专利名称：利用ms/nmr的基于结构的药物设计方法
技术领域：
本发明背景发现药物的公认方法是利用生物学鉴定筛选专用化合物的大数据库(＞100,000)以便识别在所述鉴定中影响靶蛋白质活性的先导化合物(评论参见-J.W.Armstrong，《美国生物技术实验室》(Am.Biotechnol.Lab.)17，26，28(1999)；J.E.Gonzalez，P.A.Negulescu，Curr.Opin.Biotechnol.9，624-631(1998)；K.R.Oldenburg，《医药化学年度报告》(Annu.Rep.Med.Chem)33，301-311(1998)；P.B.Fernandes，Curr.Opin.Chem.Biol.2，597-603(1998)；B.A.Kenny，M.Bushfield，D.J.Parry-smith，S.Fogarty，J.M.Treherne，《药物研究进展》(Prog.Drug Res)51，245-269(1998)；L.Silverman，R.Campbell，J.R.Broach，Curr.Opin.Chem.Biol.2，397-403(1998))。通过高流通量筛选(HTS)尝试识别的先导化合物根据结构和生物学活性资料的反馈开始优化小分子活性的迭代方法。该方法的主要缺点是在识别各个新蛋白质靶时典型地要求完全重新设计生物学鉴定方法。这实际上是要求在可以开始发现新药物项目前先投入大量资源和时间。除了与设计生物学鉴定(为了适当地筛选化学库中所需要活性)有关的困难外，还存在许多其他可能妨碍所述鉴定分析和效用的限制。这些通常是适度地摹拟靶蛋白质的细胞功能和监测其活性改变的鉴定具有必须复杂性的结果。某些多蛋白质的生物学鉴定，无论是膜基础的鉴定或者是细胞基础的鉴定都是少见的。复杂鉴定的结果是正击中目标的模棱两可性，因为靶蛋白质和小分子之间化学互作用的详细情况不易与所观察到的生物学反应相互关联。结果，这些鉴定大大地限制了药物优化的结构基础方法，使得由最初的化学先导译解结构-活性关系(SAR)变得相当困难。
NMR已广泛用于评价与基于结构的药物设计具有明显效用的配位体结合(K.Wuthruch，“蛋白质和核酸的NMR”(NMR of Proteins andNucleic Acids)(John Wiley & Sons，Inc.，纽约，1986)；G.Otting，Curr.Opin.Struct.Biol.3，760-8(1993)；P.J.Whittle，T.L.Blundell，《生物物理和生物分子结构年度综述》(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct)23，349-75(1994)；T.L.Blundell，《自然》(Nature)384，Suppl.，23-26(1996))。先前由Hajduk等人描述的“SAR by NMR”方法举例说明了NMR的效用，它可通过所观察到的2D1H-15N-HSQC谱中化学位移微扰筛选具有与蛋白质结合能力的小分子(P.J.hajduk等人，《医药化学杂志》(J.Med.Chem.)40，3144-3150(1997)；P.J.Hajduk等人，《美国化学家会志》(J.Am.Chem.Soc.)119，5818-5827(1997)；S.B.Shuker，P.J.Hajduk，R.P.Meadows，S.W.Fesik，《科学》(Science)274，1531-1534(1996))。除了测定小分子是否与所述蛋白质结合外，所观察到的化学位移微扰也考虑到蛋白质结合部位的识别。用NMR作为初级筛选的观念具有可能限制其在高流通量形式中应用的显著障碍。主要地因为灵敏度相对低的NMR要求拼命挤入可筛选化合物数量的每个样品具有显著量富含同位素的蛋白质(＞0.2mM)和数据获取时间(＞10分钟)(L.E.Kay，P.Keifer，T.Saarinen，《美国化学家会志》114，10663-5(1992)；J.Schleucher等人，《生物分子NMR杂志》(J.Biomol.NMR)4，301-6(1994))。对这些问题的反应是利用混合物，但这要求引起进一步投入样品供给和仪器资源的正击中目标的重叠合法(deconvolution)。此外，利用混合物可能使化合物的溶解度被限制在低于NMR要求的浓度，同时进一步使需要保持样品之间缓冲条件(pH、离子强度)复杂化。因此，优化NMR数据收集量的需要通常导致数据质量和获取时间之间的折中。
其他用于将资源和样品要求最小化的尝试集中在1D NMR技术的应用，特别是扩散-编辑测量和转移NOEs(M.J.Shapiro，J.R.Wareing，Curr.Opin.Drug Discovery Dev.2，396-400(1999)；B.Meyer，T.Weimar，T.Peters，Eur.J.Biochem.246，705-709(1997)；M.Lin，M.J.Shapiro，J.R.Wareing，《美国化学家会志》119，5249-5250(1997)；M.Lin，M.J.Shapiro，J.R.Wareing，《有机化学杂志》(J.Org.Chem.)62，8930-8931(1997)；P.J.Hajduk，E.T.Olejniczak，S.W.Fesik，《美国化学家会志》119，12257-12261(1997))。1D NMR实验消除了标记蛋白质的需要同时使得样品数量和数据获取时间最小化。不幸的是，1D NMR实验不提供关于结合部位位置的资料。与2D1H-15N-HSQC实验相比，它们对弱结合剂的灵敏度也低，同时要求更复杂的自动数据分析方法。此外，由于光谱重叠，利用混合物就更加困难。新近开发的NMR冷冻探针和溢流道探针可提供某些解决这些问题的方法，因为它们可分别提供增加3-4倍灵敏度和增加流通量的方法(M.J.Shapiro，J.R.Wareing，Curr.Opin.Drug Discovery Dev.2，396-400(1999))。然而，在筛选过程的初始阶段，NMR可能不是理想的，因为典型的NMR实验是费时和耗资的。据观察，大多数鉴定的击中率为0.1-1％，也就是说，所收集到的数据中＞99％的数据是否定的资料，在NMR分析步骤前消除大多数化合物似乎是更合理的方法。
本发明提供一种新的快速药物设计方法，该方法结合快速和准确地筛选很小量多种化合物的能力提供用于基于结构的药物设计的详细资料。
本发明也提供设计具有改善靶分子亲和力的配位体的方法，该方法包括制备具有已知分子量化合物的混合物并将该混合物与靶分子一起培养以便形成结合化合物-靶络合物。将化合物-靶络合物与未结合的化合物分离并对化合物-靶络合物进行质谱分析以便根据分子量来确定结合化合物的特性。制备所识别的与靶结合化合物的络合物并进行NMR。分析所识别的与靶分子结合化合物的络合物的NMR位移微扰以便识别化合物在靶分子上的结合部位并且根据所识别化合物的化学结构和所识别的靶分子的结合部位设计具有已知分子量的结构类似物的库。制备结构类似物的库并测定结构类似物与靶分子的结合。
本发明进一步提供一种设计靶分子高亲和力配位体的方法，该方法包括制备化合物的混合物，各个化合物具有已知的分子量，并且将所述混合物与靶分子一起培养形成结合化合物-靶络合物。进行质谱分析以便识别结合化合物。制备所识别的与靶分子结合化合物的络合物并分析所识别与靶分子结合化合物的络合物的NMR位移微扰以便识别具有至少两个不同靶分子结合部位的至少两个化合物。测定化合物在靶分子上的立体取向并且至少两个所识别化合物的结构资料用于设计在所识别部位结合并且最小限度地影响所测定立体取向的配位体。可通过分子模型化(modeling)或通过化学键连接。
图2是经凝胶过滤滴定的化合物2(MP 457)和MMP-1滤液的ESI(阳离子化)质谱分析，其中(A)含MMP-1仅50μM；(B-E)含增加量的MMP-1，其中(B)20μM，(C)30μM，(D)40μM和(E)50μM和增加量的化合物2，其中(B)100μM，(C)150μM，(D)200μM和(E)250μM；并且(F)只含250μM化合物2。
图3是含1mM十种已知的每种MMP-1抑制剂(TOP)和0.1mM MMP-1及含(BOTTOM)而不含MMP-1的混合物经凝胶过滤分析后滤液的ESI(阴离子化)质谱分析。十种化合物的质量离子在所述光谱上是突出的。所述混合物包含表1中所列出的4-13化合物。
图4A-C是用络合(A)化合物1，(B)化合物2和(C)化合物3的MMP-1(1-2个轮廓)覆盖且被识别为凝胶-过滤/质谱分析(
图1)结合剂的游离MMP-1的2D1H-15N-HSQC谱(多轮廓)。
图5(A)是MMP-1经NMR拆解结构(solution structure)的GRASP(32)表面，其中引起MMP-1化合物1络合物的1H-15N-HSQC谱微扰的残基被涂上黑色，指示与蛋白质相互作用的配位体的位置。
图5(B)是MMP-1化合物1络合物的NMR结构。用较粗的键显示化合物1。
本发明详述本发明提供筛选化合物以便识别与靶分子特异性结合的化合物和识别结合部位的方法。本发明也提供设计给定靶分子配位体的快速和有效的方法。
按照本发明方法制备配位体或化合物如小分子的混合物。例如，配位体可以来自商业渠道，来自预先已存在的化学库或根据需要，如根据先前的结构活性关系资料制备。各混合物由一组已知分子量的配位体组成。在本发明某些优选的实施方案中，各配位体具有独特的分子量，优选地与混合物中其他配位体分子量相差超过3Da以便于清楚地识别每种组分。在本发明某些方面，各配位体的分子量优选地小于大约2000，并且如果一个或多个化合物的键合预期发生，所述分子量可能更优选地低于大约350。除分子量外，例如，可根据化合物的酸性、反应性、形状和官能团选择配位体。通常优选多样性的库。配位体浓度将依赖于形成混合物的配位体数目而改变。通常化合物的混合物包含至少大约0.1nM的每种欲筛选化合物并且更优选至少大约1nM的各化合物。
将化合物的混合物与靶分子(如蛋白质、核酸等)一起培养。靶分子可以通过商业渠道获得，可以由天然来源进行纯化或者可以通过重组制备。通常，所培养的混合物包含至少大约10μM的靶分子，优选大约50μM-约200μM并且最优选大约100μM的靶分子。
通过将混合物经尺寸排阻柱如通过吸滤或离心，将结合化合物-靶分子络合物与未结合化合物分离。所述色谱技术如凝胶渗透色谱法(GPC)自旋柱描述于J.Mass.Spect.33264-273(1998)，将其引入本文供参考。尺寸排阻色谱法基于低分子量化合物保留在柱子上，以及高分子量化合物通过柱子的前提。因此，从柱子上洗脱下来的化合物应该已经结合到靶分子上并因此很可能在涉及靶的生物学鉴定中是活性的。
混合物中的化合物一旦与靶分子结合，就可以很容易地根据质谱法测定的其分子量识别，质谱法是通过混合物中具有一定分子量范围的化合物的滤液进行的。因为混合物中各化合物的分子量是已知的，所以观察质谱仪中的离子峰同时识别所存在的击中目标和化合物的特性。在本发明优选的具体实施方案中，混合物中各化合物具有独特的分子量。避免了为从混合物中识别候选化合物而进行的靶-特异性鉴定而使之易于自动化。另外，通常避免了重叠合法。如果重叠合法是必需的，如当击中目标的分子量相当于混合物中一个以上化合物或其片段时，重叠合法通常是在有限的范围并且可迅速进行。
在本发明某些优选的具体实施方案中，尺寸排阻柱可用任何尺寸-排阻树脂制备，所述树脂如Sephadex G25树脂(Pharmacia)，其容许大分子量化合物通过所述柱子同时保留小分子量化合物(如分子量低于2000MW的那些)。例如，可用一次性注射器或者更优选包含低-蛋白质-结合滤器如亲水性durapore滤器或硅烷化玻璃毛的96-孔滤板将树脂填充到各个柱子中。柱长小的96-孔滤板使得样品的需求量最小并且因为MS的灵敏度高，所以各样品仅需要皮摩尔的靶蛋白。在许多条件下，将蛋白质-化合物的混合物装填到尺寸-排阻柱上，其中缓冲条件、混合物中化合物的数目和蛋白质-化合物摩尔比可改变。通过离心或吸滤填充树脂的96-孔滤板，在标准96-孔滤板上收集通过柱子的滤液。该技术对弱的蛋白质-药物相互作用是灵敏的。
可对未经分离的结合化合物和未结合化合物的混合物进行质谱分析。如用电子喷雾离子化(ESI)MS方法，以正离子化和负离子化方式进行质谱分析。区分背景噪音和独特分子的离子峰并且根据靶分子重量和任何络合物重量之间不同来测定导致结合化合物特性的分子量，它与相当于独特化学实体的峰相互关联。或者，可使用辅助激光脱附/离子化MALDI/MS的基体。
利用自动化学可以很容易地将这些步骤自动化。例如，Gilson 215液体处理程序可用于将滤液从96-孔滤板转移到质谱仪。
一旦已知与靶分子结合的化合物(配位体)的特性，那么可利用NMR谱，例如通过绘制靶结构的NMR化学位移微扰图谱来测定特异性结合部位。靶的三维结构可通过标准X-射线、NMR或同源性模型化(homology modeling)技术获得并且NMR共振分配可通过标准NMR记录获得。化学位移微扰可通过比较游离靶的NMR谱和与所识别配位体络合的靶的NMR谱获得，其中所述NMR谱相当于利用富集15N或富集13C/15N的蛋白质或靶进行的标准2D1H-15N-HSQC、2D1H-13C-HSQC、2D1H-15N-HMQC或2D1H-13C-HMQC实验。利用游离靶的NMR共振排布，将所观察到的在配位体存在下显示化学位移微扰的靶的NMR共振指定到靶中的残基上。然后，将在配位体存在下经历化学位移微扰的靶中残基映射在靶的结构上以便确定配位体在靶上的结合部位。可以使用任何富集靶分子，并且优选多肽作为靶。靶分子可用本领域已知的方法标记13C或15N。在优选的具体实施方案中，利用转换宿主细胞制备重组形式的靶分子。利用NMR-化学位移微扰和连接分子片段进行药物设计的“SAR by NMR”过程已公开于国际专利申请WO 97/18469和WO97/18471中；并公开于《科学》2741531-1534(1996)；JACS1195818-5827(1997)和《医药化学杂志》403144-3150(1997)中。
制备足够量均匀标记的多肽的优选方法是用包含编码多肽的多核苷酸的表达载体转化宿主细胞并将转化的宿主细胞在包含放射性标记的可吸收源介质中培养。所述放射性标记源是本领域公知的。例如，可使用15NH4Cl、13C葡萄糖或(15NH4)2SO4。
制备包含编码特异性多肽的多核苷酸的表达载体的方法是本领域公知的，用载体转化宿主细胞并培养这些转化的细胞以便于表达多肽的方法也是本领域公知的。
通过NMR化学位移微扰、标准模型化技术提供的蛋白质和化合物的结构和化合物结合部位的一般位置用于定义络合物的计算机模型。所得到的络合物计算机模型可通过预测的短(＜5)氢对距离和在络合物NMR谱中观察到的NOEs之间的一致性和/或络合物的X-射线结构校验。
蛋白质的化合物亲和力(Kd和/或IC50)可由种种公认的技术测定，所述技术可包括由NMR扩散系数的改变或化学位移微扰来测量Kd和/或由蛋白质靶的特异性生物学鉴定来测定IC50以便确定所述击中目标的生物学关联性。
如果确定了一个以上具有独特结合部位的配位体，那么可测定与靶相关的以及彼此相关的配位体的三维结构和立体取向。靶分子各配位体的空间取向使得可以识别配位体部分，所述配位体部分与靶中的原子靠得很近，以及可以识别远离结合部位中的原子并且可在与其他分子就地相互作用的部分。
一旦确定了特异性结合部位，可利用本领域已知的许多方法中的任何一种方法产生三维模型，所述方法包括但不限制于同源性模型以及利用结晶学或光谱学技术产生的原始结构坐标数据的计算机分析。用于产生所述三维模型和/或进行必需的拟合分析的计算机程序包括但不限制于GRID(牛津大学，英国牛津)，MCSS(分子模拟(MolecularSimulations)，圣地亚哥， CA)，AUTODOCK(Scripps ResearchInstitute，La Jolla，CA)，DOCK(加利福尼亚大学，旧金山，CA)，Flo99(Thistlesoft，Morris Township，NJ)，Ludi(MolecularSimulations，圣地亚哥，CA)，QUANTA(分子模拟，圣地亚哥，CA)，SYBYL(TRIPOS，Inc.，St.Louis，MO)和LEAPFROG(TRIPS，Inc.，St.Louis，MO)。
这些和其他计算机程序将是本领域普通技术人员公知的。相关的数据一经所述程序分析，候选配位体就可被识别、制备和测试其结合靶的能力及其生物学活性。
然后，所识别的结合靶分子的配位体可在生物系统中测试以便确定生物活性与所观察到的结合有关。在传统的系统中，通过提供化学先导物初级有效性的生物学鉴定获得各配位体的IC50值。然后，可通过NMR研制数据或种种其他分析技术获得Kd值。本发明转化这些典型的步骤，因此消除了将标准生物学鉴定转化为高流通量形式(throughput format)的需要。更确切地说，减少先导物的数目，这样不必转换标准鉴定。
在生物学活性得到验证后，蛋白质-配位体络合物的精细结构可通过NMR、X-射线和/或模型化得到说明。
此外，可根据最初的单个或多个先导物来制备结构类似物库并按照本发明对结合进行测试，因此进一步优化配位体的亲和力和活性。例如，先导化合物可在分子的一个或多个位置进行衍变，这基于按照已知的提供结构类似物的化学主体在结合部位的相互作用点。组合合成可部分用于这些目的。另外如果识别出一个以上具有独特结合部位的配位体，则具有所述结合部位的配位体的立体取向可用于设计新的高亲和力配位体。新配位体可通过模型化技术或通过两个化合物的化学键合进行设计。按此方式，对靶具有给定亲和力的两种或两种以上的化合物可以连接从而形成对靶具有改进亲和力的化合物。连接(程序)的设计基于保持各配位体处于靶适当取向必需的距离和角取向。适宜的连接(程序)是公知的并且可以很容易地通过本领域技术人员识别。《计算机辅助分子设计杂志》(J.of Computer Aided MolecularDesign)661-78(1992)，《药物发现和设计展望》(Perspectives inDrug Discovery and Design)321-33(1995)，《医药化学杂志》27(5)，557-563(1984)，《科学》263380-384(1994)。
下列实施例通过使用先前测试的抗给定靶MMP-1的化合物来说明本发明方法的效用。所述实施例不限制本发明。
实施例表1MMP-1的抑制剂
实施例2蛋白质-单化合物培养将1mM各化合物1、2和3(表1)溶解在DMSO中并单独或在0.1mM的MMP-1存在下，在包含20mM Tris、100mM NaCl、5mM CaCl2、0.1mMZnCl2、2mM NaN3和3.5mM DTT，pH为6.5的缓冲液中，在室温下培养30分钟。在MMP-1化合物的混合物中，DMSO的最终浓度为5％。将总体积为25μl的各样品装填到由0.65μm亲水性durapore滤器组成的微孔多筛过滤系统中的Sephedex G25柱上。通过离心过滤(1，5000xg，3分钟)洗脱样品。收集样品并通过质谱分析法，利用自动化ESI/MS方法，以正离子化和负离子化方式，用各安装Gilson 215液体处理程序的Micromass LCT quadrapole time of flight质谱仪和Quattro I triple-quadrapole质谱仪进行分析。图1的结果显示未结合的化合物被保留(图1B(化合物1)、1D(化合物2)和1F(化合物3))，同时与MMP-1结合的化合物洗脱下来(图1A(化合物1+MMP-1)、1C(化合物2+MMP-1)和1E(化合物3+MMP-1))。
权利要求
1.筛选化合物的混合物以便识别与靶分子结合的化合物结合部位的方法，它包括a)、制备已知分子量化合物的混合物；b)、将混合物与靶分子一起培养以便形成结合化合物-靶络合物；c)、将化合物-靶络合物进行质谱分析以便根据分子量确定所结合化合物的特性；d)、制备所识别的与靶分子结合化合物的络合物；和e)、分析所识别的与靶分子结合化合物络合物的NMR化学位移微扰以便识别化合物在靶分子上结合部位的位置。
2.权利要求1的方法，它进一步包括将化合物-靶络合物与未结合化合物分离。
3.权利要求2的方法，其中利用尺寸排阻柱将化合物-靶分子络合物与未结合化合物分离。
4.权利要求2的方法，其中利用装填尺寸排阻凝胶的多筛过滤系统将化合物-靶分子络合物与未结合化合物分离。
5.权利要求1-4的任一方法，它进一步包括测试所识别的化合物抗靶分子的生物学活性。
6.权利要求1-5的任一方法，它进一步包括制备络合物的分子模型。
7.权利要求6的方法，其中利用NMR和X-射线结晶学数据中一种数据或利用二者来确定分子模型。
8.权利要求6或7的方法，它进一步包括利用计算机辅助的示构(rational)药物设计来设计具有改善的靶分子亲和力的配位体。
9.权利要求1-8的方法，其中各化合物具有低于大约2000MW的分子量。
10.设计具有改善的靶分子亲和力的配位体的方法，它包括a)、制备具有已知分子量化合物的混合物；b)、将混合物与靶分子一起培养以便形成结合化合物-靶络合物；c)、将化合物-靶络合物进行质谱分析以便根据分子量确定所结合化合物的特性；d)、制备所识别的与靶分子结合化合物的络合物；e)、分析所识别的与靶分子结合化合物的络合物的NMR化学位移微扰以便识别化合物在靶分子上的结合部位。f)、根据所识别化合物的化学结构和所识别靶分子的结合部位设计具有已知分子量结构类似物的库；g)、合成所述结构类似物；和h)、测定结构类似物是否与靶分子结合。
11.权利要求10的方法，它进一步包括结构类似物抗抑制剂的生物学活性。
12.权利要求10或权利要求11的方法，其中通过下列方法测试结构类似物的结合a)、将结构类似物与靶分子一起培养以便形成结合的结构类似物-靶络合物；b)、将结构类似物-靶络合物进行质谱分析以便根据分子量确定所结合结构类似物的特性；c)、制备所识别的与靶分子结合的结构类似物的络合物；和d)、分析与靶分子结合的结构类似物的络合物的NMR化学位移微扰以便识别化合物在靶分子上的结合部位的位置。
13.权利要求10-12的方法，它进一步包括将化合物-靶络合物与未结合化合物分离。
14.权利要求13的方法，其中利用尺寸排阻柱将化合物-靶分子络合物与未结合化合物分离。
15.权利要求13的方法，其中利用装填尺寸排阻凝胶的多筛过滤系统将化合物-靶分子络合物与未结合化合物分离。
16.权利要求10-15的任一方法，它进一步包括制备络合物的分子模型。
17.权利要求16的方法，其中利用NMR和X-射线结晶学数据来制备分子模型。
18.权利要求10-17的任一方法，它进一步包括利用计算机辅助的示构药物设计来设计结构类似物。
19.权利要求10-18的方法，其中各化合物具有低于大约2000MW的分子量。
20.设计靶分子高亲和力的方法，它包括a)、制备具有已知分子量化合物的混合物；b)、将混合物与靶分子一起培养以便形成结合化合物-靶络合物；c)、将化合物-靶络合物进行质谱分析以便根据分子量确定所结合化合物的特性；d)、制备所识别的与靶分子结合化合物的络合物；e)、分析所识别的与靶分子结合化合物的络合物的NMR化学位移微扰以便识别在靶分子上具有至少两个不同结合部位的至少两个化合物；f)、测定化合物在靶分子上的立体取向；和g)、将至少两个所识别的化合物连接以便最小限度地影响所测定的立体取向。
21.权利要求20的方法，其中利用分子模型化将至少两个所识别的化合物连接。
22.权利要求20或权利要求21的方法，其中将化合物-靶络合物与未结合的化合物分离。
23.权利要求22的方法，其中利用尺寸排阻柱将化合物-靶分子络合物与未结合化合物分离。
24.权利要求22的方法，其中利用装填尺寸排阻凝胶的多筛过滤系统将化合物-靶分子络合物与未结合化合物分离。
25.权利要求20-24的任一方法，其中各化合物具有低于大约2000MW的分子量。
全文摘要
本发明提供利用质谱/NMR设计结构药物的方法。
文档编号G01N33/542GK1411554SQ01805626
公开日2003年4月16日 申请日期2001年2月21日 优先权日2000年2月25日
发明者R·珀维斯, F·J·莫伊, M·M·斯埃格尔, D·莫比利奥 申请人:惠氏公司