在腺癌中为50%，而SCC灵敏度在鳞状细胞癌中为30%(Rasteletal.,EurJCancer.1994;30A(5):601-6)。CYFRA21-1灵敏度在鳞状细胞癌中为57%，在腺癌中为27%(Rasteletal"EurJCancer,1994;30A(5):601-6)。根据报道，ESCC患者中的血清SCC阳性率，I期为18%，II期为22%，III期为34%,IV期为37%。IV期ESCC患者中CEA阳性发生率仅为16%。尽管CEA不是预后因子，但通过多变量分析显示SCC是独立于pTNM因子的预后因子(Shimadaetal.,Surgery.2003May;133(5):486-94)。这些事实表明，尚没有肿瘤标志物被证明对检测处于有治愈潜力阶段的肺癌和ESCC是有用的，而且，现有可用于针对个别患者选择治疗方式的实用的预后标志物的数目是有限的。cDNA微阵列上的基因表达模式分析为肿瘤细胞中基因表达模式的综合分析提供了可能，而且已经报道了一些记载这些转录模式的研究。例如，关于ESCC,—些研究报道了可作为候选诊断标志物或治疗靶标的人ESCC基因表达才莫式(Luoetal.,Oncogene.2004;23(6):1291-9;Kiharaetal.,CancerRes.2001;61(17):6474-9;,Tamotoetal.，ClinCancerRes.2004;10(11):3629-38)。但是先前所有人ESCC中的研究均包含了大量肿瘤组织，而由于ESCC含有多种类型的细胞，例如间质细胞和炎症细胞，因此不能反映食道癌发生过程中准确的表达变化(Nishidaetal.,CancerRes.2005;65(2):401-9)。因此，还需要更准确的研究本发明是应上述需要作出的。具体地说，在致力于了解癌症相关的癌发生机制并鉴定用于开发新抗癌剂的靶标的过程中，本发明人使用由32,256个转录基因构成的cDNA微阵列，对包括通过激光微光束显微解剖(lasermicrobeammicrodissection,LMM)纯化的19个ESCC样品在内的食道癌细胞纯化群体中发现的基因表达模式进行了大规模全基因组分析为了分离用于肺癌和食道癌诊断、治疗和/或预防的潜在分子靶标，本发明者使用cDNA微阵列对来自101个肺癌和19个ESCC患者的癌细胞的基因表达模式进行了全基因组分析，其中这些癌细胞都是通过激光微光束显微解剖(LMM)纯化的(Kikuchietal.，Oncogene.2003Apr10;22(14):2192-205,IntJOncol.2006Apr;28(4):799-805;Kakiuchietal.，MolCancerRes.2003May;l(7):485-99，HumMolGenet.2004Dec15;13(24):3029-43.Epub2004Oct20;YamabukiT，etal，IntJOncol.2006Jun;28(6):1375-84)。为了验证各种基因产物在生物学和临床病理学上的重要性，本发明人通过组合临床肺癌材料的肿瘤组织微阵列分析与RNA干扰(RNAi)技术建立了一种筛选系统(Suzukietal.，CancerRes.2003Nov1;63(21):7038-41,CancerRes.2005Dec15;65(24):11314-25;Ishikawaetal"ClinCancerRes.2004Dec15;10(24):8363-70，CancerRes.2005Oct15;65(20):9176-84;Katoetal"CancerRes.2005Jull;65(13):5638-46;Furukawaetal.,CancerRes.2005Aug15;65(16):7102-10)。在此过程中，本发明人鉴定了Dikkopf-1(DKKl)作为一种新的血清学和组织化学生物标志物，以及作为肺癌和食道癌的治疗靶标。据报道，DKK1是一种分泌性蛋白，在脊推动物发育的头部形成中起重要作用，并且已知其是Wnt信号传导的负调节因子(Niidaetal.,Oncogene.2004Nov4;23(52):8520-6)。Dkkl结合LRP5/6和Kremen蛋白从而诱导LRP内吞，LRP内吞阻止Wnt-Frizzled-LRP5/6受体复合物的形成(Gonzalezetal.，Oncogene.2005Feb3;24(6):1098-103)。尽管有上述生物学研究，但尚没有报道描述DKK1活化在人类癌症中的重要性以及它作为诊断和治疗靶标的潜力。本发明在此报道了DKK1作为新的诊断和预后生物标志物和潜在的治疗剂/抗体靶标的鉴定，还提供了其在人肺癌和食道癌发生中可能的作用的证据。发明概述因此，本发明涉及与食道癌相关的独特基因表达图式的发现，以及开发人食道癌中信号抑制策略的靶标的发现。本文将.在食道癌(EC)例如食道鳞状细胞癌(ESCC)中差异表达的基因统称为"EC核酸"或"EC多核苷酸"，并将相应被编码的多肽称为"EC多肽"或"EC蛋白"。因此，本发明的一个目的是提供一种通过确定来自患者的生物样品，例如实体组织或体液样品中的EC相关基因的表达水平，而在受试者中检测、诊断食道癌，提供食道癌预后，或确定发生食道癌的倾向性(predisposition)的方法。术语"EC相关基因，，是指以表达水平在EC细胞中相比于正常细胞有所差异为特征的基因。正常细胞是从来自已知未患有EC的个体的食道组织获得的。在本发明的背景下，EC相关基因是表1-2和4-7中所列的基因(例如ECNo.l-1716所示的基因)，或者是与表1-2和4-7中所列的基因有至少90%、95°/。、96%、97%、98%或99%的序列同一性并具有相同功能的基因(例如同源物(homolog)、基因变体和多态性)。可以使用本领域已知的算法来确定两个或更多核酸序列之间的序列同一性(例如BLAST,见下文)。基因的表达水平相比于该基因正常对照水平的改变，例如提高或降低，表明受试者患有EC或者有风险发生EC。在本发明的背景下，短语"对照水平"是指在对照样品中检测到的mRNA或蛋白表达水平，包括正常对照水平和食道癌对照水平二者。对照水平可以是来自单一参照群体的单一表达图式或者是来自多个表达图式的单一表达图式。例如，对照水平可以来自先前测试过的细胞的表达图式的数据库。"正常对照水平"是指在正常健康个体中或者在已知未患食道癌的个体之群体中检测到的基因表达水平。正常个体是没有食道癌临床症状的个体。另一方面，"EC对照水平"是指在患有食道癌的群体中发现的EC相关基因表达模式。在测试样品中检测到的一种或多种表2、5和7中所列的EC相关基因(即ECNo.728-1543、1603-1679和1689-1716所示基因)的表达水平相比于来自正常对照样品的表达水平有所提高，则表明该受试者(所述测试样品是从其获得的)患有或有风险发生EC。与此相对地，在测试样品中检测到的一种或多种表1、4和6中所列的EC相关基因(即ECNo.1-727、1544-1602和1680-1688所示的基因)的表达水平相比于来自正常对照样品的表达水平有所降低，则表明该受试者(所述测试样品是从其获得的)患有或有风险发生EC。或者，可以将测试样品中一组EC相关基因的表达水平与相同基因的EC对照组的表达水平相比较。测试样品组中的基因与EC对照组中基因之间表达水平的相似性表明所述受试者(所述测试样品是从其获得的)患有或有风险发生EC。根据本发明，当基因表达相比于对照水平提高或降低10%、25°/。或50%时，认为基因表达水平"改变"了或有"差异"。或者，当基因表达相比于对照水平纟是高或降低至少0.1倍、至少0.2倍、至少1倍、至少2倍、至少5倍或至少IO倍或更多倍时，认为基因表达水平"改变"了或有"差异"。表达是通过检测EC相关基因探针与来自患者组织样品中的基因转录物的杂交，例如在阵列上的杂交而确定的。在本发明的背景下，来自患者的组织样品是从测试受试者获得的任何组织，其中所述测试受试者例如已知或被怀疑患有EC的患者。例如，所述组织可含有上皮细胞。更具体地，所述组织可以是来自食道鳞状细胞癌的上皮细胞。本发明还提供EC参照表达模式，其包括如表1-2和4-7所列的两种或更多EC相关基因的基因表达水平。本发明还提供通过使表达EC相关基因的测试细胞与测试化合物相接触，并确定EC相关基因的表达水平或其基因产物的活性，来鉴定抑制或增强EC相关基因，例如表1-2和4-7所列的EC相关基因之表达或活性的作用物质(agent)的方法。所述测试细胞可以是上皮细胞，例如/人食道鳞状细胞癌获得的上皮细胞。上调的EC相关基因的表达水平或其基因产物的活性相比于该基因或基因产物的正常对照表达水平或活性的下降，表明测试物质是EC相关基因的抑制剂，并可以用于减少EC的症状，例如一种或多种表2、5和7所列的EC相关基因的表达。或者，下调的EC相关基因的表达水平或其基因产物的活性相比于该基因或基因产物的正常对照表达水平或活性的提高，表明测试物质是EC相关基因表达或功能的增强剂，并且可以用来减少EC的症状，例如一种或多种表l、4和6所列的EC相关基因的过低表达。本发明还提供一种试剂盒，其包括结合一种或多种EC核酸或EC多肽的测试试剂。还提供核酸的阵列，所述核酸结合一种或多种EC核酸。本发明的治疗方法包括治疗或预防受试者中EC的方法，包括对受试者施用包含一种或多种反义寡核苷酸的组合物的步骤。在本发明的背景下，反义组合物减少一种或多种特异性靶标基因的表达。例如，反义组合物可含有一种或多种核苷酸，所述核苷酸与选自表2、5和7所列的EC相关基因的一种或多种上调EC相关基因序列互补。或者，所述方法可包括对受试者施用包含一种或多种小干扰RNA(siRNA)寡核苷酸的组合物的步骤。在本发明的背景下，所述siRNA组合物减少一种或多种选自表2、5和7所列的上调EC相关基因的EC核酸的表达。在另一种方法中，受试者中EC的治疗或预防可以通过对受试者施用包含一种或多种核酶(ribozyme)寡核苷酸的组合物来实施。在本发明的背景下，核酸特异性核酶组合物减少选自表2、5和7所列上调EC相关基因的一种或多种EC核酸的表达。本文确证了siRNA对所述表中列举的所选EC相关基因的抑制作用。具体地说，本文显示siRNA人(Homosapiens)上皮细胞转化序列2癌基因(ECT2)(SEQIDNO;30，31)和细胞分裂周期蛋白45(celldivisioncycle45)，酿酒酵母(S.Cerevisiae)类同源物(homolog-like)(CDC45L)(SEQIDNO;32,33)抑制食道癌细胞的增殖和存活力。因此，在本发明的一些实施方案中，表2、5和7所列的EC相关基因，包括ECT2和CDC45L,是食道癌的治疗靶标。其它治疗方法包括这样的方法，其中对受试者施用化合物，所述化合物增加一种或多种表l、4和6所列下调EC相关基因的表达，或者增加由一种或多种表1、4和6所列的EC相关基因所编码的多肽的活性。本发明还包括疫苗和接种方法。例如，在受试者中治疗或预防EC的方法可包含对受试者施用疫苗组合物，该组合物包含由选自表2、5和7所列上调EC相关基因的一种或多种核酸所编码的一种或多种多肽，或者此类多肽的免疫学活性片段。在本发明的背景下，免疫学活性片段是这样的多肽，它在长度上短于全长的天然存在蛋白质，但其诱导与全长蛋白质所诱导的免疫应答相似的免疫应答。例如，免疫学活性片段长度为至少8个残基，并且能够刺激免疫细胞，包括T细胞或B细胞。免疫细胞的刺激可以通过检测细胞增殖、细胞因子(例如IL-2)的生成(elaboration),或者抗体的产生来观'J定。参见,侈寸长口，HarlowandLane,UsingAntibodies:ALaboratoryManual,1998,ColdSpringHarborLaboratoryPress;andColigan，etal.，CurrentProtocolsinImmunology,1991-2006,JohnWiley&Sons。本发明的另一个目的是提供新的分子靶标以及EC特有的表达图式(expressionpattern)。被鉴定的基因可在新治疗药物或免疫疗法的开发中充当候选物。例如，本文将ECT2和CDC45L作为通过本发明的有希望的筛选系统鉴定的两种代表性的候选物加以表征。另外，本发明提供用于治疗或预防恶性食道癌，更具体的是治疗或预防食道癌转移或手术后复发的靶标分子。根据本发明，表4-5中所列的基因(即ECNo.1544-1679所示基因)被鉴定为在有淋巴结转移的食道癌细胞中具有特有的改变的表达图式的基因，而表6-7中所列的基因(即ECNo.1680-1716所示基因)被鉴定为在与手术后复发相关的食道癌中具有特有的改变的表达图式的基因。因此，可以通过抑制表5和7的上调基因或它们的基因产物的表达或活性来治疗或预防食道癌的转移和/或复发。或者，可以通过增强表4和6的下调基因或它们的基因产物的表达或活性来治疗或预防食道癌的转移和/或复发。本发明还提供预测食道癌转移的方法。具体地说，本发明包括测定选自表4和5所列基因的一种或多种标志物基因的表达水平的步骤。本文中将这些标志物基因鉴定为从具有淋巴结转移的患者中分离的食道癌细胞中具有特有的改变的表达图式的基因。因此，受试者中食道癌的转移，可以通过确定来自该受试者的样品中检测到的表达水平是更接近于参照样品中淋巴结转移阳性病例的平均表达水平，还是更接近于阴性病例的表达水平来来加以预测。本发明还提供预测食道癌手术后复发的方法。具体地说，本方法包括测定选自表6和7所列基因的一种或多种标志物基因的表达水平的步骤。本文中将这些标志物基因鉴定为从具有手术后复发的患者中分离的食道癌细胞中具有特有的改变的表达图式的基因。因此，受试者中食道癌的复发，可以通过确定来自该受试者的样品中检测到的表达水平是更接近于参照样品中复发阳性病例的平均表达水平，还是更接近于阴性病例的表达水平来来加以预测。本文中描述的方法的一个优势是在发现明显的临床症状之前鉴定食道癌。本文的这些以及其它目的和特征在结合附随的附图和实施例阅读下文的详述后将更加明了。但是，应当理解，前文的发明概述和下文的详述都是对于优选的实施方式进行说明的，对本发明及本发明的其它可选实施方式没有限制性。附图简要说明图1显示的是代表性的ESCC的激光微光束显微解剖(LMM)。上图(A)显示解剖前的样品；较下一图(B)，显示显微解剖后的同样的样品(H.E.染色XIOO)。还显示了捕获在采集帽(collectingcap)上的经过显微解剖的细胞(C)。图238个候选基因在肿瘤、细胞系和正常组织中的表达。图2A描绘了38个候选基因的半定量RT-PCR结果。ACTB是内部对照。图2B描绘了DKK1在正常肺组织和15个临床肺癌样品中的表达。图2C描绘了通过半定量RT-PCR分析检测到的25个肺癌细胞系。图2C描绘了通过western印迹分析检测到的DKK1蛋白质在5对代表性NSCLC样品中的表达。图3描绘了northern印迹分析的结果。图3A使用多组织northern印迹(MTN)描绘了ECT2在正常器官中的表达。一条大约4.3kb的转录物仅在睾丸中表达。图3B使用多组织northern印迹(MTN)描绘了CDC45L在正常器官中的表达。一条大约2.2kb的转录物仅在睾丸中表达。图3C描绘正常成人组织中DKK1转录物的Northern印迹分析。在胎盘中观察到了强信号，在前列腺中观察到了非常弱的信号。图3D描绘内源DKK1蛋白在TE8细胞中的亚细胞定位。DKK1在细胞的细胞质中被染色。图4描绘针对ECT2的小干扰RNA(siRNA)实验的结果。在部分(A)中，通过RT-PCR确证了si-ECT2-l和si-ECT2-2的敲低(knockdown)作用。MTT测定(C)和集落形成测定(B)显示了在用si-ECT2-l和si-ECT2-2转染的细胞中细胞生长的抑制。图5描绘针对CDC45L的小干扰RNA(siRNA)实验的结果。在部分(A)中，通过RT-PCR确证了si-CDC45L-l和si-CDC45L-2的敲低作用。MTT测定(C)和集落形成测定(B)显示了在用si-CDC45L-l和si-CDC45L-2转染的细胞中细胞生长的抑制。图6描绘使用通过随机置换检验(randompermutationtest)选择的136个淋巴结转移相关基因进行监督的二维等级聚类分析(supervisedtwo-dimensionalhierarchicalclusteringanalysis)的结果。图7描绘使用通过随机置换检验选择的37个手术后复发相关基因进行监督的二维等级聚类分析的结果。图8DKK1过度表达与NSCLC和ESCC患者不良预后的关联。图8A、C显示癌症中的强、弱和不存在DKK1表达，以及正常组织中无表达(原放大率xl00);(A)食道癌，(C)肺癌。图8B，D描绘了根据DKK1表达所作的ESCC(B)和NSCLC(D)患者生存率的Kaplan-Meier分析。图9在ESCC、肺癌患者和健康对照中通过ELISA确定的DKK1血清浓度。图9A描绘在来自ESCC、肺ADC、肺SCC或SCLC的患者的血清中DKK1的分布。在下列二者间差异是明显的ESCC患者和正常个体之间(P<0.001,Mann-WhitneyU检验)、ADC患者和健康个体之间(P<0.001，Mann-WhitneyU检验)、SCC患者和健康个体之间(P<O.OOl)以及SCLC患者和健康个体之间(P<0.001)。图9BFigure9B,DKKl(黑)作为血清标志物对于月申癌和食道癌进行的接受者操作特征(Receiver-operatingcharacteristic,ROC)曲线分析(X-轴，l-特异性;Y-轴，灵敏度)。图10图IOA描绘癌细胞中分泌性DKKI的翻译后修饰。丙氨酸替换突变体DKK1表现为具有与野生型DKK1的去糖基化形式相似的分子量的免疫反应性条带。使用N糖普酶F处理没有导致条件培养基和细胞沉淀中的突变体DKK1发生条带的任何迁移，提示DKK1仅在256位精氨酸处被N糖基化。转染了DKK1表达质粒的哺乳动物细胞的浸润性(invasiveness)的促进。图10B描绘的是显示用人DKK1表达质粒转染NIH3T3和COS-7细胞后，NIH3T3和COS-7细胞在Matrigel基质中的浸润性的测定。上图面，DKK1在MH3T3和COS-7细胞中的瞬时表达，通过western印迹分析测得。中图面和下图面，Giemsa染色(x200)和迁移通过包#皮Matrigel的滤器的细胞数。测定在一式三份的孔中进行三次。优选实施方式的详述I概述除非另外特别说明，本文中的用语"一个(种)"("a"、"an，'、"the")意思是"至少一个(种)"。通常，食道癌细胞是作为具有高度炎性反应、含有多种细胞组分，包括非癌性细胞例如间质细胞和炎症细胞的实体块(mass)存在的。因此，先前公开的基因表达数据反映的是不均一的模式，不一定正确地反映食道癌发生过程中的表达变化。因此，为了避免这些正常细胞的污染，本发明使用激光微光束显微解剖(LMM)系统从手术标本中纯化了癌性细胞群体和正常上皮细胞群体(Gjerdrumetal.,JMolDiagn.2001;3(3):105-10;Kitaharaetal"CancerRes.2001;61(9):3544-9;Kakiuchietal.，HumMolGenet.2004;13(24):3029-43)。我们认为这是首次与LMM系统结合的cDNA微阵列上的人ESCC基因表达模式(expressionprofile)研究。具体地说，这里，为多组在ESCC中差异表达的基因建立了详细的全基因组数据库。将关于所有32,256个基因的数据与它们在ESCC中的表达，以及通过cDNA微阵列确定的它们在34个正常人组织(30个成人器官，4个胎儿器官)中的分布联系起来。这里的数据不但提供了关于食道癌发生的重要信息，而且方便了鉴定表达产物可作为诊断标志物和/或作为治疗食道癌患者的分子靶标的候选基因，并4是供了临床相关信息。迄今为止，已经有816种候选基因被鉴定为在癌症中特异性上调的肿瘤标志物或治疗靶标(见表2)。上调基因代表多种功能，包括编码癌-睾丸或癌-胎儿抗原的基因，以及对于细胞生长、增殖、存活、运动性/浸润(invasion)和转化而言重要的基因。已经发现这些乾标可以用作诊断/预后标志物，以及作为用于食道癌治疗中新的分子靶向剂或免疫疗法的开发的治疗靶标。上调基因还代表肿瘤特异性跨膜/分泌性蛋白，它们具有显著的优势，因为它们展示在细胞表面或者细胞外空间中，和/或血清中，使得它们易于用作分子标志物和治疗靶标。已有的肿瘤特异性标志物，例如CYFRA或Pro-GRP,是跨膜/分泌性蛋白质(PujolJL,etal.,CancerRes.1993;53(l):61-6;MiyakeY,etal.，CancerRes.1994Apr15;54(8):2136-40);rituximab(Rituxan)——种针对CD20阳性淋巴瘤的人源化单克隆抗体的例子，提供了针对特异性细胞表面蛋白可产生显著临床收益的证据(HennessyBT，etal.,LancetOncol.2004;5(6):341-53)。在上调基因中，选取了38个基因用于半定量RT-PCR实验验证，并确证了它们的癌症特异性表达(图2)。然后，将淋巴结转移(淋巴结阳性)病例的表达模式与淋巴结阴性病例的表达模式相比较，因为淋巴结转移是肿瘤进展中的关键步骤，而且是不良预后的风险因子。因此，鉴定了与淋巴结转移相关的136个基因。另外，鉴定了与手术后复发相关的37个基因。在32个月的观察期中，复发的模式包括局部复发，局部淋巴结，和远端转移(肺)。手术后距复发的平均(SD)时间为21.8±11.1个月(范围，2-32个月)。这些基因是EC肿瘤进展过程中的关键分子。因此，该数据使得鉴定和选择能够接受手术后辅助疗法的患者成为可能。从包含32,256个基因的本发明cDNA微阵列系统中，ECT2(GenBankAccessionNO.AY376439;SEQIDNO:30，31被鉴定为食道癌中上调的基因。已发现这种分子是一种在大多数ESCC中活化的癌-睾丸抗原(cancer-testisantigen),并且，如下述northern印迹分析和siRNA实-睑所显示的，被认为在细胞生长/存活中起关键作用。ECT2基因编码一种具有一对BRCT域、RhoGEF域和PH域的882个氨基酸的蛋白质。据报道称它是一种核苷酸交换因子，并且参与细胞质分裂的调节(Tatsumotoetal.，JCellBiol.1999;147(5):921-8;，Saitoetal.,JCellBiochem.2003;90(4):819-36,Liuetal.,MolCellBiol.2004;24(15):6665-75)。另夕卜，分离了作为上调基因的CDC45L(GenBankAccessionNO.AJ223728;SEQIDNO;32,33)。已发现该分子是是一种在大多数ESCC中活化的癌-睾丸抗原。如northern印迹分析和siRNA实验所显示的，提示CDC45L可能与细胞生长和存活相关。CDC45L基因编码一种566个氨基酸的蛋白。i亥蛋白是基于其与酉良酒酵母OSacc/2aramycescereWsz'ae)Cdc45—一种启动DNA复制所需的关键蛋白一的高度相似性而得以鉴定的(Sahaetal.,JBiolChem.1998;273(29):18205-9)。在迄今为止鉴定的肿瘤抗原中，癌-睾丸抗原被认为是一群极有吸引力的癌症疫苗靶标(Lietal.,ClinCancerRes.2005;11(5):1809-14)。尽管其他因素，包括该蛋白的体内免疫原性，也是重要的(Wangetal.,ClinCancerRes.2004;10(19):6544-50)，但似乎ECT2和CDC45L二者都是免疫疗法以及新抗癌药物开发的良好靶标。总之，本文中描述的与LMM系统组合的cDNA微阵列揭示了与癌发生、淋巴结转移和手术后复发相关的ESCC特征性基因表达模式。人ESCC整合基因表达数据库的使用，为用于食道癌个体化疗法的靶标分子如ECT2和CDC45L的快速鉴定并进一步评估提供了一种有力的策略。肺癌和食道癌的基因表达模式和后续分析揭示，Dikkopf-l(DKK1;AccessionNo.NM—012242;SEQIDNO:109,110)在各种肺癌和食道鳞状细胞癌(ESCC)的大多数中被反式活化。在正常组织中，Northern-印迹分析仅在胎盘和前列腺中检测到了DKK1基因的表达。使用由279个保存的非小细胞肺癌(NSCLC)和220个ESCC标本组成的肿瘤组织微阵列进行免疫组化染色，确证了DKK1蛋白在这些肿瘤中高频度地过高表达；在所考察的279个NSCLC中的227个(81.4%)中,以及220个ESCC中的135个中(61.4%)观察到了它的阳性染色。另外，高水平的DKK1表达与NSCLC及ESCC患者的不良预后相关，且多变量分析确认了它的独立预后值(independentprognosticvalue)。在肺和食道癌患者中的DKK1血清水平显著高于健康对照中。根据我们的标准定义的血清DKK1阳性病例的比例是NSCLC患者162人中101人(62.3%)、SCLC患者71人中47人(66.2%)、ESCC患者67人中45人(67.2%)。而220个健康志愿者中只有11个(5.0%)被误诊为阳性。使用DKK1和CEA的联合分析增加了灵敏度，此时78.6%的NSCLC患者诊断为阳性，只有8.2%的健康志愿者被误诊为阳性。同时使用DKK1和proGRP二者提高了灵敏度，检出了高达84.8%的SCLC,而健康供体中的假阳性率仅有6.2%。此外，DKK1的外源表达增加了哺乳动物细胞的迁移和浸润活性，表明DKK1可能在某些类型的癌症的进展中起重要作用。我们的数据暗示DKK1可以用作新的诊断/预后标志物，并很可能作为肺癌和食道癌的治疗耙标。II.食道癌的诊断本文中鉴定的差异表达基因作为EC标志物和作为EC基因靶标具有诊断和预后效用，可以改变它们的表达来治疗或减轻EC的症状。将在EC患者中其表达水平被调变(即提高或降低)的基因总结在表l，2和4-7中，并在本文中将它们统称为"EC相关基因"、"EC核酸"或"EC多核苦酸"，并将相应被编码的多肽称为"EC多肽"或"EC蛋白，，。除非另有说明，"EC"是指本文公开的任何序列(例如，表l,2和4-7中所列的EC相关基因)和具有相同的功能，并且具有至少90%，95%,96%,97%,98%，99°/0的序列同一性的序列(即同源物(homolog)、变体及多态性物质(polymorphism)).先前已有记载的基因同时提供了数据库登录号。通过测量细胞样品中不同基因的表达可以诊断EC。类似地，测量这些基因响应于不同作用物质的表达可以鉴定用于治疗EC的作用物质。本发明涉及确定(例如测量)表1,2和4-7中所列EC相关基因中至少一种，多达全部的表达。使用GenBankTM数据库的已知序列条目所提供的序列信息，可以使用本领域一般技术人员已知的技术来检测和测量所述EC相关基因。例如，可以使用序列数据库条目中对应于EC相关基因的序列构建探针，用于在例如Northern印迹杂交分析中检测对应于EC相关基因的RNA序列。探针典型地包括参照序列的至少10个，至少20个，至少50个，至少100个或至少200个核苷酸。作为另一个例子，可以《吏用所述序列构建引物，用来在例如基于扩增的检测方法(例如基于逆转录的聚合酶链式反应)中特异性扩增EC核酸。然后将测试细胞群体，例如来自患者的组织样品中的一种或多种EC相关基因的表达水平与相同基因在参照细胞群体中的表达水平相比较。参照细胞群体包括一种或多种比较参数已知的细胞，例如食道鳞状细胞癌细胞(例如EC细胞)或正常食道上皮细胞(例如非EC细胞)。测试细胞群体中基因表达图式的相比于参照细胞群体是否表示EC或其倾向性取决于参照细胞群体的组成。例如，如杲参照细胞群体由非EC细胞构成，则测试细胞群体和参照细胞群体之间基因表达图式的相似性就表示该测试细胞群体为非EC。相反，如果参照细胞群体是由EC细胞构成的，则，则测试细胞群体和参照细胞群体之间基因表达图式的相似性就表示测试细胞群体包括EC细胞。如果测试细胞群体中EC标志物基因表达水平相对于相应参照细胞群体中相应EC标志物基因的表达水平变化了多于1.1倍、多于1.5倍、多于2.0倍、多于5.0倍、多于10.0倍或更多倍，则认为测试细胞群体中EC标志物基因表达水平被"改变"了或有"差异"。可以将测试细胞群体和参照细胞群体之间的差异基因表达相对于对照核酸，例如持家基因进行标准化。例如，对照核酸是已知不依赖于细胞癌性或非癌性状态而有差异的核酸。可以使用对照核酸的表达水平来标准化测试细胞群体和参照细胞群体中的信号水平。对照基因的例子包括，但不限于，例如(3-肌动蛋白、甘油醛3磷酸脱氬酶和核糖体蛋白Pl。可以将测试细胞群体与多个参照细胞群体比较。所述已知参数在多个参照细胞群体的每一个中可以不同。因此，可以将测试细胞群体与已知含有例如EC细胞的第一参照细胞群体相比较，以及与已知含有例如非EC细胞(正常细胞)的第二参照细胞群体相比较。测试细胞群体可以包含在来自已知或怀疑含有EC细胞的受试者的组织或细胞样品中。测试细胞群体可以从身体组织或体液，例如生物流体(例如，血液，痰,唾液)中获得。例如，测试细胞群体可以是从食道组织纯化。优选地，测试细胞群体包括上皮细胞。上皮细胞优选来自已知是或怀疑是食道鳞状细胞癌的组织。参照细胞群体中的细胞来自与测试细胞群体组织类型类似的组织类型。任选地，参照细胞群体是细胞系，例如EC细胞系(即阳性对照)或正常非EC细胞系(即阴性对照)。或者，对照细胞群体可以来自分子信息的数据库，其中所述分子信息来自检测参数或条件已知的细胞。受试者优选是哺乳动物。示例性的哺乳动物包括但不限于例如人、非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马或牛。本文公开的基因的表达可以使用本领域已知的方法在蛋白或者核酸水平上加以确定。例如，可以使用特异性识别一种或多种这些核酸序列的探针的Northern杂交分析来确定基因表达。或者，可以使用基于逆转录的PCR测定法是来测量基因表达，例如，使用对于差异表达的基因序列特异性的引物。基因表达也可以在蛋白水平上确定，即通过测量本文公开的基因所编码多肽的水平或其生物学活性。此类方法是本领域公知的，包括但不限于，例如，使用针对基因编码的蛋白的抗体的免疫测定。所述基因编码的蛋白的生物学活性是公知的。参见SambrookandRussell,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdEdition,2001，ColdSpringHarborLaboratoryPress;Ausubel,CurrentProtocolsinMolecularBiology,1987-2006,JohnWileyandSons;和HarlowandLane，UsingAntibodies:ALaboratoryManual,1998,ColdSpringHarborLaboratoryPress.在本发明的背景下,通过测量来自测试细胞群体(即来自患者的生物样品)的一种或多种EC核酸的表达水平诊断EC。优选的是，测试细胞群体含有上皮细胞，例如获自食道组织的细胞。还可以从血液或者其它体液，例如唾液或痰中测量基因表达。可以使用其它生物学样品来测量蛋白水平。例如，来自待诊断受试者的血液或血清中的蛋白水平可以是通过免疫测定或其它常规生物测定来测量。确定测试细胞群体或生物学样品中一种或多种EC相关基因，例如表1、2和4-7所列的基因的表达，并与^1测一种或多种EC相关基因的正常对照表达水平进行比较。正常对照水平是通常发现于来自已知未患有EC的受试者的细胞群体中的EC相关基因表达模式。组织样品中的一种或多种EC相关基因表达水平相对于来自正常对照样品的表达发生变化或不同(例如提高或降低)，表明该受试者患有或有风险发生EC。例如，相比于正常对照细胞群体中的表达，测试细胞群体中一种或多种如表2、5和7所列的上调EC相关基因的表达提高表明该受试者患有或有风险发生EC。反之，相比于正常对照细胞群体中的表达，测试细胞群体中一种或多种如表1、4和6所列的下调EC相关基因的表达降低表明该受试者患有或有风险发生EC。相比于正常对照表达水平，测试细胞群体中一种或多种EC相关基因表达水平的改变表明受试者患有或有风险发生EC。例如，EC相关基因的组(表1、2、4-7所列基因)中至少1%,至少5%,至少25%,至少50%,至少60°/0，至少70%,至少80%,至少90%或更多的表达水平的改变表明受试者患有或有风险发生EC。III.筛选测定法抑制或增强EC相关基因表达的作用物质的鉴定抑制EC相关基因的表达或抑制其基因产物的活性的作用物质，可以通过使表达EC相关上调基因的测试细胞群体与测试物质相接触，然后确定EC相关基因的表达水平或其基因产物的活性来加以鉴定。相比于不存在测试物质的条件下的表达或活性水平，存在所述物质的条件下EC相关基因表达水平或其基因产物的活性水平的下降表明该物质是相关上调基因的抑制剂并且可用于抑制EC。或者，增强EC相关下调基因的表达或抑制其基因产物的活性的作用物质，可以通过使表达EC相关基因的测试细胞群体与测试物质相接触，然后确定EC相关下调基因的表达水平或其基因产物的活性来加以鉴定。相比于不存在测试物质的条件下的表达或活性水平，存在该测试物质的条件下EC相关下调基因的表达或其基因产物的活性。测试细胞群体可以是任何表达EC相关基因的细胞。例如，测试细胞群体可含有上皮细胞，例如，来自食道组织的细胞。另外，测试细胞群体可以是来自食道鳞状细胞癌细胞的永生化细胞系。或者，测试细胞群体可以由用EC相关基因转染的细胞构成，或者由用调节序列(例如启动子序列)转染的细胞构成，所述调节序列来自与报道基因可操作连接的EC相关基因。作用物质可以是，例如，抑制性寡核苷酸(例如反义寡核苷酸、siRNA、核酶)、抗体、多肽、小有机分子。作用物质的筛选可以使用高通量方法来进行，利用多孔板(例如，96孔、192孔、384孔、768孔、1536孔)同时筛选多种作用物质。自动化高通量筛选系统是可商购的，例如可购自CaliperLifeSciences,H叩kinton,MA。可供筛选用的小有机分子文库可以是购自，例^口,ReactionBiologyCorp.,Malvern,PA;TimTec,Newark,DE。治疗剂的鉴定本文公开的差异表达的EC相关基因还可用来鉴定用于治疗EC的候选治疗剂。The本发明的方法涉及筛选候选治疗剂，以确定测试物质是否可以将表1、2和4-7中所列一种或多种EC相关基因的EC状态特征性表达模式转换为非EC状态特征性基因表达图式。在该方法中，使测试细胞群体暴露于一种测试物质，或者暴露于多种测试物质(顺序地或组合地)，并测量细胞中表1、2和4-7所列一种或多种EC相关基因的表达。将测试细胞群体中测定的EC相关基因的表达模式与参照细胞群体中相同EC相关基因的表达水平相比较，其中所述参照细胞群体未暴露于测试物质。能够刺激过低表达基因(under-expressedgene)的表达或抑制过高表达基因(over-expressedgene)的表达的作用物质在临床上是有益。可以进一步测试此类作用物质在动物或试验受试者中防止食道癌生长的能力。在另一个实施方式中，本发明提供筛选作用于EC治疗中靶标的候选物质的方法。如上文详细讨论的，通过控制标志物基因的表达水平或它们基因产物的活性，可以控制EC的发作和进展。因此，作用于EC治疗中靶标的候选物质，可以通过以这样的表达水平和活性作为癌性或非癌性状态之指标的筛选方法来加以鉴定。在本发明的背景下，此类筛选可包括，例如，下列步骤(a)使测试化合物与多肽相接触，所述多肽由选自表l、2、4、5、6或7中所列基因的多核苷酸所编码；(b)检测多肽和测试化合物之间的结合活性；和(c)选择结合多肽的测试化合物。或者，本发明的筛选方法可包括下列步骤(a)使候选化合物与表达一种或多种标志物基因的细胞相接触，其中所述一种或多种标志物基因选自表1、2、4、5、6或7中所列基因；和(b)选择这样的候选化合物相比于在不存在候选化合物的条件下检测的表达水平，其减少选自表2、5或7中所列基因的一种或多种标志物基因的表达水平，或者提高选自表l、4或6中所列基因的一种或多种标志物基因的表达水平。表达标志物基因的细胞包括，例如，从EC建立的细胞系；这样的细胞可以用于上述本发明的筛选。或者，本发明的筛选方法可包括下列步骤(a)使测试化合物与多肽相接触，所述多肽由选自表l、2、4、5、6或7中所列基因的多核苦酸所编码；(b)检测步骤(a)的多肽的生物学活性；和(c)选择这样的化合物相比于在不存在测试化合物的条件下检测的生物学活性，其抑制选自表2、5和7中所列基因的多核苷酸所编码多肽的生物学活性，或增强选自表l、4和6中所列基因的多核苷酸所编码多肽的生物学活性,.本发明筛选方法中使用的蛋白，可以使用标志物基因的核苷酸序列以重组蛋白的形式获得。基于有关标志物基因及其编码蛋白的信息，本领域技术人员可以选择所述蛋白的任何生物学活性作为筛选指标，和选择任何合适的测量方法来测定所选的生物学活性。或者，本发明的筛选方法可包括下列步骤(a)使候选化合物与其中导入了载体的细胞相接触，所述载体包含一种或多种标志物基因的转录调控区域和在所述转录调控区域的控制下表达的报道基因，其中所述一种或多种标志物基因选自表1、2、4、5、6或7中所列基因；(b)测量所述报道基因的表达水平或活性；和(c)选择这样的候选化合物与不存在该候选化合物的条件下检测到的表达水平或活性相比，当所述标志物基因是选自表2、5和7中所列基因的上调标志物基因时，该候选化合物降低所述报道基因的表达水平或活性；或者，当所述标志物基因是选自表1、4和6中所列基因的下调标志物基因时，该候选化合物增强所述报道基因的表达水平或活性。合适的报道基因和宿主细胞是本领域公知的。适用于本发明筛选方法的报道基因构建体可以使用标志物基因转录调控区域来制备。当标志物基因转录调控区域为本领域技术人员所已知时，可以使用先有的序列信息来制备报道基因构建体。当标志物基因转录调控区域尚未被鉴定时，基于标志物基因的核苷酸序列信息从基因组文库中分离含有转录调控区域的核苷酸区段。用于治疗EC的治疗剂的选择个体基因构成的不同可导致他们代谢各种药物的能力的差异。在受试者中被代谢并作为抗EC剂起作用的物质，可通过下述方式来显示自身诱导受试者细胞中的基因表达图式从癌性状态特征性基因表达图式变成非癌性状态特征性基因表达图式。因此，本文公开的差导性表达的EC相关基因使得人们能够在来自选定的受试者的测试细胞群体中测试推定的治疗性或预防性EC抑制剂，以确定作用物质在受试者中是否是合适的EC抑制剂。为了鉴定对特定受试者合适的EC抑制剂，将来自受试者的测试细胞群体暴露于治疗剂，并确定表l、2和4-7中所列一种或多种EC相关基因的表达。在本发明方法的背景下，测试细胞群体含有表达一种或多种EC相关基因的EC细胞。优选地，测试细胞群体包括上皮细胞。例如，可以在存在候选物质的条件下温育测试细胞群体，测量该测试细胞群体的基因表达图式，并与一种或多种参照表达模式，例如EC参照表达模式或非EC参照表达模式相比寿支。相对于含有EC的参照细胞群体，测试细胞群体中表2、5和7所列一种或多种EC相关基因的表达减少或表1、4和6所列一种或多种EC相关基因的表达增加提示所述物质有治疗用途。在本发明的背景下，测试物质可以是任何化合物或组合物。示例性的测试物质包括但不限于免疫调节剂(immunomodulatoryagents)(例如，抗体)、抑制性寡核苦酸(例如，反义寡核苷酸、短的抑制性寡核苷酸和核酶)及小有机化合物。转移性食道癌治疗剂的鉴定本发明提供用于治疗或预防4争移性食道癌(metastasisesophagealcancer)的靶标分子。本发明的EC转移筛选测定，可以使用与EC转移相关的标志物基因根据上文所述方法来进行。本发明中，选自表4和5所列基因的标志物基因对筛选是有用的。通过本发明获得的、抑制一种或多种上调基因的表达或它们基因产物的活性的作用物质，对治疗或预防有淋巴结转移的EC是有用的。或者，通过本发明获得的、增强一种或多种下调基因的表达或它们基因产物的活性的作用物质，对治疗或预防有淋巴结转移的EC也是有用的。在本发明中，调节表4和5中所列基因的表达水平的作用物质，可以用与鉴定抑制或增强EC相关基因表达的作用物质同样的方式加以鉴定。或者，调节它们基因产物的的作用物质，也可以用与鉴定抑制或增强EC相关基因产物的作用物质同样的方式加以鉴定。复发性食道癌治疗剂的鉴定本发明提供用于治疗或预防复发性食道癌的靶标分子。本发明的EC转移筛选测定，可以使用与EC转移相关的标志物基因根据上文所述方法来进行。本发明中，选自表6和7所列基因的标志物基因对筛选是有用的。通过本发明获得的、抑制一种或多种上调基因的表达或它们基因产物的活性的作用物质，对治疗或预防有手术后复发的EC是有用的。或者，通过本发明获得的、增强一种或多种下调基因的表达或它们基因产物的活性的作用物质，对治疗或预防有手术后复发的EC也是有用的。在本发明中，调节表6和7中所列基因的表达水平的作用物质，可以用与鉴定抑制或增强EC相关基因表达的作用物质同样的方式加以鉴定。或者，调节它们基因产物的作用物质，也可以用与鉴定抑制或增强EC相关基因产物的作用物质同样的方式加以鉴定。试剂盒本发明还包括EC检测试剂，例如，特异性结合或鉴定一种或多种EC核酸的核酸，包括与EC核酸的一部分互补的寡核香酸序列，或者与EC核酸编码的一种或多种蛋白结合的抗体。检测试剂可以以试剂盒的形式包装在一起。例如，检测试剂可以包装在不同的容器中，例如核酸或抗体(或者结合于固体基质，或者与用于将它们结合于基质的试剂分别包装)、对照试剂(阳性/阴性)、和/或可检测标记物。该试剂盒中还可以包括关于实施测定的说明书(例如书面的(written)、磁带(tape)形式的、VCR、CD-ROM等)。试剂盒的测定模式可以是Northern杂交或夹心ELISA,二者都是本领域已知的。参见,例如，SambrookandRussell,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdEdition,2001，ColdSpringHarborLaboratoryPress;andUsingAntibodies,supra。例如，EC检测试剂可以固定在固体基质，例如多孔片条(porousstrip)上，形成至少一个EC检测位点。多孔片条的测量或检测区域可包括多个位点，每个均含有核酸。测试片条(teststrip)也可以含有用于阴性和/或阳性对照的位点。或者，对照位点可以位于不同于所述测试片条的片条上。任选地，不同的检测位点含有不同量的固定核酸，即第一检测位点中的量较高，随后的位点中的量较低。添加测试样品时，显示可检测信号的位点的数目提供样品中存在的EC的定量指示。检测位点可以构成为任何可合适检测的形状，典型地是跨越测试片条宽度的条形或点形。或者，试剂盒可含有核酸基质阵列，该阵列包含一种或多种核酸。阵列上的核酸特异性鉴定由表1、2和4-7中列出的EC相关基因所示的一种或多种核酸序列。藉由与阵列测试片条或芯片的结合水平，可以鉴定由表1、2和4-7中列出的EC相关基因所示的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、40或50或更多种核酸的表达。基质阵列可以是在，例如，固体基片上，例如美国专利5,744,305(本文引证其全部内容)中描述的"芯片"上。本发明方法中有用的阵列基质可从例如Affymetrix，SantaClara，CA商购。阵列和群体(pluralities):本发明还包括含有一种或多种核酸的核酸基质阵列(nucleicacidsubstratearray)。阵列上的核酸特异性地对应于表1、2和4-7中所列的EC相关基因所示的一种或多种核酸序列。通过检测与阵列结合的核酸，可鉴定由表1、2和4-7中所列的EC相关基因表示的2，3,4,5,6,7，8,9,10,15,20，25,40,50或更多种核酸的表达水平。本发明还包括分离的核酸的群体(plurality)(即两种或两种以上核酸的混合物)。核酸可以存在于液相或固相中，例如固定于如硝酸纤维素膜的固体支持物上。所述群体包含由表l、2和4-7中所列的EC相关基因表示的一种或多种核酸。在多个实施方案中，所述群体包含由表1、2和4-7中所列的EC相关基因表示的2,3，4，5,6,7,8,9，10,15，20,25,40,50或更多种核酸。候选化合物通过筛选分离得到的化合物可作为药物开发的候选物，其中所述药物抑制标志物基因的表达或抑制由标志物基因编码的蛋白质的活性，并可用于治疗或预防食道癌此外，本发明的筛选方法可获得的化合物还包括化合物中抑制由标志物基因编码的蛋白质之活性的部分结构通过添加、缺失和/或取代而发生转变的化合物。当施用通过本发明的方法分离的化合物作为用于人或其它哺乳动物的药物时，所述其它哺乳动物包括，但不限于小鼠、大鼠、豚鼠(guinea-pig)、兔、猫、狗、羊、猪、牛、猴、狒狒(baboon)、黑猩猩(chimpanzee)，分离的化合物可以直接施用，或者可以利用已知的药物制备方法配制成剂型。例如，根据患者的需要，药物可以作为糖衣片剂、胶嚢剂、酏剂和微胶嚢口服施用；或者作为与水或任何其它药学可接受的液体形成的无菌溶液注射剂或悬浮液注射剂的形式非口服施用。例如，可以将化合物与药学可接受的载体或介质混合成为一般接受的药物实施所需的单位剂型，所述载体或介质具体有无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂(excipient)、溶媒(vehicle)、防腐剂、粘合剂等。这些制剂中有效成分的量使指定范围内的合适剂量能够获得。能够混合到片剂和胶嚢中的添加剂的例子包括但不限于粘合剂，包括明胶、玉米淀粉、黄蓍胶(tragacanthgum)和阿拉伯胶；赋形剂，包括结晶纤维素；溶胀剂，包括玉米淀粉、明胶和海藻酸(alginicacid);润滑剂，包括硬脂酸镁；增甜剂例如蔗糖、乳糖或糖精；和调味剂，包括薄荷(peppermint)、spearmint、Gaultheriaadenothrix油禾口楼冲兆。当单4立剂型为月交嚢剂时，上述成分中还可以包括液体载体，例如油。注射用无菌组合物可以使用适于注射用的溶媒例如注射用蒸馏水或盐溶液，按照标准的药物配制方式进行配制。生理盐水、葡萄糖以及包含辅料如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠的其它等渗液体，可用作注射用水溶液。这些可以与合适的增溶剂组合使用，所述增溶剂例如醇，特别是乙醇、多元醇例如丙二醇和聚乙二醇，非离子表面活性剂，例如Polysorbate80(TM)和HCO-50。芝麻油或大豆油是油性液体的实例，所述油性液体可以与苯曱酸千酯或苯曱醇组合使用作为增溶剂，还可与緩冲液，如磷酸盐緩沖液和乙酸钠緩冲液；镇痛剂，如盐酸普鲁卡因；稳定剂，如苯曱醇、酚；和/或抗氧化剂配制在一起。制备的注射剂可以装入到合适的安瓿(ampoule)中。可以利用本领域技术人员所公知的方法给患者施用本发明的药物组合物，例如通过动脉内、静脉内或经皮注射，以及鼻内、气管内、肌肉内或口服给药施用于患者。施用剂量和方法根据患者的体重和年龄以及施用方法而变化；不过，本领域技术人员能够按常规选择它们。如果所述化合物由DNA编码，可将该DNA插入到基因治疗载体中，并施用该载体以进行治疗。施用的剂量和方法因患者的体重、年龄和症状而异，不过，本领域技术人员能够合适地选择它们。举例来说，虽然结合本发明的蛋白质并调节其活性的化合物的用量根据其症状存在一些差异，但当向正常成年人(体重60kg)口服施用时，剂量一般为约0.1mg-约100mg每天，优选为约1.0mg-约50mg每天，更优选为约1.0mg-约20mg每天。当以注射剂形式向标准成年人(体重60kg)非胃肠道施用时，虽然根据患者、靶器官、症状和施用方法存在一些差异，但方便的做法是静脉内注射约0.01mg-约30mg每天，优选约0.1mg-约20mg每天，更优选约0.1mg-约10mg每天的剂量。在其它动物的情况下，可以按换算为60kg体重的量施用。IV.食道癌的监测和预后治疗效力的评估本文鉴定的差异表达的EC相关基因还使得监测EC治疗过程成为可能。在该方法中，从接受EC治疗的受试者提供测试细胞群体。如果希望的话，在治疗前、治疗中和治疗后的不同时间点从受试者获得测试细胞群体。然后确定测试细胞群体中一种或多种EC相关基因的表达并与参照细胞群体中相同基因的表达相比较，其中参照细胞群体包括EC状态已知的细胞。在本发明的背景下，参照细胞尚未暴露于感兴趣的治疗。如果参照细胞群体不含有EC细胞，则测试细胞群体和参照细胞群体中EC相关基因表达的相似性表明治疗是有效的。但是，测试细胞群体中和正常对照参照细胞群体中EC相关基因表达的差异则指示较为不利的临床结果或预后。类似地，如果参照细胞群体含有EC细胞，则测试细胞群体和参照细胞群体中EC相关基因表达的差异表明感兴趣的治疗是有效的，而测试群体中和EC对照参照细胞群体中EC相关基因表达的相似性则指示较为不利的临床结果或预后。另外，可以将治疗后从受试者获得的生物学样品中确定的一种或多种EC相关基因表达水平(即治疗后水平)与治疗前从受试者获得的生物学样品中确定的一种或多种EC相关基因表达水平(即治疗前水平)相比较。如果EC相关基因是上调基因，则治疗后样品表达水平的减少表明感兴趣的治疗是有效的，而治疗后样品表达水平的增加或维持则指示较为不利的临床结果或预后。相反，如果EC相关基因是下调基因，则治疗后样品表达水平的增加表明感兴趣的治疗是有效的，而治疗后样品表达水平的减少或维持则指示较为不利的临床结果或预后。如本文中使用的，术语"有效的，，(efficacious)表明治疗引起下列事项病理性上调基因表达的减少，病理性下调基因表达的增加，或者受试者中食道导管癌的大小、患病率(prevalence)或转移可能性的降低。当预防性地施加感兴趣的治疗时，术语"有效的"意思是所述治疗延迟或防止食道肿瘤形成，或者延迟、防止或减轻临床EC的症状。可以使用标准临床规程来评价食道肿瘤。另外，可以结合任何已知的EC诊断或治疗方法来确定有效性。例如，可以通过鉴定症候性异常，例如体重减轻、腹痛、背痛、食欲不振、恶心、呕吐和全身倦怠、衰弱和黄疽，来"^断EC。患有食道癌的受试者的预后评估本发明还提供评估患有EC的受试者预后的方法，包括将测试细胞群体中一种或多种EC相关基因的表达与参照细胞群体中相同的EC相关基因的表达相比较的步骤，其中参照细胞群体来自一系列疾病分期的患者。通过比较一种或多种EC相关基因在测试细胞群体中和参照细胞群体中的基因表达，或者随时间比较来自受试者的测试细胞群体中的基因表达图式，可以评价受试者的预后。例如，一种或多种上调EC相关基因，包括表2,5或7所列基因的表达在测试样品中相比于正常对照样品的增力口，或者一种或多种下调EC相关基因，包括表1,4或6所列基因的表达在测试样品中相比于正常对照样品的减少，指示较为不利的预后。相反，表l、2和4-7中所列的一种或多种EC相关基因的表达在测试样品中与在正常对照样品中的相似性，指示受试者较为有利的预后。优选地，可以通过比较选自表l、2和4-7所列基因的基因的表达模式，来评估受试者的预后。另外，本发明提供了一种预测受试者中食道癌转移的方法，所述方法包括下列步骤(a)检测从所述受试者采集的标本中一种或多种标志物基因的表达水平，其中所述一种或多种标志物基因选自ECNo.1544_1679(表4-5)所示基因；(b)将所述标本中一种或多种标志物基因的表达水平与转移阳性病例和转移阴性病例的一种或多种标志物基因的表达水平相比较；和移的高风险，且其中表达水平类似于转移阴性病例表达水平的标本表^食道癌转移的低风险。或者，本发明提供一种预测受试者中食道癌复发的方法，所述方法包括下列步骤(a)检测从所述受试者采集的标本中一种或多种标志物基因的表达水平，其中所述一种或多种标志物基因选自ECNo.1680-1716(表6-7)所示基因；(b)将所述标本中一种或多种标志物基因的表达水平与复发阳性病例和复发阴性病例的一种或多种标志物基因的表达水平相比较；和发的高风险，且其中表达水平类似于转移阴性病例表达水平的标本表明食道癌复发的低风险。本文所鉴定的差异表达的ECNo.1544-1679(表4-5)或ECNo.1680-1716(表6-7)还可预测受试者中食道癌的转移和复发。在该方法中，从接受食道癌治疗的患者提供测试生物学样品。如果希望的话，在治疗(例如手术)之前、之中和之后的不同时间点从受试者获得多个生物学样品。然后确定样品中选自ECNo.1544-1679(表4-5)或ECNo.1680-1716(表6-7)的一种或多种基因的表达，并与有和/或没有食道癌转移和复发的参照样品中相同基因的表达相比较。在本发明中，可以使用获自转移阴性的患者的食道癌细胞作为转移阴性病例的参照样品。例如，一般而言，当通过病理诊断在手术切除的肿瘤中未观察到淋巴结转移时，患者是转移阴性的。因此，在一些优选的实施方案中，可以通过包括下列步骤的方法预测食道癌转移(i)检测标本中选自ECNo,1544-1679(表4-5)的一种或多种标志物基因的表达水平，所述标本采集自要预测食道癌转移的受试者，(ii)将所述标本中所述一种或多种标志物基因的表达水平与来自转移阴性标本的相同的一种或多种标志物基因的表达水平相比较，和(iii)其中与来自转移阴性标本的相同的一种或多种标志物基因的表达水平相比，步骤(i)中选自ECNo.1544-1602(表4)的一种或多种基因的表达水平减少，或者步骤(i)中选自ECNo.1603-1679(表5)的一种或多种基因的表达水平增加，表明所述受试者患有或有风险发生食道癌转移。类似地，在本发明中，可以使用获自复发阴性患者的食道癌细胞作为复发阴性病例的参照样品。例如，一般而言，当手术后32个月内未观察到复发时，患者是复发阴性的。因此，在一些优选的实施方案中，可以通过包括下列步骤的方法预测食道癌复发(i)才企测标本中选自ECNo.1680-1716(表6-7)的一种或多种标志物基因的表达水平，所述标本采集自要预测食道癌复发的受试者，(ii)将所述标本中所述一种或多种标志物基因的表达水平与来自转移阴性标本的相同的一种或多种标志物基因的表达水平相比较，和(iii)其中与来自转移阴性标本的相同的一种或多种标志物基因的表达水平相比，步骤(i)中选自ECNo.1680-1688(表6)的一种或多种基因的表达水平减少，或者步骤(i)中选自ECNo.1689-1716(表7)的一种或多种基因的表达水平增加，表明所述受试者患有或有风险发生食道癌复发。在所述方法中，ECNo.1544-1679(表4-5)或ECNo.1680-1716(表6-7)的表达水平可以通过如下任一方法^:测(a)检测ECNo.1544-1679(表4-5)或ECNo.1680-1716(表6-7)的mRNA，(b)检测ECNo.1544-1679(表4画5)或ECNo.1680-1716(表6画7)的蛋白，和(c)检测ECNo.1544-1679(表4画5)或ECNo.1680-1716(表6画7)的蛋白的生物学活性。本发明还提供用于预测转移或复发的试剂盒，其中所述试剂盒包括选自下列的任一组分(a)用于检测ECNo.1544-1679(表4-5)或ECNo.1680-1716(表6-7)的mRNA的试剂，(b)用于检测ECNo.1544-1679(表4-5)或ECNo.1680-1716(表6-7)的蛋白的试剂，和(c)用于检测ECNo.1544-1679(表4-5)或ECNo.1680-1716(表6-7)的蛋白的生物学活性的试剂。V.食道癌的治疗和预防抑制食道癌的方法本发明进一步提供一种预防、治疗或减轻受试者中一种或多种EC症状的方法，该方法通过减少表2、5和7所列的一种或多种EC相关基因的表达(或者降低其基因产物的活性)，或者是通过增加表l、4和6所列的一种或多种EC相关基因的表达(或者增加其基因产物的活性)进行。可以对患有或有风险发生(或易感)EC的受试者预防性或治疗性地施用合适的治疗化合物。这样的受试者可以通过标准临床方法来鉴定，或者通过检测表1、2和4-7所列的一种或多种EC相关基因的异常表达水平，或者其基因产物的异常活性来鉴定。在本发明的背景下，合适的治疗剂包括，例如,细胞周期调节、细胞增殖和蛋白激酶活性的抑制剂。本发明的治疗方法可包括增加如下所述基因中的一种或多种基因产物的表达、功能或表达和功能两者的步骤，其中所述基因在EC细胞中与EC细胞所来源的相同组织的正常细胞相比表达减少(为"下调"或"过低表达"基因)。在这些方法中，用有效量的化合物治疗受试者，其中所述化合物增加受试者中一种或多种过低表达(under-expressed)(下调)基因的量。施用可以是全身性的或者局部的。合适的治疗性化合物包括过低表达基因的多肽产物，其生物学活性片段，以及编码过低表达基因、并且具有允许在EC细胞中表达的表达控制元件的核酸；例如，增加相对于EC细胞而言为内源的此类基因的表达水平(即上调过低表达的一种或多种基因)的作用物质。施用此类化合物来对抗受试者食道细胞中异常的过低表达的一种或多种基因的影响，并改善受试者的临床状况。或者，本发明的治疗方法可包括减少如下所述基因的一种或多种基因产物的表达、功能或表达和功能两者的步骤，其中所述基因在食道细胞中表达异常增加(为"上调，，或"过高表达(over-expressed)"基因)。可以利用本领域已知的数种方法中的任何方法来抑制表达。例如，可以对受试者施用抑制或拮抗一种或多种过高表达基因之表达的化合物，例如核酸，例如破坏过高表达的一种或多种基因之表达的反义核酸或小干扰RNA。抑制性核酸如上所述，可以使用与表2、5和7所列的EC相关基因的核苷酸序列互补的抑制性核酸(例如反义寡核苦酸、siRNA、核酶)来降低基因的表达水平。例如，与表2、5和7中所列食道癌中上调的EC相关基因互补的抑制性核酸对食道癌治疗是有用的。具体地说，本发明的抑制性核酸可以如下起作用结合表2、5和7所列的EC相关基因或相应的mRNA,从而抑制基因的转录或翻译，促进mRNA降解，和/或抑制表2、5和7所列的EC相关基因所编码的蛋白质的表达，由此抑制这些蛋白的功能。本文所使用的术语"抑制性核酸"涵盖与靶序列完全互补的核苷酸，和具有一个或多个核苷酸错配的核苷酸，只要抑制性核酸能够特异性地与靶序列杂交。本发明的抑制性核酸包括在至少15个连续核苷酸的范围内具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的多核苷酸。可以使用本领域已知的算法确定序列同一性。一种有用的算法是BLAST2.0,最初记载于Altschuletal.,(1990)J.Mol.Biol.215:403-10。用于进行BLAST分析的软件通过美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyTechnology)而向公众公开(可在万维网(ncbi.nlm.nih.gov)访问h该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字(word)来鉴定高得分对(highscoringpairs)，其中上述被鉴定的短字串当与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或者满足某些正值阈值分数(positive-valuedthresholdscore)T。T为相邻字得分阈值(neighborhoodwordscorethreshold)(Altschuletal.,supra)。将初始命中的相邻字作为源头(seeds)来启动搜索，搜索含有它们的更长的HSP。然后，只要累积比对得分能够增加，使命中的字沿着每个序列向两个方向延伸。累积得分的计算，对于核苷酸序列使用参数M(对匹配残基对赏分，总是X))和N(对错配残基罚分，总是<0)。对于氨基酸序列，则使用打分矩阵(scoringmatrix)来计算累积得分。在下述情况下，每一方向上命中字的延伸停止累积比对得分较其达到过的最大值下降了X的量；由于一个或多个得负分的残基比对的积累，导致累积得分归于零或小于零；或者到达了任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用下列值作为缺省值字长(wordlength)(W)11,期望值(E)10、截止(cutoff)100,M=5，N=-4，以及比较两条链。对氨基酸序列，BLASTP程序使用下列缺省值字长(W)3,期望值(E)10，及BLOSUM62打分矩阵(见Henikoff&Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-9).另一种有用的序列比对算法的例子是PILEUP。PILEUP使用进行性、逐对(pairwise)的比对，从一组相关序列生成多重序列比对。它还可以作出显示生成所述比对所用的聚类关系(clusteringrelationship)的树状图。PILEUP使用Feng&Doolittle,(1987)J.Mol.Evol.35:351-60所述的进行性比对方法的简化形式。所用的方法与Higgins&Sharp,(1989)CABIOS5:151-3记载的方法类似。该程序可以比对，例如，最多达300个最大长度为5000字的序列。多重比对程序首先对两个最相似的序列进行逐对比对，产生两个比对序列的群(cluster)。然后可以将该群与下一最相关的序列比对，或者与比对序列的群比对。两个序列群的比对，可以通过两个个体序列逐对比对的简单延伸来实现。最终的比对是通过一系列进行性逐对比对来达到的。该序列也可以用来作出反映聚类关系的系统树或树状图。该程序是通过指定用于序列比较的区域的特定序列及它们的氨基酸或核苷酸坐标来运行的。例如，为了确定单体域家族中的保守氨基酸，或者比较家族中单体域的序列，对本发明的序列或者编码核酸进行比对，以提供结构-功本发明的反义核酸通过下述方式作用于产生EC相关标志物基因编码蛋白的细胞结合编码所述蛋白的DNA或mRNA，抑制它们的转录或翻译，促进mRNA降解，抑制蛋白质的表达，从而导致蛋白功能的抑制。本发明的反义核酸通过与对该核酸无活性的适当基质材料掺混，制成外用制剂，例如搽剂或罨剂。并且根据需要，通过添加赋形剂、等渗剂(isotonicagents)、增溶剂、稳定剂、防腐剂、镇痛剂等，可以将本发明的反义核酸配制成例如片剂、粉剂、颗粒、胶嚢、脂质体胶嚢、注射剂、溶液、滴鼻剂和冻干剂。这些剂型可通过下文的^^知方法制备。给患者施用本发明的反义核酸，可以直接将其施于患处，也可以将其输入血管以使其到达患处。使用反义封固介质(antisense-mountingmedium)可以提高持久性和膜通透性。所述反义封固介质的例子包括但不限于脂质体、聚-L-赖氨酸、脂质、胆固醇、脂质转染试剂或它们的衍生物。本发明的抑制性核酸的剂量，可以根据患者的状况适当调整，并以所需的量^f吏用。例如，可以施用的剂量范围为0.1至100mg/kg，优选0.1至50mg/kg。本发明的反义核酸抑制本发明蛋白质的表达，因而可以用于抑制本发明蛋白质的生物活性。此外，含有本发明的反义核酸的表达抑制剂也是有用的，因为它们可以抑制本发明的蛋白质的生物活性。基因表达上调的原因例如细胞的恶性转化。在靶细胞中，siRNA与互补于表2、5和7中所列EC相关基因之一的转录物结合，导致细胞产生的蛋白质减少。寡核苷酸的长度为至少IO个核苷酸，可以与天然存在的转录物等长。优选寡核苷酸的长度少于75、50、25个核苷酸或更短。最优选寡核苷酸的长度为19-25个核苷酸。本发明的反义核酸包括经修饰的寡核苷酸。例如，可以使用疏羰酸化的(thioated)寡核苷酸以赋予针对寡核苷酸核酸酶的抗性。，所述而且，可以使用针对标志物基因的siRNA以降^f氐标志物基因的表达水平。本说明书中，术语"siRNA"指能阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。可以采用将siRNA导入细胞的标准技术，这其中包括以DNA为RNA转录的模板的技术。在本发明的背景下，siRNA含有针对上调标志物基因，如表2、5和7所列的EC相关基因的有义核酸序列和反义核酸序列。构建siRNA以使单一转录物具有来自靶基因的有义序列和互补的反义序列，例如发夹结构。EC相关基因的siRNA,包括表2、5和7所列的那些EC相关基因的siRNA，它们可与靶mRNA杂交，因此它们通过与正常单链mRNA转录物结合，干扰由表2、5和7中所列的EC相关基因所编码的多肽的翻译，从而减少或抑制所述蛋白的产生。在本发明的背景下，siRNA的长度优选为少于500、200、100、50或25个核苷酸或更短。更优选地，siRNA的长度为19-25个核苦酸。用于产生ECT2siRNA的示例性核酸序列包括SEQIDNO:8和9的核苷酸序列作为靶序列。用于产生CDC45LsiRNA的示例性核酸序列包括SEQIDNO:10和11的核苦酸序列作为靶序列。为了增强siRNA的抑制活性，可以将一个或多个尿嘧啶核苷酸"u"添加到靶序列的反义链的3，端。待添加的"u"的数目为至少2个，通常为2-10个，优选为2-5个。添加的"u"在siRNA的反义链的3，端形成单链。可以将EC相关基因的siRNA，包括表2、5和7所列的那些EC相关基因的siRNA，以能与mRNA转录物结合的形式直接导入细胞。或者，编码siRNA的DNA也可以携带于载体中。载体可以例如这样制备将EC相关基因靶序列克隆到表达载体中，其中所述表达载体具有可操作连接的调控序列，所述调控序列以这样的方式位于所述靶序列的侧翼，使得两条链均有可能得以表达(通过DNA分子的转录)(Lee，N.S.，etal.,(2002)NatureBiotechnology20:500-5.)。与EC相关基因mRNA反义的RNA分子由第一启动子(例如位于所克隆DNA3，侧的启动子序列)转录，而作为EC相关基因mRNA之有义链的RNA分子则由第二启动子(例如位于所克隆DNA5'侧的启动子序列)转录。所述有义链和反义链在体内杂交，从而产生用于沉默所述EC相关基因的siRNA构建体。或者，可以利用两个构建体生成siRNA构建体的有义链和反义链。克隆的EC相关基因可编码具有二级结构例如发夹的构建体，其中单一转录物具有来自靶基因的有义序列和互补反义序列。为了形成发夹环结构，可在有义序列和反义序列之间放置由任意核苷酸序列组成的环序列(loopsequence).因此，本发明还提供具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，的siRNA，其中[A]为核糖核苷酸序列，其对应于选自表2，5或7中所列基因的序列，[B]为由3-23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列，和[A，]是由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。[A]区与[A，]区杂交，然后形成由[B]区组成的环(loop)。所述环序列的长度可以为3-23个核苷酸。所述环序列，例如可以选自如下序列(在万维网上ambion.com/techlib/tb/tb—506.html找到)。此外，由23个核香酸组成的环序列也提供活性siRNA(Jacque,J,M.，etal.，(2002)Nature418:435-8.)。CCC,CCACC或CCACACC:Jacque,J.M,etal.,(2002)Nature,Vol.418:435-8。UUCG:Lee，N.S.，etal.,(2002)NatureBiotechnology20:500画5,;Fruscoloni,P.,etal.,(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(4):1639-44。UUCAAGAGA:Dykxhoorn，D.M.,etal.,(2003)NatureReviews分子细胞Biology4:457-67。因此，在一些实施方案中，环序列可以选自下组CCC，UUCG,CCACC,CCACACC和UUCAAGAGA。优选的环结构是UUCAAGAGA(DNA中为"ttcaagaga")。在本发明的背景下适于使用的示例性发夹siRNA包括对于ECT2画siRNAgaugcacucaccuuguagu國[b]-acuacaaggugagugcauc(用于SEQIDNO:8所示靶序列)ggcaaauacuccugagcuc隱[b]-gagcucaggaguauuugcc(用于SEQIDNO:9所示靶序列)对于CDC45L-siRNAgagacauccucuuugacua陽[b]-uagucaaagaggaugucuc(用于SEQIDNO:10所示靶序列)cagaccagugggugcaaga-[b]画ucuugcacccacuggucug(用于SEQIDNO:11所示輩巴序列)适当的siRNA的核苷酸序列可4吏用可/人万维网Ambion网站http:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html4寻至U^KjsiRNAi殳i十i十算机程序来设计。所述计算机程序基于如下规程选择核苷酸序列用于siRNA合成。选择siRNA把位点1.从目标转录物的AUG起始密码子开始向下游扫描，寻找AA二核苦酸序列。记录每个AA的出现及其3'侧邻近的19个核苷酸作为siRNA靶位点。根据Tuschl等在(1999)GenesDev13(24):3191-7，不推荐针对5'和3'非翻译区(UTRs)和邻近起始密码子的区域(75个碱基之内)设计siRNA，因为上述区域可能富含调控蛋白结合位点。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可干扰与siRNA内切核酸酶复合物的结合。2.将所述潜在靶位点与人基因组数据库进行比较，将与其它编码序列具有显著的序列同一性的任何靶序列排除在考虑之外。可采用BLAST2.0(AltschulSF，etal.，NucleicAcidsRes.1997;25(17):3389-402;AltschulSF，JMolBiol.1990;215(3):403-10.)进行序列同一性搜索，它可以在NCBI服务器ncbi,nlm.nih.gov/BLAST/找到。3.选择合格的靶序列用于合成。使用Ambion算法，优选可沿着待评价的基因的长度选择数个靶序列。侧翼邻接于EC相关基因序列的调节序列可以相同，也可以不同，使得它们的表达可以独立地以时间性或空间性方式得到调控。通过将EC相关基因的模板分别克隆到载体上在细胞内转录siRNA,其中所述载体含有例如来自小核RNA(snRNA)U6的RNA聚合酶III转录单位或人HIRNA启动子。为了将载体导入细胞，可以使用转染增强剂(transfection-enhancingagent)。FuGENE(Rochediagnostices),Lipofectamin2000(Invitrogen)，Oligofectamin(Invitrogen)和Nucleofactor(WakopureChemical)可以用作转染增强剂。本发明的反义寡核苷酸或siRNA抑制本发明的多肽的表达，因而可以用于抑制本发明的多肽的生物学活性。并且，含有本发明的反义寡核苷酸或siRNA的表达抑制剂是有用的，因为它们可以抑制本发明的多肽的生物学活性。因此，包含一种或多种本发明的反义寡核苦酸或siRNA的组合物对于治疗食道癌是有用的。抗体或者，可以通过施用与基因产物结合或以其它方式抑制基因产物功能的化合物，来抑制在EC中过高表达的基因的一种或多种基因产物的功能。例如，所述化合物是与一种或多种过高表达的基因产物或基因产物结合的抗体。本发明涉及抗体特别是针对由上调标志物基因所编码的蛋白的抗体、或所述抗体的片段的用途。如本说明书中使用的，术语"抗体"指一种具有特定结构的免疫球蛋白分子，其仅与用于合成该抗体的抗原(即上调标志物的基因产物)或与其紧密相关的抗原相互作用(即结合)。另外，抗体可以是抗体片段或修饰抗体，只要它结合标志物基因编码的一种或多种蛋白。例如，抗体片段可以是Fab，F(ab，)2,Fv，或单链Fv(scFv),其中来自重链和轻链的Fv片段通过合适的接头连接(HustonJ.S.etal.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5879-83(1988))。更具体地说，可以用酶，包括木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体来制备抗体片段。或者，可以构建编码抗体片段的基因，将其插入表达载体，然后在合适的宿主细胞中表达(参见例如，CoM.S.etal.丄Immunol.152:2968-76(1994);BetterM.andHorwitzA.H.MethodsEnzymol.178:476-96(1989);PluckthunA.andSkerraA.MethodsEnzymol.178:497-515(1989);LamoyiE.MethodsEnzymol.121:652-63(1986);RousseauxJ.etal.MethodsEnzymol.121:663-9(1986);BirdR.E.andWalkerB.W.TrendsBiotechnol.9:132-7(1991))。抗体可以通过与各种分子如聚乙二醇(PEG)偶联进行修饰。本发明提供这样的修饰抗体。可通过将抗体进行化学修饰来获得修饰抗体。这些修饰方法是本领域常规的。或者，抗体可包括嵌合抗体，其具有来自非人抗体的可变区及来自人抗体的恒定区，或者人源化抗体，其包括来自非人抗体的互补决定区(CDR)、和来自人抗体的框架区(FR)及恒定区。所述抗体可利用已知技术制备。针对癌细胞中发生的特异性分子变化的癌症疗法，已经通过下述抗癌药的临床开发和管理机构批准得到了确认用于治疗晚期乳腺癌的曲妥单抗(trastuzumab)(Herceptin),用于治疗慢性髓性白血病的曱石黄酸伊马替尼(imatinibmethylate)(Gleevec),用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的gefitinib(Iressa)和用于B细月包'淋巴瘤和套细月包(mantlecell)'淋巴瘤的rituximab(抗CD20mAb)(CiardielloFandTortoraG.(2001)ClinCancerRes.;7(10):2958-70.Review.;SlamonDJ,etal.,(2001)NEnglJMed.;344(11):783-92.;RehwaldU，etal.,(2003)Blood.;101(2):420-4.;FangG,etal.,(2000).Blood,96,2246-53.)。这些药物临床上是有效的，并且比传统抗癌剂具有更好的耐受性，因为它们仅靶向转化细胞。因此，这些药物不仅改善了癌症患者的存活率和生活质量，而且验证了分子靶向癌症疗法的理念。另夕卜，靶向药物在与标准化疗组合使用时，可以增强标准化疗的效力(GianniL.(2002).Oncology,63Suppl1，47-56.;KlejmanA,etal"(2002).Oncogene,21,5868-76.)。因此，未来的癌症治疗将会涉及将常规药物与针对肿瘤细胞不同特性如血管生成(angiogenesis)和浸润性(invasiveness)的草巴物特异性试剂组合。这些调节方法可以离体(exvivo)、体外(例如通过在作用物质的存在下培养细胞)或体内(例如通过给受试者施用作用物质)进行。所述方法包括作为抵消(counteract)差异表达基因的异常表达或其基因产物的异常活性的疗法，施用蛋白质或蛋白质的组合、或者核酸分子或核酸分子的组合。以基因和基因产物的表达水平或生物活性分别增加(相对于未患有疾病或病症的受试者)为特征的疾病和病症，可以用拮抗(即降低或抑制)一种或多种过高表达基因的活性的治疗剂来加以治疗。可以治疗性或预防性地施用拮抗活性的治疗剂。因此，可以用于本发明背景下的治疗剂包括例如(i)过高表达或过低表达的一种或多种基因的多肽或其类似物、衍生物、片段或同源物；(ii)抗过高表达基因或基因产物的抗体；(iii)编码过高表达或过低表达的一种或多种基因的核酸；(iv)反义核酸或"功能欠损(dysflmctional)"的核酸(即，由于在一种或多种过高表达基因的核酸内发生异源插入所致)；(v)小干扰RNA(siRNA);或(vi)调节剂(即，改变过高表达或过低表达多肽与其结合配对物(bindingpartner)之间的相互作用的抑制剂、激动剂和拮抗剂)。功能欠损的反义分子用于通过同源重組来"敲除"多肽的内源性功能(参见例如Capecchi,Science244:128892,1989)。以生物学活性下降(相对于未患有疾病或病症的受试者)为特征的疾病和病症，可以使用提高活性的治疗剂(即，对该活性的激动剂)进行治疗。可以用治疗或预防的方式施用上调活性的治疗剂。可以利用的治疗剂包括但_不限于多肽(或其类似物(analog)、衍生物、片段或同源物(homolog))或提高生物利用度(bioavailability)的激动剂。通过获取患者组织样品(例如从活检组织)、并在体外检测其RNA或肽水平、表达的肽(或表达有所改变的基因的mRNA)的结构和/或活性，可以对肽和/或RNA进行定量，从而可以容易地检测出水平的上升或下降。本领域公知的方法包括但不限于免疫测定法(例如在Western印迹分析、免疫沉淀后进行十二烷基磺酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫细胞化学等)和/或检测mRNA表达的杂交测定(例如Northern测定、斑点印迹、原位杂交等)。预防性施用在出现疾病的明显临床症状之前进行，以阻止疾病或病症的出现或者延迟其进程。本发明的治疗方法可以包括使细胞与作用物质接触的步骤，其中所述作用物质调节一种或多种差异表达基因的基因产物的活性。调节蛋白质活性的作用物质的例子包括但不限于核酸、蛋白质、这些蛋白质的天然存在的同源酉己体(naturallyoccurringcognateligands)、肽、肽沖莫才以物及其它小分子。例如，合适的作用物质可以刺激一种或多种差异性过低表达基因的一种或多种蛋白质的活性。针对食道癌的接种本发明还涉及治疗或预防受试者中食道癌的方法，该方法包括如下步骤对所述受试者施用疫苗，其中所述疫苗包含由选自表2、5和7中所列EC相关基因(即上调基因)的一种或多种核酸所编码的一种或多种多肽、该多肽的免疫活性片段(即表位)、或者编码该多肽或其片段的多核苷酸。所述多肽的施用在受试者中诱导抗肿瘤免疫。为了诱导抗肿瘤免疫，给有需要的受试者施用由选自表2、5和7中所列EC相关基因的一种或多种核酸所编码的一种或多种多肽、该多肽的免疫活性片^a或者编码该多肽或其片段的多核芬酸。另外，由选自表2、5和7中所列EC相关基因的一种或多种核酸所编码的一种或多种多肽可诱导分别针对转移性和复发性食道癌的抗肿瘤免疫。多肽或其免疫活性片段可以用作针对EC的疫苗。在一些情况下，蛋白质或其片段可以以结合于T细胞受体(TCR)的形式，或者以由抗原呈递细胞(APC)如巨噬细胞、树突状细胞(DC)或B细胞呈递的形式进行施用。由于DC具有强抗原呈递能力，所以在APC中DC是最优选的。免疫活性片段(即表位)的鉴定是本领域公知的。B细胞表位可以由连续的氨基酸形成，或者由通过蛋白质三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位，典型地，当暴露于变性溶剂时得以保持，而通过三级折叠形成的(即由构象确定的)表位则在变性溶剂处理时丧失。表位典型地在特有的空间构象中包括至少3个，更通常至少5个或8-10个氨基酸。确定表位空间构象的方法包括，例如，x射线晶体学和2维核磁共振。见，<列^口，EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology,Vol.66,GlennE.Morris,Ed.(1996)。识别相同表位的抗体，可以用显示一种抗体阻断另一种抗体结合靶抗原的能力的筒单免疫测定(例如竟争性ELISA或固相放射免疫测定(SPRIA))来加以鉴定。T细胞对于CD8细胞识别大约9个氨基酸的连续表位，或者对于CD4细胞而言识别大约13-15个氨基酸的连续表位。识别表位的T细胞可以通过测量抗原依赖性增殖的体外测定来鉴定，其中抗原依赖性增殖是根据下列事项确定的被刺激的T细胞响应于表位的3H胸苷摄取(Burkeetal.,J.Inf.Dis.170,1110-19(1994))、抗原依赖性杀伤(细胞毒性T淋巴细胞测定，Tiggesetal.，J.Immunol.(1996)156:3901-10)、或细胞因子的分泌。确定免疫原性表位的方法记载于，例如Reineke，etal.,CurrTopMicrobiolImmunol(1999)243:23-36;Mahler，etal"ClinImmunol(2003)107:65-79;AnthonyandLehmann,Methods(2003)29:260-9;ParkerandTomer，MethodsMolBiol(2000)146:185-201;DeLisser,MethodsMolBiol(1999)96:1卜20;VandeWater,etal"ClinImmunolImm漏pathol(1997)85:229-35;Carter,MethodsMolBiol(1994)36:207-23;及Pettersson，MolBiolRep(1992)16:149-53。在本发明中，针对EC的疫苗是指当接种到动物体内时具有诱导抗肿瘤免疫能力的物质。根据本发明，表2、5和7所列的EC相关基因编码的多肽或其片段是HLA-A24或HLA-A5150201限制性表位肽，它们诱导针对表达表2、5和7所列的EC相关基因的EC细胞的强烈特异性免疫应答。因此，本发明还涵盖使用所述多肽诱导抗肿瘤免疫的方法。一^t殳而言，抗肿瘤免疫包括免疫应答，该免疫应答包括-诱导针对肿瘤的细胞毒性淋巴细胞，-诱导识别肿瘤的抗体，和-诱导抗肿瘤细胞因子产生因此，当某蛋白质接种到动物体内时诱导任一种所述免疫应答时，确定该蛋白质具有抗肿瘤免疫诱导作用。由蛋白质诱导的抗肿瘤免疫可以通过在体内或体外观察宿主中的免疫系统针对该蛋白质的应答而进行检测。例如，检测细胞毒性T淋巴细胞的诱导的方法是公知的。具体地，进胞。以抗原特异性方式应答于APC所呈递抗原的T细胞由于该抗原的刺激而分化为细胞毒性T细胞(或细胞毒性T淋巴细胞；CTL)，然后增殖(这称为T细胞活化)。因此，肽的CTL诱导可以通过将该肽经由APC呈递于T细胞，然后检测CTL的诱导来进行评估。此外，APC具有激活CD4+T细胞，CD8+T细胞，巨噬细胞，嗜酸性粒细胞和NK细胞的作用。由于CD4十T细胞和CD8+T细胞在抗胂瘤免疫中也是重要的，可使用这些细胞的激活效应作为指标来评价肽的抗肿瘤免疫诱导作用。参见Coligan,CurrentProtocolsinImmunology,supra。使用树突细胞(DC)作为APC来评价CTL诱导作用的方法在本领域中是众所周知的。在APC中，DC是具有最强CTL诱导作用的代表性APC。在该方法中，首先使受试多肽与DC接触，然后使该DC与T细胞接触。在与DC接触后，如果检测出具有针对目标细胞的细胞毒性作用的T细胞，则表示该受试多肽具有诱导细胞毒性T细胞的活性。CTL的抗肿瘤活性可以例如采用"Cr标记的肺瘤细胞的裂解(lysis)作为指标来进行检测。或者，采用SH-胸苦摄取活性或LDH(乳糖脱氢酶)释放作为指标来评价肿瘤细胞损伤程度的方法也是众所周知的。除DC外，外周血单个核细胞(PBMC)也可用作APC。已报道通过在存在GM-CSF和IL-4的条件下培养PBMC增强了CTL的诱导。相似地，已显示通过在存在钥孔血蓝蛋白(KLH)和IL-7的条件下培养PBMC诱导了CTL。通过这些方法确定为具有CTL诱导活性的测试多肽，认为是具有DC激活效应和随后的CTL诱导活性的多肽。因此，诱导针对肿瘤细胞的CTL的多肽可用作抗肿瘤的疫苗。此外，通过与所述多肽接触而获得诱导针对肿瘤的CTL的能力的APC也可用作抗肿瘤的疫苗。此外，通过APC呈递多肽抗原而获得细胞毒性的CTL也可用作抗肿瘤的疫苗。这些利用由APC和CTL所致的抗肿瘤免疫的肿瘤治疗方法称为细胞免疫疗法。一般来说，当使用多肽用于细胞免疫疗法时，已知组合多种具有不同结构的多肽并使其与DC接触可增加CTL诱导的效率。因此，当用蛋白质片段刺激DC时，使用多种类型的片段的混合物是有利的。可选地，多肽对抗肿瘤免疫的诱导可以通过观察抗胂瘤抗体产生的诱导来进行确认。例如，当用多肽免疫的试验动物中诱导产生抗该多肽的抗体并且这些抗体抑制肿瘤细胞生长时，所述多肽可视为具有诱导抗肿瘤免疫的能力。施用本发明的疫苗可诱导抗肿瘤免疫，而抗肿瘤免疫的诱导使得治疗和预防EC成为可能。抗癌治疗或癌症发病的预防可以包括任何下述步骤诸如癌性细胞生长的抑制，癌症的退缩(involution)以及癌发生的抑制。癌症的治疗或预防还包括患有癌症的个体死亡率和发病率降低、血液中肿瘤标志物水平下降、癌症伴发的可检测症状的緩解等。所述治疗性和预防性效果优选是统计学上显著的。例如，在比较疫苗对细胞增殖性疾病的治疗或预防效果与未施用疫苗的对照的观察中，显著性水平为5%或更低。例如，统计学分析-使用Student'st-检验，Mann-WhitneyU-检验或ANOVA。上述具有免疫活性的蛋白质或编码该蛋白质的载体可与佐剂组合。佐剂是指当与具有免疫活性的蛋白质共同(或顺序)施用时能增强针对该蛋白质的免疫应答的化合物。例示性的佐剂包括但不限于霍乱毒素(choleratoxin)、沙门氏菌毒素(salmonellatoxin)、明饥(alum)等。此外，本发明的疫苗可适宜地与药学可接受的载体组合。这样的载体的例子包括但不限于无菌水、生理盐水、磷酸盐緩冲液、培养液等。此外，疫苗可根据需要包含稳定剂，悬浮剂，防腐剂，表面活性剂等。疫苗可全身或局部地施用，例如经由皮内途径、肌肉途径、皮下途径、经皮途径、含服途径或鼻内途径施用。疫苗施用可以通过单次施用进行，或者通过多次施用来强化(boost)。剂量在下文"^兌明。当使用APC或CTL作为本发明的疫苗时，可以例如通过离体方法治疗或预防肿瘤。更具体地，收集接受治疗或预防的受试者的PBMC,使细胞与所述多肽在离体条件下接触，在诱导APC或CTL后，可以将该细胞施用于受试者。可通过将编码多肽的载体在离体条件下导入PBMC中来诱导APC。体外诱导的APC或CTL可以在施用前进行克隆。通过克隆和培养具有高度的靶细胞破坏活性的细胞，可以更有效地实施细胞免疫治疗。此外，以该方式分离的APC和CTL不仅可以用于针对提供所述细胞的受试者进行细胞免疫治疗，还可以用于针对来自其它个体的相似类型的肿瘤进行细胞免疫治疗。开发疫苗的通用方法i己载于，例如，VaccineProtocols,RobinsonandCranage,Eds"2003，人aPress;Marshall,VaccineHandbook:APracticalGuideforClinicians,2003,LippincottWilliams&Wilkins;andVaccineDeliveryStrategies,Dietrich,etal.，Eds.,2003,SpringerVerlag。药物《且合物另外，本发明提供一种用于治疗或预防细胞增殖性疾病例如癌症的药物组合物，其包括药学有效量的本发明多肽。该药物组合物可以用来激发抗肿瘤免疫。在本发明的背景下，适宜的药物制剂包括适于口服、直肠、鼻、局部(包括口腔或舌下)、阴道或非消化道(包括肌肉内、皮下和静脉内)施用的制剂，以及适于通过吸入或吹入(insufflation)施用的制剂。优选静脉内施用。制剂可以任选包装到不同的剂量单位(dosageunit)中。适于口服施用的药物制剂包括胶嚢剂、扁嚢剂(cachet)或片剂，它们各含有一定量的活性成分。适合的制剂还包括粉剂、颗粒剂、溶液、悬浮液和乳液。活性成分任选以大丸剂(bolus)、药糖剂(electuary)或糊剂(paste)的形式施用。用于口服给药的片剂和胶嚢剂可含有常规赋形剂诸如粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂和/或湿润剂。片剂可通过压缩或成型来制备，任选与一种或多种配方成分压缩或成型。压缩片剂可通过如下方法制备将自由流动形式的活性成分，如粉末或颗粒，任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑剂、表面活性剂和/或分散剂混合，在适当的机器中进行压缩。成型片剂可通过如下方法制备在适当的机器中对利用惰性液体稀释剂湿润的粉末化合物的混合物进行成型。所述片剂可根据本领域已知的方法进行包衣(coated)。口服液体制备物可以是例如水性或油性的悬浊液、溶液、乳液、糖浆或酏剂的形式；或者也可以作为干燥产物提供，在使用前用水或其它适宜溶媒构成。所述液体制备物可含有常规添加剂诸如悬浮剂，乳化剂，非水性溶媒(可包括食用油)和/或防腐剂。片剂可任选地配制以提供其中活性成分的緩释或控释。片剂的包装中可以包含每月服用的一片药物。适于非消化道施用的制剂包括水性和非水性的无菌注射溶液，其中任选地含有抗氧化剂、缓沖剂、抑菌剂(bacteriostat)和使得制剂与目标接受者的血液等张的(isotonic)溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，其中含有悬浮剂和/或增稠剂。所述制剂可以以单位剂量或多次剂量容器(unitdoseormulti-dosecontainer)提供，例如密封的安吾瓦和小瓶；还可以在冷冻-干燥(冻干的)条件下保存，仅需要在即将使用前添加无菌液体载体例如盐水、注射用水。或者，可提供所述制剂用于连续输注(conti皿ousinftision)。可以从前述的无菌粉末、颗粒及片剂的类型制备即配即用的注射溶液和悬浮液。适于直肠给药的制剂包括含有标准载体如可可脂或聚乙二醇的栓剂(suppository)。适于口内局部给药，例如口腔或舌下给药的制剂包拮"t走剂(lozenge)和软锭剂(pastille),其中锭剂在调味基质，如蔗糖和阿拉伯胶(acacia)或黄蓍胶中包含活性成分，而软锭剂在基质，如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中包含活性成分。鼻内给药时，本发明的化合物可以用作液体喷雾剂、可分散粉末，或以滴鼻剂(drop)的形式。滴鼻剂可用水性或非水性基质配制，该基质中也含有一种或多种分散剂、增溶剂和/或悬浮剂。吸入给药时，可以由吹入器、雾化器、加压包装(pressurizedpack)或其它输送气溶胶喷雾的便利装置方便地输送化合物。压缩的包装可含有适宜的喷射剂，如二氯二氟曱烷、三氯氟曱烷，二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适宜气体。在加压气溶胶的情况下，可通过提供对输送物可进行计量的阀门来确定剂量单位。或者，通过吸入或吹入给药时，化合物可以采取干粉组合物的形式，例如该化合物与适宜粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末组合物可以以单位剂量型式(unitdosageform)提供，这些剂型例如胶嚢、药筒(cartridge)、凝胶(gelatin)或发泡包(blisterpack),借助吸入器或吹入器，可由上述剂型施用所述粉末。其它的制剂包含可释放治疗剂的可植入装置及粘性贴片(adhesivepatches)。需要时，可以采用适于活性成分緩释的上述制剂。药物组合物中还可以含有其它活性成分，诸如抗微生物剂，免疫抑制剂和/或防腐剂。除了以上所述成分，本发明的制剂还可包括本领域针对具体剂型而言常规使用的其它物质，例如，适于口服的制剂可包括调味剂。优选的单位剂量制剂含有如下所述有效剂量的活性成分，或该活性成分的适当部分。举例来说，当向标准成年人(体重60kg)口服给药时，虽然根据其症状存在一些差异，但与本发明的多肽结合并调节其活性的化合物的剂量为约O.lmg-约100mg每天，优选为约l.Omg-约50mg每天，更优选为约1.0mg-约20mg每天。对于前述的各种情况，所述组合物，例如多肽和有机化合物，可以在每天约0.1-约250mg/kg的剂量范围内口服或通过注射施用。成人的剂量范围通常为约5mg-约17.5g/天，优选为约5mg-约10g/天，更优选为约100mg-约3g/天。片剂或其它以分散单元提供的单位剂型可适宜地含有这样的有效剂量或者多个这样的有效剂量的量，例如含有约5mg-约500mg，更通常为约100mg-约500mg。所用剂量将依赖于多种因素，包括受试者的年龄和性别，治疗的确切疾患及其严重程度。此外，给药途径也依赖于病症及其严重程度而变化。然而无论怎样，本领域技术人员都能在考虑上述因素的基础上常规地计算出合适的最佳剂量。VI.癌症的血清学诊断通过测量来自受试者的生物学样品中的DKK1水平，可以确定受试者中癌症的发生和癌症发病的倾向性。优选地，癌症是食道癌或者肺癌，或者二者。因此，本发明包括确定(例如测定)生物学样品中的DKK1水平。任何生物材料均可作为生物学样品用于测定DKK1水平，只要该样品中的DKK1基因或DKK1蛋白质可以被;险测。优选地，生物学样品包括血液、血清或者其它体液，例如痰。优选的生物学样品是血液或源自血液的样品。源自血液的样品包括血清、血浆或全血。根据所述方法诊断癌症的受试者优选是哺乳动物，包括人类、非人灵长类，小鼠、大鼠、犬、猫、马和牛。在本发明的一个实施方案中，检测DKK1基因的基因转录物(即DKK1蛋白)的水平以确定DKK1水平。可以使用本领域普通本领域技术人员公知的技术来检测和测量DKK1基因。由本发明检测的基因转录物包括转录和翻译产物，例如mRNA和蛋白质。例如，可以使用与DKK1基因相应的序列来构建探针，用于检测DKK1mRNA,例如通过Northern印迹分析。所述探针与受试者生物学样品中基因转录物的杂交也可以在DNA阵列上实施。例如，可以使用DKK1序列来构建引物，用来特异性扩增DKK1多核香酸，例如在基于扩增的检测方法如基于逆转录的聚合酶链式反应(RT-PCR)中进行所述扩增。在另一实施方案中，通过测量生物学样品中DKK1蛋白的量来确定DKK1水平。用于测量生物学样品中DKK1蛋白质量的方法包括免疫测定方法。在一个优选实施方案中，所述免疫测定包括ELISA。然后将生物学样品中DKK1水平与参照样品(例如正常对照样品)相关的DKK1水平相比较。术语"正常对照水平"是指典型地在未患癌症群体的生物学样品中发现的DKK1的水平。参照样品优选与测试样品具有类似的性质。例如，如果测试样品包含从待诊断或预后评估的患者收集的血清，则参照样品也应该是血清。可以同时测定来自对照和测试受试者的生物学样品中的DKK1水平，或者，作为选择，可以基于分析先前从对照组收集的样品中DKK1水平所得的结果，通过统计方法来确定正常对照水平。DKK1水平还可以用来检测癌症治疗的过程。在这种方法中，从接受癌症治疗的受试者提供测试生物学样品。优选地，癌症是食道癌和肺癌。优选地，在治疗之前、之中和之后的多个时间点从受试者获得多个测试生物学样品。然后可以将治疗后样品中的DKK1水平与治疗前样品中的DKK1水平进行比较，或者，作为选择，将其与参照样品(例如正常对照水平)比较。例如，如果治疗后的DKK1水平低于治疗前的DKK1水平，则可作出治疗有效的结论。类似地，如果治疗后的DKK1水平类似于正常对照DKK1水平，也可作出治疗有效的结论。"有效的"治疗是这样的治疗，它引起受试者中DKK1水平下降或者癌症的大小、患病率(prevalence)或转移可能性减少。当预防性地施用治疗时，"有效"意味着治疗延迟或防止癌症的出现，或者减轻癌症的症状。可以使用标准临床规程来评估癌症。另外，有效性还可以结合任何已知的癌症诊断或治疗方法来确定。例如，癌症常规上通过组织病理学i貪断，或者通过鉴定症候性异常来诊断，症候性异常诸如慢性咳嗽、声嘶、咳血、体重减少、食欲不振、气短、译鸣、支气管炎或肺炎反复发作，及胸痛。另外，通过比较来自患者的生物学样品中的DKK1水平和参照样品中的DKK1水平，本发明的癌症诊断方法还可以应用于癌症患者预后的评i"介。优选癌症是食道癌和肺癌。或者，可以在一系列疾病阶段对生物学样品中的DKK1水平进行测量，以评估患者的预后。DKK1水平相比于正常对照水平的增加提示较为不利的预后。DKK1水平相比于正常对照水平的类似性则提示患者预后较为良好。VII.评估癌症预后的方法根据本发明，新近发现DKK1的表达与患者较为不良的预后具有显著的关联(见图2)。因此，本发明提供一种确定或评估癌症患者，尤其是食道癌或肺癌患者的预后的方法，所述方法是通过检测所述患者的生物学样品中DKK1基因的表达水平，将检测到的表达水平与对照水平比较，并确定相对于对照水平有所增加的表达水平作为不良预后(不良生存)的指示。本文中，术语"预后"是指对于由病例的性质和症状所指示的疾病可能后果和疾病康复前景的预测。因此，将较为不利的、消极的、不良的预后定义为较低的治疗后生存期(survivalterm)或生存率(survivalrate)。相反、将积极的、有利的、良好的预后定义为上升的治疗后生存期或生存率。术语"评估预后"是指对患者的癌症的后果(例如恶性、癌症治愈的可能性、生存，诸如此类)进行预测、预想，或者将其与给定的检测或测量关联起来的能力。例如，通过确定DKK1的经时表达水平，可以对患者的后果(例如恶性的增加或减少、癌症级别(grade)的增加或减少，癌症治愈的可能性、生存，诸如此类)作出预测。在本发明的背景下，短语"评估(或确定)预后"意在包括对于癌症、进展(progression)、尤其是癌症复发、转移扩散和疾患再发的预测和可能性分析。所述的预后评估方法意在用于在临床上作出有关治疗方案的决定，包括治疗性介入、诊断标准诸如疾病分期、以及针对肿瘤的转移或复发所作的疾病监测和监^L。来自患者的生物学样品可以是源于待评估的受试者的任何样品，只要该样品中的DKK1基因能够被检测。优选地，所述生物学样品包括食道细胞和肺细胞(从食道和肺得到的细胞)。另外，所述生物学样品包括体液诸如痰、血液、血清或血浆。此外，样品可以是/人组织中纯化的细胞。可以在多个时间点，包括治疗之前、之中和/或之后从患者获得生物学样品。根据本发明可见，从来自患者的生物学样品中测得的DKK1基因表达水平越高，治疗后緩解、恢复、和/或生存的预后越差，不良临床后果的可能性越高。因此，根据本方法，用于比较的"对照水平"可以是，例如，在经治疗后显示良好或积极癌症预后的个体或个体群中，于任何种类的治疗之前测得的DKK1基因表达水平，在本文中将该水平称为"良好预后对照水平"。或者，用于比较的"对照水平"可以是，例如，在经治疗后显示不良或消极癌症预后的个体或个体群中，于任何种类的治疗之前测得的DKK1基因表达水平，在本文中将该水平称为"不良预后对照水平"。"对照水平"来自单一参照群体的单一表达图式，或者来自多个表达图式。因此，对照水平可以基于在癌症患者或者已知疾病状态(良好或不良预后)的患者群体中于任何种类的治疗之前测得的DKK1基因表达水平来加以确定。优选地，癌症是食道癌或肺癌。优选使用具有已知疾病状态的患者群中DKK1基因表达水平的标准值。标准值可以利用本领域已知的任何方法来获得。例如，可以使用平均值±25.0.或平均值±3S.D.作为标准值。使用在任何种类的治疗之前预先从疾病状态(良好或不良预后)已知的癌症患者(对照或对照组)采取并保存的样品，可以与测试生物学样品同时确定对照水平。或者，可以基于预先从对照组采取并保存的样品中DKK1基因的表达水平的分析所得结果，通过统计学方法来确定对照水平。另外，对照水平可以是来自先前测试的细胞的表达图式的数据库。此外，根据本发明的一个方面，生物学样品中的DKK1基因表达水平可以与多个对照水平进行比较，其中所述对照水平是从多个参照样品确定的。优选的是使用从这样的参照样品确定的对照水平该参照样品来自与所述来自患者的生物学样品相似的组织类型。根据本发明，DKK1基因表达水平与良好预后对照水平的相似性指示患者较为有利的预后，而表达水平相对于良好预后对照水平有所增加，则指示较为不利、不良的治疗后緩解、恢复、生存和/或临床结果的预后。另一方面，DKK1基因表达水平相对于不良预后对照水平有所减少指示患者较为有利的预后，而表达水平与不良预后对照水平的相似性则指示较为不利、不良的治疗后緩解、恢复、生存和/或临床结果的预后。如果生物学样品中DKK1基因表达水平与对照水平相差多于1.0、1.5、2.0、5.0、10.0倍或更多倍，则可以认为其有改变。或者，如果生物学样品中DKK1基因表达水平较对照水平增加或减少了至少10%,20%,30%，40%,50%,60%,80%,90%或更多，则可以认为其有改变。可以将测试生物学样品的表达水平与对照水平之间的差异相对于对照，例如持家基因，进行标准化。例如，可以〗吏用已知表达水平在癌性细胞和非癌性细胞之间没有差异的多核苦酸，例如那些编码P-肌动蛋白、甘油醛3磷酸脱氢酶和核糖体蛋白Pl的多核苷酸，来将DKK1基因表达水平标准化。可以使用本领域公知的技术检测来自患者的生物学样品中的基因转录物来确定表达水平。本发明检测的基因转录物包括转录产物和翻译产物，例如mRNA和蛋白质。例如，可以藉由使用针对基因转录物的DKK1基因探针进行杂交，例如Northern印迹杂交分析，来检测DKK1基因的转录产物。所述检测可以在芯片或者阵列上进行。对于检测包括DKK1基因在内的多个基因的表达水平而言，使用阵列是优选的。作为另一个例子，检测可以使用基于扩增的检测方法，例如使用DKK1基因特异性引物的基于逆转录的聚合酶链式反应(RT-PCR)(见实施例)。参考DKK1基因的全序列(SEQIDNO:109)，可以使用常规技术设计和制备DKK1基因特异性探针或引物。例如，实施例中所用的引物(SEQIDNO:74和111，73和74)可以用于RT-PCR检测，但本发明不限于此。具体地说，用于本方法的探针或引物在严紧(严格)、中度严紧(中度严格)或低严紧(低严格)条件下与DKK1基因的mRNA杂交。如本文所用的，短语"严紧(严格)(杂交)条件"是指这样的条件，在该条件下探针和引物将与其靶序列杂交，但不与其它序列杂交。严紧条件是序列依赖性的，在不同环境下将会不同。相比于较短的序列，较长的序列在更高的温度观察到特异性杂交。一般而言，选择的严紧条件温度使其比在确定的离子强度和pH下指定序列的热解链温度(Tm)低约5-10。C。Tm是有50°/。的与靶序列互补的探针在平衡时与靶序列杂交(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)的温度。由于靶序列通常是过量的，在Tm温度，有50%的探针在平衡时^皮占用。典型地，严紧条件是这样的条件，其中盐浓度小于约1.0M钠离子，典型地为约0.01到l.OM钠离子(或其它盐)，pH为7.0到8.3,温度对于短探针或引物(例如10到50个核苷酸)为至少约30°C,对较长的探针或引物为至少大约60°C。此外，通过添加去稳定剂，如曱酰胺，也可以形成严紧条件。或者，为了本发明的评估，可以4企测翻译产物。例如，可以确定DKK1蛋白的量。确定作为翻译产物的蛋白量的方法包括使用特异性识别DKK1蛋白的抗体的免疫测定方法。所述抗体可以是单克隆或多克隆的。另外，抗体的任何片段或修饰形式(例如嵌合抗体，scFv,Fab,F(ab，)2,Fv等等)均可用于检测，只要该片段保持对于DKK1蛋白的结合能力。用于蛋白检测的这些种类的抗体的制备方法是本领域公知的，本发明中可以使用任何方法来制备所述抗体和它们的等价物。作为另一种基于其转录产物检测DKK1基因表达水平的方法，可以通过使用抗DKK1蛋白的抗体的免疫组化分析来观察染色强度。即，观察到强染色则表明增加的DKK1蛋白存在，以及同时，DKK1基因的高表达水平。另外，已知DKK1蛋白具有细胞增殖活性。因此，可以使用这种细胞增殖活性作为指标来确定DKK1基因表达水平。例如，在生物学样品存在的条件下制备和培养表达DKK1的细胞，然后可以通过检测增殖速度，或者通过测量细胞周期或者集落形成能力，来确定生物学样品的细胞增殖活性。例如，除了DKK1基因的表达水平之外，还可以确定其它食道细胞和肺细胞相关基因的表达水平，例如已知在食道癌和肺癌中差异表达的基因的表达水平，来改善评估的准确性。所述其它肺细胞相关基因包括WO2004/031413和WO2005/090603中记载的那些。应根据本方法进行癌症预后评估的患者优选是哺乳动物，包括人、非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马和牛。VIII.用于评估癌症预后的试剂盒本发明提供一种用于评估癌症预后的方法。优选地，癌症是食道癌和肺癌。具体地说，所述试剂盒包括至少一种用于检测来自患者的生物学样品中DKK1基因表达的试剂，所述试剂可以选自下组(a)用于检测DKK1基因mRNA的试剂；(b)用于检测DKK1蛋白的试剂；(c)用于检测DKK1蛋白生物学活性的试剂。用于检测DKK1基因mRNA的合适试剂包括特异性结合或鉴定DKK1基因mRNA的核酸，例如具有与DKK1mRNA的一部分互补的序列的寡核脊酸。这些种类的寡核苷酸的例子包括对DKK1mRNA特异的引物和探针。这些种类的寡核苷酸可以基于本领域公知的方法来制备。如果需要，用于检测DKK1mRNA的试剂可以固定在固体基质上。另外，试剂盒中还可以包括一种或一种以上的用于检测DKK1mRNA的试剂。另一方面，用于检测DKK1蛋白的合适试剂包括针对DKK1蛋白的抗体。所述抗体可以是单克隆或多克隆的。此外，所述抗体的任何片段或修饰形式(例如嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab，)2、Fv等等)均可以用作所述试剂，只要该片段保持对DKK1蛋白的结合能力。用于检测蛋白的这些种类的抗体的制备方法是本领域公知的，且本发明中可以使用任何方法来制备此类抗体及其等价物。另外，所述抗体可以用信号生成分子通过直接连接来标记，或者通过间接标记技术来标记。标记物、标记抗体的方法以及斗企测抗体与其耙标结合的方法都是本领域公知的，而且任何标记物和方法均可用于本发明。另外，试剂盒中还可包括一种或一种以上用于^r测DKK1蛋白的试剂。另夕卜，当使用表达LRP5/6和Kremen的细胞作为所述试剂时，生物学活性可以通过，例如，测定生物中表达的DKK1蛋白所致的细胞增殖活性来加以确定。例如，在来自患者的生物学样品存在的条件下培养所述细胞，然后可以通过检测增殖速度，或者通过测量细胞周期或者集落形成能力，来确定生物学样品的细胞增殖活性。如果需要，用于检测DKK1mRNA的试剂可以固定在固体基质上。另外，试剂盒中还可以包括一种或一种以上的用于检测DKK1蛋白生物活性的试剂。所述试剂盒可以包括一种或一种以上的上述试剂。另外，该试剂盒可包括用于结合针对DKK1基因的探针或抗DKK1蛋白抗体的固体基质及试剂、用于培养细胞的培养基和容器、阳性和阴性对照试剂、以及用于检测抗DKK1蛋白抗体的第二抗体。例如，从具有良好预后或不良预后的患者获得的组织样品可以作为有用的对照试剂。本发明的试剂盒还可以包括其它从商业和应用角度看需要的材料，包括緩沖剂、稀释剂、滤材(filters)、针头、注射器和带有使用指导的包装插页(例如书面的、磁盘(带)形式的、CD-ROM等等)。这些试剂等等可以包含在具有标识的容器中。合适的容器包括瓶、小瓶和试管。所述容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料。作为本发明的一个实施方案，当所述试剂是针对DKK1mRNA的纟笨4十时，试剂可以固定在固体基质，例如多孔片条上，形成至少一个4企测位点。多孔片条的测量或检测区域可包括多个位点，每个均含有核酸(探针)。测试片条也可以含有用于阴性和/或阳性对照的位点。或者，对照位点可以位于不同于所述测试片条的片条上。任选地，不同的检测位点含有不同量的固定核酸，即第一检测位点中的量较高，随后的位点中的量较低。添加测试样品时，显示可检测信号的位点的数目提供样品中存在的DKK1mRNA的量的指示。检测位点可以任何可合适检测的形状，典型地以横跨测试片条的条形或点形构成。本发明的试剂盒还可包括阳性对照样品或DKK1标准样品。可以通过收集DKK1阳性血样来制备本发明的阳性对照样品，然后测定那些DKK1水平。或者，可以将纯化的DKK1蛋白或多核苷酸加到不含DKK1的血清中来形成阳性样品或DKK1标准品。在本发明中，纯化的DKK1可以是重组蛋白。阳性对照样品的DKK1水平是，例如，超过截留值(cutoffvalue)的水平。接下来，参考实施例对本发明进行更详细的说明。但是，下文的材料、方法和实施例仅仅说明本发明的某些方面，决非意在限制本发明的范围。因此，与本文所述的材料和方法相似或等同的材料和方法可以用于本发明的实施或者测试。实施例实施例1材料和方法细胞系本文中使用"10个人ESCC细胞系和咽癌细胞系包括10个鳞状细胞癌(SCCs;TE1,TE2,TE3,TE4，TE5，TE6,TE8，TE9,TE10,和FaDu),和1个腺癌(ADC;TE7)。本研究中使用的25个人肺癌细胞系包括9个腺癌(ADCs):A427,A549,LC319，PC-3,PC-9,PC画14,NCI-H1373,NCI-H1666,和NCI-H1781,两个腺鳞癌(ASCs):NCI-H226,NCI-H647，7个鳞状细胞癌(SCCs):EBC-1,LU61，NCI-H520，NCI-H1703,NCI-H2170,RERF-LC-AI和SK-MES-1,1个大细胞癌(LCC):LX1;和6个小细胞肺癌(SCLCs)，DMS114，DMS273,SBC-3,SBC-5,NCI-H196和NCI-H446。所有细胞均在补充有10%胎牛血清(FCS)的合适培养基中单层培养，并维持在37。C、5%032的加湿空气气氛中。组织样品和显微解剖来自ESCC(『19)和正常食道(『5)的组织样品，是在知情并同意的条件下从外科标本获得的。本研究以及述及的所有临床材料的使用均获得了各个机构的伦理委员会的批准。所有癌组织均已由病理学者组织学验证为食道乡奔4大纟田月包癌(squamous-ce11carcinomaoftheesophagus)。临床"f言息获自医疗记录(5名女性患者，14名男性患者；中值年龄66.6岁，范围51-76岁)。临床分期根据UICCTNM分类进行判断。正常食道组织观察为病理学上正常的上皮，且它们不是发育异常。所有标本均在手术切除后立即收集，包埋在TissueTekOCT介质(Sakura，Tokyo，Japan)中，然后保存在-80。C。使用恒冷切片片几(Sakura，Tokyo,Japan)将冷冻的组织切成8|am切片，然后用苏木精和曙红染色用于组织学检查。使用带有脉沖紫外狭光束焦点激光器(pulsedultravioletnarrowbeam-focuslaser)的EZ切割系统(SLMicrotestGmbH，Germany),根据制造商的规程选择性收集ESCC细胞和正常食道上皮细胞。为了获得ESCC细胞的精确表达模式，使用LMM以避免样品被非癌性细胞污染。显微解剖(microdissection)之后，将5个正常食道上皮细胞混合形成微阵列杂交用的"通用对照"。图l显示在显微解剖之前(A)和之后(B)代表性的癌的显微图像，以及被解剖的癌细胞(C)。用作正常对照的人小气道上皮细胞(SAEC)在购自CambrexBioScienceInc的优化培养基(SAGM)中生长。早先已在获得知情同意的条件下，获得了15个原发性肺癌样品和IO个原发性ESCC组织样品，其中15个原发性肺癌样品中5个被归类为ADC、5个归类为SCC，5个归类为SCLC(Kikuchietal.,Oncogene.2003Apr10;22(14):2192画205，Yamabukietal.，IntJOncol,2006Jun;28(6):1375-84)。临床分期根据UICCTNM分类判断(Sobinetal.,TNMClassificationofMalignantTumours,6thedition.NewYork:Wiley-Liss，Inc.,2002)。用于在组织微阵列上进行免疫染色的、福尔马林固定的原发性肺肿瘤和邻近的正常肺组织样品，是从在SaitamaCancerCenter(Saitama,Japan)和HokkaidoUniversity及其附属医院(Sapporo,Japan)接受了手术的279名患者(161例ADC,96例SCC,18例LCC，4例ASC;96名女性患者，183名男性患者；中值年龄63.3岁，范围26-84岁)获得的。还从接受了手术的患者中获取了总共220个福尔马林固定的原发性ESCC(18名女性患者，202名男性患者，中值年龄61.4岁，范围42-81岁)的样品和邻近的正常食道组织的样品。本研究以及述及的所有临床材料的使用均获得了各个机构的伦理委员会的批准。血清样品在获得书面知情同意的条件下，从220个健康对照个体(179名男性，41名女性，中值年龄，50.2士6.8SD;范围，31-61岁)获得了血清样品；其中所述健康对照个体的全血细胞计数、C反应蛋白、红细胞沉降速率、肝功能测试、肾功能测试、尿液分析、粪检、胸部X射线或心电图未显示异常。另外，在获得知情同意的条件下，从HiroshimaUniversityHospital及其附属医院收治的94名肺癌患者(72名男性和22名女性，中值年龄65.5±12.3SD;范围30-86岁)，以及/人参力口了JapaneseProjectforPersonalizedMedicine的139名肺癌患者(BioBankJapan;100名男性，39名女性；中值年龄64.5±8.8SD;范围，41-89岁)获得了血清样品。这233个肺癌病例包括106例ADC、56例SCC和71例SCLC。此外，还在获得知情同意的条件下，从67名同在BioBankJapan项目登记的ESCC患者(55名男性，l2名女性；中值年龄63.8±6.3SD;范围，46-74岁)获得了血清样品。这些总共来自300名癌症患者的血清样品是根据下列标准选择用于研究的(a)患者新近被诊断且先前未接受治疗，和(b)他们的肿瘤被病理学诊断为肺癌或食道癌(I-IV期)。血清是在诊断时获得的，并保存在-80。C。临床病理学记录全部文档化。cDNA微阵列用选自美国国家生物技术信息中心(NCBI)UniGene数据库(build弁131)的32,256个cDNA制备了全基因组cDNA微阵列。该微阵列系统的构建基本上如前人所述(Onoetal.，CancerRes.2000;60(18):5007-11)。简而言之，使用从多种人器官分离的poly(A)+RNA作为才莫4反，利用RT-PCR扩增cDNA;扩增子的长度范围为200到1100bp,没有任何重复序列或poly(A)序列。RNA提取、基于T7的RNA扩增、及杂交从每个激光显樣t解剖的细胞中将总RNA提取到350(ilRLT裂解緩冲液(QIAGEN,Hilden，Germany)中。在1URNA酶抑制剂(TOYOBO,Osaka,Japan)存在的条件下，将提取的RNA用30UDNA酶I(Roche,Basel,Switzerland)室温处理30min，以去除任何污染的基因组DNA。70。C失活10min后，根据制造商的推荐使用RNeasyMiniKit(QIAGEN)纯化RNA。将所有DNA酶I处理过的RNA用于基于T7的RNA扩增；从每个样品经两轮扩增产生了50-100吗的aRNA。然后通过逆转录，将2.5(xg等份的来自癌细胞或正常食道上皮细胞的aRNA分别用Cy5-dCTP或Cy3-dCTP(GEHealthcare/AmershamBiosciencesCorp.)通.过逆4争录才示i己，J(口另'j处4笛述的(Onoetal.，CancerRes.2000;60(18):5007-11)。杂交、清洗和扫描也都根据先前记载的方法进行(Onoetal.，CancerRes,2000;60(18):5007-11)。数据分析使用ArrayVision软件(ImagingResearch,Inc.,StCatharines,Ontario,Canada),通过背景置换，对来源于32,256个点的Cy3和Cy5信号强度进行了定量和分析。然后，调节针对各个目标点的Cy5(肿瘤)和Cy3(对照)的荧光强度，使得阵列上52个持家基因的平均Cy3/Cy5比值等于1。由于来自低信号强度的数据可靠性比较差，如先前描述地(Onoetal.，CancerRes.2000;60(18):5007-11)在每个载玻片上确定了截留值，当Cy3和Cy5染料均产生低于截留值的信号强度时，则将基因从进一步分析中排除(Saito-Hisaminatoetal.,DNARes.2002;9(2):35-45)。对于其它基因，使用各样品的原始数据计算Cy5/Cy3比值。半定量RT-PCR:选择了高度上调的基因，并借助半定量RT-PCR实验考察了它们的表达水平。使用随机引物(Roche)和SuperscriptII(Invitrogen)，从来自每个样品的总共3等份的aRNA逆转录为单链cDNA。稀释各个cDNA混合物用于接下来的PCR扩增，其中PCR扩增使用与制备用于目的DNA特异性或的表达作为内部对照。对PCR反应的循环数进行了优化，以保证产物的强度(intensity)位于扩增的线性相以内。Northern印迹分析为了Northern分析，将人多组织Northern印迹(HumanMultipleTissueNorthernblots)(BDBioscience,PaloAlto，CA)与ECT2(C卯98)的[a-32P]-dCTP标记的269bpPCR产物杂交；其中所述269bpPCR产物是使用引物5'-CAATTTTCCCATGGTCTTATCC-3'(SEQIDNO;l)和5'-GCGTTTTCAAGATCTAGCATGTG隱3'(SEQIDNO;2)通过逆转录PCR(RT-PCR)制备作为探针的。使用引物5'-ATGAGGAGAACACACTCTCCGT-3'(SEQIDNO;3)和5'國GCTTCTACATCTCAAATCATGTCC-3'(SEQIDNO;4)，通过逆转录PCR(RT-PCR)制备了CDC45L(A2466)的1019bpPCR产物作为探针。使用引物5'-CATCAGACTGTGCCTCAGGA-3'(SEQIDNO:111)和5'-CAAAAACTATCACAGCCTAAAGGG-3'(SEQIDNO:74)，制备了DKK1的776bpPCR产物作为纟罙针。预杂交、杂交和洗涤均按照生产商的规定进行。用增感屏在-80。C经过7天对印迹进行放射自显影。RNA干扰测定为了评估ECT2和CDC45L在癌细胞中的生物学功能，使用psiHlBX3.0载体表达针对目标基因的短发夹RNA,如先前所述(ShimokawaT，etal.，CancerRes.2003;63(19):6116-20)。HI启动子被克隆到基因特异性序列的上游(来自目标转录物的19个核苷酸的序列，与同一序列的反向互补体(reversecomplement)相隔短间隔序列TTCAAGAGA(SEQIDNO;5))，并且有5个胸腺嘧咬作为终止信号和一个用于遗传霉素(Sigma)选择的neo盒(neo-cassette)。用于RNAi的合成寡核苷酸的目标序列如下对照1(EGFP:增强绿色荧光蛋白(GFP)基因，A^oreaWctoWaGFP的突变体),5，-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3，(SEQIDNO;6);对照2(乱序(scmmble)(SCR):编码5S和16SrRNA的叶绿体Euglenagracilis基因),5，-GCGCGCTTTGTAGGATTCG-3，(SEQIDNO;7);si画ECT2-l，5'画GATGCACTCACCTTGTAGT醫3'(SEQIDNO;8);si-ECT2-2,5'-GGCAAATACTCCTGAGCTC-3';(SEQIDNO;9)si-CDC45L画l，5'-GAGACATCCTCTTTGACTA-3';(SEQIDNO;10)si匪CDC45L画2，5'-CAGACCAGTGGGTGCAAGA-3'(SEQIDNO;11).将FaDu和TE9细胞铺在10-cm盘上(每盘1.5x106个细胞)，才艮据制造商的说明，使用Lipofectamine2000(Invitrogen)用psiHlBX载体转染细胞，其中psiHlBX载体包括用于EGFP、SCR、ECT2及CDC45L的目标序列。在含有1mg/ml遗传霉素(Invitrogen)的培养基中选择细胞7天，4天后收集细胞，用于RT-PCR分析各个基因的敲低(knockdown)作用。用于这些RT-PCR实验的引物与上述那些相同。温育7天后，用Giemsa溶液染色细胞来评估集落形成，利用3-(4，5-二曱基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)测定来评估细胞数。Western印迹在下述裂解緩冲液中裂解肿瘤组织或细胞50mMTris-HCl(pH8.0)、150mMNaCl、0.5%NP40、0.5%脱氧胆酸钠，和蛋白酶抑制剂合剂III(ProteaseInhibitorCocktailSetIII)(Calbiochem)。以牛血清白蛋白(BSA)为标准品，使用Bio-Rad蛋白测定法(Bio-Rad,Hercules,CA)确定每份裂解物的蛋白含量。将10微克的每种裂解物在10%到12%的变性聚丙烯酰胺凝胶(具有3%聚丙烯酰胺积层胶)上解析，并电泳转移到硝酸纤维素膜(GEHealthcareBio-sciences)上。在含5°/。无脂乳的TBST中封闭后，将膜与第一抗体在室温温育1小时。将免疫反应性蛋白质与偶联辣根过氧化物酶的第二抗体(GEHealthcareBio-sciences)在室温温育1小时。用TBST清洗后，用增强化学发光试剂盒(GEHealthcareBio-sciences)对反应物显色。使用NSCL和ESCC组织和细胞系以及正常组织的裂解物进行Western印迹分析，证明一种商品化的兔抗人DKK1多克隆抗体(CatalogNo.sc-25516,SantaCruz，CA)对人DKK1是特异的(参见图2)。免疫组织化学分析3夸细月包^t在3皮璃盖JE皮片(BectonDickinsonLabware,FranklinLakes,NJ)上，用4%多聚曱醛固定，并在室温条件下用含0.1%TritonX-100的PBS渗透化处理3分钟。在室温用CASBLOCK(ZYMED)处理10分钟封闭非特异性结合。然后在室温将细胞与用含3%BSA的PBS稀释的第一抗体温育60分钟。用PBS洗涤细胞后，用FITC偶联的第二抗体(SantaCruz)在室温对细胞染色60分钟。再用PBS洗涤一次后，将每个标本用含有4'，6，-二脒基國2，-苯基p引p朵二盐酸(4',6'-diamidine國2'誦phenylindolendihydrochrolide)(DAPI)的Vectashield(VectorLaboratories,Inc,Burlingame,CA)去于固,并用SpectralConfocalScanning系统(TSCSP2AOBS:LeicaMicrosystems,Wetzlar，Germany)显色。免疫组织化学和组织微阵列为了考察石蜡块中包埋的临床样品中DKK1蛋白的存在，本发明人以下述方式对切片进行了染色。简而言之，封闭内源过氧化物酶和蛋白质之后，将3.3pig/ml兔抗人DKK1多克隆抗体(SantaCruz)加到每个载玻片上，并将切片与作为第二抗体的辣才艮过氧化物酶标记的抗兔IgG(HistofineSimpleStainMAXPO(G),Nichirei,Tokyo,Japan)—起温育。加入底物-色原(substrate-chromogen)，并用苏木精复染标本。用福尔马林固定的279个原发性肺癌和220个原发性食道癌构建肿瘤组织微阵列，如他处所述的(Chinetal.，MolPathol.2003Oct;56(5):275-9;Callagyetal.，DiagnMolPathol.2003Mar;12(l):27國34，JPathol.2005Feb;205(3):388-96)。才艮据与载玻片上相应的H&E染色切片目测比对来选择用于采样的组织区域。用组织」微阵列点样器(tissuemicroarrayer)(BeecherInstruments,SunPrairie,WI)将从供体肿瘤块取出的3个、4个或5个组织核(直径0.6mm;深度3-4mm)置入接受的石蜡块中。从每个病例钻取(punch)正常组织核，使用所得微阵列块的5pm切片用于免疫组化分析。三个独立的研究者在事先不知道临床病理学数据的情况下，半定量地评估了DKK1阳性度(positivity),如先前报道的(Suzukietal"CancerRes.2005Dec15;65(24):11314-25;Ishikawaetal"ClinCancerRes.2004Dec15;10(24):8363-70，CancerRes,2005Oct15;65(20):9176-84;Katoetal.,CancerRes.2005Jull;65(13):5638-46;Furukawaetal.,CancerRes.2005Aug15;65(16):7102-10)。使用下列标准评估DKK1染色强度强阳性(评分为2+),在多于50%的肿瘤细胞中完全掩盖细胞质的深褐色；弱阳性(1+),肿瘤细胞质中可觉察的任何程度较弱的褐色染色；不存在(评分为0),肿瘤细胞中没有可觉察的染色。只有在评价者独立地定义病例为强阳性时，方承认该病例为强阳性。统计分析使用StatView统计程序(SaS,Cary,NC)进行统计分析。计算从手术日起，到NSCLC或ESCC相关死亡时或者到最后一次随访观察时止的肿瘤特异性生存曲线。针对每个相关变量和DKK1表达算出Kaplan-Meier曲线；使用时序检验(log-ranktest)分析患者亚组中生存时间的差异。使用Cox比例-危险回归模型(Coxproportional-hazardregressionmodel)进行单变量和多变量分析，以确定临床病理学变量和癌症相关死亡率之间的关联。首先，本发明人分析了死亡与包括年龄、性别、组织学(histology)、pT分类和pN分类在内的可能预后因素之间的关联，每次考虑一个因素。然后，以反向(分步)程序适用多变量Cox分析，其中总是将强DKK1表达与任何满足入口水平即P值小于0.5的所有参数一道纳入^莫型。由于该模型持续添加因素，独立因素没有超过P0.05的出口水平。ELISA:使用最初构建的ELISA系统测量DKK1血清水平。首先，将对DKK1特异性的兔多克隆抗体(SantaCruz)加入96孔微孔板(Apogent，Denmark)作为捕获抗体，并在室温温育2小时。洗去任何未结合的抗体后，向孔中加入5%BSA并在4'C温育16小时用于封闭。洗涤后，向孔中加入稀释3倍的血清，室温温育2小时。洗去任何未结合物质后，将使用BiotinLabelingKit-NH2(DojindoMolecularTechnologies,Inc.)生物素化的DKK1特异性多克隆抗体加入孔中作为检测抗体，室温温育2小时。洗涤以去除任何未结合的抗体-酶试剂后，向孔中加入HRP-链霉抗生物素蛋白(HRP-streptavisin)并温育20分钟。洗涤后，向孔中加入底物溶液(R&DSystems,Inc.),让其反应30分钟。通过加入200pl2N石危酸终止反应。用光度计以570nm为参考波长在450nm测定颜色强度。用可商购的酶测试试剂盒(HOPELaboratories,Belmont，CA)根据提供商的建议，通过ELISA测定血清中的rEI水平。用可商购的酶测试试剂盒(TFB，Tokyo，Japan)根据制造商的规程，通过ELISA测定血清中的ProGRP水平。通过Mann-WhitneyU检验分析肿瘤组和健康对照组之间DKK1、CEA和proGRP水平的差异。进一步使用接受者操作特征(receive-operatingcharacteristic,ROC)曲线分析评估DKK1、CEA和proGRP水平，以确定具有最优诊断准确度和可能性比率的截留(cutoff)水平。使用Spearman等级相关(Spearmanrankcorrelation)计算DKK1和CEA/proGRP之间的相关系数。显著性定义为P<0.05。DKK1表达质粒根据另U处的才艮道(Suzukietal.,CancerRes.2005Dec15;65(24):11314-25)，构建了精氨酸—256变为丙氨酸，C末端带FLAG标签的DKK1野生型和点突变型构建体。带p3XFLAG标签的DKK1(野生型或点突变型)表达质粒或者模拟质粒转染COS-7细胞，将转染的细胞用于western分析《Matrigel浸润测定用带p3XFLAG标签(C末端)的DKK1表达质粒或模拟质粒转染的N1H3T3和COS-7细胞在含10%FCS的DMEM中生长到接近汇合。胰蛋白酶处理收集的细胞，在未加血清或蛋白酶抑制剂的条件下将细胞在DMEM中洗涤，并以1x1()S个细胞/ml重悬在DMEM中。在制备细胞悬液之前，将Matrigel基质(BectonDickinsonLabware)的干燥层用DMEM室温复7JM匕2小时。在24孔Matrigel浸润室的每个下部小室(lowerchamber)中添加含10%FSC的DMEM(0.75ml)，向上部小室(upperchamber)的各个插入部中添加0.5ml(5x104个细胞)的细胞悬液。将插入部的平板在37。C温育24小时。温育后对小室进行处理，根据供应商(BectonDickinsonLabware)的指示，对浸润通过Matrigel的细月包进行固定和Giema染色。实施例2通常在ESCC中下调/上调的基因根据下面的标准鉴定通常在ESCC中上调和下调的基因(1)在超过50%的(19个病例中至少10个)被^r查癌症中的表达数据可得的基因；(2)在多于40%的信息提供病例中ESCC细胞中的表达比高于3.0的基因(定义为上调基因)，或者在多于50%的信息提供病例中ESCC细胞中的表达比低于0.33的基因(定义为下调基因)。表1中列出了总共727个ESCC中通常下调的基因，而表2中列出了816通常上调的基因。为了验证通过微阵列分析得到的表达数据，对于在几乎所有的信息提供病例中过高表达的基因进行了半定量RT-PCR实验。在上述候选物中，选择了83个基因(C1948,A9371,E0341,A3097,A2735,A5065,D9504,C6209,B3827,A4513，E0556，A8172,A3802,C8926,A9723,G3996,F5946,B7534,A7296,A8487,C9490,C9858,E0133,A7856,A7608,A7908,C9098,C9517，C9046,A8335,C卯16,A6598,B4161,E2191,B6125N,D8457,B8814，和A2466),并且用半定量RT-PCR证实了它们在肿瘤和正常组织中的基因表达图式(图2)。RT-PCR实验的结果与受试病例的微阵列数据具有特有的一致性。实施例3与淋巴结转移或手术后复发相关的基因为了检测基因表达模式与临床病理学特征之间的联系，本发明人搜寻了可能与淋巴结转移一确定患者预后的一个重要因素一相关的基因。根据下面所述的标准选择了与淋巴结转移阳性(淋巴结-阳性)(r)和淋巴结阴性(n)、复发阳性(r)和复发阴性(n)等临床病理学特征相关的基因(i)在至少80%的病例中信号强度高于截留值；和(ii)IMedr-Mednl》0.5,其中Med表示由两个群体中经过对数变换的相对表达比导出的中值。如果基因满足在每个临床病理学状态中置换P值(permutationP-value)小于0.5的标准，则选择其作为候选基因。首先，使用13个淋巴结阳性和6个淋巴结阴性的病例考察了表达模式和淋巴结转移状态。适用随机置换检验(randompermutiontest)来鉴定在两个组中差异表达的基因。由每个基因分别在淋巴结阳性(r)与淋巴结阴性(n)病例中，以及复发阳性(r)与复发阴性(n)病例中的经过对数转换的相对表达比计算平均值(ja)和标准偏差(cy)。对于每个基因定义识别得分(discriminationscore)(DS)如下DS="-/(ar+crn)进行置换检验来估计各个基因在两个组之间的区別能力。在两个组间随机置换样本10000次。由于每个基因的DS数据集合显示正态分布，本发明人对用户定义的分组算出了P值(Golubetal.,Science.1999;286(5439):531-7)。本文中，使用由13个淋巴结阳性和6个淋巴结阴性病例组成的19个病例的表达数据，以及由6个复发阳性和13个复发阴性病例组成的19个病例的表达数据。分析的结果，通过随机置换(P值O.05)鉴定了136个与淋巴结状态相关的基因。在淋巴结阳性肺瘤(图6)中，这些基因中有59个基因下调(表4),77个基因相对上调(表5)。另外，将有复发的6个病例的表达模式与手术后32个月的观察期内没有复发的13个病例的表达模式进行比较。复发部位包括局部，肺、及其区域淋巴结。鉴定了37个仅在复发病例中显示改变的表达图式的基因，在肿瘤中，它们中有28个(表7)相对上调，9个(表6)相对下调。使用这些鉴定的基因组进行监督等级聚类分析(supervisedhierarchicalclusteringanalysis)，也能句多对与、淋巴结状态相关的组或者具有复发的组进行明确的分类(图6和7)。实施例4:ECT2使用ECT2cDNA片段作为探针进行Northern印迹分析，鉴定了一个仅在睾丸中表达的4.3kb转录物，在考察的其它任何组织中均未见表达。认为ECT2编码癌-睾丸抗原(CTA)(图3A)。为了评估ECT2是否在癌细胞的生长或生存中起作用，设计并构建了表达针对ECT2的siRNA(si-ECT2-l(#1)和-2(#2》的质粒，以及两种不同的对照质粒(针对EGFP和SCR的siRNA),并将它们转染到内源表达高水平ECT2的TE9细胞中，以抑制内源ECT2的表达。转染了si-ECT2-l和si-ECT2-2的细胞中ECT2mRNA的量与转染了两种对照siRNA中任一种的细胞相比显著减少(图4A)。与它们对ECT2水平的抑制效应相一致，转染的si-ECT2-l和si-ECT2-2导致集落形成及MTT测定所测得的集落数和细胞活力发生显著降低(图4B和4C)。在FaDu细胞系中观察到了类似的效应(数据未显示)。实施例5:CDC45L使用CDC45LcDNA片段作为探针进行Northern印迹分析，鉴定了一个仅在睾丸中表达的2.2kb转录物，在考察的其它任何组织中均未见表达。认为CDC45L编码癌-睾丸抗原(CTA)(图3B)。为了评估CDC45L是否在癌细胞的生长或生存中起作用，设计并构建了表达针对CDC45L的siRNA(si-CDC45L-1(#1)和-2(#2))的质粒，以及两种不同的对照质粒(针对EGFP和SCR的siRNA)，并将它们转染到内源表达高水平CDC45L的FaDu细胞中，以抑制内源CDC45L的表达。转染了si-CDC45L-l和si-CDC45L-2的细胞中CDC45LmRNA的量与转染了两种对照siRNA中任一种的细胞相比显著减少(图4A)。与它们对CDC45L水平的抑制效应相一致，转染的si-CDC45L-l和si-CDC45L-2导致集落形成及MTT测定所测得的集落数和细胞活力发生显著降低(图5B和5C)。在TE9细胞系中观察到了类似的效应(数据未显示)。实施例6:DKK1肺癌和食道癌以及正常组织中的DKK1表达为了鉴定能够检测早期癌细胞，并且能够应用于以癌细胞生物学特征为基础的个别化治疗的新分子，本发明人使用cDNA微阵列，针对通过激光显微解剖纯化的肺癌及ESCC细胞的基因表达模式进行了全基因组分析(KikuchiTetal.，Oncogene.2003Apr10;22(14):2192-205，IntJOncol.2006Apr;28(4):799-805,KakiuchiSetal.，MolCancerRes.2003May;l(7):485-99，HumMolGenet.2004Dec15;13(24):3029-43.Epub2004Oct20,Yamabukietal.,IntJOncol.2006Jun;28(6):1375-84)。在被筛选的27,648个基因中，本发明人鉴定了DKK1转录物，显示在所检查的绝大多数肺癌及食道癌样品中，在癌细胞中具有较之正常上皮细胞(对照)3倍或更高的表达倍数。利用半定量RT-PCR实验，本发明者在15个肺癌组织中的10个、25个肺癌细胞系中的21个、10个ESCC组织中的10个，以及10个ESCC细胞系中的10个中证明了它的过高表达(图2A-C)。随后，本发明人使用抗DKKl抗体进行western印迹分析，证明了所分析的代表性NSCLC样品对中的肿瘤组织中35kDaDKKl蛋白的表达(图2D)。使用DKKlcDNA片段作为探针进行Northern印迹分析，鉴定了一种大约1.8kb的转录物，其在胎盘中高度表达，而在前列腺中表达水平极低；在任何其它正常组织中未见表达(图3C)。本发明人进行了免疫荧光分析来考察内源DKKl在ESCC细胞系TE8和NSCLC细胞系LC319中的亚细胞定位。在肿瘤细胞的细胞质检测到呈颗粒状外观的DKKl(TE8细胞的代表性数据示于图3D中)。DKKl表达与不良预后的关联为了验证DKK1的生物学和临床病理学意义，本发明人对组织;錄阵列进行了免疫组化染色，其中所述组织微阵列含有来自接受了^^艮治性手术切除的279个NSCLC及220个ESCC病例的组织切片。使用DKKl特异性多克隆抗体的DKKl染色主要可见于肿瘤细胞的细胞质，但未在正常细胞中检测到(图8A、C)。本发明人将组织阵列上的DKKl表达图式在从不存在(评分为0)到弱/强阳性(评分为1+~2+)的范围内进行了分类。在279例NSCLC中，DKKl在125例中发生强染色(44.8%，评分2+)，在102例中弱染色(36.6%;评分为l+)，在52例中没有染色(18.6%,评分为O)(详情示于表10A)。NSCLC患者的中值生存时间(mediansurvivaltime)显著缩短，这与较高的DKK1表达水平一致(P-0.0039，时序检验(log-ranktest);图8D)。本发明人还应用了单变量分析来评价患者预后与包括年龄、性别、组织学(ADC相对于非ADC)、pT阶段(肿瘤大小；Tl+T2相对于T3+T4)、pN阶段(NO相对于Nl+N2)、以及DKK1状态(评分2+相对于0、l+)在内的数种因素之间的关联。所有这些参数均与不良预后显著相关。使用Cox比例國危险冲莫型(Cosproportional-hazardmodd)的多变量分析确定了DKKl(P=0.0163)是手术治疗的NSCLC患者的独立预后因素(表IOB)。另一方面，在检查的220个ESCC病例中，DKKl在60例(27.3%，评分2+)中强染色，在75例(34.1%，评分为l+)中弱染色，在85例(38.6%,评分为O)中未染色(详情见表9A)。ESCC患者的中值生存时间显著缩短，这与较高的DKK1表达水平一致(P-0.042，时序检验(log-ranktest);图8B)。本发明人还应用了单变量分析来评价ESCC患者预后与包括年龄、性别、pT阶段(肿瘤深度；Tl+T2相对于T3+T4)、pN阶段(NO相对于Nl)、以及DKK1状态(评分2+相对于0、l+)在内的数种因素之间的关联。所有这些参数均与不良预后显著相关。使用Cox比例-危险模型的多变量分析确定了DKK1不是手术治疗的ESCC患者的独立预后因素(表9B)。癌细胞中DKK1的N-糖基化据报道，DKK1蛋白在转染了DKK1表达载体的细胞中表达为大约35-kDa的蛋白质，并以35-40kDa的蛋白质的形式分泌到培养基中(Fedietal.:JBiolChem.1999Jul2;274(27):19465-72,Niidaetal.,Oncogene.2004Nov4;23(52):8520-6)。如图IOA所示，通过western印迹分析，在转染的COS-7细胞的条件培养基中外源DKKl蛋白作为大约35-40kDa的条带^皮识别。western印迹检测的分泌的DKKl蛋白为双条带。因此，本发明人首先将从转染COS-7细胞的条件培养基收集的细胞提取物和蛋白质在存在或不存在N-糖苷酶F的条件下进行温育，然后通过western印迹分析，分析了DKKl蛋白的分子量。正如预料的那样，用N-糖苷酶F处理的细胞提取物和条件培养基中的大部分DKK1蛋白测得的分子量均小于未处理细胞中的DKKl蛋白(图IOA)。由于DKKl具有一个位于该蛋白C末端附近的潜在糖基化位点(天冬酰胺-256),本发明人将DKK1中的这个潜在糖基化位点(天冬酰胺256)置换为丙氨酸。在条件培养基及细胞沉淀中，突变的DKK1被western印迹检测为这样的免疫反应性条带，其与野生型DKK1的脱糖基化形式具有相似的分子量(图IOA)。使用N-糖苷酶F处理没有造成细胞沉淀和条件培养基中的DKK1突变条带发生任何移动(图IOA)。这些结果提示，天冬酰胺256是DKK1的关连(cognate)N-糖基化位点，但没有影响DKK1的分泌。在患有肺癌或ESCC的患者中的DKK1血清水平由于体外实验结果提示使用DKK1的分泌形式可能开发一种新的肿瘤标志物，本发明人考察了DKK1蛋白是否被分泌到肺癌或食道癌患者的血清中。ELISA实验在来自这些患者的血清样品中检测到了DKK1蛋白。肺癌患者中血清DKK1的平均值(土1SD)为27.2±21.0U/ml，而ESCC患者中的为33.5±25.3U/ml。相比之下，健康个体中DKK1血清水平的平均值(±1SD)为6,3±5.0U/ml。差异是显著的P值O.OOl(Mann-WhitneyU检验)。当根据肺癌中的组织学类型进行分类时，DKK1血清水平在ADC患者中为25.5±18.4U/ml，在SCC患者中为24.7±17.7U/ml,在SCLC患者中为31.8±25.8U/ml(图9A);这3种组织学类型之间的差异不是显著的。进一步对来自肺癌和ESCC患者，以及正常个体的血清样品中的DKKl水平进行了分析，所述分析是通过描绘操作特征(receive-operatingcharacteristic,ROC)曲线分析来确定它们的截止水平(图9B)。该测定中设置的截止水平，即14.7U/ml,导致对DKKl最优的诊断准确度和可能性比率(灵敏度为63.7%(191/300)，特异性为95.9%(211/220))。在健康个体中血清DKKl水平的平均值(士2SD)为16.3U/ml,提示该截止点是合适的。为了评价使用血清DKK1水平作为肿瘤检测生物标志物的可行性，本发明人还在相同的患者和对照中，利用ELISA测定了NSCLC患者的CEA血清水平，以及SCLC患者的proGRP血清水平，其中CEA和proGRP是上述肺癌组织学类型的两种常规肿瘤标志物。NSLCL患者中CEA的截止值确定为2.5ng/ml(灵敏度为40.3%(64/159)，特异性为97.1%(204/210))。血清DKKl和CEA值之间的相关系数不显著(Spearman秩相关系数p=-0.034，P=0.668)，提示同时测量血清中的这两种标志物可将NSCLC检测的整体灵敏度提高到78.6%(159中125)(对于诊断NSCLC，单独CEA的灵敏度为40.3%(159中64)，DKK1的灵敏度为61,6%(159中98))。在正常志愿者(对照组)中两种肿瘤标志物中任一种的假阳性率达8.2%(208中17)，而在相同对照组中，对于CEA和DKK1的假阳性率各自为2.9%(208中6)和5.3%(208中11)。另一方面，SCLC患者中对于proGRP的ROC分析确定了ProGRP的截止值为46.0pg/ml(其灵敏度为60.6%(66中40)，特异性为99.3%(146中145))。血清DKK1和ProGRP值之间的相关系数不显著(Spearman秩相关系数p=0.113,P=0.362)，提示同时测量血清中的这两种标志物可将SCLC检测的整体灵敏度提高到84.8%(66中56)(对于诊断SCLC,单独ProGRP的灵敏度为60.6%(66中40),DKK1的灵敏度为63.6%(66中42))。在146名正常志愿者(对照组)中两种肿瘤标志物中任一种的假阳性率达6.2%(146中9),而在相同对照组中，对于proGRP和DKKl的假阳性率各自为0.7%(146中l)和5.5%(146中8)。DKK1对细胞浸润活性的活化由于在組织微阵列上进行的免疫组化分析已经表明，与肿瘤为DKK1阴性的患者相比，具有DKK1阳性肿瘤的肺癌和食道癌患者显示较短的癌症特异性生存期，本发明人使用NIH3T3细胞和COS-7细胞，在Matrigel测定中考察了DKK1在细胞运动和浸润中的可能作用。如图IOB、C所示，相比于用模拟载体转染的细胞，将DKK1cDNA转染到任一细胞系中均显著;也增强了该细月包系通过Matrigel的浸润活性(invasiveactivity)。讨论虽然现代外科技术和辅助化学放射疗法已经取得了进步，但是在恶性肿瘤中肺癌和ESCC显示的预后最差是众所周知的。因此，目前急切需要开发新的诊断用生物标志物，用于癌症的早期检测并为合适患者的辅助治疗方式提供更好的选择。本发明人使用含有27,648个基因的cDNA微阵列，对通过激光^:光束显^f效解剖(LMM)纯化的101种肺癌和19种ESCC细胞的基因表达模式进行了全基因组分析(Yamabukietal.IntJOncol.2006Jun;28(6):1375-84;Kikuchietal"Oncogene.2003Apr10;22(14):2192-205,IntJOncol.2006Apr;28(4):799画805;Kakiuchietal,MolCancerRes.2003May;l(7):485-99,HumMolGenet.2004Dec15;13(24):3029-43.Epub2004Oct20)。在此过程中，本发明人鉴定了若干基因，它们可能是开发新的诊断标志物、治疗药物和/或免疫疗法的良好候选物(Suzukietal.,CancerRes.2003Nov1;63(21):7038-41，CancerRes.2005Dec15;65(24):11314-25;Ishikawaetal"ClinCancerRes,2004Dec15;10(24):8363画70,CancerRes.2005Oct15;65(20):9176-84;Katoetal.，CancerRes,2005Jull;65(13):5638-46;Furukawaetal.,CancerRes.2005Aug15;65(16):7102-10)。在它们之中，编码推定的肿瘤特异性跨膜或分泌蛋白的基因被认为具有显著的优势，因为它们呈现在细胞的表面或细胞外空间中，和/或血清中，使它们成为容易达到的分子标志物和治疗靶标。在本文的研究中，本发明人选择了一种编码分泌型蛋白的上调基因(DKK1),并且通过组织微阵列分析和ELISA考察了蛋白表达状态，从而鉴定了用于肺癌和/或ESCC的新的治疗和预后生物标志物。DKK1是一种266个氨基酸的蛋白质，含有一个信号肽序列和两个富半胱氨酸域(Fedietal.，JBiolChem.1999Jul2;274(27):19465-72)，并且已知它是一种分泌型蛋白，作为Wnt信号传导的负调节物发挥功能，并且在脊推动物发育过程中的头部形成中起关键作用(Glinkaetal.,Nature.1998Jan22;391(6665):357-62;Fedietal.，JBiolChem.1999Jul2;274(27):19465-72;Maoetal.,Nature.2002Jun6;417(6889):664-7.Epub2002May26,Nature.2001May17;411(6835):321誦5;Mukhopadhyayetal"DevCell.2001Sep;l(3):423-34)。另外据报道，DKK1是p-联蛋白/TCF的下游靶标，并且参与Wnt信号传导中的负反馈回路(Gonzalezetal.，Oncogene.2005Feb3;24(6):1098-103;Niidaetal.,Oncogene.2004Nov4;23(52):8520誦6)。人DKK(hDKK)相关基因家族由DKK1、DKK2、DKK3和DKK4，以及一种称为Soggy(Sgy)的独特的DKK3相关蛋白质构成。hDKK1-4含有两个截然不同的富半胱氨酸域，所述域中10个半胱氨酸的位置在家族成员之间是高度保守的。hDKKl和hDKK4在角蟾胚胎中抑制Wnt诱导的第二体轴诱导，而hDKK2、hDKK3或Sgy则不然(Krupniketal.，Gene.1999Oct1;238(2):301-13)。通过基因表达连续分析(SAGE)和定量逆转录(RT)-PCR发现，DKK4显示对胃癌的高特异性(Aungetal.，Oncogene.2006Apr20;25(17):2546-57)。其它研究显示DKK1在维尔姆斯瘤(Wilms，tumor)、肝母细胞瘤(hepatoblastoma)、和肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma)(HCC)中过高表达(Wirthsetal.，LabInvest.2003Mar;83(3):429-34;Patiletal.,Oncogene.2005May26;24(23):3737-47)，但是先前尚无人指明DKKl蛋白作为血清/组织化学标志物在人类癌症中的临床效用。和DKKl蛋白一样，已知Wnt抑制性因子-1(WIF-1)和Frizzeled相关蛋白(FRP)是被分泌的分子，有人指出它们结合Wnt蛋白并抑制其活性(Hsiehetal.,Nature.1999Aprl;398(6726):431-6;Wodarzetal.，AnnuRevCellDevBiol.1998;14:59-88;Moonetal.,DevSuppl.1993;:85-94)。才艮道称这两种蛋白与人类癌症包括结肠直肠癌相关(Cebratetal.,CancerLett.2004Mar31;206(1):107-13)。FRP-4蛋白在结肠直肠癌症中与正常粘膜中相比显示显著增加的表达，但是与病理学特征或者患者的最终结果没有显著关联(Horvathetal.,ClinCancerRes.2004Jan15;10(2):615-25)。由于已经记载了多种DKK家族蛋白在人类癌症中过高表达(Aungetal"Oncogene.2006Apr20;25(17):2546-57;Horvathetal"ClinCancerRes.2004Jan15;10(2):615画25)，因此DKK1看来似乎在肿瘤发生或进展中具有潜在的作用。在本发明中，本发明人证明了诱导DKKl的外源表达增强了正常哺乳动物细胞的细胞迁移/浸润活性。与此一致的是，由组织樣t阵列分析检测到的原发性NSCLC组织中的强DKKl染色与不良预后相关。虽然DKKl在肺癌发生和食道癌发生中的准确功能尚不知晓，而且癌细胞对邻近组织的浸润和远端转移是由一系列复杂的顺序步骤所构成，但这些结果表明，DKKl表达可以通过刺激细胞迁移而促进肿瘤的播散。DKK1已被描述为一种分泌型蛋白，它在脊推动物发育过程中的头部形成中起关键作用，并且已知是Wnt信号传导的负调节物(Niidaetal.,Oncogene.2004Nov4;23(52):8520-6)。DKKl结合LRP5/6和Kremen蛋白，从而诱导LRP内吞，LRP内吞则阻止Wnt-Frizzled-LRP5/6受体复合物的形成(Gonzalezetal.，Oncogene.2005Feb3;24(6):1098-103)。但是，本发明人通过半定量RT-PCR分析肺和食道癌细胞系及癌症组织中的DKKl和LRP5/6mRNA表达时发现，LRP5/6的表达图式与DKKl不一致(数据未显示)。进一步研究以鉴定人癌症中DKKl的未知结合配偶体和受体，不但可能有助于鉴定新的肺瘤标志物和治疗靶标，而且可能产生关于DKKl表达介导的信号途径的新认识。本发明人利用酶处理和丙氨酸置换突变体确证了C末端潜在位点天冬酰胺256是DKKl中的N-糖基化位点，但它并没有影响DKKl的分泌。近来，多种癌症特异性抗原，包括糖抗原，被报道为血清肿瘤标志物。特异性糖基化已经被用于诊断目的；即曱胎蛋白，用于肝细胞癌(Poonetal.,ClinChem.2002Jul;48(7):1021-7);人胰核糖核酸酶，其由胰I^J中瘤细胞产生时具有不同的寡糖链(Peracaulaetal.,Glycobiology.2003Apr;13(4):227-44.Epub2002Nov26);或者前列腺特异性抗原(PSA)，它是目前用于前列腺癌筛选的肿瘤标志物(Tabar6setal.，Glycobiology.2006Feb;16(2):132-45.Epub2005Sep21)。据^1道在癌症发生过程中发生N-连接糖基化的变化。已经将寡糖分枝的增加与转移关联，并且与乳房、结肠和黑素瘤的人类癌症中的肿瘤进展相互关联(Comunaleetal.，JProteomeRes.2006Feb;5(2):308國15)。尽管还需要进一步评价，但DKK1的糖基化可能是用于肺癌和食道癌治疗的新的诊断和治疗靶标。为了考察应用DKK1作为诊断工具的可行性，本发明人就诊断灵敏度和特异性将DKK1血清水平与CEA或ProGRP血清水平进行了比较，其中CEA和ProGRP是NSCLC和SCLC的常规诊断标志物。DKK1的相同血清样品中阳性病例的比例超过60%,而DKK1的假阳性率为5.0°/。左右，这表明DKK1的诊断力等价于或优于CEA。另外，联合两种标志物(DKK1+CE或DKKl+ProGRP)的测定法增加了灵敏度，使得大约80%的肺癌患者被诊断为阳性，而6.2-8.2°/。的健康志愿者被误诊为阳性。尽管还需要使用覆盖不同临床分期的更大的血清样品组来加以验证，但本文提供的数据足以表明DKK1本身作为肺癌和食道癌血清学/组织化学标志物的潜在临床应用。综上所述，本发明人鉴定了DKK1作为潜在的生物标志物，用于肺癌和食道癌的"^断以及对患有这些疾病的患者不良预后的预测。DKK1在本发明者所检测的大多数肺癌和食道癌组织中特异性地过高表达，并且在很大一部分具有这些肿瘤的患者的血清中有所升高。DKK1，与其它肿瘤标志物相结合，可以显著改善癌症诊断的灵敏度。另外，这种分子也很有可能作为候选物用于治疗途径例如抗体疗法的开发。工业应用性本文描述了通过激光捕获解剖和全基因组cDNA微阵列的组合获得的食道癌基因表达分析，该分析鉴定了用于癌症预防和治疗的靶标的特异性基因。根据这些差异表达的基因中的亚群的表达，本发明提供了用于鉴定和检测食道癌的分子诊断标志物。本文所描述的方法还可用于鉴定其它分子耙标，用于食道癌的预防、诊断和治疗。本文报道的数据增加了人们对食道癌的全面理解，方便了新诊断策略的开发，并且为鉴定治疗剂和预防药物的分子靶标提供了线索。这些信息为深化对于食道肿瘤发生的认识作出了贡献，并为诊断、治疗及最终预防食道癌的新策略的开发提供了启示。此外，本文中描述的方法还可用于诊断癌症，包括肺癌和食道癌，以及预测患有这些疾病的患者的不良预后。此外，本文报道的数据也为开发包括肺癌和食道癌在内的癌症的治疗手段提供了可能的侯选项。除非另有说明，本文所使用的所有技术术语和科学术语的意义均与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意义相同。若有冲突，当以包括定义在内的本说明书为准。本文引证本文中述及的所有出版物、专利申请、专利及其它参考文献的全部内容。虽然已经参照本发明的具体实施方案对本发明进行了详细说明，但对本领域技术人员显而易见的是可以对这些实施方案进行各种改变和修改而不背离本发明的精神和范围。表1.下调基因编号LMMID登录号符号基因名1A0906NM一002939RNH核糖核酸酶/血管生成素抑制剂2A1350NM013314BLNKB细胞连接物Clinker)3A1475BC017048GJB2Gap连接蛋白，beta2,26kDa(连接蛋白(connexin)26)4A2014L23959TFDP1转录因子Dp-lA2460AF000959CLDN5密蛋白(Claudin)5(软腭-心-面综合征(velocardiofacialsyndrome)中缺失的跨膜蛋白)6A3340M93284PNLIPRP2胰脂肪酶相关蛋白27A3821薩004925AQP37K通道蛋白(Aquap0rin)38A4472AF042081SH3BGRLSH3域结合性富谷氨酸蛋白类蛋白(Stl3domainbindingglutamicacid-richproteinlike)9A4587AF070609SLC1A3DKFZP547J0410蛋白10A0283画一021120DLG3Discs，大同源物3(神经内分泌-dlg,果蝇)11A1365D10653TM4SF2跨膜4超家族成员212A3322M80899AHNAKAHNAK核蛋白(桥粒连接蛋白(desmoyokin))13A5658AJ243937GPSM3G蛋白信号调节物3(类-AGS3，秀丽隐杆线虫(C.elegans》14A0765BC004102ALDH3A1醛脱氬酶3家族，成员Al15A1215NM002275KRT15角蛋白1516A1879U45955GPM6B糖蛋白M6B17A1758U60553CES2羧酸酯酶2(肠，肝)18A2363顧一000060BTD生物素酰胺酶(Biotinidase)19A6156BU616881ARHERas同源物基因家族，成员E20A2487D10923GPR109BG蛋白偶联受体109B21A2747NM—004347CASP5胱天蛋白酶5,凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶22A3095U26726HSD11B2羟类固醇(11-beta)脱氳酶223A3605画007366PLA2R1磷脂酶A2受体1，180kDa24A3701BC028412ELL2延伸因子，RNA聚合酶II,225A4481AF053470BLCAP膀胱癌相关蛋白26A4832D7觀DPYS二氢嘧啶酶27A4744AF020202UNC13BUnc-13同源物B(秀丽隐杆线虫(C.elegans))28A5888U56417AGPAT1l-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶l(溶血磷脂酸酰基转移酶,alpha)<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>112A4163画006001TUBA2微管蛋白，alpha2113A4388画—001988EVPL外被斑蛋白(Envoplakin)114A2291AF003341ALDH1A1醛脱氢酶1家族，成员Al115A2444AY366508L0H11CR2A杂合性丧失(Lossofheterozygosity)，11,染色体区域2，基因A116A2796NM006681N而神经调节肽U117A2802CR592117CASP1胱天蛋白酶l，凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶(白细胞介素1,beta,转化酶)118A3412而000552VWFVonWillebrand因子119A0593蘭002290LAMA4层粘连蛋白，alpha4120A1415L25798HMGCS13-羟基_3_曱基戊二酸单酰_辅酶A合酶1(可溶)121A2159L10340EEF1A2真核翻译延伸因子1alpha2122A2306U70063ASAH1N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(酸性神经酰胺酶(acidceramidase))1123A4810AF077599RNF41环指蛋白(ringfinger蛋白)41124A5155蘭000418IL4R白细胞介素4受体125A0304U80456SIM2Single-minded同源物2(果蝇)126A0856M32402PU26丝氨酸蛋白酶127A0574NM033018PCTK1PCTAIRE蛋白激酶1128A1564U70370PITX1类似配对同源域转录因子1(Paired-likehomeodomaintranscriptionfactor1)129A1832M74297H0XA4同源框(Homeobox)A4130A2664BC033820FGL2血纤蛋白原样2131A3291BM805032PRSS2蛋白酶，丝氨酸，2(胰蛋白酶2)132A4179画—002769PRSS1蛋白酶，丝氨酸，1(胰蛋白酶1)133A4297画—012205HAAO3-羟基氨基苯曱酸3,4-双加氧酶(3-hydroxyanthranilate3，4-dioxygenase)134A4695画001003395TPD52L1肺瘤蛋白D52样1135A5849NM_024095ASB8含锚蛋白重复序列和SOCS框的8(AnkyrinrepeatandSOCSbox-containing8)136A0971AY034086DSCR1L1Down氏综合征关键区域基因l样l137A2307NM一004563PCK2磷酸烯醇丙酮酸羧激酶2(carboxykinase2)(线粒体的)138A4517L08488INPP1肌醇多磷酸-l-磷酸酶139A5442AF105036KLF4Kruppel类似因子4(肠)<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>因(musculoaponeuroticfibrosarcomaoncogene)同源物(鸟类)537E1379AK123877ALDH3A2醛脱氢酶3家族，成员A2538D3758H28090CYYR1富含半胱氨酸和酪氨酸1539D9508AA928325FLJ25124假设蛋白FLJ25124540D3013AK096741SARG特异性由雄激素调节的蛋白541E0942画—173060CAST钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin)542E0921AF309033TNKS2端锚聚合酶(Tankyrase),TRFl-相互作用性锚蛋白-相关ADP-核糖聚合酶2543D3229BC054488RICSRhoGTP酶-活化蛋白544D5318NM—004185丽T2B无翅型MMTV整合位点家族，成员2B545D5082XM—374137假设的LOC389328546E0523BC017483AHNAKAHNAK核蛋白(桥粒连接蛋白)547E1815XM—041162NDFIP2Nedd4家族相互作用性蛋白2548E0542画—152243CDC42EP1CDC42效应物蛋白(RhoGTP酶结合性)I549E0387AI242329ANKRD22锚蛋白重复序列域22550E0785BC039269NALP2NACHT，含富亮氨酸重复序列和PYD2551D3359AJ272268CACNA2D3钩通道，电压依赖的，alpha2融a3亚基552D4215AB096175SP5Sp5转录因子553D4784AK026652PADI1肽酰精氨酸脱亚氨基酶(deiminase》I型554D5720AA970157FLJ10052假设蛋白FLJ10052555D9210CA844321MGC3196假设蛋白MGC3196556D8412BC071956ZBED2含锌指、BED域2557E0009AA947873558D5189BX101094FLJ21128假设蛋白FLJ21128559D7736AI022908被转录的座位560D3893AK074037CAPN34丐蛋白酶3，(p94)561D3442画1458006-Sep隔蛋白(Septin)6562D5553AA031882净皮转录的座位563D3309AA768426EVA1上皮V样抗原1564D4861AA913741被转录的座位565D5799CA450336净皮转录的座位566D9407CR749484LOC152519假设蛋白LOC152519567E0630CR591347KRT13角蛋白13568D4231C05897ARL5ADP-核糖基化因子样5<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table>819A4141D84239FCGBPIgG的Fc片段结合蛋白820A5679BC037430被转录的座位，中度类似于XP—375099.1假设蛋白LOC283585[人]821A6307AA639599SLC12A2溶质载体蛋白家族12(钠/钾/氯转运蛋白)，成员2822A1153M61199SSFA2精子特异性抗原2823A4672NM一022173TIA1TIA1细胞毒性颗粒相关的RNA结合蛋白824A4700U51336ITPK1肌醇1,3，4-三磷酸5/6激酶825A0333丽—002466MYBL2V-myb成髓细胞白血症病毒癌基因同源物(鸟类)样2826A1783AK055379MCM7MCM7微型染色体维持缺陷7(酿酒酵母)827A1824NM—002224ITPR3肌醇1,4,5-三磷酸受体，3型828A3889NM—002226JAG2Jagged2829A5576BC008141TREX23'修复外切核酸酶2830A0018画_198433STK6丝氨l苏氨酸激酶6831A4559AK055599CTSL组织蛋白酶L832A5290AK126848DKFZP564K0822假设蛋白DKFZp564K0822833A1510画—004385CSPG2硫酸软骨素蛋白聚糖2(多能聚糖(versican))834A2898AB030905CBX3Chromobox同源物3(HP1gamma同源物，果蝇)835A3156L02870C0L7A1胶原，VII型，alpha1(大疱性表皮松解症，营养不良性，显性和阴性)836A3890AF020774ALOX12P2花生四烯酸12-脂加氧酶假基因2(Arachidonate12-lipoxygenasepseudogene2)837A5422W91908GALNAC4S-6STB细胞RAG相关蛋白838A0215NM—021874CDC25B细胞分裂周期25B839A1797D00244PLAU血纤维蛋白溶酶原活化物，840A3298M91670UBE2S遍在蛋白偶联的酶E2S841A3555K02581TK1胸苦激酶l,可溶842A4954AB024402ING1生长家族抑制剂，成员1843A5556BC071586TIMP2金属蛋白酶组织抑制剂2844A0429BM554470UBE2C遍在蛋白偶联的酶E2C845A3015画201442CIS补体组分1,s亚组分846A1835U薩8ETV4Ets变体基因4(E1A增强子结合蛋白，E1AF)<table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table>975B7749BC023152GYG2糖原蛋白2976B7968R46597LRCH3含有富亮氨酸重复序列和4丐调理蛋白同源性(CH)域3977B9223AK023319KIAA0643KIAA0643蛋白978A4739NAJ306929AFURS1在衰老细胞中上调的ATP酶家族同源物979A8317NBQ013695FLJ10420假设蛋白FLJ10420980B4161BX538214C6orfl67染色体6可读框167981B4558NAK027019MGC45731假设蛋白MGC45731982B5373ND86962GRB10结合于生长因子受体的蛋白10983B7887BU580616FLJ10159假设蛋白FLJ10159984B9579AK055994FLJ25084假i殳蛋白FLJ25084985A6448N,AK127801FLJ46603FLJ46603蛋白986A8508NBX647338TM4SF13跨膜4超家族成员13987A9518NAA570186由AK096951;BC066547支持的假设基因988B8814BC007754SUV39H2花斑抑制物3-9同源物2(Suppressorofvariegation3-9homolog2)(果蝇)989A3200NAK122763C0L5A1胶原，V型，alpha1990A5073L09235ATP6V1AATP酶，H+转运性，溶酶体70kDa,VI亚基A991B5175NBC038183CAMTA1钩调蛋白结合性转录活化物1992B8480N62352KIAA1573KIAA1573蛋白993B9615CA314364MRNA;cDNADKFZp434L201(来自克隆DKFZp434L201)994A8542NAF542548AHSA2AHA1，热激90kDa蛋白ATP酶同源物活化物2(酵母)995A9534NAK000993C7orf28B染色体7可读框28B996A5065BC036661CMKOR1趋化因子孤儿受体1997B3358AA731746CPSF6切割和聚腺苷酸化特异性因子6,68kDa998B3958AF145713SCHIP1施旺膜蛋白相互作用性蛋白1(Schwannomininteractingprotein1)999B4587AB096683MGC57827类似于RIKENcDNA2700049P18基因1000B4217BU608626WFDC2WAP四二硫键核心域2薩B6125NT57349DRE1DRE1蛋白1002B6968BC016950MGC22679假i殳蛋白MGC22679聽B7480AF407165PPP1R14C蛋白质磷酸酶l,调节性(抑<table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table>同源性域相互作用性蛋白1321G3374AI740551SMARCA2SWI/SNF相关的，基质相关的，肌动蛋白依赖性染色质调节蛋白，亚家族a,成员21322G4230AA460431HSPC150HSPC150蛋白，类似于遍在蛋白偶联的酶1323G5380BC012776KUB3Ku70-结合蛋白31324G5190画006544SEC10L1SEC10样1(酿酒酵母)1325G7017AL832577PHACTR3磷酸酶和肌动蛋白调节物31326G7052AW376957FP67781327G7074AW057520TCF12转录因子12(HTF4,螺旋-环-螺旋转录因子4)1328G7311AW273713免疫球蛋白重链，V区(SPH1.17)1329G7334AW444577PRKDC蛋白激酶，DNA活化的，催化多肽1330G7392AI700994KIAA1287KIAA1287蛋白1331G7756BM673560CUL1滞蛋白1(Cullin1)1332G7409AV661871ALDOB醛缩酶B,果糖-二磷酸1333G7433AK0224261334G7944AL833181BCL11AB细胞CLL/淋巴瘤11A(锌指蛋白)1335G8118BC041347FLNB细丝蛋白(Filamin)B,beta(肌动蛋白结合蛋白278)1336F3260AK022675FLJ20542假设蛋白FLJ205421337G1502BG219755JMY连接介导和调节性蛋白1338G2206AB044088BHLHB3含碱性螺旋-环-螺旋域，B类，31339G2234BI496248VEZATIN跨膜蛋白vezatin1340G2919BF114768FLJ10808假设蛋白FLJ108081341G2629AK091973IGF1R胰岛素样生长因子l受体1342G2620N39603MAP3K5有丝分裂原活化蛋白激酶1343G3228AW450394PLAG1多形腺瘤基因11344G4095AA022935F画L2成蛋白样21345G4140BI918168cDNA克隆IMAGE:4811759,部分cds1346G4068BU078631PKD2多嚢性肾病2(常染色体显性)1347G4120AA151666被转录的座位，与类似于RIKENcDNA0910001B06的XP—343158.1高度类似[大鼠(Rattusnorvegicus)]1348G4165BM470637KLF3Kruppel类似因子3(碱性)<table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table>1474G4645AK057639UBE2B遍在蛋白偶联的酶E2B(RAD6同源物)1475G4332AI668557yj83d08.x5Soares胸部2NbHBst人cDNA克隆IMAGE:1553433'，mRNA序列.1476G5235R40058NRCAM神经细胞粘附分子1477G5028R11869ATF6活化转录因子61478G5270T59016yb49cl2.slStratagene月台JL脾脏(#937205)人cDNA克隆IMAGE:745183',mRNA序列.1479G5043AW973785證BLNipped-B同源物(果蝇)1480G5587BG281555由BC019009支持的假设基因函G6767AB036693RAB9BRAB9B,成员RAS癌基因家族1482G7916BF921173MR2-NT0135-161100陽006-a08NT0135人cDNA,mRNA序列.1483B5869NNM—015259ICOSL诱导型T细胞共刺激物配体1484G2037BG462138被转录的座位1485G2819AK095968cDNAFLJ38649fis,克隆HHDPC20073021486G3342BE156543QV0-HT0368-310100-091-h06HT0368人cDNA,mRNA序列.1487G4254BU739793PDE4B磷酸二酯酶4B，cAMP特异性(磷酸二酯酶E4dunce同源物，果蝇)1488G4287BX537672KIAA0934KIAA09341489G4511AK054893LOC146713假设蛋白LOC1467131490G4531AK055134STAG1基质抗原11491G4894AK096262cDNAFLJ38943fis,克隆NT2NE20174801492G4925AK097171cDNAFLJ39852fis,克隆SPLEN20148651493G5095H98216C14orf24染色体14可读框241494G5160N63395MLSTD2含雄性不育域21495G5123N48593cDNAFLJ36725fis,克隆UTERU20122301496G6039BC036620C9orf99染色体9可读框991497G7046AK07顿2PARVGParvin，gamma1498G7119BM977618PLEKHA5含普列克底物蛋白同源性<table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table>ACTAATGCAGTCAGGGACATAC9016CACCCATAACCAAGAGAACTCAG79GGGATGTCTGTTCCTTTTATTCC80C9046GTGGCCACTGAATGTAAAACAAC81AGTAACTCTGTCTTCATCCGCAG82C9098CAATTTTCCCATGGTCTTATCC1GCGTTTTCAAGATCTAGCATGTG2C9490GTTTTGGCCCAATTAACCAGTA83GCACTTGGAAGGGGTATTGTATT84C9517ATTCATTCTGGACCAAAGATCC85TCTACTGTGGACAAGAAGCCTGT86C9858AGCAGTCAGGGACAGACATACAT87AAGGTAAACTCTAGGCATCCGTC88D8457AAAGAGGAACACACTGGGTGTAA89AGGAGCCTAGAGAAGCAATCATC90D9504TCTTCAGCATGATGTGTTGTGT91TGAGAGATTCATGAGGAAGTCTTG92E0133AGGTGTACTGAGTGGGGAAGAAT93CTGGCATAACAGTGGCTTAAGTT94E0341GCTCCTTCTCTCATGGATTACCT95CAAGTGGGTAAAATGCTGTCTTC96E0556ACAAGTGCGAAGTCTGGTAAG97ACAGTGGTATTTGTGGCGTATC98E2191CCAAAAGCTAAGCAGTGGTGAAC99CTGTGCAACAGTTCCCAAAATG100F5946TTGACAAGCTGTAGAACTGGATT101AAAGTTGGAATGCCGATGACA102G3996CAGCCTCAATGGATACTGGC103GCTAGAAAGCAAACTCATGCTCTG104A3097TATGGTCTCCGTGCCTACCAC107ATACAGACAGGAAAAGCAGAGCA108ACTBGAGGTGATAGCATTGCTTTCG105CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC106表4在淋巴结阳性病例中下调的基因编号LMMID登录号符号基因名1544C8947AL833303全长插入序列cDNA克隆YZ04E021545B2112S74221IKIK细胞因子，HLAII下调因子<table>tableseeoriginaldocumentpage135</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage136</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage137</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage138</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage139</column></row><table>(Phosphatidylinositolbindingclathrinassemblyprotein)1659D9475AW0899120AZ1鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白11660E0215AI091879净皮转录的座4立1661E1229雨—003470USP7遍在蛋白特异性蛋白酶7(疱渗病毒相关的)1662E1378AK025645SLA2Src样-适体21663A0183NNM—004431EPHA2EPH受体A21664D7869菌一007175C8orf2SPFH域家族，成员21665E0052A腿459PSMA6蛋白酶体(prosomc,macropain)亚基,alpha型，61666El522BM550980MGC521假设蛋白MGC520101667C0328CR592555人胎盘全长cDNA克隆CS0DE011YI041668E0523BC017483AHNAKAHNAK核蛋白(桥粒连接蛋白)1669E1379AK123877ALDH3A2醛脱氮酶3家族，成员A21670D6549BC004888FLJ152假设蛋白FLJ100521671D3747AA843607LOC12376假设蛋白LOC1203761672C7731AF245505DKFZp56411922Adlican1673A0954NM000252MTM1Myotubularin11674B2801AK130734FLJ1371假设蛋白FLJ137101675A8688CR597998NPDC1神经增殖、分化和控制，11676B0629AK126877FLJ1521假设蛋白FLJ105211677A7145X52005EST1678A6751NM一002258KLRB1杀伤细胞凝集素样受体亚家族B，成员11679A9307BC053677FLJ37562假设蛋白FLJ37562表6在复发阳性病例中下调的基因编号LMMID登录号基因名<table>tableseeoriginaldocumentpage141</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage142</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage143</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage144</column></row><table>*P<0.05NS,无显著性表10A.NSCLC组织中的DKK1阳性和患者特征之间的关联(11=279)<table>tableseeoriginaldocumentpage144</column></row><table>年龄(岁)组织型因素pN因素<65^65ADC非ADCTl+T2T3+T4NONl+N21341451611182413821069517448771111488375943703284188517242843946637150.0309*<0.001*NSNSADC,腺癌；SCC,鳞状细胞癌非ADC，SCC,大细胞癌(LCC),和腺鳞状细胞癌(ASC)*P<0.05(Fisher'sexacttest)NS,无显著性表1OB.患有NSCLC的患者中预后因素的Cox，s比例危险模型分析变量危险比率95%CI不良/艮好P-值1ADC,腺癌*P<0.05单变量分析DKK1年龄(岁)性别组织型分DKK1pT因素pN因素1.9772.2141.9582.2792.4313.8111.7982.4073.4180.0013*0.0138*0.0007*1.234-3.169强(+)/弱(+)或0.0046*(-)1.365-3.59265^/<651.147-3.345男性/女性1.418-3.661非ADC/ADC11.374-4.303T3+T4/T1+T20.0023*2.387-6.084N1+N2/N0O.0001*1.114-2.903强(+)/弱(+)或0.0163*(-)1.349-4.294T3+T4/0.0029*T1+T22.124-5.500N1+N2/N0O.0001*权利要求1.一种诊断受试者中食道癌或发生食道癌的倾向性的方法，包括确定来自患者的生物样品中食道癌相关基因的表达水平，其中所述样品中所述基因表达水平与正常对照表达水平相比增加或减少则表明所述受试者患有或者有风险发生食道癌。2.权利要求1的方法，其中所述食道癌相关基因选自由ECNo.728-1543(表2)、1603-1679(表5)和1689-1716(表7)所示基因构成的群组，且其中所述样品中所述基因表达水平与正常对照表达水平相比增加则表明所述受试者患有或者有风险发生食道癌。3.权利要求2的方法，其中所述样品表达水平比所述正常对照水平至少高10%。4.权利要求l的方法，其中所述食道癌相关基因选自由ECNo.1-727(表l)、1544-1602(表4)和1680-1688(表6)所示基因构成的群组，且其中所述样品中所述基因表达水平与正常对照表达水平相比减少则表明所述受试者患有或者有风险发生食道癌。5.权利要求4的方法，其中所述样品表达水平比所述正常对照水平至少低10%。6.权利要求l的方法，其中所述食道癌是食道鳞状细胞癌。7.权利要求l的方法，其中所述生物样品包括上皮细胞。8.权利要求l的方法，其中所述生物样品包括食道癌细胞。9.权利要求1的方法，其中所述生物样品包括来自食道癌的上皮细胞。10.权利要求1的方法，其中所述方法还包括确定多个食道癌相关基因的表达水平。11.权利要求l的方法，其中通过选自下組的方法确定基因表达水平(a)检测食道癌相关基因的mRNA,(b)检测食道癌相关基因编码的蛋白质，和(c)检测食道癌相关基因编码的蛋白质的生物学活性。12.权利要求10的方法，其中所述检测是在DNA阵列上进行的。13.—种食道癌参照表达模式，包括两种或多种食道癌相关基因的基因表达图式，其中所述食道癌相关基因选自ECNo.1-1716的基因。14.一种篩选用于治疗或预防食道癌的化合物的方法，所述方法包括下列步骤(a)使试验化合物与由选自ECNo.1-1716的基因的多核苷酸所编码的多肽相接触；(b)检测多肽和试验化合物之间的结合活性；和(c)选择与多肽结合的试验化合物。15.—种筛选用于治疗或预防食道癌的化合物的方法，所述方法包括下列步骤(a)使候选化合物与表达一种或多种标志物基因的细胞相接触；其中所述一种或多种标志物基因选自ECNo.1-1716的基因；和(b)选择这样的候选化合物与不存在该候选化合物的条件下检测到的表达水平相比，其降低选自ECNo728-1543(表2)、1603-1679(表5)和1689-1716(表7)所示基因中的一种或多种标志物基因的表达水平，或者其提高选自ECNo.l-727(表1)、1544-1602(表4)、和1680-1688(表6)所示基因中的一种或多种标志物基因的表达水平。16.权利要求15的方法，其中所述细胞包括食道癌细胞。17.—种篩选用于治疗或预防食道癌的化合物的方法，所述方法包括下列步骤(a)使试验化合物与由选自ECNo.1-1716的基因的多核苷酸所编码的多肽相接触；(b)检测步骤(a)的多肽的生物学活性；和(c)选择这样的候选化合物，与不存在该候选化合物的条件下检测到的生物学活性相比，其抑制选自ECNo728-1543(表2)、1603-1679(表5)和1689-1716(表7)所示基因的多核苷酸所编码的多肽的生物学活性，或者其增强选自ECNo.1-727(表1)、1544-1602(表4)和1680-1688(表6)所示基因的多核苦酸所编码的多肽的生物学活性。18.—种筛选用于治疗或预防食道癌的化合物的方法，所述方法包括下列步骤(a)使候选化合物与其中导入了载体的细胞相接触，所述载体包含一种或多种标志物基因的转录调控区域和在所述转录调控区域的控制下表达的报道基因，其中所述一种或多种标志物基因选自ECNo.1-1716所示基因；(b)测量所述报道基因的表达水平或活性；和(c)选择这样的候选化合物与不存在该候选化合物的条件下检测到的表达水平或活性相比，当所述标志物基因是选自ECNo728-1543(表2)、1603-1679(表5)和1689-1716(表7)所示基因的上调标志物基因时，该候选化合物降低所述报道基因的表达水平或活性；或者，当所述标志物基因是选自ECNo.1-727(表l)、1544-1602(表4)和1680-1688(表6)所示基因的下调标志物基因时，该候选化合物提高所述报道基因的表达水平或活性。19.一种包含检测试剂的试剂盒，所述检测试剂结合(a)选自ECNo.1-1716的基因中的两种或更多核酸序列，或(b)它们所编码的多肽。20.—种包含两种或更多核酸的阵列，所述核酸结合选自ECNo.1-1716的基因中的一种或多种核酸序列。21.—种在受试者中治疗或预防食道癌的方法，包括对所述受试者施用反义组合物，所述反义组合物包含与编码序列互补的核香酸序列，所述编码序列选自ECNo728-1543(表2)、1603-1679(表5)和1689-1716(表7)所示基因。22.—种在受试者中治疗或预防食道癌的方法，包括对所述受试者施用siRNA组合物，其中所述siRNA组合物减少核酸序列的表达，所述核酸序列选自ECNo728-1543(表2)、1603-1679(表5)和1689-1716(表7)所示基因。23.权利要求22的方法，其中所述核苦酸序列选自SEQIDNO:30(ECT2)和SEQIDNO:32(CDC45L),并且所述siRNA包含有义链，所述有义链包含选自SEQIDNO:8、9、10和11的核香酸序列的核苷酸序列。24.—种在受试者中治疗或预防食道癌的方法，包括对受试者使用药学有效量的抗体或其免疫学活性片段，其中所述抗体或其免疫学活性片段结合由选自ECNo728-1543(表2)、1603-1679(表5)和1689-1716(表7)所示基因的任一基因所编码的蛋白质。25.—种在受试者中治疗或预防食道癌的方法，包括对受试者施用疫苗，所述疫苗包含(a)由核酸编码的多肽，所述核酸选自ECNo728-1543(表2)、1603-1679(表5)和1689-1716(表7)所示基因，(b)所述多肽的免疫学活性片,史，或(c)编码所述多肽的多核芬酸。26.—种诱导抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括使抗原呈递细胞接触下列物质的步骤多肽、编码该多肽的多核苷酸、或包含该多核苷酸的载体；其中所述多肽由选自ECNo728-1543(表2)、1603-1679(表5)和1689-1716(表7)所示基因或其片段所编码。27.权利要求26的诱导抗肿瘤免疫的方法，其中所述方法还包括将所述抗原呈递细胞施用于受试者的步骤。28.—种在受试者中治疗或预防食道癌的方法，包括对所述受试者施用化合物，该化合物增加(a)选自ECNo.1-727(表1)、1544-1602(表4)、和1680-1688(表6)所示基因的多核普酸的表达；或(b)它们所编码的多肽的活性。29.—种在受试者中治疗或预防食道癌的方法，所述方法包括施用通过权利要求14-18任一项的方法获得的化合物的步骤。30.—种在受试者中治疗或预防食道癌的方法，包括对所述受试者施用药学有效量的作用物质，所述作用物质包含(a)选自ECNo.l-"7(表1)、1544-1602(表4)、和1680-1688(表6)所示基因的多核香酸；或(b)它们所编码的多肽。31.—种治疗或预防食道癌的组合物，所述组合物包含药学有效量的反义多核苷酸或siRNA,所述反义多核苷酸或siRNA针对选自ECNo728-1543(表2)、1603-1679(表5)和1689-1716(表7)所示基因的多核苦酸。32.权利要求31的组合物，其中所述siRNA包含有义链，所述有义链包含选自SEQIDNO:8、9、10和11的核苷酸序列的核苷酸序列。33.—种治疗或预防食道癌的组合物，所述组合物包含药学有效量的抗体或其片段，所述抗体或其片段结合由选自ECNo728-1543(表2)、1603-1679(表5)和16S9-1716(表"所示基因的基因所编码的蛋白质。34.—种治疗或预防食道癌的组合物，所述组合物包含药学有效量的通过权利要求14-18任一项的方法所选择的化合物作为活性成分，以及药学可接受的载体。35.—种筛选用于治疗或预防食道癌转移的化合物的方法，所述方法包括下列步骤(a)使试验化合物与由选自ECNo.1544-1679(表4-5)所示基因的多核苦酸所编码的多肽相接触；(b)4全测多肽和试验化合物之间的结合活性；和(C)选择与多肽结合的试验化合物。36.—种筛选用于治疗或预防食道癌转移的化合物的方法，所述方法包括下列步骤(a)使候选化合物与表达一种或多种标志物基因的细胞相接触；其中所述一种或多种标志物基因选自ECNo.1544-1679(表4-5)所示基因；和(b)选择这样的候选化合物与不存在该候选化合物的条件下检测到的表达水平相比，其降低选自ECNo.1603-1679(表5)所示基因中的一种或多种标志物基因的表达水平，或者提高选自ECNo1544-1602(表4)所示基因中的一种或多种标志物基因的表达水平。37.—种筛选治疗或预防食道癌转移的化合物的方法，所述方法包括下列步骤(a)使试验化合物与由选自ECNo.1544-16"(表4-5)所示基因的多核苷酸所编码的多肽相接触；(b)检测步骤(a)的多肽的生物学活性；和(c)选择这样的候选化合物与不存在该候选化合物的条件下检测到的生物学活性相比，其抑制选自ECNo.1603-1679(表5)所示基因的多核苷酸所编码的多肽的生物学活性，或者增强选自ECNo1544-1602(表4)所示基因的多核苷酸所编码的多肽的生物学活性。38.—种筛选治疗或预防食道癌转移的化合物的方法，所述方法包括下列步骤(a)使候选化合物与其中导入了载体的细胞相接触，所述载体包含一种或多种标志物基因的转录调控区域和在所述转录调控区域的控制下表达的报道基因，其中所述一种或多种标志物基因选自ECNo.1544-1679(表4-5)所示基因；(b)测量所述报道基因的表达水平或活性；和(c)选择这样的候选化合物与不存在该候选化合物的条件下检测到的表达水平或活性相比，当所述标志物基因是选自ECNo1603-1679(表5)所示基因的上调标志物基因时，该候选化合物降低所述报道基因的表达水平或活性；或者，当所述标志物基因是选自1544-1602(表4)所示基因的下调标志物基因时，该候选化合物提高所述报道基因的表达水平或活性。39.—种在受试者中治疗或预防食道癌转移的方法，包括对所述受试者施用反义组合物，所述反义组合物包含与编码序列互补的核苷酸序列，所述编码序列选自ECNo1603-1679(表5)所示基因。40.—种在受试者中治疗或预防食道癌转移的方法，包括对所述受试者施用siRNA组合物，其中所述siRNA组合物减少核酸序列的表达，所述核酸序列选自ECNo1603-1679(表5)所示基因。41.一种在受试者中治疗或预防食道癌转移的方法，包括对受试者使用药学有效量的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段结合由选自ECNo1603-1679(表5)所示基因所编码的蛋白质。42.—种在受试者中治疗或预防食道癌转移的方法，包括对受试者施用疫苗，所述疫苗包含(a)由核酸编码的多肽，所述核酸选自ECNo1603-16<79(表5)所示基因，(b)所述多肽的免疫学活性片段，或(c)编码所述多肽的多核苦酸。43.—种在受试者中治疗或预防食道癌转移的方法，包括对所述受试者施用化合物，该化合物增加(a)选自ECNo.1544-1602(表4)所示基因的多核苷酸的表达；或(b)所述多核苷酸所编码的多肽的活性。44.一种在受试者中治疗或预防食道癌转移的方法，包括对所述受试者施用药学有效量的作用物质，所述作用物质包含(a)选自ECNo.1544-1602(表4)所示基因的多核苦酸；或(b)所述多核苷酸所编码的多肽。45.—种治疗或预防食道癌转移的组合物，所述组合物包含药学有效量的反义多核苷酸或小干扰RNA，所述反义多核苷酸或小干扰RNA针对选自ECNo1603-1679(表5)所示基因的多核普酸。46.—种治疗或预防食道癌转移的组合物，所述组合物包含药学有效量的抗体或其片段，所述抗体或其片段结合由选自ECNo1603-1679(表5)所示基因的基因所编码的蛋白质。47.—种治疗或预防食道癌转移的组合物，所述组合物包含药学有效量的通过权利要求35-38任一项的方法所选择的化合物作为活性成分，以及药学可接受的载体。48.—种筛选用于治疗或预防食道癌复发的化合物的方法，所述方法包括下列步骤(a)使试验化合物与由选自ECNo.1680-1716(表6-7)所示基因的多核香酸所编码的多肽相接触；(b)检测多肽和试验化合物之间的结合活性；和(c)选择与所述多肽结合的试验化合物。49.一种筛选用于治疗或预防食道癌复发的化合物的方法，所述方法包括下列步骤(a)使候选化合物与表达一种或多种标志物基因的细胞相接触；其中所述一种或多种标志物基因选自ECNo.1680-1716(表6-7)所示基因；和(b)选择这样的候选化合物与不存在该候选化合物的条件下检测到的表达水平相比，其降低选自ECNo.1689-1716(表7)所示基因的一种或多种标志物基因的表达水平，或者提高选自ECNo1680-1688(表6)所示基因的一种或多种标志物基因的表达水平。50.—种筛选治疗或预防食道癌复发的化合物的方法，所述方法包括下列步骤(a)使试验化合物与由选自ECNo.1680-ni6(表6-7)所示基因的多核苦酸所编码的多肽相接触；(b)检测步骤(a)的多肽的生物学活性；和(c)选择这样的候选化合物与不存在该候选化合物的条件下检测到的生物学活性相比，其抑制选自ECNo.1689-1716(表7)所示基因的多核香酸所编码的多肽的生物学活性，或者增强选自ECNo1680-1688(表6)所示基因的多核苷酸所编码的多肽的生物学活性。51.—种筛选治疗或预防食道癌复发的化合物的方法，所述方法包括下列步骤(a)使候选化合物与其中导入了载体的细胞相接触，所述载体包含一种或多种标志物基因的转录调控区域和在所述转录调控区域的控制下表达的报道基因，其中所述一种或多种标志物基因选自ECNo.1680-1716(表6-7)所示基因；(b)测量所述报道基因的表达水平或活性；和(c)选择这样的候选化合物与不存在该候选化合物的条件下检测到的表达水平或活性相比，当所述标志物基因是选自ECNo1689-1716(表7)所示基因的上调标志物基因时，该候选化合物降低所述报道基因的表达水平或活性；或者，当所述标志物基因是选自ECNo.1680-1688(表6)所示基因的下调标志物基因时，该候选化合物提高所述报道基因的表达水平或活性。52.—种在受试者中治疗或预防食道癌复发的方法，包括对所述受试者施用反义组合物，所述反义组合物包含与编码序列互补的核苷酸序列，所述编码序列选自ECNo1689-1716(表7)所示基因。53.—种在受试者中治疗或预防食道癌复发的方法，包括对所述受试者施用siRNA组合物，其中所述siRNA组合物减少核酸序列的表达，所述核酸序列选自ECNo1689-1716(表7)所示基因。54.—种在受试者中治疗或预防食道癌复发的方法，包括对受试者使用药学有效量的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段结合由选自ECNo1689-1716(表7)所示基因的任一基因所编码的蛋白质。55.—种在受试者中治疗或预防食道癌复发的方法，包括对受试者施用疫苗，所述疫苗包含(a)由核酸编码的多肽，所述核酸选自ECNo1689-1716(表7)所示基因，(b)所述多肽的免疫学活性片段，或(c)编码所述多肽的多核香酸。56.—种在受试者中治疗或预防食道癌复发的方法，包括对所述受试者施用化合物，该化合物增加(a)选自ECNo.1680-1688(表6)所示基因的多核苷酸的表达；或(b)所述多核苷酸所编码的多肽的活性。57.—种在受试者中治疗或预防食道癌复发的方法，包括对所述受试者施用药学有效量的作用物质，所述作用物质包含(a)选自ECNo.1680-1688(表6)所示基因的多核苷酸；或(b)所述多核苷酸所编码的多肽。58.—种治疗或预防食道癌复发的组合物，所述組合物包含药学有效量的反义多核苦酸或小干扰RNA，所述反义多核苷酸或小干扰RNA针对选自ECNo1689-1716(表7)所示基因的多核苷酸。59.—种治疗或预防食道癌复发的组合物，所述組合物包含药学有效量的抗体或其片段，所述抗体或其片段结合由选自ECNo1689-1716(表7)所示基因的基因所编码的蛋白质。60.—种治疗或预防食道癌复发的组合物，所述组合物包含药学有效量的通过权利要求48-51任一项的方法所选择的化合物作为活性成分，以及药学可接受的载体。61.—种预测受试者中食道癌转移的方法，所述方法包括下列步骤(a)检测从所述受试者采集的标本中一种或多种标志物基因的表达水平，其中所述一种或多种标志物基因选自ECNo.1544-1679(表4-5)所示基因；(b)将所述标本中一种或多种标志物基因的表达水平与转移阳性病例和转移阴性病例的一种或多种标志物基因的表达水平相比较；和道癌转移的低风险。62.—种预测受试者中食道癌复发的方法，所述方法包括下列步骤(a)检测从所述受试者采集的标本中一种或多种标志物基因的表达水平，其中所述一种或多种标志物基因选自ECNo.1680-1716(表6-7)所示基因；(b)将所述标本中一种或多种标志物基因的表达水平与复发阳性病例和复发阴性病例的一种或多种标志物基因的表达水平相比较；和道癌复发的低风险。63.—种诊断患者中癌症的方法，包括下列步骤(a)从待诊断患者采集血液样品；(b)确定血液样品中DKK1的水平；(c)将步骤(b)中确定的DKK1水平与正常对照水平相比较；和(d)判定血液样品中相比于正常对照水平的高DKK1水平表明该受试者患有癌症。64.权利要求63的方法，其中所述癌症是食道癌和肺癌。65.权利要求63的方法，其中所述血液样品选自全血、血清和血浆。66.权利要求63的方法，其中所述DKK1水平是通过才企测血清中的DKK1蛋白而确定的。67.权利要求66的方法，其中所述DKK1蛋白是通过免疫测定4企测的。68.权利要求67的方法，其中所述免疫测定是ELISA。69.权利要求67的方法，其中所述免疫测定是使用抗DKK1多克隆抗体作为#:测抗体的夹心法。70.—种用于检测癌症的试剂盒，其中该试剂盒包括(a)用于确定血液样品中DKK1水平的免疫测定试剂；和(b)4十对DKK1的阳性对照样品。71.权利要求70的试剂盒，其中所述癌症是食道癌和肺癌。72.权利要求70的试剂盒，其中所述阳性对照样品针对DKK1是阳性的。73.权利要求72的试剂盒，其中所述阳性对照样品是液体形式。74.用于检测癌症的阳性对照血液样品，其中所述血液样品包括高于正常水平的两者的DKK1。75.权利要求74的阳性对照血液样品，其中所述癌症是食道癌和肺癌。76.评估癌症患者的预后的方法，所述方法包括下列步骤(a)检测患者来源的生物样品中DKK1基因的表达水平；(b)将测得的表达水平与对照水平相比较；和(c)基于(b)的比较确定所述患者的预后。77.权利要求76的方法，其中所述对照水平是良好预后对照水平，且表达水平相比于对照水平增加则确定为不良预后。78.权利要求77的方法，其中所述增加为高于对照水平至少10%。79.权利要求76的方法，其中所述方法包括确定其它癌症相关基因的表达水平。80.权利要求76的方法，其中所述表达水平是通过选自下组的任一方法确定的(a)检测DKK1基因的mRNA;(b)检测DKK1蛋白；和(c)检测DKK1蛋白的生物学活性。81.权利要求76的方法，其中所述表达水平是通过检测探针与DKK1基因的基因转录物的杂交而确定的。82.权利要求81的方法，其中所述杂交步骤是在DNA阵列上进行的。83.权利要求76的方法，其中所述表达水平是通过检测针对DKK1蛋白的抗体的结合作为DKK1的表达水平而确定的。84.权利要求76的方法，其中所述生物样品包括痰或血液。85.权利要求76的方法，其中所述癌症是食道癌和肺癌。86.—种用于评估癌症患者预后的试剂盒，其包括选自下组的试剂(a)用于检测DKK1基因的mRNA的试剂；(b)用于检测DKK1蛋白的试剂；和(c)用于检测DKK1蛋白生物学活性的试剂。87.权利要求86的试剂盒，其中所述试剂是针对DKKl蛋白的抗体。88.权利要求86的试剂盒，其中所述癌症是食道癌和肺癌。全文摘要为了鉴定涉及食道癌发生的分子和可用作诊断标志物及新药及免疫疗法的靶标的分子，构建了代表32,256个基因的cDNA微阵列，用来分析了通过激光捕获显微解剖纯化的19个食道鳞状细胞癌(ESSCCS)的表达模式。本文公开了在食道癌中显著上调或下调的基因群的详细全基因组数据。这些基因可用于开发治疗药物或免疫疗法以及肿瘤标志物。另外，本文公开了与淋巴结转移和手术后复发相关的基因。在候选的分子靶标基因中，进一步表征了人上皮细胞转化序列2癌基因(ECT2)和细胞分裂周期蛋白45，酿酒酵母类同源物(CDC45L)。用ECT2或CDC45L的小干扰RNA(siRNA)处理ESCC细胞抑制了癌细胞生长。因此，本文的数据为食道癌诊断系统和治疗靶标分子的鉴定提供了有价值的信息。另外，本发明人鉴定了DKK1，作为用于诊断癌症例如肺癌和食道癌以及预测这些疾病患者的不良预后的潜在生物标志。DKK1在本发明人检查的大多数肺和食道癌组织中特异性地过度表达，并且在一大部分患有这些肿瘤的患者的血清中有所提高。DKK1与其它肿瘤标志物组合，可以显著地改善癌症诊断的灵敏度。另外，该分子也是用于开发抗体疗法等治疗手段的可能候选。文档编号C12Q1/68GK101273144SQ20068003523公开日2008年9月24日申请日期2006年7月26日优先权日2005年7月27日发明者中村佑辅,中鹤修一,醍醐弥太郎申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司