专利名称：用可见光线和/或近红外线诊断有无乳房炎的方法与装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及根据来自奶牛的尿液、生奶或哺乳腺的可见光和/或红外光谱来诊断乳房炎的方法与装置。
现有技术生奶中体细胞的数量是乳房炎诊断的主要标志。迄今为止，测量体细胞数量一直是应用直接显微法、CMT修正法和荧光测定法。
目前，一般使用荧光型体细胞计数器(Fossomatic)测量生奶的体细胞数。该装置能计算和显示每毫升的体细胞数，方法是将缓冲液与染色液(溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓溶液)混入生奶，对体细胞的细胞核作荧光染色，将得到的混合奶用微注射器分散加到连续旋转盘的外围部分，再用荧光显微镜自动测量体细胞数。
日本规定，在用荧光型体细胞订数器(Fossomatic)测量生奶时，若每毫升的体细胞数达300000或更多，就断定该奶牛已患乳房炎，禁止挤奶。
本发明要解决的问题然而，基于用荧光型体细胞计数器测量体细胞的常规乳房炎诊断法有各种问题要解决(1)挤取的生奶要加缓冲液与染色液等化学品作预处理；(2)不能以非破坏方式测量生奶样品；(3)生奶易被其它物质干扰；(4)化学品价格高，从成本性能的观点来看是不利的；和(5)操纵装置与样品要用熟练的技术方法。
因此，本发明的目的是提出一种测量方法与装置以及判断方法，它通过对奶牛的尿液、生奶或哺乳腺发出的可见光和/或近红外光谱作光学测量，能在短时间内高度精密地诊断乳房炎。
解决问题的措施本发明涉及诊断奶牛乳房炎的方法，包括以下步骤将400～2500nm波长范围内的可见光线和/或近红外线辐照入奶牛的尿液、生奶或哺乳腺里，检测来自所述尿液、生奶或哺乳腺的透射光线、反射光线或者透射与反射光线的强度，作多元回归分析，诊断奶牛存在乳房炎。相对于用于检测的可见光线和/或近红外线，选用能有效判断乳房炎的波长的光线。
根据本发明，检测来自奶牛的尿液、生奶或哺乳腺的透射光线、反射光线或者透射与反射光线的强度，可以确定随尿液、生奶或哺乳腺中体细胞数变化的吸收比，这样通过多元回归分析和诊断存在奶牛乳房炎，可以判定奶牛的乳房炎。因此，无须作常规而麻烦的预处理、使用贵重化学品和熟练操作样品。从哺乳腺反射的光线等的强度表示由活体组织(包括哺乳动物细胞)反射的光线等的强度。在哺乳腺中，哺乳腺细胞(包括生奶)和活组织分别认为是牛乳和透明小容器。至于透射光线的测量，例如，将入射光线经光纤加到哺乳腺的一个右侧，同时把该光纤加到左侧，通过加到哺乳腺另一左侧的另一根光纤测量透射光线(在检测器一侧)。近红外范围的光线在哺乳腺中通过甚至更厚的路径，视波长范围而定。
本发明中用于诊断乳房炎的可见光线与近红外线的波长范围为400～2500nm。若应用400～1000nm范围的可见光线与红外线，就使用硅光探测器，若应用700～2500nm波长范围的近红外线，PbSe、InGaAs或GaAs等光探测器。
在上述可见光线与近红外线波长范围内，由于400～700nm范围的可见光线与近红外线有噪声，所以最好使用700～2500nm范围的近红外线。再者，由于生奶含各种成分，如水、蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质等，在各种波长区内，光线主要被作为主成分的水吸收，担心会妨碍测量近红外光谱。然而，在700～2500nm波长区内，与水相关的干扰比其它波长区要小。在1100～2500纳以长区内，尿液、生奶或哺乳腺中体细胞的吸收比变化作为分子振动的第一谐音或组合谐音。因此，最好用1100～2500nm波长范围的近红外线作测量，它能在短时间里测量尿液、生奶或哺乳腺中的体细胞。
再者，在红外线波长区中，由于在尿液、生奶或哺乳腺中吸收比较小，在测量透射光线或者透射与反射光线时，可将样品厚度保持为几毫米，因而易于搬动与设定样品容器。
通过对尿液、生奶或哺乳腺作光学测量和基于多元回归的数据处理，很容易高度精密地诊断奶牛的乳房炎。下面将描述这种诊断奶牛乳房炎的方法。
本发明的特征在于，在光学测量中，用分光仪在波长上扫描来自尿液、生奶或哺乳腺的入射光线、透射光线、反射光线或透射与反射光线，对得到的分光光谱作多元回归分析。
根据本发明，由于用分光仪扫描波长可得到波长分辨率高的基本上连续的分光光谱，故能得到数据分析必需的大量数据。例如，若在1100～2500nm波长区内以2nm波长分辨率作扫描，每次扫描可得到701个数据点，提高了数据分析的精密度。
本发明还涉及诊断奶牛乳房炎的装置，包括(1)近红外线发生器，产生波长范围为400～2500nm的可见光线和/或近红外线；(2)将可见光线和/或近红外线引入奶牛的尿液、生奶或哺乳腺的光学系统；(3)检测器，检测来自所述尿液、生奶或哺乳腺的透射光线、反射光线或透射与反射光线的强度；和(4)数据处理器，用于接收来自所述检测器的信号，作多元回归分析，以诊断奶牛存在乳房炎。
本发明的乳房炎诊断装置最好还包括一光纤，用于将来自奶牛的所述尿液、生奶或哺乳腺的可见光线和/或近红外线引入光探测器，从而用所述光探测器通过该光纤检测与来自所述尿液、生奶或哺乳腺的透射光线、反射光线或透射与反射光线的强度。
利用光纤可提供便携小型的乳房炎诊断装置。
奶牛乳房炎诊断装置最好还包括一供料器，将所述生奶经在线或线上引入生奶样品容器。
设置供料器将所述生奶经在线或线上引入样品容器，可按消逝的时间连续地测量可见光线和/或近红外线。
奶牛乳房炎诊断装置还包括保存生奶的样品容器和使样品容器内的生奶稳定到指定温度的温控器。
样品容器中生奶温度稳定可防止生奶的吸收比因温度而变化，可提高诊断乳房炎的精度。在测量哺乳腺以诊断乳房炎时，将哺乳腺固定于挤奶机，必要时，按上述方法控制温度。
附图简介
图1是本发明一实施例的生奶光谱测量装置的结构图。
图2是一例生奶光谱测量装置的电气结构的框图。
图3是样品架40的剖视图。
图4是一曲线图，示出一例若干生奶样品在400～1100nm波长范围内的近红外线光谱。
图5是一曲线图，同一例若干生奶样品在1100～2500nm波长范围内的近红外线光谱。
图6示出执行PLS法的步骤，该方法是本发明多元回归分析法的一种形式。
图7给出的曲线表示用于各计算的若干PLS因素和分析误差。
图8是一曲线图，表示PLS法推定的体细胞数与使用取自奶牛的生奶样品时实际体细胞数之间的相关性。
图9是一曲线图，表示PLS法推定的体细胞数与使用取自奶牛的尿样的实际体细胞数之间的相关性。
实施本发明的实施例现参照图1描述本发明的乳房炎诊断装置。
图1是本发明一实施例的生奶光谱测量装置的结构图。以光行进方向看，该装置包括产生测量光线的光源、使光源1发出的光线相互平行的透镜2，通过分离光源1的光线而取得所需光线的分光仪9、截断分光仪发射的高光部分光线的滤光器10、汇集分离光线的透镜11、插在透镜11与反射镜12之间的光斩波器14、由光漫射材料形成的积分球13、保存样品的样品架40等。
光源1由钨卤素灯等组成，产生波长范围很宽的光线，包括近红外线。分光仪9包括汇集入射光线的透镜3、调节光线通量与大小的缝隙4、对通过缝隙4的光线作反射的反射镜5、带曲线表面的衍射光栅6、控制衍射光栅6的衍射角的电机6a、在衍射光栅6上衍射的光线中只通过所需光部分的缝隙7、相互平行地发射衍射光线的光发射透镜8等。通过用电机6a作角度控制，能有选择地只取出所需波长的光线。
光斩波器14设计成转盘形式，其中交替安置了光反射部分与光透过部分，驱动电机14a而转动光学斩波器14，周期性反射或通过来自透镜11的光线。斩波传感器14b检测光斩波器14的旋到相位，根据来自斩波传感器14b的信号，同步电路14c输出同步信号Sa与Sb，分别表示来自透镜11的光线的反射与通过状态。
积分球13包括向上打开的入射光窗口13a、向下打开的光发射窗口13b和多个把接收的光线量转换为电信号的光探测器20。积分球13的作用是使进入该球的光线发生漫射而减少测量误差。光探测器20由PbS等构成，在近红外线区具有灵敏度。样品架40位于光发射窗口13b附近。
若用光斩波器14反射经分光仪9分离的光线，则进入样品架40的光线就像经入射光窗口13a通过积分球13一样，结果返回的光线在积分球13中漫射，一部分光线被光探测器20接收。另一方面，若分光仪9分离的光线通过光斩波器14，它被反射镜12反射而通过入射光窗口13a斜向进入积分球13，因而该光线漫射而不到达样品，部分光线被光探测器20接收。斩波器的上述操作取出了受样品影响和不受样品影响的信号。
图2是一例框图，表示生奶光谱测量装置中数据处理器的电气结构。来自光探测器20的检测信号被放大器21放大后，输入采样保持电路22以同步信号Sa采样，并输入采样保持电路23以同步信号Sb采样。采样保持电路22在光线由分光仪9进入样品时只在采样周期内保持信号电压，而采样保持电路23在光线未从分光仪9进入样品时只在采样周期内保持电信号。然后，从采样保持电路22与23输出的信号分别由对数转换电路24、25作对数转换，在减法电路26中将它们相减。通过与光斩波器14同步的检测，可以消除扰动分量。
减法电路的输出信号经AD(模/数)转换器27量化，导入个人计算机(PC)30，机内安装的各种程序可按多元回归法作数据处理。与PC30相接的有输入数据的键盘38、显示数据的显示器29等。
图3是一剖视图，表示样品架40的结构。该样品架40适合积分球13的光发射窗口13b的结构。由铝等热传导材料制作的样品架包括样品容器41，可保持生奶等液体样品SP；透明盖玻璃板42，用于遮盖样品容器41的开口；对样品容器41加热或冷动的珀耳帖元件；温度传感器45，可控制样品容器41的温度；温度电路44，通过根据来自温度传感器45等的温度信号驱动珀耳帖元件，稳定样品SP的温度。
当光斩波器14反射的光线经盖玻璃板42进入样品SP时，它们在经过衰减与散射后(取决于样品SP的吸收光谱)至新返回积分球13，因此光探测器210接收一部分返回的光线并把它们转换成电信号。
由于生奶的吸收比对温度变化很敏感，而且必须得到生奶中很少受影响的脂肪，若测量环境温度在每次测量时都发生变化，就失去了测量的意义。因此，根据该实施例，用温度传感器45、温控电路44与珀耳帖元件43构成的温度反馈系统来稳定样品SP的温度，从而提高测量精密度。
图4是表示一例生奶近红外光谱的曲线图，其中纵坐标表示由指数代表的吸收比，指数是对光反射比的倒数作对数转换得到的，横坐标表示波长(nm)。曲线对应的吸收光谱，通过用图1的分光仪9在400～1100nm波长内扫描而得到。图4中，以重迭状态显示通过测量多个生奶样品而得到的结果。图5也是表示一例生奶近红外光谱的曲线图，其中纵坐标给出由指数表示的吸收比，指数通过对光反射比的例数作对数到换而得到，横坐标表示波长(nm)。曲线对应的吸收光谱是用分光仪9在1100～2500nm波长上扫描得到的。图5中，显示并重迭了测量多个生奶样品所得到的结果。
所有的曲线都可归因于水的吸收光谱，尤其是接近1400～1500nm和1850～2050的大的峰值可归因于水的分子振动。
上述说明是对透射与反射型结构作的，被测光线通过样品SP，在样品容器41的内表面上反射，再次通过样品SP。此外，也可用透射型测量，样品容器41由透明材料制作，检测通过样品SP的透射光，或采用反射型，测量从样品SP表面反射的光线。
上述说明对这样的结构例子作的，其中将分光仪9安置在光源1与样品SP之间，分离进入样品SP的光线。此外，可以应用结构例子，其中将分光仪9安置在样品SP与光探测器20之间，并分开从样品SP透射的光线或透射与反射光线。
下面说明多元回归分析。
根据多元回归法，建立某种样品的定量特性(如对应于本申请中体细胞浓度或数量)与一个或多个示例变量之间的关系。在本申请中，示例变量表示测得的近红外光谱。然而，近红外光谱实际上在波长下不是由单一吸收比而是由若干吸收比构成的。因此，由于多元数据称为多元回归分析，在本发明方法中，用近红外光谱从完全不同的测量值里推定已知样品的定量特性(本申请中为体细胞数)。在本申请中，基于将近红外光谱作为多元数据，对要推定的特性的体细胞数，用多元回归分析法找出相互关系。
作为多元回归分析法之一，下面将说明PLS法(局部最小平方回归)(参照Tetsuro Aijima，“Chemometrics”1991年Marugen出版，和H.Martens &T.Naes，“多元校正法”，John Willy出版，纽约，1991)。如在图4中，若在700～1100nm波长范围内以2nm分辨率扫描，一次扫描可得201数据。
作为光谱预处理，必要时可作Kubelka-Munk转换(把视在反射指数转换成吸收率K(λ)与散射指数S(λ)之间的比率)、移动平均等平滑处理、一维或二维差分处理、基线校正处理等。
图6表示本发明PLS法的执行步骤。一个波长点的吸收比是一维数据，由多个分量构成(牛奶中的体细胞、蛋白质、类脂体等或哺乳腺的构成组分)，一个光谱包括在M个波长点对波长扫描一次的多维数据，因而在体细胞的多元分析方法中，一个光谱数据构成了一维数据×M个直角坐标空间。
接着，运用正交型PLS法，以相互正交的系数记分t1，t2，t3，……ta，……，th代表光谱数据X中的变量和体细胞数里的变量。图6示出形成第a系数的系数参量的步骤。E是光谱残余矩阵(波长数据点×采样的样品数据阵)，t为系数记分，w为加载权重(Loading weight)，p与q分别为x与y加载。
a-1系数的谱残余矩陈Ea-1表示为系数记分ta与第a系数的加载权重wa的乘积、系数记分ta与X加载的乘积和第a系的谱残余矩阵Ea之和。第(a-1)系数的体细胞误差矩阵fa-1表示为系数记分ta与Y加载qa的乘积和第a系数的体细胞数误差矩阵fa之和。
因此，作为分析的一个步骤，可根据谱残余矩阵Ea-1和第(a-1)系数的体细胞数误差矩阵fa-1，来计算第(a-1)系数的系数记分、加载权重wa、X加载pa与Y加载qa，再计算谱残余矩阵Ea与体细胞数误差矩阵fa。
更具体地说，计算出该谱数据的第一残余矩阵E0＝X-Xm(下标m表示“平均值”)和体细胞数的第一误差矩阵f0＝Y-Ym，并算出第一系数的参量t1、w1、p1与q1。然后去除第一系数的影响，形成新的谱残余矩阵E1和体细胞误差矩阵f1。接着，运用谱残余矩阵E1和体细胞数误差矩阵f1，计算第二系数的参量t2、w2、p2与q2。然后去除第二系数的影响，形成新的谱残余矩阵E2与体细胞数误差矩阵f2，于是应用谱残余矩阵E2与体细胞数误差矩阵f2，计算第三系数的参量t3、w3、p3与q3。接着去除第三系数的影响，形成新的谱残余矩阵E3与体细胞数误差矩阵f3。以后以同样方法重复计算各系数的参量并形成每个残余矩阵与误差矩阵，直到提取完有效的系数。
图7的曲线示出了若干PLS系数与分析误差，该曲线图与体细胞数相关，纵坐标表示体细胞的对数。图7(a)给出的数据(SEC标准校正误差)是在样品具有已知体细胞数时通过测量体细胞数而得到的，而图7(b)给出的数据(SEP标准预测误差)是在使用体细胞数未知的样品时通过测量体细胞数而得到的。
从这些曲线可看出，当PLS系数为5时，即当误差计算重复到第五系数时，SEC与SEP两值都收敛在约0.25的误差范围内。
当使用图7中达到第五的PLS系数时，可构建一模型，它可以根据近红外谱逆向地计算体细胞数。因此，对该模型应用与未知的体细胞数相关的近红外谱，可算出某样品推定的体细胞数。
图8是一曲线图，表示按PLS法推定的体细胞数与实际体细胞数的相关性。横坐标表示实际的体细胞数，纵坐标表示推定的体细胞数。从该图可看出，在近乎线性分布的两种情况之间，图中有很强的相关性，说明按PLS法作多元分析极为有效。
下面描述MLR法与PCR法。根据MLR法，对一已知样品相对于测量得到的体细胞数编制一线性回归公式，在由吸收比组成的新红外谱中，只把多个特定波长的吸收比作为多个变量。将要预测的未知体细胞数的近红外谱应用于这样编制的线性回归公式，可预测出来知的体细胞数。在PCR法中，作基本上与PLS法一样的计算(参照Yoshikatu Miyashita&Sinichi Sasaki，“Kemometrix-化学模式的识别与多元分析”，1995年由Kyoritsu出版者出版)。
图9是一曲线图，表示按PLS法推定的体细胞数与使用奶牛尿液时实际的体细胞数的相关性。尿液光谱应用上述生奶光谱一样的测量装置与同样的测量方法确定。由图9可知，横坐标的实际体细胞数与纵坐标的推定体细胞数的强相关性，呈几乎线性的方式分布，表明PS法的多元分析极其有效。
发明效果如上所述，根据本发明，通过检测来自尿液、生奶或哺乳腺的透射光线、反射光线或透射与反射光线的强度，对得到的吸收比作多元回归分析，可以测量体细胞数。
通过对尿液作光学测量并对生奶或哺乳腺作数据处理，可高度精密地测量出体细胞数。
权利要求
1.一种诊断奶牛乳房炎的方法，其特征在于包括以下步骤将波长范围为400～2500nm的可见光线和/或近红外光线辐射入奶牛的尿液、生奶或哺乳腺里，检测来自所述尿液、生奶或哺乳腺的透射光线、反射光线或透射与反射光线的强度，作多元回归，并诊断奶牛存在乳房炎。
2.如权利要求1的诊断奶牛乳房炎的方法，其特征在于包括以下步骤将波长范围为700～2500nm的近红外线辐射入奶牛的尿液、生奶或哺乳腺里，检测来自所述尿液、生奶或哺乳腺的透射光线、反射光线或透射与反射光线的强度，作多元回归，并诊断奶牛存在乳房炎。
3.一种诊断奶牛乳房炎的方法，其特征在于包括以下步骤将波长范围为700～1100nm或1100～2500nm的近红外线辐射入奶牛的尿液、生奶或哺乳腺里，检测来自所述尿液、生奶或哺乳腺透射光线、反射光线或透射与反射光线的强度，作多元回归分析，并诊断奶牛存在乳房炎。
4.如权利要求1～3之一的奶牛乳房炎诊断法，其特征在于包括，对来自所述尿液、生奶或哺乳腺的入射光线、透射光线、反射光线或透射与反射光线的波长作扫描，并对如此获得的可见光线和/或近红外线的光谱作多元回归分析。
5.如权利要求1～4之一的奶牛乳房炎诊断法，其中多元回归分析由多重线性回归(MLR)、主分量回归(PCR)或局部最小平方回归(PLS)执行。
6.一种诊断奶牛乳房炎的装置，包括近红外线发生器，产生波长范围为400～2500nm的可见光线和/或近红外线；光学系统，将可见光线和/或近红外线引入奶牛的尿液、生奶或哺乳腺；检测器，检测来自所述尿液、生奶或哺乳腺的透射光线、反射光线或透射与反射光线的强度；和数据处理器，接收来自所述检测器的信号，作多元回归分析，以诊断奶牛存在乳房炎。
7.如权利要求6的奶牛乳房炎诊断装置，其中所述近红外线发生器是产生波长范围为700～2500nm的近红外线的红外线发生器、产生波长范围为700～1100nm的近红外线的红外线发生器，或产生波长范围为1100～2500nm的近红外线的红外线发生器。
8.如权利要求6或7的奶牛乳房炎诊断装置，其特征在于还包括一根接至所述近红外线发生器的光纤，用于将可见光线和/或近红外线引入所述的奶牛的尿液、生奶或哺乳腺，并将来自所述的尿液、生奶或哺乳腺的透射光线、反射光线或透射与反射光线通过该光纤导入所述检测器。
9.如权利要求6～8之一的奶牛乳房炎诊断装置，其特征在于还包括将所述生奶经在线或线上引入样品容器的供料器。
10.如权利要求6～9之一的奶牛乳房炎诊断装置，其特征在于还包括保存生奶的样品容器和使样品容器里的生奶稳定至指定温度的温控器。
11.如权利要求6～10之一的奶牛乳房炎诊断装置，其中多元回归分析由多重线性回归(MLR)、主分量回归(PCR)或局部最小平方回归(PLS)执行。
全文摘要
一种以光学手段通过对牛的尿液、生奶或乳房中体细胞计数而在短时间内以高准确度诊断奶牛乳房炎的方法和装置。装置包括发射测量光的光源(1)、通过使光色散仅从光源的光中提取所需波长的分光仪(9)设置在透镜(11)与反光镜(12)之间的光斩波器(14)、由光漫射元件形成的积分球(13)、和固定诸如生奶的样品的样品固定器(40)。将可见光或近红外辐射射在奶牛的尿液、生奶或乳房上；从来自生奶或乳房的光谱测量预定波长的透射光、反射光、或透射与反射光的强度；作多元回归分析；由此诊断乳房炎。
文档编号G01N21/27GK1395683SQ01800748
公开日2003年2月5日 申请日期2001年3月14日 优先权日2000年3月31日
发明者R·采恩科瓦, 村山幸一 申请人:神户大学校长代表的日本国