治疗哮喘的方法

专利名称：治疗哮喘的方法
相关申请的交叉引用本申请要求2003年12月24日提交的美国临时申请序号no.60/532,525以及2004年7月20日提交的美国临时申请序号no.60/589,415的权益，通过引用将每个申请的完整内容引入这里。
背景技术：
本发明涉及生物学和免疫学领域。特别地，发明涉及哮喘和治疗哮喘的方法。哮喘是慢性的呼吸道炎性疾病，特征在于可逆的呼吸道阻塞以及呼吸道过敏(AHR)的反复发作。患哮喘的患者的呼吸道频繁过敏并发炎。当哮喘患者与过敏原或者刺激其呼吸道的物质接触时，呼吸道就收缩(即呼吸道壁周围的肌肉绷紧)，使患者难于呼吸。呼吸道内壁开始发炎，引起粘痰和过敏的其它临床表现的产生。哮喘的其它临床表现包括气短、喘息、咳嗽以及胸紧，可能成为生命威胁或者在某些情形下是致命的。尽管存在聚焦于减少症状性支气管痉挛和肺部炎症的治疗方法，不过人们逐渐认识到了长期的呼吸道重塑在加速哮喘患者肺恶化中的作用。呼吸道重塑是指许多病理特征，包括上皮平滑肌和肌成纤维细胞增生和/或化生、上皮下纤维化以及基质沉积。这些过程共同导致致命哮喘情形下最高达约300％的呼吸道增厚。尽管在阐明哮喘病理生理方面已经取得了相当大的进展，然而这种疾病的流行程度、发病率和死亡率在过去的二十年间已经增加了。最新获得的数据表明在美国有大约2千万人、全世界有超过1.5亿人患有哮喘。在这个十年的前期，在年度基础上直接归因于哮喘的，仅仅在美国就有近190万人急诊就诊、454,000人住院以及超过4000人死亡。哮喘是由对空气传播中的过敏原不适当的炎性反应而引起的，这是普遍承认的。哮喘患者的肺证实了淋巴细胞、肥大细胞、特别是嗜酸性细胞的强烈浸润。尽管当前的研究已经揭示了一些造成在哮喘中观察到的炎症的复杂的细胞和分子相互作用，不过仍然存在重大的知识缺口。作为研究哮喘原因的结果，已经可以获得大范围的各种药物来治疗哮喘症状。然而，许多药物具有各种缺点，使得它们用于治疗哮喘并不理想。例如，许多药物诸如肾上腺素和异丙基肾上腺素仅仅是很短的一段时间内减轻哮喘症状。其它治疗在使用了一段时间后就失效了。此外，一些药物象皮质类固醇具有严重副作用，限制了它们的长期使用。很明显，既需要对哮喘更多的分子水平的认识，也需要更有益的哮喘治疗方法。本发明解决这些需求。
发明概述本发明至少部分是基于发明人发现了蛋白激酶Cθ(PKC-θ)在包括哮喘的呼吸道疾病状态中的作用。因此，本发明提供了用于鉴别对于治疗哮喘有用的试剂的方法，用于治疗患有哮喘或哮喘样症状的患者的方法，以及不表达内源PKC-θ蛋白的分离的肥大细胞。因此，在第一方面，本发明提供了用于鉴别PKC-θ蛋白的调节剂的方法。该方法包括将PKC-θ蛋白或其功能性片段与测试试剂接触；并确定测试试剂是否调节PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性，其中在存在测试试剂时，PKC-θ蛋白或其功能性片段激酶活性的变化表明是PKC-θ蛋白的调节剂。在某些实施方案中，确定步骤包括比较测试试剂相对于没有测试试剂的条件下的激酶活性。在一些实施方案中，降低激酶活性的PKC-θ蛋白的调节剂是PKC-θ蛋白或其功能性片段的抑制剂。在一些实施方案中，增加激酶活性的PKC-θ蛋白的调节剂是PKC-θ蛋白或其功能性片段的激活剂。在一些实施方案中，PKC-θ蛋白的调节剂使PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性降低至少两倍。在某些实施方案中，PKC-θ蛋白是全长PKC-θ蛋白。在一些实施方案中，PKC-θ蛋白是全长PKC-θ蛋白的功能性变体。在特定的实施方案中，功能性片段是PKC-θ激酶结构域。在一些实施方案中，接触步骤是通过提供PKC-θ蛋白或其功能性片段与测试试剂的反应混合物而实现的。在某些实施方案中，反应混合物是在含有选自50mM-100mM、100-150mM、150-200mM和200-250mM以及250-300mM的浓度的NaCl的缓冲液中。在特定的实施方案中，NaCl浓度是250mM。在一些实施方案中，PKC-θ蛋白的调节剂对于治疗哺乳动物诸如人哮喘是有用的。在一些实施方案中，哮喘是IgE-介导的哮喘。在特定的实施方案中，该方法进一步包括在体外或体内哮喘模型中评估测试试剂的效力，其中在体外或体内哮喘模型中显示出相对于对照试剂效力增加的测试试剂就被鉴别为对于治疗哮喘是有用的。在一些实施方案中，PKC-θ蛋白或其片段是从原核细胞诸如细菌细胞(如大肠杆菌)获得的。在一些实施方案中，接触步骤是在细胞中实现的。在某些实施方案中，PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性是PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化。在一些实施方案中，PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化发生在SEQ ID NO1选自695位丝氨酸残基、685位丝氨酸残基、538位苏氨酸残基和536位苏氨酸残基的氨基酸残基上。在特定的实施方案中，自身磷酸化发生在SEQ ID NO1的538位苏氨酸残基上。在一些实施方案中，该方法包括将PKC-θ蛋白或其功能性片段与测试试剂以及PKC-θ底物相接触。在某些实施方案中，PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性是PKC-θ底物的磷酸化。在一些实施方案中，PKC-θ底物含有R-X-X-S基序或者R-X-X-T基序，其中R是精氨酸，X可以是未知氨基酸或者可以是任何氨基酸，S是丝氨酸，T是苏氨酸。例如，PKC-θ底物可以具有选自如下的氨基酸序列(基于通用的单字母氨基酸代码)KKRFSFKKSFK(SEQ ID NO5)，FARKGSLRQKN(SEQ ID NO6)，FARKGSLRQ(SEQ ID NO15)，KKRFSFKKSFK(SEQ ID NO16)，QKRPSQRSKYL(SEQ IDNO17)，KIQASFRGHMA(SEQ ID NO18)，LSRTLSVAAKK(SEQID NO19)，AKIQASFRGHM(SEQ ID NO20)，VAKRESRGLKS(SEQ ID NO21)，KAFRDTFRLLL(SEQ ID NO22)，PKRPGSVHRTP(SEQ ID NO23)，ATFKKTFKHLL(SEQ IDNO24)，SPLRHSFQKQQ(SEQ ID NO25)，KFRTPSFLKKS(SEQID NO26)，IYRASYYRKGG(SEQ ID NO27)，KTRRLSAFQQG(SEQ ID NO28)，RGRSRSAPPNL(SEQ ID NO29)，MYRRSYVFQT(SEQ ID NO30)，QAWSKTTPRRI(SEQ ID NO31)，RGFLRSASLGR(SEQ ID NO32)，ETKKQSFKQTG(SEQ IDNO33)，DIKRLTPRFTL(SEQ ID NO34)，APKRGSILSKP(SEQID NO35)，MYHNSSQKRH(SEQ ID NO36)，MRRSKSPADSA(SEQ ID NO37)，TRSKGTLRYMS(SEQ ID NO38)，LMRRNSVTPLA(SEQ ID NO39)，ITRKRSGEAAV(SEQ IDNO40)，EEPVLTLVDEA(SEQ ID NO41)，SQKRPSQRHGS(SEQID NO42)，KPFKLSGLSFK(SEQ ID NO43)，AFRRTSLAGGG(SEQ ID NO44)，ALGKRTAKYRW(SEQ ID NO45)，VVRTDSLKGRR(SEQ ID NO46)，KRRQISIRGIV(SEQ ID NO47)，WPWQVSLRTRF(SEQ ID NO48)，GTFRSSIRRLS(SEQ IDNO49)，RVVGGSLRGAQ(SEQ ID NO50)，LRQLRSPRRTQ(SEQID NO51)，KTRKISQSAQT(SEQ ID NO52)，NKRRATLPHPG(SEQ ID NO53)，SYTRFSLARQV(SEQ ID NO54)，NSRRPSRATWL(SEQ ID NO55)，RLRRLTAREAA(SEQ IDNO56)，NKRRGSVPILR(SEQ ID NO57)，GKRRPSRLVAL(SEQID NO58)，QKKRVSMILQS(SEQ ID NO59)，和RLRRLTAREAA(SEQ ID NO60)。在一些实施方案中，PKC-θ蛋白或其功能性片段在细胞中，诸如肥大细胞或CD4+T细胞中。在进一步的方面，本发明提供了用于鉴别PKC-θ蛋白的调节剂的方法，包括将表达PKC-θ蛋白或其功能性片段的细胞与测试试剂接触并确定测试试剂是否减少细胞中的功能性PKC-θ蛋白的量，其中减少细胞中的功能性PKC-θ蛋白的量的测试试剂就被鉴别为PKC-θ蛋白的调节剂。在一些实施方案中，PKC-θ蛋白的调节剂对于治疗哺乳动物诸如人哮喘是有用的。在一些实施方案中，哮喘是IgE-介导的哮喘。在特定的实施方案中，该方法进一步包括在体外或体内哮喘模型中评估测试试剂的效力，其中在体外或体内哮喘模型中显示出相对于对照试剂效力增加的测试试剂就被鉴别为对于治疗哮喘是有用的。在一些实施方案中，试剂减少了编码功能性PKC-θ蛋白的核酸分子在细胞中的表达。在特定实施方案中，哮喘是IgE-介导的哮喘。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在某些实施方案中，功能性PKC-θ蛋白在细胞中，诸如肥大细胞或者CD4+T细胞(如TH2T细胞)中。在某些实施方案中，试剂减少了编码功能性PKC-θ蛋白的RNA的量。在一些实施方案中，试剂抑制了编码功能性PKC-θ蛋白的RNA的翻译。在进一步的方面，本发明提供了用于鉴别对于治疗哺乳动物哮喘有用的试剂的方法，包括将可操作地连接到PKC-θ启动子的编码报道基因产物的核苷酸序列与测试试剂接触，并确定测试试剂是否减少了报道基因产物的产生，其中减少报道基因产物产生的试剂就被鉴别为对于治疗哮喘有用的试剂。在某些实施方案中，可操作地连接到PKC-θ启动子的编码报道基因产物的核苷酸序列是在细胞(如肥大细胞或CD4+T细胞)中的。在一些实施方案中，肥大细胞不表达内源PKC-θ蛋白。在某些实施方案中，报道基因产物是荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素酰基转移酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、碱性磷酸酶或者绿色荧光蛋白。在进一步的方面，本发明提供了用于鉴别PKC-θ蛋白的调节剂的方法。该方法包括将表达PKC-θ蛋白或其功能性片段的细胞与测试试剂相接触；确定测试试剂是否减少了PKC-θ蛋白或其功能性片段在细胞中的自身磷酸化，其中减少了PKC-θ蛋白或其功能性片段自身磷酸化的测试试剂就被鉴别为PKC-θ蛋白的调节剂。在一些实施方案中，确定步骤包括比较测试试剂相对于没有测试试剂的条件下的激酶活性。在一些实施方案中，降低激酶活性的PKC-θ蛋白的调节剂是PKC-θ蛋白或其功能性片段的抑制剂。在一些实施方案中，增加激酶活性的PKC-θ蛋白的调节剂是PKC-θ蛋白或其功能性片段的激活剂。在一些实施方案中，PKC-θ蛋白的调节剂使PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性降低至少两倍。在某些实施方案中，PKC-θ蛋白是全长PKC-θ蛋白。在一些实施方案中，PKC-θ蛋白是全长PKC-θ蛋白的功能性变体。在一些实施方案中，功能性片段是PKC-θ激酶结构域。在一些实施方案中，PKC-θ蛋白的调节剂对于治疗哺乳动物诸如人哮喘是有用的。在一些实施方案中，哮喘是IgE-介导的哮喘。在特定实施方案中，该方法进一步包括在体外或体内哮喘模型中评估测试试剂的效力，其中在体外或体内哮喘模型中显示出相对于对照试剂效力增加的测试试剂就被鉴别为对于治疗哮喘是有用的。在一些实施方案中，细胞是原核细胞，诸如细菌细胞(如大肠杆菌)。在一些实施方案中，PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化发生在SEQ ID NO1选自695位丝氨酸残基、685位丝氨酸残基、538位苏氨酸残基和536位苏氨酸残基的氨基酸残基上。还有另一方面，发明公开了用于治疗哮喘的方法，包括给患有哮喘或患有哮喘症状的哺乳动物施用降低PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性或者减少功能性PKC-θ蛋白产生的试剂。在一些实施方案中，试剂是与药学可接受的载体一起施用的。在一些实施方案中，载体是气雾剂形式。在发明方法的某些实施方案中，试剂是通过静脉内、口服、经皮和/或肌肉内途径施用的。在特定实施方案中，试剂是经吸入施用的。在一些实施方案中，哮喘是IgE-介导的哮喘。在一些实施方案中，试剂是与药物共施用的，药物可以是β-肾上腺素能试剂、茶碱化合物、皮质类固醇、抗胆碱能剂、抗组胺剂、钙通道阻断剂、色甘酸钠、或者它们的组合。在特定实施方案中，试剂是特异性结合PKC-θ蛋白或其片段的抗体。在一些实施方案中，抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，测试试剂是核酸分子。在某些实施方案中，核酸分子是核糖核酸分子。在一些实施方案中，核糖核酸分子包括与SEQ ID NO3所述核苷酸序列的部分互补的核苷酸序列。在某些实施方案中，PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性是PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化。在一些实施方案中，PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化发生在SEQ ID NO1选自695位丝氨酸残基、685位丝氨酸残基、538位苏氨酸残基和536位苏氨酸残基的氨基酸残基上。在某些实施方案中，PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性是PKC-θ底物的磷酸化。在一些实施方案中，PKC-θ底物含有R-X-X-S基序或者R-X-X-T基序，其中R是精氨酸，X是未知的或任何已知的氨基酸，S是丝氨酸，T是苏氨酸。例如，PKC-θ底物可以具有选自如下的氨基酸序列(基于通用的单字母氨基酸代码)KKRFSFKKSFK(SEQ ID NO5)，FARKGSLRQKN(SEQ ID NO6)，FARKGSLRQ(SEQ ID NO15)，KKRFSFKKSFK(SEQ ID NO16)，QKRPSQRSKYL(SEQ ID NO17)，KIQASFRGHMA(SEQ IDNO18)，LSRTLSVAAKK(SEQ ID NO19)，AKIQASFRGHM(SEQID NO20)，VAKRESRGLKS(SEQ ID NO21)，KAFRDTFRLLL(SEQ ID NO22)，PKRPGSVHRTP(SEQ ID NO23)，ATFKKTFKHLL(SEQ ID NO24)，SPLRHSFQKQQ(SEQ IDNO25)，KFRTPSFLKKS(SEQ ID NO26)，IYRASYYRKGG(SEQID NO27)，KTRRLSAFQQG(SEQ ID NO28)，RGRSRSAPPNL(SEQ ID NO29)，MYRRSYVFQT(SEQ ID NO30)，QAWSKTTPRRI(SEQ ID NO31)，RGFLRSASLGR(SEQ ID NO32)，ETKKQSFKQTG(SEQ ID NO33)，DIKRLTPRFTL(SEQ IDNO34)，APKRGSILSKP(SEQ ID NO35)，MYHNSSQKRH(SEQID NO36)，MRRSKSPADSA(SEQ ID NO37)，TRSKGTLRYMS(SEQ ID NO38)，LMRRNSVTPLA(SEQ ID NO39)，ITRKRSGEAAV(SEQ ID NO40)，EEPVLTLVDEA(SEQ IDNO41)，SQKRPSQRHGS(SEQ ID NO42)，KPFKLSGLSFK(SEQID NO43)，AFRRTSLAGGG(SEQ ID NO44)，ALGKRTAKYRW(SEQ ID NO45)，VVRTDSLKGRR(SEQ ID NO46)，KRRQISIRGIV(SEQ ID NO47)，WPWQVSLRTRF(SEQ ID NO48)，GTFRSSIRRLS(SEQ ID NO49)，RVVGGSLRGAQ(SEQ IDNO50)，LRQLRSPRRTQ(SEQ ID NO51)，KTRKISQSAQT(SEQID NO52)，NKRRATLPHPG(SEQ ID NO53)，SYTRFSLARQV(SEQ ID NO54)，NSRRPSRATWL(SEQ ID NO55)，RLRRLTAREAA(SEQ ID NO56)，NKRRGSVPILR(SEQ IDNO57)，GKRRPSRLVAL(SEQ ID NO58)，QKKRVSMILQS(SEQID NO59)，和RLRRLTAREAA(SEQ ID NO60)。在进一步的方面，发明提供了不表达内源PKC-θ蛋白的分离的肥大细胞。在一些实施方案中，细胞表达外源PKC-θ蛋白或其片段。本发明的这些以及其它的方面、实施方案以及优点从这里的描述来看将是显而易见的。
附图简述

图1A-1C是Western印迹分析的照片图，图示了TCR共刺激人T细胞时的PKC-θ膜易位以及可诱导的激活环磷酸化。图2A-2C是照片(图2A和2C)和图片(图2B)，显示了PKC-θ激活环的自身磷酸化是细胞中的激酶活性所必需的。图3A-3D是显示PKC-θ激酶结构域(PKC-θKD)自身磷酸化特征的示意图(图3A)，如通过质谱分析所确定的，肽NFpSFMNPGMER(SEQ ID NO64；其中pS表示丝氨酸是被磷酸化的；跨越位置693-703)的产物离子谱在m/z 705.52(图3B)，肽ALINpSMDQNMFR(SEQ ID NO65；跨越位置681-692)在m/z 760.48(图3C)，肽TNTFCGTPDYIAPEILLGQK(SEQ ID NO66；跨越位置536-555)在m/z 1159.71(图3D)。注意在图3D中，被碘乙酰胺烷基化的半胱氨酸用#表示。图4A-4C是用抗-pT538PKC-θ免疫印迹(图4A)以及抗His免疫印迹(图4B)，对所示PKC-θKD蛋白和突变体的大肠杆菌裂解产物的Western印迹分析以证实等效表达，以及显示所示PKC-θKD蛋白和突变体的体外裂解活性的图表(图4C)。图5A-5D为系列图表，显示了在100mM NaCl时截距对1/[肽1]重作图(图5A)；在100mM NaCl时斜率对1/[肽1]重作图(图5B)；在625mM NaCl时截距对1/[肽1]重作图(图5C)；在625mMNaCl时斜率对1/[肽1]重作图(图5D)。图6A-6C是显示PKC-θKD的动力学表现可能的各种机制的系列示意图。图6A显示了顺序有序机制，由此ADP是最后释放的产物；图6B显示了动力学机制，由此ADP是最后释放的产物；图6C显示了随机机制。在图6A-6C中，“E”代表酶，“A”代表底物A，“B”代表底物B，“P”代表产物P，“Q”代表产物Q。图7A-7D显示了溶剂粘度对PKC-θKD的kcat(图7A和7C)以及kcat/Km(图7B和7D)的影响。图7A显示了在ATP保持在2.0mM时用不同的肽1影响kcat。图7B显示了ATP保持在0.125mM时，肽1的kcat/Km。图7C显示了在ATP保持在2.0mM时用不同的肽3影响kcat。图7D显示了在ATP保持在2.0mM时肽3的kcat/Km。空心圆符号(○)表示在增加的蔗糖中的100mM NaCl；空心倒三角符号()表示在增加的蔗糖中的250mM NaCl；实心圆符号(●)表示在增加的Ficoll 400中的100mM NaCl；实心倒三角符号()表示在增加的Ficoll 400中的250mM NaCl。图7A-7D中的虚线表示斜率1。图8是显示抑制性底物可能干扰PKC-θKD催化活性的不同机制的示意图。在图8中，“E”代表酶，“A”代表底物A，“B”代表底物B，“P”代表产物P，“Q”代表产物Q。图9A-9B图示了能够鉴别PKC-θ的几种肽底物序列的肽阵列(图9A)以及鉴别出被PKC-θ磷酸化的肽(图9B)。图10A-10B是Western印迹分析的照片图，显示PKC-θ激活环在IgE受体交联到骨髓衍生的肥大细胞(BMMC)上时被可诱导地磷酸化。图11A-11C是IgE受体交联的BMMC的膜级分(图11A)、去污剂不溶级分(DI)(图11B)以及完整细胞提取物(WCE)(图11C)的Western印迹分析的照片图，证明在IgE受体刺激的BMMC中的PKC-θ膜易位。图12A-12B是Western印迹分析的照片图，证实了在IgE受体交联到BMMC上时，PKC-δ(图12A)和PKC-β(图12B)的分布没有被明显改变。图13A-13B是组织学(图13A)和图解(图13B)图，例证了PKC-θ敲除小鼠的BMMC含有比野生型小鼠的BMMC更少的颗粒。图13B显示了细胞平均荧光强度(MFI)作为时间的函数或者作为DNP-BSA浓度的函数。图14A-14B是图解图，证实了PKC-θ敲除小鼠的腹膜肥大细胞具有比野生型小鼠更低水平的细胞表面IgE(图14A)，但是具有类似水平的细胞表面ckit(图14B)。p值由t-检验确定。图15A-15C是图解图，证实了PKC-θ敲除小鼠与野生型小鼠相比具有降低水平的血清IgE(图15A)和IgG1(图15B)，但是具有增加水平的IgA(图15C)。p值由t-检验确定。图16A-16C是图解图，表明在IgE受体交联后，源自PKC-θ敲除小鼠的BMMC中下列细胞因子的产生不足TNF-α(图16A)、IL-13(图16B)和IL-6(图16C)。图17A-17B是图解图，显示出PKC-θ敲除小鼠的静息CD4+T细胞、TH1细胞和TH2细胞在缺少IL-2以及存在0.5μg/ml抗-CD3的条件下培养后显示了降低水平的IL-4(图17A)和IL-5(图17B)。图18是图解图，证明PKC-θ敲除小鼠在下面实施例7描述的对抗-IgE应答的被动皮肤过敏反应(PCA)模型中没有耳肿的增加。耳肿表示为自基线的Δ变化。统计分析是使用斯氏不配对t检验来确定的。显示的P值将野生型与PKC-θ敲除动物相比较。图19是图解图，证明PKC-θ敲除小鼠在下面描述的存在外源IgE的被动皮肤过敏反应(PCA)模型中没有耳肿的增加。耳肿表达为自基线的Δ变化。统计分析是使用斯氏不配对t检验来确定的。显示的p值将野生型与PKC-θ敲除动物相比较。图20A-20D是直方图，显示出PKC-θ敲除小鼠的TH1和TH2T细胞都显示了与PKC-θ野生型小鼠的TH1和TH2T细胞相比对抗-CD3刺激(0.5μg/ml)的增殖降低。PKC-θ野生型小鼠(浅灰条)或者PKC-θ敲除小鼠(深灰条)的TH0、TH1或TH2细胞另外用抗-CD28(图20A)、抗-CD28加上IL-2(图20B)、不用抗-CD28且不用IL-2(图20C)以及在没有抗-CD28时用IL-2(图20D)刺激。图21A-21D是直方图，显示出PKC-θ敲除小鼠的TH1和TH2T细胞都显示了与PKC-θ野生型小鼠的TH1和TH2T细胞相比对抗-CD3刺激(0.05μg/ml)的增殖降低。PKC-θ野生型小鼠(浅灰条)或者PKC-θ敲除小鼠(深灰条)的TH0、TH1或TH2细胞另外用抗-CD28(图21A)、抗-CD28加上IL-2(图21B)、不用抗-CD28且不用IL-2(图21C)以及在没有抗-CD28时用IL-2(图21D)刺激。
优选实施方案的描述发明是基于调节蛋白激酶Cθ(PKC-θ)的试剂或调节功能性PKC-θ蛋白的量的试剂对于治疗哮喘有用的发现。这里提出的新发现支持了将降低PKC-θ催化活性或降低功能性PKC-θ蛋白的量的试剂作为靶向过敏和哮喘的肥大细胞的用途。为了增进对发明原理的理解，现在将提及优选实施方案，并将使用具体语言来描述它们。不过要明白的是，并不因此打算限制发明范围，发明的这些改变和进一步的修正、以及如这里所图解的发明原理的这些进一步应用，对于发明相关的本领域技术人员来说将被预期为是正常发生的。这里引用的专利和科学文献确立了本领域技术人员可获得的知识。这里引用的已授权美国专利、允许授权的申请、公布的申请(美国和外国)以及参考文献包括GenBank数据库序列通过引用而引入，如同每种都具体并单独显示通过引用而被引入的同样程度。PKC-θ是不依赖Ca+2的PKCs新类别的成员。它在T细胞和肌肉中高表达。如这里所述，已经发现PKC-θ蛋白在呼吸道疾病诸如哮喘中起作用，并与例如诱导与哮喘有关的症状和/或并发症有关，包括例如包括IgE-介导哮喘的过敏性哮喘；非过敏性哮喘、职业性哮喘以及药物诱导的哮喘。基于这里提出的发现，发明提供了鉴别治疗哮喘的试剂的方法，以及提供了通过给哺乳动物施用治疗有效量的调节(如通过抑制或增强)PKC-θ产生和/或激酶活性的试剂来治疗哮喘的方法。此外，发明提供了缺少内源PKC-θ蛋白表达的分离的肥大细胞。一方面，发明提供了用于鉴别PKC-θ蛋白的调节剂的方法。该方法包括将PKC-θ蛋白或其功能性片段与测试试剂相接触；并确定测试试剂是否抑制PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性。降低PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性的测试试剂就被鉴别为PKC-θ蛋白的调节剂。如这里所使用的，“测试试剂”是化学品(如有机物或无机物)、小分子化合物、核酸分子、肽或蛋白质，诸如激素、抗体，和/或它们的部分。由“PKC-θ蛋白的调节剂”表示的是能够调节——要么增加要么降低——PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性的试剂，或者能够调节功能性PKC-θ蛋白的量(如通过转录或翻译)的试剂。在一些实施方案中，降低激酶活性的PKC-θ蛋白的调节剂是PKC-θ蛋白或其功能性片段的抑制剂。在一些实施方案中，增加激酶活性的PKC-θ蛋白的调节剂是PKC-θ蛋白或其功能性片段的激活剂。在发明的一种形式中，用于鉴别PKC-θ蛋白的调节剂的方法包括将PKC-θ蛋白或其功能性片段与测试试剂相接触，并检测PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化变化(如SEQ ID NO1中下列残基的磷酸化的变化695位的丝氨酸，685位的丝氨酸，538位的苏氨酸，536位的苏氨酸)。在替代形式中，该方法包括将PKC-θ蛋白或其功能性片段与测试试剂和PKC-θ底物相接触，并检测PKC-θ底物的磷酸化变化。测试试剂是一种被认为有效调节(即抑制或增加)PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性、或者功能性PKC-θ蛋白的量(例如通过改变编码功能性PKC-θ蛋白的RNA或DNA的量)的试剂。在某些实施方案中，PKC-θ蛋白的调节剂使PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性降低至少两倍。在一些实施方案中，调节剂使PKC-θ蛋白或其功能性片段的PKC-θ蛋白激酶活性降低至少四倍或至少十倍。在一些实施方案中，调节剂消除了PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性。PKC-θ蛋白激酶活性可被定量，例如使用下面描述的诸如体外激酶分析的标准技术。在发明的另一种非限制性实施方案中，功能性PKC-θ蛋白的量被PKC-θ蛋白的调节剂降低。如这里使用的，“功能性”的意思是正常起作用的PKC-θ蛋白或其片段(例如具有与野生型PKC-θ蛋白同样的激酶活性)。确定PKC-θ蛋白或其片段是否是功能性的，可由普通熟练的生物学家很容易进行。用于确定所述PKC-θ蛋白或其片段是否是功能性的一种非限制性的方法是，在标准蛋白激酶分析(参见例如Ausubel et al.，eds.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，NewYork，New York(1995，到2003年为止加入了随后的更新))中比较所述PKC-θ蛋白或其片段与野生型PKC-θ蛋白或野生型PKC-θ片段，激酶分析在下面的实施例中描述。PKC-θ蛋白功能性片段的一种非限制性例子是PKC-θ激酶结构域。如下面实施例(特别是实施例3)中所述，PKC-θ蛋白的激酶结构域(也称为“PKC-θ激酶结构域”或者简称“PKC-θKD”)令人惊讶地能够自身磷酸化。这是令人惊讶的，因为已知该类别中的其它酶不会自身磷酸化。如所使用的，术语“PKC-θ激酶结构域”是指PKC-θ蛋白的激酶结构域，其包括跨越大约氨基酸残基362到大约氨基酸残基706的蛋白质部分。在一些实施方案中，发明的PKC-θKD具有SEQID NO61中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中，发明的PKC-θKD具有SEQ ID NO62中提供的氨基酸序列(注意SEQ ID NO62的头两个N-末端氨基酸残基甲硫氨酸和甘氨酸是为了便于PKC-θKD片段的表达，但是并不出现在全长PKC-θ蛋白中)。在一些实施方案中，发明的PKC-θ激酶结构域是在原核细胞中表达的，诸如细菌，诸如大肠杆菌。在一些实施方案中，PKC-θ激酶结构域在下列一个或多个氨基酸残基上被磷酸化(例如通过自身磷酸化)SEQ ID NO1的695位的丝氨酸，685位的丝氨酸，538位的苏氨酸和536位的苏氨酸。在某些实施方案中，PKC-θ蛋白的调节剂使功能性PKC-θ蛋白的量降低至少两倍。在一些实施方案中，PKC-θ蛋白的调节剂使功能性PKC-θ蛋白的量降低了至少四倍。在一些实施方案中，PKC-θ蛋白的调节剂使功能性PKC-θ蛋白的量降低了至少十倍。在一些实施方案中，PKC-θ蛋白的调节剂消除了功能性PKC-θ蛋白的量。功能性PKC-θ蛋白的水平可被定量，例如使用下面描述的诸如Western印迹分析的标准技术。在进一步的方面，发明提供了另一种用于鉴别PKC-θ蛋白的调节剂的方法，包括将含有功能性PKC-θ蛋白或其功能性片段的细胞与测试试剂相接触，确定测试试剂是否降低了功能性PKC-θ蛋白或其功能性片段在细胞中的量，其中降低功能性PKC-θ蛋白或其功能性片段在细胞中的量的测试试剂就被鉴别为PKC-θ蛋白的调节剂。这些PKC-θ蛋白的调节剂可以在例如转录或翻译水平起作用。在某些实施方案中，PKC-θ蛋白的调节剂对于治疗哺乳动物诸如人呼吸系统疾病是有用的。呼吸系统疾病包括但不限于哮喘(如过敏性哮喘或非过敏性哮喘)；支气管炎(如慢性支气管炎)；慢性阻塞性肺病(COPD)(如肺气肿)；涉及呼吸道炎症、嗜酸性细胞增多、纤维化和过量粘液产生、例如囊性纤维化、肺纤维化以及过敏性鼻炎的状况。在一些实施方案中，PKC-θ蛋白的调节剂对于治疗特应性疾病是有用的。“特应性”是指经常具有发生过敏反应遗传倾向的一组疾病。特应性病症的非限制性例子包括过敏、过敏性鼻炎(枯草热，其症状包括发痒、流鼻涕、打喷嚏、或者鼻塞、以及眼发痒)、特应性皮炎(通常也称为湿疹；影响皮肤的慢性病)、哮喘以及枯草热。在特定实施方案中，PKC-θ蛋白的调节剂对于治疗哺乳动物诸如人哮喘是有用的。如这里使用的“哮喘”是指以持续性的或者阵发性的困难呼吸为标志的病症，伴随着喘息、胸紧的感觉、以及经常的咳嗽或喘息的发作。任何的或所有的这些症状被包括为“哮喘症状”。如这里使用的，“哮喘”包括但不限于非过敏性哮喘(也称为内因性的或非特应性的哮喘)、过敏性哮喘(也称为外因性的或特应性的哮喘)、非过敏性和过敏性哮喘的结合、运动诱发性哮喘(也称为混合哮喘)、药物诱导的哮喘、职业性哮喘、以及晚期哮喘。外因性的或过敏性的哮喘包括由例如过敏原、诸如花粉、孢子、草或野草、宠物毛屑、灰尘、螨等引起的或者与之相关的事件。由于过敏原和其它刺激物在全年的不同点出现，这些类型的事件也被称为季节性哮喘。外因性哮喘类也包括支气管哮喘和过敏性支气管肺曲霉病。哮喘是与间歇性呼吸道疾病症状诸如支气管过敏和可逆转的气流阻塞有关的表型异质性病症。哮喘的免疫组织病理学特征包括例如呼吸道上皮裸露、基底膜下的胶原沉积；水肿；肥大细胞激活；以及炎性细胞浸润(例如通过中性白细胞、嗜酸性细胞以及淋巴细胞)。呼吸道炎症可能进一步归因于呼吸道过敏、气流受限、急性支气管收缩、粘液堵塞的形成、呼吸道壁重塑、以及其它呼吸道疾病症状。可由本方法治疗或减轻的哮喘包括由传染剂引起的那些，所述传染剂诸如病毒(如感冒和流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、副粘病毒、鼻病毒和流感病毒。RSV、鼻病毒和流感病毒感染在儿童中很普遍，是婴儿和少年儿童呼吸道疾病的一种最主要原因。患病毒性细支气管炎的儿童可能发展为慢性喘息和哮喘，其能够使用本发明的方法进行治疗。也包括可能在一些哮喘患者中由锻炼和/或冷空气引起的哮喘状况。本发明的方法对于与烟暴露(如香烟诱导的或工业烟雾)以及工业和职业暴露，诸如烟、臭氧、毒气、二氧化硫、氧化亚氮、烟尘，包括来自涂料、塑料、聚氨酯、清漆等的异氰酸盐，木头、植物或其它有机灰尘等相关的哮喘是有用的。该方法对于与食品添加剂、防腐剂或药理剂相关的哮喘事件也是有用的。本发明的方法对于治疗、抑制或减轻各种被称为沉默哮喘或咳嗽变异型哮喘的哮喘也是有用的。此外，本发明的方法对于治疗和减轻与能够刺激支气管收缩的胃食管反流(GERD)相关的哮喘是有用的。在一些实施方案中，哮喘是IgE-介导的哮喘。在特定实施方案中，该方法进一步包括在体外或体内哮喘模型中评估测试试剂的效力，其中在体外或体内哮喘模型中显示出相对于对照试剂效力增加的测试试剂就被鉴别为对于治疗哮喘是有用的。各种哮喘模型是现有技术已知的。例如Soler et al.，J.Appl.Physiol.70(2)617-23(1991)以及Long et al.，J.Appl.Physiol.69(2)584-590(1990)描述了用于绵羊支气管收缩的模型。绵羊对蛔虫寄生虫猪蛔虫(Ascaris suum)是天然致敏的。在用猪蛔虫抗原吸入攻击后，动物经受了早期和晚期支气管收缩反应，类似于哮喘患者暴露于致敏过敏原时的反应。蛔虫攻击也诱导了绵羊的呼吸道过敏，其在用胆碱能激动剂碳酰胆碱攻击后作为肺阻力的增加而被测定。碳酰胆碱的剂量需要引起蛔虫在攻击后24小时降低的特定应答，这是呼吸道过敏的标志。Bischof et al.(Clin.Exp.Allergy 33(3)367-75(2003))描述了用于绵羊过敏性哮喘的模型，其中皮下免疫了溶解的屋尘螨提取物的绵羊随后用屋尘螨进行单次支气管攻击。在该模型中，收集屋尘螨支气管攻击前后的支气管肺泡灌洗(BAL)和外周血液淋巴细胞用于流式细胞分析，在攻击后48小时取组织样本用于组织学和免疫组化分析(Bischof et al.，见上文)。被认为是PKC-θ蛋白的调节剂的测试试剂，特别是被认为是PKC-θ蛋白抑制剂的测试试剂可以施用给绵羊，以评估攻击后与没有施用发明的测试试剂的绵羊中BAL淋巴细胞的数目相比之下降低BAL淋巴细胞的数目的能力。还有另一公知的哮喘模型是蛔虫-诱导的呼吸道炎症的非人灵长类模型(参见例如Gundel et al.，Clin.Exp.Allergy 22(1)51-57(1992))。恒河猴对蛔虫寄生虫猪蛔虫是天然致敏的，其通过诱导强烈的IgE应答而作为过敏原起作用。在用抗原在气管内攻击时，动物显示了主要由嗜酸性细胞组成的呼吸道炎症。这可以通过肺段过敏原攻击后24小时计数流入支气管肺泡灌洗液中的淋巴细胞而进行测定。还有另一种非限制性的哮喘模型是在小鼠中卵清蛋白(OVA)诱导的呼吸道过敏(参见例如Kips et al.，Eur.Respir.J.22(2)374-382(2003)；Taube et al.，Int.Arch.Allergy Immunol.135(2)173-186(2004)；以及Reader et al.，Am.J.Pathol.162(6)2069-2078(2003))。在该模型中，用明矾佐剂中的卵清蛋白(OVA)免疫小鼠，加强，然后用OVA给予气雾剂攻击。当攻击时，动物显示出增加的呼吸道阻力，并且淋巴细胞浸润到支气管肺泡灌洗(BAL)液中。此外，血清细胞因子水平增加，肺组织学显示了组织炎症和粘液产生。现有技术中已知的其它非限制性哮喘模型包括在狗和猴中猪蛔虫抗原-诱导的哮喘模型(参见例如Hirshman et al.，J.Appl.Physiol.49953-957(1980)；Mauser et al.，Am.J.Respir.Crit.CareMed.152(2)467-472(1995))。体外哮喘模型也是普通熟练的生物学家所已知的。例如，对于T细胞靶向治疗来说，一种非限制性的例子是对TH2细胞的细胞因子产生的抑制。T细胞可在体外刺激CD3和CD28的抗体，以模拟TCR-介导的激活。这将诱导细胞因子产生，其可在48小时后的上清液中分析。关键细胞因子是IL-4和IL-13。IL-13尤其是动物模型中哮喘发病的主要诱导物(参见例如Wills-Karp M.，Immunol Rev.202175-190(2004))。用于评估PKC-θ蛋白的调节剂对哮喘的效果的另一种非限制性体外方法是在应答抗-CD3和抗-CD28时T细胞增殖的抑制或者核转录因子NF-kB或NFAT的诱导。T细胞增殖可通过例如3H-胸苷摄取进行分析(参见方法，例如在Ausubel et al.，见上文)。在应答T细胞激活中，NFAT或NF-kB经历了激活和核转移，其可通过细胞裂解产物的Western印迹进行分析。PKC-θ蛋白抑制剂应该也减少卵清蛋白免疫的小鼠中的TH2应答，其可由于卵清蛋白特异性IgG1或总IgE的减少产生进行分析。这些抗体的水平可通过小鼠血清的ELISA进行分析。如这里使用的，发明的PKC-θ蛋白可以来自人，并可具有SEQ ID NO1(GenBank Accession NoNM_006257)中所示氨基酸序列。在另一实施方案中，发明的PKC-θ蛋白可以来自小鼠，并可具有SEQ ID NO2(GenBank Accession NoNM_008859)中所示氨基酸序列。发明中有用的PKC-θ蛋白也可由SEQ ID NO3(人)(GenBankAccession NoNM_006257)或者SEQ ID NO4(鼠)(GenBank AccessionNoNM_008859)中所示核苷酸序列编码。编码这些蛋白的另外的PKC-θ蛋白序列和核苷酸序列可在GenBank Accession NoNM_178075(Niino et al.，J.Biol.Chem.276(39)36711-36717(2001)；(小鼠))；GenBank Accession No.AF473820(Nonneman和Rohrer，Anim.Genet.34(1)42-46(2003)；猪))得到。如这里使用的，核苷酸序列打算意指核苷酸和/或核苷的天然的或合成的线性或连续阵列，以及它们的衍生物。术语“编码(encoding)”和“编码(coding)”是指这样的过程，通过转录和翻译机制，核苷酸序列通过该过程提供给细胞以信息，一系列氨基酸可由此被组装成特定氨基酸序列以产生多肽。编码特定氨基酸序列的过程可涉及具有一个或多个碱基改变(即插入、缺失、取代)而不引起编码的氨基酸改变的DNA序列，或者其涉及可能改变一个或多个氨基酸、但不消除由DNA序列编码的多肽的功能性的碱基改变。PKC-θ与哮喘症状和/或并发症的诱导有关的这一发现使得PKC-θ序列在鉴别发明的试剂的方法中有用。这些方法包括分析对于调节(如抑制或增强)PKC-θ激酶活性的能力的潜在试剂。在发明的分析中有用的PKC-θ核酸分子(如PKC-θ启动子序列)和蛋白不但包括这里公开的基因和编码的蛋白，也包括与野生型基因和多肽具有基本上同样活性的它们的变体。如这里使用的“变体”，包括含有一个或多个缺失、插入或取代的多核苷酸或多肽，只要变体保持与野生型多核苷酸或多肽基本上同样的活性。就多肽来说，缺失变体预期包括缺少对于生物活性不必要的多肽部分的片段，插入变体预期包括野生型多肽或其片段融合到另一多肽的融合多肽。因此，在某些实施方案中，发明的PKC-θ蛋白是全长PKC-θ蛋白的功能性变体。因此可以理解的是，PKC-θ蛋白不限于由SEQ IDNO3或SEQ ID NO4所示核苷酸序列编码。例如，如上文所讨论的，编码变体氨基酸序列的核苷酸序列在编码PKC-θ的核苷酸序列的范围之内。产生基本上不影响PKC-θ蛋白功能特性的“沉默”改变的序列修饰，诸如序列缺失、插入或取代，是这里特意预期的。例如，可以理解的是，反映遗传密码简并性、或者在特定位点导致化学等价氨基酸产生的核苷酸序列改变是预期中的。因此，疏水氨基酸丙氨酸的密码子可以被编码另一较不疏水残基的密码子诸如甘氨酸取代，或者被更疏水的残基诸如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸取代。同样的，导致一个负电荷残基取代为另一个的变化，诸如用天冬氨酸取代谷氨酸，或者一个正电荷残基取代为另一个的变化，诸如用赖氨酸取代精氨酸，也可期望产生生物学等价PKC-θ蛋白。就这里所述分析中的使用来说，PKC-θ蛋白可以从各个供应商处商业购买，诸如Panvera(Madison，WI)，或者可通过熟练技术人员已知的遗传工程和蛋白纯化方法来生产。例如，可将编码哺乳动物PKC-θ蛋白的核苷酸序列引入期望的宿主细胞中，培养、分离并纯化。可首先将这些核苷酸序列插入适当的或者其它期望的重组表达载体中。例如，可将编码哺乳动物PKC-θ蛋白的核苷酸序列亚克隆到pcDNA3表达载体中并在人293细胞中表达，如下面实施例中所描述的。PKC-θ蛋白或PKC-θ激酶结构域在原核细胞中的表达也是预期中的。例如，如下面实施例中所描述的，可将PKC-θ蛋白或PKC-θ激酶结构域亚克隆到细菌表达载体诸如pET16b(例如商业获自EMDBiosciences/Merck Biosciences.San Diego，CA)中，并在细菌细胞中表达。如这里使用的以及如现有技术已知的，“载体”是指包括了设计来指导靶细胞转化的遗传材料的构建体。载体可含有多种定位的且顺序定向的遗传元件，即可操作地与其它必需的或期望的元件连接，以便核酸盒中的核酸能够被转录，以及如果期望，在转染的细胞中翻译。重组表达载体可通过将上述核苷酸序列插入载体中而构建，其根据熟练技术人员所公知的方法进行，例如如Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Springs HarborLaboratory，2nded.，Cold Springs Harbor，New York(1989)中所描述的。描述分子生物学和重组DNA技术的其它参考文献也进一步说明于例如DNA Cloning 1Core Techniques，(D.N.Giover et al.，eds.，IRL Press，1995)；DNA Cloning 2Expression Systems，(B.D.Hameset al.，eds.，IRL Press，1995)；DNA Cloning 3A Practical Approach，(D.N.Glover et al.，eds.，IRL Press，1995)；DNA Cloning 4Mammalian Systems，(D.N.Glover et al.，eds.，IRL Press，1995)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.，IRL Press，1992)；NucleicAcid HybridizationA Practical Approach，(S.J.Higgins and B.D.Hames，eds.，IRL Press，1991)；Transcription and TranslationAPractical Approach，(S.J.Higgins & B.D.Hames，eds.，IRL Press，1996)；R.I.Freshney，Culture of Animal CellsA Manual of BasicTechnique，4th Edition(Wiley-Liss，1986)；and B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning，2nd Edition，(John Wiley & Sons，1988)；和Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.，eds.，JohnWiley & Sons)，它们是规律性和周期性更新的。在发明中有用的多种载体是已知的。合适的载体包括质粒载体、病毒载体，包括逆转录病毒载体(例如参见Miller et al.，Methodsof Enzymology 217581-599(1993))、腺病毒载体(例如参见Erzurumet al.Nucleic Acids Res.211607-1612(1993)；Zabner et al.，NatureGenetics 675-83(1994)；以及Davidson et al.，Nature Genetics 3219-223(1993))、腺伴随病毒载体(例如参见Flotte et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9010613-10617(1993))以及疱疹病毒载体(例如参见Anderson et al.，Cell Mol.Neurobiol.13503-515(1993))。载体可包括对核酸在特定宿主细胞中有效表达所必需或期望的其它已知遗传元件，包括调节元件。例如，载体可包括启动子和任何必需的与启动子协同实现基因转录的增强子序列。“增强子”意指能够刺激细胞诸如真核宿主细胞中的启动子活性的核苷酸序列元件。如这里所定义的，当核苷酸序列被置于与另一核苷酸序列功能性关系中时，核苷酸序列就是“可操作地连接”到另一核苷酸序列的。例如，如果编码序列可操作地连接到启动子序列时，这一般意味着启动子可以促进编码序列的转录。可操作地连接意指被连接的DNA序列典型地是邻接的，必要时加入两个蛋白编码区，其邻接并且在读码框中。然而，由于增强子在与启动子相隔几千个碱基时也可起作用，内含子序列可以是可变长度，因此一些核苷酸序列可以是可操作地连接的，但是并不邻接。对于将编码PKC-θ蛋白的核苷酸序列引入宿主细胞来说，许多现有技术已知的方法是可用的，所述核苷酸序列可以被包括在重组表达载体中。这些方法包括但不限于机械方法、化学方法、亲脂性方法以及电穿孔。代表性的机械方法包括例如微注射以及基因枪的使用，用例如金微粒作为要引入DNA的基质。代表性的化学方法包括例如使用磷酸钙或DEAE-Dextran。代表性的亲脂性方法包括使用脂质体和其它阳离子试剂进行脂介导转染。这些方法是现有技术公知的，许多这样的方法描述在例如Gene Transfer MethodsIntroducing DNAinto Living Cells and Organisms，(P.A.Norton and L.F.Steel，eds.，Biotechniques Press，2000)；以及Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel et al.，eds.，John Wiley & Sons)，它们是规律性和周期性更新的。在本发明中可以利用广范围的各种宿主细胞以产生期望的量的PKC-θ蛋白或其功能性片段，用于例如这里描述的筛选分析中。这些细胞包括真核和原核细胞，包括现有技术已知的哺乳动物和细菌细胞。许多宿主细胞可商业获自美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA。PKC-θ蛋白或其功能性片段可通过熟练技术人员公知的技术分离和纯化，包括色谱、电泳以及离心技术。这些方法是现有技术已知的，可在例如Current Protocols in Protein Science，J.Wiley andSons，New York，NY，Coligan et al.(Eds.)(2002)；以及Harris，E.L.V.，and S.Angal in Protein Purification ApplicationsA PracticalApproach，Oxford University Press，New York，NY(1990)中找到。为帮助重组生产的PKC-θ蛋白或其功能性片段的纯化和检测，可对PKC-θ蛋白或其功能性片段工程化以使它被“标记”。在下面的一些实施方案中，PKC-θ蛋白和PKC-θ激酶结构域(PKC-θ蛋白功能性片段的非限制性例子)用组氨酸标记进行标记。这可以使his-标记的蛋白结合到镍-NTA上，从而被纯化。在下面的其它实施例中，PKC-θ蛋白用红细胞凝集素(HA)标记进行标记并在293细胞中表达。其它非限制性的、可用于帮助纯化和/或检测PKC-θ蛋白(或其功能性片段)的商业可获得标记包括但不限于myc标记(结合到抗-myc标记抗体)、GST标记(结合到谷胱苷肽-Sepharose)以及flu标记(结合到抗-flu标记抗体)。为确定测试试剂是否抑制PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性，可以采用的一种非限制性分析是将PKC-θ蛋白(或其功能性片段)与测试试剂接触足够抑制PKC-θ蛋白激酶活性的时间段。这个时间段可根据所选抑制剂和PKC-θ蛋白或其功能性片段的性质而变化。这样的时间可由熟练技术人员不经过度实验而容易地确定。非限制性的发明测试试剂是减少PKC-θ(或其功能性片段)激酶活性的试剂，尽管通过例如结合到PKC-θ底物而抑制PKC-θ或者通过一些其它机制抑制PKC-θ激酶活性的测试试剂也是预期中的。如下面描述的，在IgE受体交联时，在BMMC中的PKC-θ在至少一个下面的残基上被诱导磷酸化SEQ ID NO1的695位丝氨酸、685位丝氨酸、538位苏氨酸或536位丝氨酸。因此，在特定实施方案中，测试试剂可通过它抑制PKC-θ蛋白自身磷酸化的能力而被确定为能够抑制PKC-θ激酶活性的试剂(从而对于治疗哮喘是有用的)。在一些实施方案中，PKC-θ蛋白激活环的氨基酸残基的自身磷酸化被抑制。可以利用许多分析来确定测试试剂是否抑制PKC-θ蛋白的激酶活性。由于PKC-θ蛋白是激酶，这些分析包括在存在一种磷酸形式诸如三磷酸(ATP)腺苷或者可转移到PKC-θ底物的其它磷酸形式时，测定测试试剂对PKC-θ在538位苏氨酸残基上自身磷酸化它自身的能力的影响。同样的，这些分析可在磷酸形式存在时测定测试试剂对PKC-θ磷酸化PKC-θ底物能力的影响。可以利用基于放射性的分析和基于非放射性的分析，包括基于荧光的分析。基于放射性的分析测定例如[γ-32P]-ATP掺入PKC-θ底物中并通过液体闪烁计数测量。采用体外底物磷酸化和基于抗体的比色检测或者其它检测方法的其它分析是从各种来源容易地商业获得的，包括Promega(Madison，WI；CatalogNos.V7470和V5330)、Calbiochem(San Diego，CA；Catalog Nos.539484，539490，539491)、Panvera Discovery Screening(Madison，WI；Catalog Nos.P2747和P2748；它是Invitrogen，Carlsbad，CA的子公司)。非放射性分析包括由Panvera(Madison，WI)所出售的那些，其包括具有R-X-X-S/T共有基序的底物的磷酸化以及通过荧光偏振测定磷酸化的底物。在一个非限制性实例中，可用抗-IgE受体抗体刺激暴露于测试试剂和32P-ATP的BMMC以交联IgE受体。交联十五分钟后，然后可将细胞裂解。接下来，可用商业获得的抗体免疫沉淀内源PKC-θ(例如用Santa Cruz Biotechnology，Inc.(Santa Cruz，CA)商业提供的抗-PKC-θ抗体，它在下面的实施例中描述)，通过SDS-PAGE分析进行分辨。用抑制PKC-θ自身磷酸化的测试试剂处理的BMMC的PKC-θ将显示出与未处理细胞的PKC-θ相比的磷酸化减少(即32P-ATP掺入减少)。在该实例的替代中，在没有32P-ATP时将BMMC暴露于测试试剂。在抗-IgE受体交联十五分钟后，将细胞裂解，免疫沉淀内源PKC-θ并通过SDS-PAGE分辨。然后将SDS-PAGE凝胶用抗-磷酸苏氨酸抗体(商业获自例如Zymed Laboratories Inc.，San Francisco，CA)进行Western印迹分析。用抑制PKC-θ自身磷酸化的测试试剂处理的BMMC的PKC-θ将显示出与未处理细胞的PKC-θ相比的磷酸化减少(即32P-ATP掺入减少)。PKC-θ激酶活性也可通过它磷酸化底物的能力来确定。因此，可以将广泛的各种寡肽和多肽底物利用于分析中以测定PKC-θ激酶活性。在发明中有用的肽具有共有的R-X-X-S/T基序(其中R是精氨酸，X是未知的或任何已知的氨基酸；S是丝氨酸以及T是苏氨酸)。其它蛋白底物包括但不限于肉豆蔻酰化的富含丙氨酸的C-激酶底物(MARCKS)(氨基酸序列KKRFSFKKSFK(SEQ ID NO5)，其中加下划线的丝氨酸残基被磷酸化)、PKC-α拟底物(氨基酸序列FARKGSLRQKN(SEQ ID NO6)，其中加下划线的丝氨酸被磷酸化。使用肽阵列技术，已经鉴别出了几种潜在的PKC-θ底物，它们可含有PKC-θ生理性底物独特的序列，可能是与PKC-θ具有同样应用的治疗目标(见图9B和下面的实施例4)。底物可具有各种修饰，只要底物参与由PKC-θ催化的反应。还有另一种测定PKC-θ激酶活性的方法是测定它的自身磷酸化能力。在下面描述的实施例中，令人惊讶地发现PKC-θ激酶结构域在细菌细胞中表达时被磷酸化。该磷酸化是由于自身磷酸化，因为细菌细胞不会磷酸化蛋白质。因此，发明也提供了用于鉴别对治疗哺乳动物中的免疫病症有用的试剂的方法，该方法是通过将表达PKC-θ蛋白(或其功能性片段)的细胞与测试试剂接触；确定测试试剂是否减少了PKC-θ蛋白(或其功能性片段)在细胞中的自身磷酸化，其中减少PKC-θ蛋白(或其功能性片段)的测试试剂就被鉴别为治疗免疫病症有用的试剂。在一些实施方案中，细胞是细菌细胞(如大肠杆菌)。在一些实施方案中，免疫病症是哮喘。根据发明，可通过将编码PKC-θ蛋白或其功能性片段的核苷酸序列引入细胞中来使细胞表达PKC-θ蛋白或其功能性片段。如上所述，核苷酸序列可操作地连接到允许细胞表达PKC-θ蛋白(或其功能性片段)的调节序列(如启动子序列和增强子)。普通熟练技术人员将明白，实现编码PKC-θ蛋白(或其功能性片段)的核苷酸序列表达所需的调节序列类型将根据编码PKC-θ蛋白(或其功能性片段)的核苷酸序列被引入的细胞的类型而变化。例如，如果细胞是细菌细胞，那么优选使用细菌细胞的调节序列。用于许多不同类型细胞(如昆虫、哺乳动物和细菌)的调节序列是现有技术中公知的(参见例如Ausubelet al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY，其是规律性和周期性更新的)。还有另一方面，发明提供了用于鉴别对治疗哺乳动物中免疫病症诸如哮喘有用的试剂的方法，通过将功能性PKC-θ蛋白或PKC-θ激酶结构域与测试试剂接触；并且确定测试试剂是否降低功能性PKC-θ蛋白或PKC-θ激酶结构域的自身磷酸化，其中降低功能性PKC-θ蛋白或PKC-θ激酶结构域自身磷酸化的测试试剂就被鉴别为治疗免疫病症有用的试剂。在一些实施方案中，接触是在体外进行的。在一些实施方案中，功能性PKC-θ或PKC-θ激酶结构域与测试试剂的接触是在缓冲液中进行的。在一些实施方案中，缓冲液具有相对于细胞中发现的离子强度(大约100mM NaCl)的高总离子强度。例如，在一些实施方案中，缓冲液具有至少100mM的离子强度。在一些实施方案中，缓冲液具有至少200mM或至少250mM的离子强度。在某些实施方案中，功能性PKC-θ蛋白或PKC-θ激酶结构域与测试试剂相接触的缓冲液中含有NaCl。例如，缓冲液可含有至少50mM NaCl(注意，另外的盐(即除NaCl之外的)可存在于缓冲液中)。在一些实施方案中，缓冲液含有至少100mM NaCl、或至少150mMNaCl、或至少200mM NaCl。在一些实施方案中，缓冲液含有至少250mM NaCl。当然，普通熟练技术人员将明白，不同于或除了NaCl之外的盐可用来获得高离子强度的缓冲液。这些盐的一些非限制性例子包括乙酸铵、乙酸钠和氯化钾。根据发明，“免疫病症”意指其中的免疫系统细胞(如T细胞、B细胞、天然杀伤细胞、肥大细胞、嗜中性白细胞和巨噬细胞)不正常起作用的病症。在一些实施方案中，免疫病症是哮喘。其它免疫病症包括但不限于自身免疫疾病(诸如I型糖尿病和类风湿性关节炎)、移植排斥以及呼吸道疾病，诸如过敏，免疫细胞在其中起作用。因此，发明提供了用于鉴别对治疗免疫病症诸如哮喘有用的试剂的方法，其通过鉴别调节(如降低)功能性PKC-θ蛋白水平的试剂或者调节(如降低)PKC-θ激酶活性的试剂。调节(如减少)功能性PKC-θ蛋白产生或PKC-θ激酶活性的试剂包括但不限于小分子化合物、化学品、核酸分子、肽和蛋白质，诸如激素和抗体。试剂也包括例如寡核苷酸或多核苷酸，诸如反义核糖核酸和小干扰RNAs(siRNA)。反义核苷酸序列和siRNAs典型地包括与靶核苷酸序列的部分互补的、或者与靶核苷酸序列的部分能够杂交的核苷酸序列。在一种非限制性例子中，反义核苷酸序列和/或siRNA杂交到核苷酸序列CAGAATATGTTCAGGAACTTTTCCTTCATGAACCCCG(SEQ IDNO7)，其编码氨基酸序列QNMFRNFSFMNP(SEQ ID NO8)，相应于氨基酸残基688到699，在695位含有丝氨酸残基，这是T538自身磷酸化所需的。在另一非限制性例子中，反义RNA和/或siRNA杂交到核苷酸序列GGAGATGCCAAGACGAATACCTTCTGTGGGACACCT(SEQ ID NO9)，其编码氨基酸序列GDAKTNTFCGTP(SEQ IDNO10)，相应于氨基酸残基532到543，在536和538位含有苏氨酸，至少其一是激酶活性所需的(参见例如图2B和2C)。反义核苷酸序列可具有大约20个核苷酸的长度，但是可以在大约20个到大约200个核苷酸的长度范围，或者可以是全长基因靶。熟练技术人员通过现有技术已知的标准程序能够选择适当的靶和适当长度的反义核酸，以具有期望的疗效，例如在Methods in Enzymology，AntisenseTechnology，Parts A and B(Volumes 313 and 314)(M.Phillips，ed.，Academic Press，1999)中所描述的。本发明中有用的反义分子的非限制性例子是描述于Bennett et al.，美国专利No.6,190,869(2001年2月20日颁发)中的那些，由此通过引用并入。RNA干扰涉及序列特异性的、转录后的基因沉默，是由与被沉默的基因靶同源的小的干扰双链RNA片段导致的(Lee，N.S.etal.，Nature Biotech.19500-505(2002))。这些siRNA能够特异性地靶向并除去天然mRNA分子。利用siRNAs抑制蛋白质产生的方法是现有技术公知的，披露于例如PCT国际申请号码WO 01/75164；WO00/63364；WO 01/92513；WO 00/44895；以及WO 99/32619。可用于调节(如减少)功能性PKC-θ蛋白产生或调节(如减少)PKC-θ激酶活性的其它试剂包括但不限于阻断PKC-θ转移到细胞膜表面的试剂。可被利用的其它试剂包括在这里描述的筛选分析中发现的那些。另外的试剂，或者PKC-θ的抑制剂或拮抗剂包括例如特异性结合到PKC-θ蛋白或PKC-θ蛋白部分的抗体和小分子。“特异性结合”意指发明的抗体以至少10-5M的解离常数(KD)、或至少10-6M的KD、或至少10-7M的KD、或至少10-8M的KD、或至少10-10M的KD识别并结合到PKC-θ蛋白(或其部分)。用于确定结合和结合亲和性的标准方法是公知的。因此，这里提供了特异性结合到PKC-θ蛋白的抗体。这里使用的特异性结合到PKC-θ蛋白的抗体可以是，但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、遗传工程化抗体、双特异性抗体、抗体片段(包括但不限于“Fv”、“F(ab’)2”、“F(ab)”和“Dab”)以及表现抗体活性部分的单链。产生每一种上述抗体形式的方法是现有技术公知的。例如，多克隆抗体可通过将纯化的酸性哺乳动物PKC-θ蛋白注入各种动物并分离血清中产生的抗体而获得，更充分的描述于例如Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，其是规律性和周期性更新的。抗体可以是单克隆抗体，其生产方法是现有技术公知的。特定的单克隆抗体可商业获得，或者另外可以通过Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.6511-519(1976)的技术及其改进或改变来制备。简要地说，这些方法包括制备能够产生期望抗体的无限增殖细胞系。无限增殖细胞系的产生可通过将选择的抗原注入动物诸如小鼠中、从动物的脾收获B细胞并将细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤。可通过现有技术中的常规程序选择单一集落并测试它们分泌期望表位的高亲和性抗体的能力。替代性地，可通过现有技术已知的各种方法从表达文库中重组生产抗体。例如，可从分离自淋巴细胞、优选分离自B淋巴细胞以及更优选分离自注射了期望抗原的动物的核糖核酸(RNA)生产cDNA。诸如编码各种免疫球蛋白基因的cDNA可通过聚合酶链式反应(PCR)被扩增并克隆到适当载体中，诸如噬菌体展示载体。这些载体可被加入细菌悬浮液中，优选包括大肠杆菌的悬浮液中，可产生噬菌体或噬菌体颗粒，其展示了连接到噬菌体颗粒表面的相应抗体片段。可通过筛选包括期望抗体的噬菌体颗粒来构建亚文库，其通过现有技术已知的方法例如亲和纯化技术，诸如淘选。然后可利用亚文库来从期望的细胞类型，诸如细菌细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞中分离抗体。如这里描述的生产重组抗体的方法及其改进可以在例如Griffiths，W.G.et al.，Ann.Rev.Immunol.12433-455(1994)；Marks，J.D.et al.，J.Mol.Biol.222581-597(1991)；Winter，G.and Milstein，C.，Nature 349293-299(1991)；Hoogenboom，H.R.and Winter，G.，J.Mol.Biol.227381-388(1992)中找到。为了用于本发明中，在用于产生抗体之前，首先可通过这里前面讨论的熟练的技术人员公知的技术纯化PKC-θ蛋白。发明进一步的实施方案提供了通过预筛选测试试剂减少测试试剂的量的非限制性方式。例如只有那些具有结合到PKC-θ蛋白能力的测试试剂或者指导PKC-θ基因表达的启动子才可以被用于发明的功能性分析中。在非限制性的实例中，首先筛选测试试剂结合到PKC-θ蛋白的能力，可分离纯化的PKC-θ蛋白并用于筛选测试试剂。例如，可将纯化的PKC-θ蛋白固定在固相表面上(例如琼脂糖珠或塑料上)，使测试试剂与纯化的固定化PKC-θ蛋白进行接触。在替代性实施例中，在PKC-θ暴露于测试试剂之后，可加入针对PKC-θ蛋白的抗体并用于免疫沉淀PKC-θ蛋白，以确定测试试剂是否与PKC-θ蛋白共免疫沉淀。只有那些能够结合到PKC-θ蛋白的测试试剂才在下一步被用于功能分析，以确定它们是否能调节(如降低)PKC-θ激酶活性或者调节(如降低)细胞，诸如肥大细胞或T细胞(如TH1或TH2辅助T细胞)中功能性PKC-θ蛋白的量。在非限制性实例中，首先筛选测试试剂结合到PKC-θ启动子的能力，可将PKC-θ启动子序列固定化，如在DNA微芯片阵列中那样。然后可筛选不同测试试剂结合到启动子的能力。只有那些能够结合到PKC-θ启动子的测试试剂才被用于功能分析中，以确定它们是否能调节(如降低)细胞，诸如肥大细胞或T细胞(如TH1或TH2辅助性T细胞)中功能性PKC-θ蛋白的量。在进一步的方面，发明提供了用于鉴别对治疗哺乳动物(如人)哮喘有用的试剂的方法，包括将可操作地连接到PKC-θ启动子的编码报道基因产物的核苷酸序列与测试试剂相接触，确定测试试剂是否降低报道基因产物的产生，其中降低报道基因产物产生的测试试剂就被鉴别为对于治疗哮喘有用的试剂。在某些实施方案中，可操作地连接到PKC-θ启动子的编码报道基因产物的核苷酸序列是在细胞(如肥大细胞或者T细胞，诸如TH1或TH2辅助性T细胞)中的。PKC-θ启动子的核苷酸序列通过本领域公知的方法确定。这些方法的一个非限制性例子是使用PKC-θ的核苷酸序列作为探针筛选感兴趣的启动子序列的基因组文库(如YAC人基因组文库)，然后分离探针所结合的核苷酸序列5′的核苷酸序列。确定适当启动子序列的方法的另一非限制性例子是进行人基因组DNA的Southern印迹分析，这是通过用探针(例如包括了编码人PKC-θ蛋白的核苷酸序列或其部分的探针)电泳探查分辨的人基因组DNA，然后确定cDNA探针杂交的位置。一旦确定探针杂交的带，就可将带分离(如将凝胶切掉)并进行序列分析。这样就允许了核苷酸ATG(即转录位点的起始)5′的核苷酸片段的检测。该核苷酸片段是PKC-θ的启动子，可以进行序列分析。该核苷酸片段可在大约500到1000个核苷酸的长度。本发明也包括与这些序列具有至少大约70％、至少大约80％或至少大约90％同一性并作为启动子起作用例如指导编码这里描述的PKC-θ蛋白的基因表达的核苷酸序列。广泛的各种报道基因可被可操作地连接到上述PKC-θ启动子上。这些基因可编码例如荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、碱性磷酸酶、以及绿色荧光蛋白、或者现有技术已知的其它报道基因产物。在发明的一种形式中，将可操作地连接到PKC-θ启动子的编码报道基因的核苷酸序列引入宿主细胞中。如上所述，在发明中可采用许多宿主细胞。首先可将这些核苷酸序列插入适当的或者期望的重组表达载体中，如这里前面描述的那样。发明这种形式的载体可包括其它已知的对于从PKC-θ启动子表达报道基因必需的或期望的遗传元件，包括哺乳动物细胞中的调节元件。例如，载体可包括与启动子在体内协同的任何必需增强子序列，例如在体内实现报道基因转录。将核苷酸序列引入宿主细胞的方法与前面描述的用于生产PKC-θ蛋白的一样。将可操作地连接到PKC-θ启动子的编码报道基因的核苷酸序列与测试试剂接触之后，确定测试试剂是否抑制报道基因产物的产生。该终点可通过定量报道基因产物的量或活性来确定。定量方法将依赖于所使用的报道基因，但是可以涉及用抗报道基因产物的抗体进行的酶联免疫分析的使用。此外，分析可以测定化学发光、荧光、放射性衰变、等等。如果测试试剂抑制报道基因产物的产生，它就被归类为治疗哮喘的试剂。用于确定这里描述的报道基因产物的活性或量的方法是现有技术已知的，论述于例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.，eds.，John Wiley & Sons)，其是规律性和周期性更新的。对这里论述的报道基因产物进行分析的进一步描述可在例如下列出版物中发现对于荧光素酶，参见Nguyen，V.T.et al.，Anal.Biochem.171404-408(1988)；对于β-半乳糖苷酶，参见例如Martin，C.S.et al.，Bioluminescence and ChemiluminescenceMolecularReporting with Photons pp.525-528(J.W.Hastings et al.，eds.，JohnWiley & Sons，1997)；Jain，V.K.and Magrath，I.T.，Anal.Biochem.199119-124(1991)；对于β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶和碱性磷酸酶，参见例如Bronstein，I.et al.Bioluminescence andChemiluminescenceFundamentals and Applied Aspects，pp.20-23，(A.K.Campbell et al.，eds.，John Wiley & Sons，1994)；对于氯霉素乙酰转移酶，参见Cullen，B.，Methods.Enzymol.152684(1987)；Gorman，C.et al.Mol.Cell.Biol.21044(1982)；Miner，J.N.et al.，J.Virol.62297-304(1988)；Sleigh，M.J.，Anal.Biochem.156251-256(1986)；Hruby，D.E.and Wilson，E.M.，Methods Enzymol.216369-376(1992)。选择性抑制PKC-θ活性的小分子也是治疗哮喘的治疗剂。选择性可被限定为通过比其它PKC-θ同工型抑制PKC-θ超过大约20倍的IC50。(IC50被定义为产生50％的抑制剂靶活性的抑制剂浓度)。在发明的另一方面，发明提供了治疗哮喘的方法，包括给患有哮喘或患有哮喘症状的哺乳动物(如人)施用治疗有效量的降低PKC-θ催化活性或降低功能性PKC-θ蛋白产生的试剂。在一个实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，哮喘是IgE-介导的哮喘。这里使用的“治疗”意指预防、降低或消除至少一种哮喘症状或并发症。“治疗有效量”表示试剂的量能够抑制或减少功能性PKC-θ蛋白的产生或者能够抑制或减少PKC-θ蛋白的激酶活性，并引起临床上显著的反应。临床上显著的反应包括但不限于被治疗状况的改善或者状况的预防。根据本发明所施用试剂的特定剂量当然将由病例相关的特定情况来确定，包括所施用的试剂、被治疗中的特定哮喘以及类似状况。哮喘的治疗可通过例如减少呼吸道过敏、减少粘液过量产生、减少血清IgE水平或者减少呼吸道嗜酸性细胞增多。试剂可通过广泛的各种途径施用给哺乳动物，包括经肠内、肠胃外以及经表面施用。例如试剂可经口服、鼻内、经吸入、肌内、皮下、腹膜内、血管内、静脉内、经皮、皮下、或者它们任意的组合来施用。试剂可在药学可接受的载体中被施用。药学可接受的载体和它们的剂型是公知的，一般描述于例如RemingtonThe Science andPractice of Pharmacy(20th Edition，ed.A.Gennaro(ed.)，Lippincott，Williams & Wilkins，2000)。在一些实施方案中，药学可接受的载体是气雾剂形式。现有技术中已知的任何合适的药学可接受的载体都可以使用。载体可以是固体、液体、或者固体和液体的混合物。当以液体或者固体和液体的混合物存在时，有效溶解试剂的载体是优选的。载体可采取胶囊、片剂、丸剂、粉剂、锭剂、悬浮液、乳状液或糖浆的形式或者其它已知形式。载体可包括作为芳香剂、润滑剂、增溶剂、助悬剂、粘合剂、稳定剂、片剂崩解剂和包封材料的物质。固体或液体载体可采取气雾剂形式以将试剂输送到它们期望的位置，诸如当用在吸入试剂的喷雾器中时。全身或口服施用的片剂可包括赋形剂，如现有技术中已知的，诸如碳酸钙、碳酸钠、糖类(如乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇)、纤维素(如甲基纤维素、羧甲基纤维素钠)、树胶(如阿拉伯树胶、黄蓍胶)，以及崩解剂诸如玉米、淀粉或藻酸，粘合剂诸如明胶、胶原或阿拉伯胶，以及润滑剂诸如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。在粉剂中，载体是精细分割的固体，其与有效量的精细分割的抑制剂混合。在溶液、悬浮液或糖浆中，将有效量的抑制剂溶解并悬浮在载体诸如无菌水、盐水或有机溶剂诸如液态丙二醇中。其它组合物可通过将抑制剂分散在淀粉或羧甲基纤维素钠水溶液或者现有技术已知的合适的油中。试剂以治疗有效量施用给哺乳动物。这样的量在治疗哮喘或减轻哮喘症状中是有效的。这个量可根据所利用试剂的活性、是否有任何其它的抗哮喘试剂共施用以及这种抗哮喘试剂的性质、哮喘性质和患者健康状况而改变。尽管这些量可由熟练技术人员确定，不过典型的治疗有效量包括大约10mg/kg/天到大约100mg/kg/天。当然，根据具体病例可能需要更低或更高的剂量。当试剂与载体组合时，它们可以以大约1％重量百分比到大约99％重量百分比的量存在，其余由药学可接受的载体组成。在某些实施方案中，试剂或者PKC-θ产生或催化活性的抑制剂可在例如包括一种或多种抗哮喘试剂的组合物中共施用。这些试剂是现有技术已知的，包括例如β-类肾上腺素能试剂，包括异丙肾上腺素、肾上腺素、二羟苯基异丙氨基乙醇和间羟叔丁肾上腺素；甲基黄嘌呤，包括茶碱、氨茶碱和胆茶碱；皮质类固醇，包括倍氯米松、倍他米松、氢化可的松和强的松；抗胆碱能药，包括阿托品和异丙托溴铵；抗组胺剂，包括特非那定和阿司咪唑；钙通道阻断剂，包括维拉帕米、硝苯吡啶；以及肥大细胞稳定剂，包括色甘酸钠和nedocromilsodium。在一些实施方案中，试剂是核酸分子。在某些实施方案中，核酸分子是核糖核酸分子。在一些实施方案中，核糖核酸分子包括与SEQ ID NO3中所示核苷酸序列的部分互补的核苷酸序列。在某些实施方案中，试剂降低编码PKC-θ蛋白的RNA的量。在一些实施方案中，试剂抑制编码PKC-θ蛋白的RNA的翻译。在特定实施方案中，试剂是特异性结合PKC-θ蛋白或其部分的抗体(如多克隆、单克隆、人源化或嵌合抗体)。在进一步的方面，发明公开了不表达内源PKC-θ的细胞。在某些实施方案中，细胞是肥大细胞。这种细胞可从例如下面描述的PKC-θ敲除的小鼠中分离(也参见Sun et al.，Nature 404402-407(2000))。分离肥大细胞的方法是公知的(参见例如下面描述的方法)。不表达内源PKC-θ蛋白的这种细胞也可以是人细胞，其中编码PKC-θ的基因被缺失或突变，以便细胞不再表达内源PKC-θ。不表达内源PKC-θ蛋白的肥大细胞是有用的，例如对于检测测试试剂是否是对治疗哮喘有用的试剂。如下面实施例中描述的，红细胞凝集素(HA)-标记的PKC-θ在293细胞中表达。HA-标记的PKC-θ可在肥大细胞中表达，HA-标记的PKC-θ蛋白的活性和/或量在测试试剂存在下测定。然而，由于肥大细胞表达内源PKC-θ，一些测试试剂可能影响内源PKC-θ蛋白，因此屏蔽了它对HA-标记蛋白的影响。这种屏蔽不会发生在缺少内源PKC-θ表达、而表达HA-标记的PKC-θ蛋白的肥大细胞中。而且，这些细胞对于筛选那些影响HA-标记的PKC-θ与它们影响野生型PKC-θ不同的测试试剂是有用的。在一些实施方案中，细胞表达外源PKC-θ或其片段。现在将提及具体实施例来例证上述组合物和方法。要明白的是，实施例是提供来例证优选实施方案的，并不打算因此而限制发明的范围。
实施例1当TCR共刺激人T细胞时的PKC-θ膜易位和激活环磷酸化没有PKC-θ(即PKC-θ敲除)的小鼠是能存活的，但是成熟T细胞在增殖、IL-2产生和NF-κB激活上是有缺陷的(Sun et al.，Nature404402-407(2000))。在培养的人肥大细胞(HCMC)中证实了在IgE受体交联后PKC激酶活性迅速(＜5min)定位于膜上(Kimata etal.，BBRC 3895-900(1999))。因为PKC-θ在TCR-介导的信号传递中起着中心作用并且在大鼠嗜碱性细胞白血病细胞系RBL-2H3细胞中具有证实的效应(Liu et al.，J.Leukocyte Biol.69831-840(2001))，故检测了PKC-θ在BMMC、腹膜肥大细胞和T细胞中的激活和功能。在TCR刺激之后，PKC-θ迅速易位到超分子激活复合物的中心区，在那里保持最多达四小时(Huang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 999369-9373(2002))。为确定该易位是否与PKC-θ蛋白的磷酸化变化相应，将人T细胞纯化并分析PKC-θ易位和自身磷酸化。为纯化T细胞，从Biological Specialties(Colmar，PA)获得单核细胞制剂。将细胞在Ficoll-Histopaque(可商业获自例如SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)上分层，在离心后收集血块黄层。将细胞在PBS中漂洗数次，以106/ml的密度培养在RPMI/10％FCS中。经阴性选择纯化T细胞(Dynal Biotech，Oslo，Norway)。用可溶的抗-CD3ε(5μg/ml，与10μg/ml抗-mIgG交联)和可溶的抗-CD28(5μg/ml)刺激纯化的T细胞0、2、10、45和60分钟(抗-CD3ε和抗-CD28均商业获自BD Biosciences，San Jose，CA)。就分析来说，经离心收集受刺激的细胞，在冰冷PBS中漂洗一次。通过将细胞沉淀重悬浮在100μl低渗裂解缓冲液[20mMTris-HCl，pH 7.5，2mM EDTA，5mM乙二醇双-(B-氨基-乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)，每mL中亮抑酶肽和抑酶肽各10μg，蛋白酶混合物和磷酸酶抑制剂]中制备全细胞裂解液。将细胞悬浮液通过25号针头30次进行剪切，然后在280xg离心7分钟以沉淀细胞核。在保存一小份用于分析之后，将全细胞提取物经高速离心(16,000xg)澄清。收集胞质溶胶提取物，将膜沉淀在低渗裂解缓冲液中漂洗一次，然后重悬浮在同样的缓冲液中，加入1％NP-40去污剂在冰上裂解30分钟。经另一次高速离心步骤获得去污剂可溶的膜级分，剩下的颗粒级分是去污剂不溶的含有膜微结构域的膜级分(DI级分)。将该DI级分在SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸进行分析。亚细胞蛋白质级分经4-20％SDS-PAGE分析，转移到硝酸纤维素上，用抗-磷酸T538PKC-θ特异性抗体(商业获自Cell Signaling Technology，Inc.(Beverly，MA))在5％blotto/TBS-Tween.05％中免疫印迹(见图1A)。接下来，将硝酸纤维素印迹剥离，用抗-PKC-θE7(SantaCruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)再探查(见图1B)。最后，如图1C所示，为在所有泳道显示等量加样，再次将印迹剥离，然后用抗-肌动蛋白(商业获自Santa Cruz Biotechnology，Inc.)探查。如图1A所示，在TCR刺激(经CD3和CD28刺激)后，PKC-θ在激酶激活环中538位苏氨酸残基上自身磷酸化。自身磷酸化事件与PKC-θ易位到超分子激活复合物中心区相一致(见图1B)。如图1C所示，在所有的时间处理中发现了近似等量的肌动蛋白。因此，这些结果表明PKC-θ易位到超分子激活复合物中心区是与激酶激活环在氨基酸残基苏氨酸538上的伴随可诱导性磷酸化相一致的。
实施例2PKC-θ激活环自身磷酸化是激酶活性所需的如实施例1所述，在T细胞受体共刺激人T细胞时，PKC-θ膜易位是与激酶激活环在氨基酸残基苏氨酸538上的伴随的可诱导磷酸化相应的。该激活环磷酸化被报道为是激酶功能所需的(Liu et al.，Biochemical Journal，2002，361-255-265)。为证实该报道，用C末端红细胞凝集素(HA)表位标记将PKC-θ全长cDNA亚克隆到质粒pcDNA3(商业获自Invitrogen)中，产生C末端HA表位标记的全长(WT)PKC-θ(核苷酸序列SEQ ID NO11；氨基酸序列SEQ IDNO12)。HA-标记的激酶失活的PKC-θ也通过将氨基酸409位赖氨酸突变为色氨酸来产生。该激酶失活的K409W突变通过亚克隆PCR产物而产生，并经测序证实(核苷酸序列SEQ ID NO13；氨基酸序列SEQID NO14)，亚克隆到pcDNA3表达载体中。使用脂(使用MirusTransIT-LT1试剂，商业获自Mirus Corporation，Madison WI)用这些表达构建体瞬时转染人胚肾293细胞(商业获自美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)双份。在转染24或72小时后收集细胞用于Western印迹分析和活性。将收获的细胞在低渗裂解条件下裂解，离心除去细胞核(参见实施例1中更详细的方法)。将一份平行测定的全细胞提取物在SDS-PAGE上电泳，转移到硝酸纤维素上，首先用抗-磷酸T538PKC-θ特异性抗体(Cell Signaling Technology)探查，然后剥离，用抗-HA抗体(Santa Cruz)再探查。如图2A所示，存在激酶失活的全长PKC-θ蛋白(如通过它的抗-HA抗体染色所确定的)，但是在538位苏氨酸残基上未被磷酸化(如通过它缺少抗-pT538PKC-θ抗体染色所确定的)。因此，如图2A转染实验中所示，虽然野生型激酶激活环被有效磷酸化，激酶失活型(通过突变蛋白质中409位的催化性赖氨酸为色氨酸而产生，因此名为K409W)未被磷酸化。尽管其它PKC同工型的证据显示激活环(即538位苏氨酸)的磷酸化可能被归因于PDK-1激酶(其基于其它PKC同种型的证据)，然而这里出现的结果显示人胚293肾细胞中存在的内源PDK-1没有磷酸化PKC-θ激活环。也通过细菌表达的活性激酶结构域的磷酸印迹分析和纯化激酶结构域的分析证明了激活环的自身磷酸化(数据未示出)。接下来，使用肽底物分析了同一平行测定的细胞液提取物(即图2A中使用的那些)的体外激酶活性。在96孔板中分析了胞质溶胶提取物的体外激酶活性，每孔5μg蛋白、终浓度为83μM的生物素化肽底物(氨基酸序列FARKGSLRQ；SEQ ID NO15)、166μMATP、0.5μl P33ATP(比活性3000Ci/mmol，10mCi/ml)、84ng/μl磷脂酰丝氨酸、8.4ng/μl二酰甘油，于ADBII缓冲液(20mM MOPS pH7.2，25mMβ-甘油醛，1mM原钒酸钠，1mM DTT，1mM CaCl2)中终体积30μl，室温30分钟。用含有EDTA的缓冲液终止激酶分析，转移到链霉抗生物素蛋白包覆的闪烁板上漂洗，在板读数仪中检测放射性。从终计数中减去作为背景的只有肽和只有激酶的反应。如图2B所示，与野生型PKC-θ蛋白相比，激酶失活的全长PKC-θ蛋白在转染到人胚肾293细胞后24和72小时时具有显著更低的激酶活性。最后，确定了野生型和激酶失活的PKC-θ引起内源底物IKK(IκBα激酶)磷酸化的能力。为此，将平行测定组的细胞在1％NP-40裂解缓冲液中裂解，将去污剂不溶的膜级分转移到硝酸纤维素上。首先用抗-pIKKα/β探查硝酸纤维素印迹，然后剥离，用抗-IKKα再探查，最后剥离并用抗-IKKβ再探查(所有抗体来自Cell SignalingTechnology)。如图2C所示，野生型PKC-θ，而不是激酶失活的PKC-θ，引起了IKK-β的磷酸化。图2B和2C显示的结果证实激活环自身磷酸化(即在538位的苏氨酸)是PKC-θ活性和信号传递所需的，如通过使用合成底物的体外细胞裂解液激酶活性(图2B)以及内源IKK的磷酸化(图2C)所显示的。这些结果显示野生型激酶诱导了IKK磷酸化，而激酶失活型无法这样做。这些结果将PKC-θ激活环自身磷酸化确定为治疗性调节的独特而新颖的机制。
实施例3PKC-θ激酶结构域的催化机制接下来进行研究以阐明新的磷酸化PKC-θ激酶结构域(PKC-θKD)的催化机制。为此，表达并纯化催化活性的PKC-θKD用于磷酸化位点分析。对于这些研究，首先表达和纯化PKC-θ激酶结构域(PKC-θKD；氨基酸残基362到706)。为此，将PKC-θKD(氨基酸残基362到706)克隆到pET16b表达载体中，引入六-组氨酸标记到C末端。His-标记的PKC-θKD的氨基酸序列提供在SEQ ID NO63(注意SEQ ID NO63中的N末端甲硫氨酸和甘氨酸残基不出现在全长PKC-θ中)。将质粒用来转化大肠杆菌BL21-DE3株以过量表达。用0.1mM IPTG将10升的在37℃光密度0.4的细胞培养物在25℃诱导3小时，然后收获它们并重悬浮在缓冲液(25mM Tris pH 8.0，25mMNaCl，5mM 2-巯基乙醇，5mM咪唑，50μM ATP以及蛋白酶抑制剂)中，用微流化器裂解。将裂解液加到20mL的镍-NTA树脂上，4℃1小时。随后将树脂倾倒作为层析柱，用包括25mM咪唑的同样缓冲液彻底漂洗。用200mM咪唑缓冲液洗脱结合到树脂上的蛋白质。立即将蛋白质加样到阴离子交换器HQ上，用25mM Tris pH 8.0、25mM NaCl、5mMDTT、50μM ATP漂洗柱子，然后通过应用25mM到500mM NaCl线性梯度进行分辨。含有PKC-θKD的级分的选择通过SDS-PAGE，汇集，用25mM Tris pH 8.0、5mM DTT稀释两倍，加样到肝素层析柱上。立即流过羟磷灰石柱，用25mM Tris pH 8.0、50mM NaCl、5mMDTT彻底漂洗。0到100mM的磷酸钠线性梯度洗脱目标蛋白质。然后将蛋白质在Superdex 200大小排阻层析柱上作为单体进行大小分级，用25mM Tris pH 8.0、50mM NaCl、5mM DTT在4℃透析过夜，浓缩。接下来，进行质谱分析。为进行该分析，将PKC-θKD(在50mM Hepes pH 7.5、5mM MgCl2、5mM DTT、10％甘油和0.0025％Brij-35中，0.25μg/μl)在10％Tricine凝胶上电泳(Invitrogen)，考马斯亮蓝染色。切下条带，在ProGest Investigator自动机(GenomicsSolutions，Ann Arbor，MI)中用胰蛋白酶(Promega，Madison，WI)进行胶内消化。经SpeedVac减少样品体积，用0.1M乙酸复原到大约30μl的终体积。然后将肽进行nanoLC/MS/MS分析。简要的说，将样品注入到75μm×10cm IntegraFrit柱(New Objectives，Woburn，MA)上，柱是用10μm C18珠(YMC，Wilmington，NC)装填的。HPLC梯度经过45min以250nL/min的流速线性地由4％增加到60％溶剂B(溶剂A，0.1M乙酸/1％CAN；溶剂B，0.1M乙酸/90％ACN)。用LCQ DECA XP离子阱质谱仪(ThermoFinnigan，San Jose，CA)收集质谱。使用Sequest算法(ThermoFinnigan，San Jose，CA)检索MS/MS数据，以得到PKC-θ在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸上的差异性磷酸化修饰。为帮助分析PKC-θKD的催化机制，使用定点诱变(使用商业获自Stratagene，La Jolla，CA的试剂盒)在PKC-θKD表达构建体中进行各种突变。经测序验证这些突变的序列。如上所述表达构建体来表达野生型PKC-θKD，在通过Bradford分析(商业获自BioRad，Hercules，CA)估测蛋白质后，通过免疫印迹和激酶分析来分析等量的大肠杆菌裂解液。简要的说，通过4-20％SDS-PAGE分析裂解液，转移到硝酸纤维素上，用商业获自Cell Signaling Technology(Beverly，MA)的抗-pT538PKC-θ抗体或者商业获自Invitrogen(Carlsbad，CA)的抗-His抗体在5％blotto/TBS-Tween 0.05％中进行免疫印迹。质谱研究显示PKC-θKD被磷酸化。由于PKC-θKD表达是在大肠杆菌中进行的，其中是没有丝氨酸-苏氨酸激酶的，因此质谱发现就是所表达激酶自身磷酸化的结果。基于氨基酸序列的预测分子量是41,615道尔顿，然而，经ESI-MS确定的分子量是42,092道尔顿和42,173道尔顿(每种50％)，这表明5或6个氨基酸在大肠杆菌中自身磷酸化了。图3A-3D是显示PKC-θKD自身磷酸化特征的示意图。如图3A所示，新的C2结构域位于蛋白质的氨基末端，接着是两个结合辅因子的C1结构域，然后是羧基末端激酶结构域。在示意图3A上面显示了保守的磷酸化位点(即538位苏氨酸，676位丝氨酸，685位丝氨酸，以及695位丝氨酸)，而在示意图下面显示了PKC-θKD N末端和C末端氨基酸残基(分别在362和706位)。在质谱分析中，m/z比是肽的质量/电荷比，z(电荷)是1。因此，m/z比给出了肽片段的质量。质谱产物离子谱分析显示Ser695是磷酸化位点。这样，图3B显示了肽NFpSFMNPGMER(跨越位置693-703)的产物离子谱在m/z 705.52，这证实Ser695是磷酸化位点。图3C显示了肽ALINpSMDQNMFR(跨越位置681-692)的产物离子谱在m/z 760.48，表明Ser685是磷酸化位点。图3D显示了肽TNTFCGTPDYIAPEILLGQK(跨越位置536-555)的产物离子谱在m/z 1159.71。图3D的产物离子谱表明该肽上的一个磷酸，也表明磷酸化位点是Thr536或Thr538。注意540位的半胱氨酸残基(在图3D中用#表示)是被碘乙酰胺所烷基化的。因此，疏水基序Ser695和转角基序Ser685就被鉴别为自身磷酸化位点(分别见图3B和3C)。质谱没有检测到Ser662和Ser657转角基序残基的任何磷酸化。根据与其它PKC转角基序的同源性，Ser676可能是自身磷酸化的，但是这在这些研究中不是明确的，因为没有在胰蛋白酶处理的肽中检测到Ser676。这些研究进一步揭示了激活环中的Thr536或Thr538也是自身磷酸化的(见图3D)。细菌中表达的PKC-θKD的X-射线结构测定证实Thr538残基是磷酸化的(Xu et al.，J.Biol.Chem.279(48)50401-50409(2004))。这个结果是令人惊讶的，因为它与以前的意见即激活环被PDK-1磷酸化(Balendran et al.，FEBS Lett.484217-223(2000)；LeGood et al.，Science 2812042-2045(1998))是相反的。实际上，激酶失活的全长PKC-θ突变体K409W的早先研究已经显示该分子在Thr538未被磷酸化(Liu et al.，Biochem.J.361255-265(2002))。使用上面实施例2中描述的HEK293细胞异源表达系统，也观察到了细胞中的K409W PKC-θ突变体缺少Thr538磷酸化(数据未显示)。这个发现意味着Thr538未磷酸化是由于K409W激酶突变体不能自身磷酸化。而且，K409W PKC-θ分子的Thr538未磷酸化与缺少体外细胞裂解液激酶活性以及内源IKKα/β磷酸化相关联(数据未显示)。因为以前已经提出过，PKC-θ激活环是被PDK-1磷酸化的(Balendran et al.，FEBS Lett.484217-223(2000)；LeGood et al.，Science 2812042-2045(1998))，表明了细菌中表达的PKC-θKD的Thr536或Thr538被自身磷酸化的质谱分析结果是令人惊讶的(见图3B-3D)。这部分地通过x-射线结构来解释，其揭示了磷酸化的Thr538与前面的Thr536侧链是氢键相互作用的(Xu et al.，J.Biol.Chem.279(48)50401-50409(2004))。这个相互作用可能进一步稳定了激活环内的以及与αC-螺旋的相互作用，这两者都与催化作用相关(Johnson et al.，Cell 85149-158(1996))。以前的研究已经提出了PKC-θ有催化能力的构象，其中激活环被组成型磷酸化(Newton，A.C.，Biochemical Journal.370361-371(2003))。PDK-1在激酶结构域激活环磷酸化PKCs和其它AGC家族激酶，作为发生在疏水和转角基序上的保守位点处的自身磷酸化之前所需的修饰(Newton，A.C.，Biochemical Journal.370361-371(2003)；Balendran et al.，FEBS Lett.484217-223(2000))。这里出现的结果揭示，与流行的假说相反，PKC-θ能够独特地自身磷酸化。这里提出的关于PKC-θKD特征的发现提出了证据来支持除了激酶结构域中的疏水和转角基序之外，激活环也被自身磷酸化(见图3B-3D)。这些研究也排除了PDK-1在细胞中能够磷酸化PKC-θ激活环的可能性。然而，与细菌中表达的PKC-θ相反(Smith et al.，J.Biol.Chem.27745866-45873(2002))，本实施例中呈现的发现显示PKC-θKD能够在PKC-θ激活环处自身磷酸化，因此PDK-1磷酸化需求就不是必须的了。质谱数据显示细菌中表达的PKC-θKD在5或6个氨基酸残基处被自身磷酸化。在这些实验中鉴别的磷酸化位点包括疏水基序Ser695、转角基序Ser685、激活环Thr538或Thr536。在胰蛋白酶处理的肽中没有检测到转角基序Ser676，尽管根据序列同源性它也可能被磷酸化。Ser685是新鉴别的转角基序自身磷酸化位点。最后，除了上述鉴别到的磷酸化位点之外，至少另外2个氨基酸残基被自身磷酸化，但是没有被这些技术检测到。激活环中的氨基酸残基Thr538是激酶活性所需的(Liu etal.，Biochem.J.361255-265(2002))。因此，检查了激酶结构域中几个磷酸化位点的点突变对激活环Thr538自身磷酸化的影响。为此，使用抗-pT538PKC-θ抗体通过Western印迹分析来分析PKC-θKD蛋白和各种突变体的大肠杆菌裂解液。如图4A所示，只有野生型PKC-θKD蛋白和三个测试的突变片段在538位酪氨酸上被磷酸化。通过剥离印迹并用抗-His抗体染色的再探查来确定泳道的等量加样(见图4B)。也进行这些大肠杆菌裂解液级分的裂解液激酶分析。这些激酶分析用30μl的终浓度83μM生物素化肽底物(FARKGSLFQ)、166μM ATP、0.5μl of P33ATP(比活性3000Ci/mmol，10mCi/ml)、84ng/μl磷脂酰丝氨酸、8.4ng/μl二酰甘油在20mM MOPS pH 7.2中、25mM β-磷酸甘油、1mM DTT、1mM CaCl2在室温进行30分钟。五到十μl的反应液点样在磷酸纤维素纸上，然后在0.75％磷酸中漂洗三次、在丙酮中漂洗一次。将闪烁混合物加到磷酸纤维素上，用闪烁计数器检测结合的放射性。如图4C所示，在测试的各种PKC-θKD突变体中，只有野生型PKC-θKD蛋白和三种突变片段在苏氨酸538上被磷酸化，显示了在体外裂解液激酶活性分析中的活性。实际上，裂解液激酶活性与每种表达的突变体裂解液中检测到的磷酸化苏氨酸538(pThr538)的程度相关联(比较图4A和4C)。PKC-θKD的C末端疏水基序的695位丝氨酸(Ser695)对于最佳激活环自身磷酸化也是必需的，如通过抗-pT538Western印迹图中明显减少的信号所证明的(见图4A中的S695A突变体(即695位丝氨酸突变为丙氨酸))。因此，695位丝氨酸对PKC-θKD激酶活性是必需的，如S695A突变体激酶活性缺失所证实的(见图4C中的S695A突变体)，分别与失活的和激酶失活突变体T538A和K409W非常类似(见图4A和4C)。相反，转角基序残基Ser662对活性和Thr538自身磷酸化都不是必要的(见图4A中的S662A突变体)，而转角基序残基Ser676和Ser685有部分影响(见图4A中的S676A和S685A突变体)。因此，突变分析证实了保守转角基序中的Ser676和Ser685部分影响PKC-θKD的激酶功能(见图4A和4C)。以前已经报道过，全长激酶中的S676A突变不影响激酶活性，而全长分子中的S695A突变使激酶活性降低了80％(Liu et al.，Biochem.J.361255-265(2002))。全长PKC-θ中报道的S695A残基活性与中度的磷酸-Thr538信号相一致，这是这里对激酶结构域中的S695A所观察到的(见图4C，S695A突变体)。这暗示了Ser695突变导致了最佳Thr538自身磷酸化的丧失，从而导致激酶活性的减弱。这个特性也是PKC-θ在其它PKC同工型中所独有的。至于PKC-θ，Ser695和Thr538自身磷酸化有某种程度的相互依赖是可能的。在激活环处被磷酸化的PKC分子被称作存在于辅因子结合、自身磷酸化和底物催化步骤之前的“有催化能力的构象”(Newton，A.C.，Biochemical Journal.370361-371(2003))。为优化PKC-θKD激酶功能，激活环和疏水基序都自身磷酸化来提供PKC-θ“有催化能力的构象”是可能的。已经确定了表达的活性PKC-θKD的磷酸化位点关系，接下来进行详细的酶机制研究以检查激酶催化反应。用于确定PKC-θ动力学机制的所研究肽底物示于表I。
表I用于PKC-θKD分析的肽 肽1和肽2是源自PKC-α拟底物区的底物。肽3和肽4分别源自血清反应因子(Heidenreich et al.，J.Biol.Chem.27414434-14443(1999))中的磷酸化位点以及淋巴细胞特异性蛋白质-1中的磷酸化位点(Huang et al.，J.Biol.Chem.27217-19(1997)).就酶动力学分析来说，ATP、ATPγS、Ficoll-400、蔗糖、ATP、ADP、磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、NADH、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脱氢酶(LDH)、AMP-PNP、乙腈、以及缓冲液HEPES购自SigmaChemical Co.(St.Louis，MO)。肽底物、抑制剂和磷酸化的底物肽购自AnaSpec(San Jose，CA)、SynPep(Dublin，CA)或者OpenBiosystems(Huntsville，AL)。在25℃使用偶联的PK/LDH分析确定酶活性，接着在Molecular Devices板读数仪上于340nm进行分光光度分析。除非另外指出，标准反应在25mM HEPES pH 7.5、10mMMgCl2、2mM DTT、0.008％TritonX100、100mM NaCl、20单位PK、30单位LDH、0.25mM NADH和2mM PEP中进行，终体积0.080mL。PKC-θKD浓度在0.156μg/ml到0.312μg/ml之间变化。接下来，进行溶剂粘度分析。稳态动力学参数在上述用于酶动力学分析的缓冲液中确定，其中含有可变的蔗糖(0-35％)或Ficoll400(0-8％)。相对溶剂粘度(ηrel)使用OstWald粘度计相对于25mMHEPES pH 7.5、10mM MgCl2、2mM DTT和100mM NaCl在25℃平行测定三次。没有粘精(viscogen)的缓冲液用上标0表示。偶联酶系统不受这些粘精存在的影响。用ATPγS进行的硫效应研究和用ADP进行的产物抑制研究在Hewlett Packard系列1100HPLC上分析，使用Phenomenex Auga 5m C18124 A050mm×4.60mM柱(00B-4299-E0)。使用0％到100％的20mM磷酸盐pH 8.8/乙腈(50/50)梯度将未磷酸化的肽与磷酸化的肽分开。通过在485nm激发并在530nm监测荧光发射来检测荧光标记的肽。接下来确定底物动力学。为此，将数据代入方程1以得到标准Michaelis-Menten动力学，或者对代入方程2以得到底物抑制v=Vmax[S]Km+[S]---(1)]]>v=Vmax[S]Km+[S]+[S]2Ki---(2)]]>其中S是底物，Vmax是最大酶反应速度，Km是Michaelis常数，Ki是底物抑制的抑制常数(Adams，J.A.，Biochemistry 42601-607(2003))。在各种固定浓度肽和ATP下获得初速度并代入下列方程v=Vmax[A][B]KiaKb+Kb[A]+Ka[B]+[A][B]---(3)]]>v=Vmax[A][B]Kb[A]+Ka[B]+[A][B]---(4)]]>在上面的方程中，[A]和[B]分别是ATP和肽的浓度；Ka和Kb分别是ATP和肽的Km；Kia是A从EA复合物上解离的常数。初始反应速度作为产物抑制(ADP或磷酸肽)的函数或者作为失活末端抑制(AMP-PNP)的函数而获得。在这些研究中，一种底物保持恒定，而另一种随增加的抑制剂浓度而变化。在产物抑制情况下，不变底物保持在饱和或非饱和水平，而在失活末端抑制中，不变底物保持在饱和水平。将数据代入竞争性抑制模型(方程5)、非竞争性抑制模型(方程6)或者反竞争性抑制模型(方程7)
v=Vmax[S]Km(1+[I]Kis)+[S]---(5)]]>v=Vmax[S]Km(1+[I]Kis)+[S](1+[I]Kii)---(6)]]>v=Vmax[S]Km+[S](1+[I]Kii)---(7)]]>p其中Kii和Kis是截距和斜率抑制常数。使用SPSS Science(Richmond，CA)的Sigma Plot 2000 Enzyme Kinetics Module分析数据。表II提供了肽1-4、ATP以及没有肽的ATP的稳态动力学参数汇总。
表II稳态动力学参数汇总
a肽1和肽2代入方程(2)；肽3、肽4和ATP代入方程(1)b肽1在该分析中存在c在分析中没有肽存在如表II所示，在没有肽底物时，PKC-θKD水解ATP(0.16sec-1)比存在肽时(18sec-1)慢110倍。ATP的Km是59μM(没有肽)和49μM(饱和的肽1)，这表明ATP结合在肽底物存在时没有显著性差异。饱和ATP时的PKC-θ稳态动力学参数列在表II中。肽3和肽4显示了最高的PKC-θKm，分别是420μM和240μM。相比之下肽1和肽2的Km值分别是6.5μM和4.3μM，在高浓度时引起酶抑制(表II)。更碱性的肽1和肽2更低的Km值，意味着碱性氨基酸底物肽是PKC-θ优选的。有趣的是，在更长的更碱性的肽2中观察到的底物抑制比更短的肽1更为显著(表II)。因此，在增加的NaCl浓度下检查了PKC-θ(肽1和ATP)的动力学参数。这些研究的结果示于表III。
表IIINaCl对PCK-θKD稳态动力学参数的影响
a0.2mM肽1b代入方程(1)c代入方程(2)如表III所示，当NaCl浓度增加，ATP的Km和酶转换增加，而肽1的Km仍然相对恒定。也研究了离子强度对PKC-θ的影响，这是通过在非产物性的或失活末端的复合物中当底物与酶结合时，检查所发生的NaCl对底物抑制的影响而实现的。在优选的碱性肽1和2中观察到了底物抑制，但是在非最佳的肽3和4中没有观察到(见表II)。而且，也发现底物抑制依赖于缓冲液的离子强度。当NaCl浓度增加到250mM时，肽1的底物抑制就减少了(见表III)。因此，表III显示缓冲液NaCl浓度的增加就增加了ATP的PKC-θKD Km以及酶更新。也观察到了离子强度对肽1底物抑制的影响。当NaCl浓度增加，观察到了肽1底物抑制的减少(见表III)。盐(NaCl)的性质和它对离子对形成的影响能够理解这些观察结果。根据阳离子和阴离子的Hofmeister序列，NaCl落在低离液序列和高离液序列中间(Cacace et al.，Quarterly Reviews of Biophysics 30241-277，1997)。因此，NaCl应该不会盐析酶，也不会使酶变性。然而，缓冲液离子强度的增加将对离子对的形成有影响(Park C.R.R.，J.Am.Chem.Soc.12311472-11479(2001))。就酪氨酸激酶Csk来说，50mM NaCl的加入具有增加负电荷底物聚(Gly，Tyr)的Km的效果；然而，对于ATP的Km或者酶转换没有影响(Cole et al.，J.Biol.Chem.26930880-30887，1994)。在PKC-θKD的情况下，ATP的Km的增加可能是两种可能性的结果1)在250mM NaCl时，肽1对酶-ATP二元复合物的产物性结合更多，所观察到的Km是ATP的真实Km的反映；或者2)离子强度的增加以与肽1同样的方式影响带电底物ATP。所观察到的Km增加可能是上述两种可能性的结合。就肽1底物来说，离子对形成(Columbic相互作用)可能在该底物对酶的结合中是重要的。在pH 7.5时，诸如肽1这样的碱性肽将具有净正电荷。因此，NaCl浓度的增加将产生对离子对形成更不利的环境(Park C，R.R.，J.Am.Chem.Soc.12311472-11479(2001))。如果离子对形成是肽1抑制的原因，那么随NaCl增加而减少的底物抑制是与Columbic相互作用的减弱相一致的。在确定PKC-θ的动力学机制中，对固定变化的肽底物浓度在100mM NaCl时确定了不同ATP的反应初速度。分析首先用肽1进行，然而由于肽1的底物抑制，很难解释所得到的Lineweaver-Burk曲线(数据未显示)。接着进行了Lineweaver-Burk曲线(未显示)的截距和斜率对肽1的重作图。如图5A和5B所示，截距和斜率重作图分别对100mM NaCl的肽1是非线性的。也进行了初速度分析，使用肽3在同样的条件下进行。不同ATP浓度对固定变化的肽3浓度的曲线在Lineweaver-Burk曲线上产生了交叉模式(数据未显示)，这表明了顺序动力学机制。ATP的Kia值是61±22μM，ATP的Ka是118±17μM。然后在625nMNaCl下确定了肽1的初速度模式，因为增加的盐浓度减少了肽1的底物抑制(见表III)。所得到的Lineweaver-Burk曲线也产生了交叉模式(数据未显示)，与肽1是底物时的顺序动力学机制一致。在高NaCl浓度下，Lineweaver-Burk曲线(未显示)的截距和斜率重作图对肽1是线性的(见图5C和5D)。在高NaCl下获得的ATP的Kia值是66±32μM，发现与肽3在100mM NaCl下的ATP的Kia值61±22μM是相似的。这表明增加的离子强度不会影响ATP从酶-ATP复合物解离的常数。在625mM NaCl下获得的ATP的Ka是321±19μM，与在100mMNaCl下的ATP的Ka118±17μM不同。这与离子强度增加时ATP的Km增加是一致的(见表III)。失活末端抑制研究将ATP鉴别为结合PKC-θKD的第一底物。这样，接着确定顺序催化机制中的底物结合次序。将ATP的不可水解类似物AMP-PNP以及将肽1的丝氨酸变为丙氨酸的肽5(见表I)用于抑制研究。抑制研究结果示于表IV。
表IV抑制模式和常数a
aNaCl浓度保持在100mMbc，竞争性；nc，非竞争性；uc，反竞争性；-，未观察到抑制c数据代入的方程号dATP保持在0.1mMe肽3保持在0.5mM，由于肽1较低的Km而使用肽3f由于用肽1观察到了底物抑制而使用肽3如表IV所示，发现AMP-PNP是ATP的竞争性抑制剂，Ki值为228μM。在饱和ATP时用AMP-PNP对肽没有观察到抑制。肽抑制剂肽5显示为肽1及肽3的竞争性抑制剂，Kis值分别为10μM和4.4μM(表IV)。肽5进一步显示为ATP的反竞争性抑制剂，Kii值为1100μM(见表IV)。这些结果与PKC-θ底物的有序顺序加入是一致性的，其中ATP首先与酶缔合，接着是肽。因为PK/LDH偶联的激酶分析消耗了催化产物ADP，所以使用HPLC分析来确定ADP的抑制模式(见表IV)。发现ADP在饱和的肽1时是ATP的竞争性抑制剂，Kis为291μM。当在饱和ATP时分析ADP，没有观察到对肽1的抑制。当在未饱和ATP(0.1mM)下进行分析时，观察到了非竞争性模式，Kis为494μM，Kii为200μM(见表IV)。ADP的这些结果排除了如图6C中所示意性描述的随机机制，但是与顺序有序(如图6A所示意性描述)或者Theorell-Chance(如图6B所示意性描述)动力学机制是一致性的，其中ADP是释放的终产物。为进一步阐明动力学机制，用磷酸肽1进行了产物抑制分析。由于用肽1观察到了底物抑制，所以用肽3进行产物抑制分析。磷酸肽1是肽3的非竞争性抑制剂，在饱和ATP浓度下Kis为1700μM，Kii为1200μM(表IV)。在未饱和ATP下，观察到了反竞争性模式，Kii为2000μM。在未饱和的肽3(0.5mM)时，磷酸肽1是ATP的反竞争性抑制剂，Kii为1600μM。上述结果与顺序有序Bi-Bi机制更为一致，ADP为释放的终产物(见图6A)。使用ATP的硫类似物ATPγS来研究催化中的磷酸转移步骤的速率，这些研究的结果示于表V。
表V硫对PKC-θKD的影响
a分析中使用的肽1b速率峰值区域/(反应时间，分钟)([酶]nM)如表V所示，ATPγS对ATP的替代产生了反应的kcat的大变化。与ATP的反应相比，ATPγS反应在100mM NaCl和250mM NaCl中分别慢112倍和146倍。然而，使用HPLC获得的ATP和ATPγS的Km仅仅相差两倍(表V)。为确定化学步骤是否是反应速度的唯一贡献者，确定了溶剂粘度对PKC-θ稳态动力学参数的影响。在该研究中采用了两种类型的粘精，微粘精蔗糖和大粘精Ficoll-400。微粘精直接影响小分子的扩散，同时产生粘度计观察到的粘度效应(Blacklow et al.，Biochemistry 271158-1167(1988))。大粘精产生粘度计可见的粘度效应，但是并不明显影响小分子的扩散速度，因而用作分析中观察到的微粘度效应的对照(Cole et al.，J.Biol.Chem.26930880-30887(1994))。在增加的溶剂粘度和两种不同的离子强度下确定了肽1、肽3和ATP的稳态动力学参数。溶剂粘度对动力学参数kcat和kcat/Km，的相对效应对缓冲液的相对粘度作图，进行线性回归拟合。图7A-7D显示了溶剂粘度对PKC-θKD的kcat和kcat/Km的影响。图7A显示了使用变化的肽1，ATP保持在2.0mM时的kcat效应。图7B显示ATP在0.125mM肽1的kcat/Km。图7C显示了用变化的肽3、ATP保持在2.0mM时的kcat效应。图7D显示了肽3在2.0mMATP时的kcat/Km。就图7A-7D来说，空心圆符号(○)表示100mM NaCl在增加的蔗糖中；空心倒三角符号()表示250mM NaCl在增加的蔗糖中；实心圆符号(●)表示100mM NaCl在增加的Ficoll 400中；实心倒三角符号()表示250mM NaCl在增加的Ficoll 400中。图7A-7D中的虚线表示斜率1。斜率1表示微粘精对动力学参数的最大效应。大粘精的存在对酶速率影响很小。随着溶剂微粘度的增加，可见对(kcat)η值的适度影响。所有的三种底物在100mM NaCl和250mMNaCl中的研究都可见所观察到的酶速率的线性降低。在所有条件下获得的斜率[(kcat)η]在0.38到0.54之间变化，意味着产物释放是部分限速的(图7A和7C)。0.8到1的值表明产物释放是催化限速步骤(Adams，J.A.，Biochemistry 42601-607(2003))。底物粘度可通过粘度分析确定。简要的说，对于粘性底物，产物形成速率比底物解离速率快，而非粘性底物将比产物形成速率更快地从酶上解离(Cleland，W.W.(1986)Investigations of Rates andMechanisms of Reactions，Vol.6，Wiley-Interscience Publications，JohnWiley & Sons，New York，NY)。增加的溶剂微粘度对kcat/Km的相对影响对相对溶剂粘度作图(图7B和7D)。当微粘度影响对相对溶剂粘度作图时，对肽1来说，在250mM NaCl中的斜率具有0.86的(kcat/Km)η值(数据未显示)。肽1在100mM NaCl时没有获得数据，因为在低离子强度所观察到的底物抑制。另一方面，肽3在任一离子强度下都没有显示出溶剂粘度效应(图7D)。这些研究意味着肽1是粘性底物，而肽3是非粘性的。已经报道了几种激酶的动力学机制(参见例如Wu et al.，Biochemistry 411129-1139(2003)；Trauger et al.，Biochemistry 418948-8953(2003)；Chen et al.，Biochemistry 392079-2087(2000))。两种肽底物在高和低的离子强度下，PKC-θKD初速度曲线都在图中产生了在坐标左边和下边相交的线。这个模式清晰表明是顺序机制，其保持不受缓冲液离子强度影响。此外，ATP Kia值没有什么差别，肽3在100mM NaCl时为61μM，肽1在625mM NaCl时为66μM，进一步表明ATP从酶-ATP复合物上解离不受离子强度影响。在两种条件下都发现Kia值小于分别是118μM和321μM的Ka值，排除了快速平衡机制。失活末端抑制和产物抑制研究(见表IV)与顺序有序机制是一致性的，其中ATP是结合的第一底物。肽抑制剂(表I中的肽5)对两种肽底物是竞争性的，对ATP是反竞争性的。尽管发现了ATP类似物AMP-PNP对ATP是竞争性的，在饱和ATP下最高达2.0mM的AMP-PNP没有观察到对肽1的抑制。在饱和ATP时，尽管ATP对ADP变化时观察到了竞争性模式，肽1对ADP变化时没有观察到抑制。在未饱和的ATP时，当肽1对ADP变化时，观察到了非竞争性模式。这些抑制研究排除了PKC-θKD的随机机制，证明ADP是释放的最后产物，如图6A所示。肽1在100mM NaCl下的初速度实验对观察到的底物抑制类型给出了一些理解。简要的说，在图8所示的有序双反应物体系(Segel，I.H.Enzyme KineticsBehavior and Analysis of RapidEquilibrium and Steady-State Enzyme Systems，Whiely-Interscience，1975)中，观察到有三种类型的底物抑制。两种是这样的底物抑制，其中底物B形成失活末端EB复合物，或者底物A形成EAA失活末端复合物。第三种是这样的底物抑制，其中B形成EBQ失活末端复合物。EAA失活末端复合物的形成被排除了，因为缔合的第一底物是ATP，没有观察到ATP的底物抑制。图5A-5D显示了肽1在100mM NaCl和625mM NaCl下的初速度数据的重作图。如图5A和5B所示，抑制效应在100mM NaCl下的斜率和截距重作图上都发现了(即重作的曲线图是非线性的)。然而，在625mM NaCl下(如图5C和5D所示)，重作图成为线性了，表明在高离子强度下最高达0.5mM肽1的抑制都被消除了。在斜率和截距重作图上的底物抑制效应是与非竞争性底物抑制相一致的(Cleland，W.W.，Methods Enzymol.63500-513(1979))。在有序顺序机制中的非竞争性底物抑制表明形成了下面类型的非产物性酶复合物。两种示于图8中，EB和EBQ复合物。第三种可能性将是非产物性的EAB复合物。这明显是可能的，因为在0mM NaCl时，底物抑制是有效的(0.129mM)，ATP浓度是约80x Km(0.025mM，在0mM NaCl下)。在顺序有序机制中，ATP首先结合，就很少存在自由酶来形成EB失活末端复合物。使用硫代磷酸酯来研究不同类型的酶促磷酸转移反应。在Csk激酶(Cole et al.，J.Biol.Chem.26930880-30887(1994))的情况下，ATPγS反应速率比ATP反应慢15到20倍。类似地，在磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PLC)的酶促机制研究中，当未成键氧被硫取代时，反应减慢105倍(Kravchuk et al.，Biochemistry 405433-5439(2001))。无论使用哪种ATP类似物，ATP或ATPγS，产物ADP是相同的。因此，催化速率将保持不受产物释放的影响。对于PKC-θKD所观察到的硫效应，意味着磷酸转移化学对酶促反应总速率的贡献。此外，以PKC-θ观察到的很大的硫效应反驳了图6B中描述的Theorell-Chance有序顺序动力学机制(McKay et al.，Biochemistry 358680-8685(1996))。就Theorell-Chance动力学机制来说，三元复合物是短暂的，因此意味着化学步骤非常快。溶剂粘度效应在确定酶促反应限速步骤中是有价值的工具。在非化学步骤上诸如产物由酶扩散以及底物扩散到酶活性部位，发现了增加的溶剂粘度效应(Blacklow et al.，Biochemistry 27，1158-1167(1988))，在单分子步骤上诸如磷酸转移步骤没有发现(Adams，J.A.，Biochemistry 42601-607(2003))。这里报道的PKC-θ溶剂粘度效应研究表明，产物抑制是催化作用中的部分限速步骤。这里进行的研究例证了PKC酶催化特征和动力学机制，从而提供了对高度类似于PKC的PKC同工型和/或AGC家族激酶的理解。所给出的结果是与顺序有序机制相一致的，其中ATP首先结合，ADP最后释放。磷酸肽释放和磷酸转移对限速步骤作出了贡献。重要的是，在这里给出的激酶结构域研究中，揭示了PKC-θ潜在的独特特征。一并考虑PKC-θ的结构特征.see Xu et al.，J.Biol.Chem.279(48)50401-50409(2004))，这些发现在推进该激酶用于疾病治疗的选择性靶向中具有重要暗示。
实施例4PKC-θ底物的鉴别接着进行肽扫描阵列以鉴别PKC-θ的肽底物。为此，如实施例3中所述，将PKC-θ从残基362到残基706的催化激酶结构域克隆到pET-16b表达载体中。该载体框内引入C末端六-组氨酸标记到表达克隆。将质粒转化到BL21-DE3大肠杆菌株中过量表达。将10升细胞培养物初始生长在37℃直到O.D.为0.4，然后将温度降到25℃，然后用0.1mM IPTG诱导表达。在收获前将细胞再生长3小时。将细胞重悬浮，使用微流化器在Tris 25mM pH 8.0、NaCl 25mM、2-巯基乙醇5mM、咪唑5mM、ATP 50μM和蛋白酶抑制剂中裂解。将裂解液在4℃通过批处理方法加到20ml(床)的镍-NTA树脂上1小时。随后将树脂倾倒作为层析柱，用带有增加到25mM的咪唑的同样缓冲液大量漂洗。洗脱步骤用200mM咪唑缓冲液实现。然后将蛋白质立即加样到阴离子交换器HQ上，用Tris 25mM pH 8.0、NaCl 25mM、DTT 5mM、ATP 50μM漂洗，然后应用最高达500mM的NaCl线性梯度进行分辨。合并SDS-PAGE选择的级分，用Tris 25mM pH 8.0、DTT 5mM进行两倍洗脱，加样到肝素层析柱上。将流出的蛋白质级分立即加到羟磷灰石柱上，用Tris 25mM pH 8.0、NaCl 50mM、DTT 5mM大量漂洗。用0到100mM的磷酸钠线性梯度洗脱目标蛋白。然后将蛋白质在Superdex 200大小排阻层析柱上作为单体进行大小分级，对Tris 25mM pH 8.0、NaCl 50mM、DTT 5mM透析过夜，浓缩。就肽的点合成来说，用聚乙二醇和Fmoc-保护的氨基酸修饰的纤维素膜购自Intavis。Fmoc-保护的丙氨酸购自Chem-Impex(WoodDale，IL)。通过偶联β-丙氨酸间隔基将阵列限定在膜上，使用标准DIC/HOBt(二异丙基碳化二亚胺/羟基苯并三唑)偶联化学如之前所述(参见例如Molina et al.，Peptide Research 9151-155(1996)；andFrank，R.，Tetrahedron 489217-9232(1992))合成肽。使用AbimedASP 222自动机点样活化的氨基酸。手动进行漂洗和脱保护步骤，在最后的合成循环之后将肽N末端乙酰化。肽合成和侧链脱保护之后，进行激酶分析。就这些分析来说，将膜在甲醇中漂洗10分钟，在分析缓冲液(20mM HEPESpH＝7.5，10mM MgCl2，2mM DTT，100mM NaCl和20μM ATP)中漂洗10分钟。然后将膜用50nM PKC-θ(激酶结构域氨基酸残基362-706)C-末端His-标记的、在大肠杆菌中表达并纯化的)在含有0.33Ci/mMolγ-32P-ATP的分析缓冲液中温育1小时。然后将膜用含有0.1％Triton-X和100μM冷ATP的200mM磷酸钠漂洗5次，用乙醇漂洗3次。接下来将膜干燥，用Biorad Fx成像。使用这些方法，测试了384个肽序列。这些肽的磷酸化示于图9A。在这384个肽序列中，下面的被显示出是PKC-θ的底物。
FARKGSLRQKN(SEQ ID NO6)KKRFSFKKSFK(SEQ ID NO16)QKRPSQRSKYL(SEQ ID NO17)KIQASFRGHMA(SEQ ID NO18)
LSRTLSVAAKK(SEQ ID NO19)AKIQASFRGHM(SEQ ID NO20)VAKRESRGLKS(SEQ ID NO21)KAFRDTFRLLL(SEQ ID NO22)PKRPGSVHRTP(SEQ ID NO23)ATFKKTFKHLL(SEQ ID NO24)SPLRHSFQKQQ(SEQ ID NO25)KFRTPSFLKKS(SEQ ID NO26)IYRASYYRKGG(SEQ ID NO27)KTRRLSAFQQG(SEQ ID NO28)RGRSRSAPPNL(SEQ ID NO29)MYRRSYVFQT(SEQ ID NO30)QAWSKTTPRRI(SEQ ID NO31)RGFLRSASLGR(SEQ ID NO32)ETKKQSFKQTG(SEQ ID NO33)DIKRLTPRFTL(SEQ ID NO34)APKRGSILSKP(SEQ ID NO35)MYHNSSQKRH(SEQ ID NO36)MRRSKSPADSA(SEQ ID NO37)TRSKGTLRYMS(SEQ ID NO38)LMRRNSVTPLA(SEQ ID NO39)ITRKRSGEAAV(SEQ ID NO40)EEPVLTLVDEA(SEQ ID NO41)SQKRPSQRHGS(SEQ ID NO42)KPFKLSGLSFK(SEQ ID NO43)AFRRTSLAGGG(SEQ ID NO44)ALGKRTAKYRW(SEQ ID NO45)VVRTDSLKGRR(SEQ ID NO46)KRRQISIRGIV(SEQ ID NO47)WPWQVSLRTRF(SEQ ID NO48)GTFRSSIRRLS(SEQ ID NO49)RVVGGSLRGAQ(SEQ ID NO50)
LRQLRSPRRTQ(SEQ ID NO51)KTRKISQSAQT(SEQ ID NO52)NKRRATLPHPG(SEQ ID NO53)SYTRFSLARQV(SEQ ID NO54)NSRRPSRATWL(SEQ ID NO55)RLRRLTAREAA(SEQ ID NO56)NKRRGSVPILR(SEQ ID NO57)GKRRPSRLVAL(SEQ ID NO58)QKKRVSMILQS(SEQ ID NO59)RLRRLTAREAA(SEQ ID NO60)这些肽中的一些示于图9B，被PKC-θ磷酸化的丝氨酸以粗体表示。这些被PKC-θ磷酸化的肽序列可被包含在PKC-θ的生理底物之中，同样地可能是通过在细胞中或体内测试底物磷酸化的抑制而测试抑制剂生理活性的方法。此外，由于PKC-θ信号传递途径中的机制，含有任意这些氨基酸残基的生理底物可能是潜在的用于哮喘治疗中的抑制或调节的治疗靶。
实施例5当IgE受体交联到BMMC上时，发生PKC-θ激活环的可诱导性磷酸化和PKC-θ膜易位为考察PKC-θ激活环中的自身磷酸化(即538位苏氨酸上)在哮喘和过敏反应中的作用，在IgE受体在BMMC中交联后确定了PKC-θ激活环中的自身磷酸化。为了这些研究，分离了BMMC。为此，从C57Bl/6J小鼠(商业获自The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)的骨(股骨和胫骨)提取骨髓，然后以5×105细胞/ml置于DMEM中的10％HI FCS+PS/gln和50μM βME+20ng/ml重组鼠IL-3和50ng/ml重组鼠SCF(商业获自R&D Systems，Minneapolis，MN)中。每3-7天将细胞传代。4周后，培养物就是＞95％的肥大细胞(如通过IgE受体表达和c-kit表达所确定的)。此时，将细胞培养在鼠IL-3仅仅为50ng/ml的上述培养基中。将分离的BMMC用抗-DNP(二硝基苯基)IgE处理，培养过夜(大约16小时)。第二天，加入DNP-BSA到培养物中0、2、5、30和90分钟来触发IgE受体交联。接着，将处理过的BMMC在1％NP-40裂解缓冲液中裂解，将胞质溶胶提取物(按实施例1中描述所制备的)在SDS-PAGE上电泳，转移到硝酸纤维素膜上。首先用抗-磷酸T538 PKC-θ特异性抗体(Cell Signaling Technology)探查硝酸纤维素印迹，然后剥离，再用抗-PKC-θ(商业获自Santa Cruz)探查。如图10A所示，在过敏和哮喘的肥大细胞效应物功能中，发现当IgE受体交联时，PKC-θ的538位苏氨酸在骨髓衍生的粘膜肥大细胞中迅速被磷酸化(图9A)。注意到所有BMMC表达近似等量的PKC-θ，与处理方式无关(见图10B)。不象在T细胞中观察到的持续磷酸化(见图1A-1C)，发现在肥大细胞中该位点的磷酸化是迅速而短暂的(图10A)。如图10A所示，发现激活环磷酸化发生在早至IgE受体交联后2分钟，交联后30分钟恢复到基线水平。为确定IgE受体在BMMC中交联时是否发生PKC-θ膜易位，用抗-DNP IgE处理BMMC(如上所述分离的)培养过夜，加入DNP-BSA刺激0分钟、2分钟、5分钟或30分钟。然后如上面实施例1中所述将细胞裂解并分级。通过SDS-PAGE分辨膜级分、去污剂不溶的级分(DI)以及全细胞提取物(WCE)，然后转移到硝酸纤维素上。然后首先用抗-PKC-θ(Santa Cruz)探查硝酸纤维素印迹，然后剥离，再用抗-FcεRIγ亚基探查膜级分和DI级分，用抗-肌动蛋白(SantaCruz)探查WCE，以证实IgE受体(即FcεR1γ亚基)在膜和DI级分上的等量表达，并证实细胞蛋白肌动蛋白在WCE中的等量表达。如图11A所示，在交联IgE受体2分钟后可在膜级分中发现PKC-θ，在交联30分钟后就是清楚明显的了。类似地，如图11B所示，尽管在未被刺激的BMMC中(即图11B中0分钟)可观察到DI级分中低水平的PKC-θ，不过在IgE受体交联后存在的蛋白质的量就增加了。注意到在图11A和11B中显示的所有泳道中都存在等量的IgE受体。因此，类似于T细胞中的信号传递，发现当IgE受体在肥大细胞中交联时，PKC-θ迅速易位到膜的去污剂不溶的级分上。图11C证实了这个结果并不是完全因为在不同泳道中PKC-θ量的差别，因为BMMC所有泳道在它们的全细胞提取物中都具有等量的PKC-θ。
实施例6当IgE受体在BMMCs上交联时，PKC-δ和PKC-β分布并未显著改变。在IgE受体交联后，两种另外的PKC家族成员PKC-δ和PKC-β涉及肥大细胞功能的介导(Nechushtan et al.，Blood 951752-1757(2000)；Kalesnikoff et al.，J.Immunol.1684737-4746(2002)。为确定在IgE受体交联后其它PKC家族成员是否易位到BMMC膜上，将结果示于图11A-11C的实施例5中描述的实验的级分(即膜、DI和WCE级分)进行Western印迹分析，使用抗-PKC-δ(图12A)和抗-PKC-βI/βII(图12B)(两者均来自Santa Cruz Biotechnology Inc.)探查印迹的PKC-δ和PKC-β(而不是PKC-θ)。如图12A和12B所示，没有检测到PKC-β(图12A)和PKC-δ(图12B)可诱导的膜易位，因为在刺激(即IgE受体交联)之前和之后两者都等量存在于细胞液、膜和去污剂不溶的级分中。这些结果证明了PKC-θ与PKC-β和PKC-δ两者在调节肥大细胞中IgE受体信号中的重要差别。
实施例7PKC-θ敲除小鼠的肥大细胞与野生型小鼠的肥大细胞不同PKC-θ敲除小鼠的研究已经显示PKC-θ对于TCR-介导的T细胞激活是必需的(Sun et al.，Nature 404402-407(2000))。关于PKC-θ敲除小鼠的BMMC是否不同于野生型小鼠的BMMC，进行了确定。为此，根据Sun et al.，Nature 404402-407(2000)中描述的方法，获得PKC-θ敲除小鼠，证实了T细胞增殖缺陷(数据未显示)。在粘膜肥大细胞(MMC)和结缔组织肥大细胞(CTMC)两者中检查了PKC-θ缺乏的效果。这些截然不同的肥大细胞表型，颗粒体成分和介质含量、以及它们的解剖学分布都不同(参见Beil et al.，HistolHistopathol.15937-946(2000))。MMC是在肺和肠粘膜中发现的，含有高水平的蛋白酶类胰蛋白酶。它们的颗粒体富含蛋白聚糖硫酸软骨素，使得细胞能够用阿尔新蓝染色。相反，在肠、皮肤和腹膜腔中发现的CTMC表达高水平的类胰蛋白酶和糜蛋白酶两者，比MMC释放相对更高水平的组胺。它们的颗粒体含有蛋白聚糖硫酸乙酰肝素，使得它们能够用甲苯胺蓝染色，但是不能用阿尔新蓝。这两种表型上截然不同的肥大细胞亚组可能在它们的体内功能和调节方面不同(参见例如Miller and Pemberton，Immunology 105375-90(2002))，但是这些差异的确切本质仍然在研究中。为充分研究PKC-θ对肥大细胞的影响，在PKC-θ敲除小鼠中检查了每种肥大细胞亚组。MMC体外源自骨髓祖细胞。相反，CTMC能够从小鼠腹膜腔以成熟形式回收。首先，在表型上比较了野生型和PKC-θ敲除小鼠的CTMC和BMMC。为此，经腹腔灌洗分离CTMC，使用cytospin旋转到显微镜载片上，用甲苯胺蓝染色，然后用番红复染。可替代地，细胞用Wright′s-Geimsa染色。任一种染色方案都将鉴别出肥大细胞颗粒体。在腹膜肥大细胞的数量或百分比方面，或者在每个细胞的颗粒体密度或分布方面，野生型和PKC-θ敲除小鼠之间没有明显差别(数据未显示)。如实施例5所述分离野生型和PKC-θ敲除小鼠的BMMC，使用Cytospin旋转到显微镜载片上，然后用3％乙酸中的1％阿尔新蓝染色5分钟以染色颗粒体。细胞用番红复染。如图13A所示，野生型小鼠的BMMC显示出比PKC-θ敲除小鼠的BMMC更多的颗粒化。接下来，为定量IgE受体交联后BMMC中的颗粒化差异，采取了细胞表面膜联蛋白染色。细胞表面膜联蛋白染色随脱粒而增加，与颗粒体膜融合和磷脂酰丝氨酸暴露在质膜表面是一致的。为分析细胞表面膜联蛋白表达，通过用0.2μg/ml IgE抗-DNP处理过夜，将源自野生型或PKC-θ敲除小鼠的BMMC与IgE抗-DNP一起加样。第二天，收获细胞并漂洗到PACM缓冲液中。加入FITC-膜联蛋白，在37℃与细胞温育3分钟。基于时间的数据采集在配备有37℃样品室的FACScan上开始，中断以加入指定浓度的DNP-BSA诱导脱粒，然后每个样品再继续10分钟。这样，细胞在FITC-标记的膜联蛋白存在下被诱导脱粒。膜联蛋白在细胞表面的表达是脱粒时颗粒膜与细胞膜融合的标志。平均荧光密度作为时间的函数作图(图13B)。如图13B所示，与野生型相比，PKC-θ敲除小鼠的BMMC显示出脱粒时更少的细胞表面膜联蛋白染色，这与它们通过阿尔新蓝染色检验出更低的颗粒体含量是一致的(见图13A)。
实施例8PKC-θ敲除小鼠具有降低的IgE水平接着比较了CTMC上野生型和PKC-θ敲除小鼠的IgE受体的水平。为此，将野生型和PKC-θ敲除小鼠的腹膜腔用PIPES-EDTA缓冲液灌洗。将个体小鼠的未分级腹膜灌洗细胞漂洗到含有1％BSA的PBS(PBS-BSA)中，在冰上与5μg/ml IgE抗-DNP或者没有抗体温育30分钟。将细胞在PBS-BSA中漂洗，然后用FITC-标记的抗-小鼠IgE和PE-标记的抗-ckit(BD-Pharmingen)染色。平均荧光密度经流式细胞术定量。如图14A所示，与野生型相比，PKC-θ敲除小鼠具有显著降低水平的IgE结合到CTMC表面上。相反，ckit表达水平上没有什么差别(图14B)。结合到CTMC的表面IgE受体上的IgE水平与动物中的循环IgE水平相关。CTMC上肥大细胞结合的IgE的降低表明PKC-θ敲除小鼠可能具有低水平的血清IgE。此外，在野生型小鼠和PKC-θ敲除小鼠的血清抗体水平之间观察到了显著差异。就这些研究来说，分析了野生型和PKC-θ敲除小鼠的血清样品的IgE、IgG1和IgA含量。为此，用抗-小鼠IgE(商业获自Pharmingen，San Diego，CA)、抗-小鼠κ轻链(商业获自Sigma，St.Louis，MO)的IgA、或者抗-小鼠IgG(Fab-特异性的；Sigma)的IgG1包被Maxi-Sorp ELISA板(商业获自Nunc，Rochester，NY)。用含有0.05％Tween-20(PBS-Tween)的PBS漂洗板，然后用含0.5％明胶的PBS室温封闭2小时。将血清稀释液加入PBS-Tween中，室温温育2到6小时。结合的检测使用针对小鼠IgE或IgA(商业获自Southern Biotechnology Associates，Inc.，Birmingham，AL)、或者IgG1(Pharmingen)的特异性生物素化抗体，接着使用HRP-链霉抗生物素蛋白(Southern Biotechnology Associates)和Sure-Blue过氧化物酶底物(商业获自Kirkegaard and Perry Labs)。使用纯化的适当同种型的标准(Pharmingen)来定量Ig水平。这样，使用特异性ELISAs分析个体小鼠的血清样品的适当抗体同种型的水平，并通过与纯化的标准对照而定量。如图15A所示，IgE水平在PKC-θ敲除小鼠中显著降低。经常与IgE协同调节的IgG1也被降低了。相反，与野生型相比，PKC-θ敲除小鼠中的IgA水平更高(图15C)。实际上，发现了PKC-θ敲除小鼠的CTMCs具有更少的带抗-IgE的体外脱粒(数据未显示)，与降低水平的循环IgE和减少的肥大细胞结合的IgE相一致(见图14A和15A)。与PKC-θ敲除小鼠中报道的T细胞激活缺陷不同，PKC-θ敲除小鼠的BMMC中没有观察到显著的体外肥大细胞功能缺陷(数据未显示)。因为这些细胞是体外源自骨髓祖细胞的，它们不受体内IgE水平的影响，可与外源的体外IgE抗-DNP一起加样。接着进行研究以确定当IgE受体与DNP-BSA交联时，PKC-θ敲除小鼠的BMMC是否脱粒，是否产生白三烯，以及产生的细胞因子与野生型小鼠的BMMC所产生的细胞因子是否在类似水平。就这些研究来说，用下面的方法，将肥大细胞置于DMEM中的10％HI FCS+PS/gln和50μM βME+50ng/ml重组鼠IL-3+0.1μg/ml抗-DNP-IgE(Sigma)中过夜。将细胞在PACM(25mM PIPES，pH 7.2，含有110mM NaCl、5mM KCl、5mMCaCl2、2mM MgCl2和0.05％BSA)中漂洗，以终浓度2.5×105细胞/ml置于DNP-BSA滴定板(商业获自Calbiochem，San Diego，CA)上以交联IgE受体或离子霉素。就组胺、B-氨基己糖苷酶和白三烯产生的研究来说，将细胞在DNP-BSA或离子霉素存在下于37℃培养30min，然后收获上清液，立即测试或者冷冻。脱粒和白三烯产生实验的结果显示PKC-θ敲除小鼠的BMMC具有正常水平的脱粒和白三烯产生(数据未显示)。最大脱粒通过用0.1％Triton X-100裂解一份细胞来确定。就β-氨基己糖苷酶来说，将上清液与0.08M柠檬酸钠pH 4.5中的对-硝基苯基N-乙酰B-D氨基葡糖苷(Sigma)在37℃温育过夜。12-18小时后，加入1N NaOH终止反应，通过在分光光度计中读取405nm的吸收来定量β-氨基己糖苷酶。在最大脱粒时没有观察到显著差异(数据未显示)。就细胞因子产生分析来说，将在抗-DNP-IgE中培养过夜的细胞与DNP-BSA温育以触发IgE受体交联6小时，然后收获上清。使用特异于LT(C4/D4/E4)(商业获自ALPCO(Windham，NH)的ELISA分析上清液中的白三烯，或者使用特异性ELISA分析(R&DSystems，Minneapolis，MN)来分析IL-6、IL-13或GM-CSF。如图16A-16C所示，PKC-θ敲除小鼠的BMMC始终比野生型小鼠的BMMC产生更低水平的细胞因子TNF-α(图16A)、IL-13(图16B)和IL-6(图16C)。接下来，将C57BL/6小鼠(The Jackson Laboratory，BarHarbor，ME)脾制成单细胞悬液，通过抗-CD4磁珠、然后通过Detach-A-bead(Dynal Biotech)分离CD4+细胞，按照厂商用法说明进行。将细胞作为静息T细胞分析，或者激活产生效应细胞。效应细胞的产生是通过将补充了10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、5×10-5M 2-巯基乙醇、青霉素、链霉素、丙酮酸钠和非必需氨基酸(均Gibco LifeTechnologies，Invitrogen，Carlsbad，CA的子公司)的DMEM培养基中的6×105CD4+细胞/ml铺板到包被了1μg/ml抗-CD3和4μg/ml抗-CD28抗体的24-孔板中。将富含Th1的T细胞在30ng/ml rmIL-12(Wyeth，Cambridge，MA)、10U/ml rhIL-2(Invitrogen，Carlsbad，CA)和5μg/ml抗-小鼠IL-4抗体的存在下培养。将富含TH-2的T细胞在40ng/ml rmIL-4(R&D Systems，Minneapolis，MN)、10U/mlrhIL-2(Invitrogen)和5μg/ml抗-小鼠IFN-γ抗体的存在下培养。在刺激三天后，将细胞在缺少IL-2(5U/ml)下扩增另外的3-4天。将静息CD4+T细胞或者Th1或Th2效应细胞以1×105细胞/孔铺板到包被了0.5μg/ml抗-CD3(2C11)的96-孔平底板中。所有抗体均来自B-DPharMingen，San Jose，CA。3天后收获细胞培养上清，经细胞因子珠分析(FACS)分析IL-4和IL-5。如图17A和17B所示，PKC-θ敲除小鼠的T细胞细胞因子数据显示，这些小鼠产生了降低水平的两种这些细胞因子。这些结果显示，幼稚PKC-θ敲除小鼠缺乏循环IgE和IgG1水平，这与PKC-θ维持体内IL-4恒定水平的作用相一致。IL-4是Th2细胞因子，在导致IgE和IgG1合成的Ig(免疫球蛋白)基因转换中具有作用(参见Bacharier and Geha，J.Allergy Clin.Immunol.105(2Pt2)S547-58(2000)；以及Bergstedt-Lindqvist et al.，Eur.J.Immunol.181073-1077(1988))。显性失活基因构建体的T细胞表达证明PKC-θ激活了IL-4基因转录，这是与GDP/GTP交换因子Vav协同作用的(参见Hehner et al.，J.Immunol.1643829-3836(2000))。
实施例9PKC-θ敲除小鼠反应于抗-IgE、或者在存在外源IgE的PCA模型中没有耳肿的增加为确定PKC-θ是否参与IgE介导的肥大细胞激活，在呼吸道疾病小鼠模型中考察被动皮肤过敏反应(PCA)来评估PKC-θ敲除小鼠。因此，为确定PKC-θ是否与IgE介导的肥大细胞激活有关，用抗-IgE(Pharmingen；0.5μg/kg，在20μl PBS中)在左耳皮内攻击PKC-θ-/-(即PKC-θ敲除)小鼠和C57BL/6野生型对照。作为对照，动物在对侧的右耳接受20μl的PBS。在抗-IgE攻击前，使用工程测微器确定基线耳厚度，Upright Dial Gauge(商业获自Mitutoyo(日本))测量可低至.0001”。攻击之后，在1小时、2小时、4小时和6小时收集耳厚度测定值，表示为基线读数之上的增加。如图18所示，PKC-θ敲除小鼠反应于抗-IgE没有耳肿增加。实际上，在抗-IgE攻击之后，与PKC-θ敲除动物相比，野生型动物在1小时时间点的耳肿大约大2.5倍(Fig.18)。这些小鼠中降低的耳肿反应是与细胞表面和循环IgE水平相一致的。如上所述，PKC-θ缺乏导致了更少的肥大细胞颗粒(图13A-13B)和更低的IgE水平(图14A)。这些结果可能部分地是由于对调节肥大细胞功能的减弱的T细胞依赖性影响(Boyce，J.Allergy Clin.Immunol.11124-32(2003))。为提供PKC-θ是否参与IgE介导的肥大细胞信号传递，用源自PKC-θ敲除小鼠或野生型小鼠的肥大细胞选择性修复肥大细胞缺乏的KitW/KitW-v小鼠(商业获自the Jackson Laboratory)的肥大细胞缺乏。换句话说，将PKC-θ敲除小鼠或正常野生型小鼠的肥大细胞转移到KitW/KitW-v小鼠中(这种过继转移技术评述于Galli and Lantz，Allergy.InFundamental Immunology，W.E.Paul(ed.).pp.1137-1184.Lippincott-Raven Press，Philadelphia PA 1999；and William and Galli，J.Allergy Clin.Immunol.105(5)847-859(2000))。简要的说，将1×106PKC-θ敲除小鼠或野生型小鼠的BMMC重悬浮在20μlDMEM中，注入7周龄的肥大细胞缺乏的KitW/KitW-v小鼠(10只动物/组)的左右耳中(1×106BMCMC/耳)。十二周之后(使得过继转移的肥大细胞能够在结缔组织中成熟的适当时间周期)，通过皮内注射IgE抗-DNP(5μg/kg)到左耳中致敏小鼠。作为对照，动物在右耳中接受0.9％盐水。二十四小时后，静脉内用DNP-HSA(10mg/kg)攻击动物。在攻击之前以及攻击后1小时、2小时、4小时和6小时收集基线耳测定值。结果显示，用缺少PKC-θ的肥大细胞重构的KitW/KitW-v小鼠在耳肿方面，与以野生型肥大细胞重构的同样处理的KitW/KitW-v小鼠相比，没有显示出差别(数据未显示)。这些结果表明PKC-θ小鼠中的耳肿缺乏很可能是由于T细胞依赖的效应物直接和/或间接作用于其它免疫细胞类型上。一些被抑制的并影响免疫细胞功能的T细胞细胞因子包括IL-4、IL-5、TNF-α(图17A，17B，以及未显示的数据)。然而，肥大细胞数据表明PKC-θ的抑制可能直接调节肥大细胞应答。如上所探讨的，发现了当IgE受体交联时PKC-θ迅速在激活环上被磷酸化(见图10A-10B)。当IgE受体交联时，PKC-θ的亚细胞分布被改变了，而PKC-δ或PKC-βI/βII没有改变(见图11A-12B)。最重要的是，反应于IgE，由PKC-θ敲除的BMMC产生了减少的细胞因子(图16A-16C)。这些细胞是体外源自骨髓祖细胞的，不受IgE体内水平的影响。在另一实验中，在攻击前24小时，通过用单克隆IgE抗-DNP(Sigma；5μg/kg，在20μl 0.9％盐水中)皮内注射到左耳中来被动致敏PKC-θ敲除(即PKC-θ-/-)小鼠和C57BL/6野生型对照。作为对照，动物在对侧右耳中接受20μl 0.9％盐水。二十四小时后，收集基线耳测定值，然后将动物进行DNP-HSA(10mg/kg，在100μl 0.9％盐水中)静脉内攻击。在随后的6小时期间(即在攻击后1小时、2小时、4小时和6小时读数)，如上所述收集耳厚度测定值。如图19所示，PKC-θ敲除小鼠与同样处理的野生型对照相比，具有显著更小的耳肿。这些PCA研究结果(图18和19)支持了PKC-θ小分子拮抗剂在动物疾病模型中的过敏和哮喘中的用途。
实施例10与PKC-θ野生型小鼠相比，PKC-θ敲除小鼠的TH1和TH2T细胞在反应于刺激时显示出减少的增殖为确定PKC-θ敲除小鼠的分化T细胞在它们应答刺激的能力方面是否正常，将野生型和PKC-θ敲除小鼠的脾细胞体外分化为TH1或TH2群，以确定在PKC-θ不表达时T辅助细胞亚组的增殖缺陷。就这些实验来说，分离幼稚T细胞，产生TH1和TH2效应细胞。为此，将C57/B6小鼠(商业获自Taconic，Germantown，NY)的脾制成单细胞悬液。将红细胞(RBC)用RBC裂解缓冲液(0.3g/L氯化铵于0.0M Tris-HCl缓冲液pH 7.5中)裂解，漂洗两次。经抗-CD4磁性颗粒、接着经Detach-A-Bead(Dynal)，按照厂商用法说明分离CD4+细胞。将细胞作为幼稚T细胞分析，或者激活产生效应细胞。通过将处于补充了10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、5×10-5M2-巯基乙醇、青霉素、链霉素、丙酮酸钠和非必需氨基酸(均来自GibcoLife Technologies)的DMEM培养基中的6×105CD4+分离细胞/ml铺板在已包被了1μg/ml抗-CD3和4μg/ml抗-CD28的24-孔板中激活幼稚T细胞来产生效应细胞。富含TH1的T细胞(即大多数是TH1细胞的T细胞群)通过将细胞在30ng/ml重组鼠IL-12(Wyeth，Cambridge，MA)、10U/ml重组人IL-2(Invitrogen，Carlsbad，CA)和5μg/ml抗-小鼠IL4存在下培养3天而产生。富含TH2的T细胞通过将细胞在40ng/ml重组鼠IL-4(R&D Systems，Minneapolis，MN)、10U/ml重组人IL-2(Invitrogen)和5μg/ml抗-小鼠IFN-gamma存在下培养3天而产生。所有抗体均来自B-D PharMingen，San Jose，CA。就增殖分析来说，将TH1-或TH2-效应细胞以1×105细胞/0.2ml/孔铺板到已包被了各种浓度抗-CD3(2C11)的96-孔平底板中，如所示存在或不存在可溶的5μg/ml抗-CD28(克隆37.51)和/或10U/ml重组人IL-2。在第2天，用0.5μCi的[3H]胸苷(Amersham Bioscience，Piscataway，NJ)脉冲培养物，6-8小时后使用96-孔板收获机收获到过滤器上。使用液体闪烁计数器(Wallac，Gaithersburg，MD)测定掺入的放射性。所有抗体均来自B-D PharMingen，San Jose，CA。如图20和21所示，PKC-θ敲除小鼠的TH1和TH2细胞对最佳(0.5μg/ml)和亚最佳(0.05μg/ml)抗-CD3信号强度的TCR刺激(分别为图20C和图21C)以及TCR/CD28共刺激(分别为图20A和图21A)的增殖反应显著降低。外源IL-2的加入不依赖于PKC-θ的途径支持T细胞增殖部分地克服了PKC-θ敲除小鼠的幼稚TH0、TH1和TH2细胞增殖反应降低，但是只是在最佳的0.5μg/ml抗-CD3信号(图20B有抗-CD28，图20D没有抗-CD28)时与TCR/CD28共刺激协同才行。在亚最佳的0.05μg/ml抗-CD3时，CD28共刺激未能克服PKC-θ敲除小鼠细胞增殖的几乎完全缺乏(图21A)。在这些条件下只有中度的外源IL-2效应(图21B和21D)，PKC-θ敲除小鼠的TH2细胞增殖保留了野生型小鼠TH2细胞增殖的大约30％。这些结果与由PKC-θ敲除T细胞抑制IL-2产生(参见例如Sun et al.，Nature 404402-407(2000))一起，表明TCR-刺激诱导的增殖不能被TH0、TH1和TH2细胞维持，前提是PKC-θ活性在这些细胞中被抑制。连同降低的TH2细胞因子产生，这些T辅助细胞因此将不会作为最佳效应细胞起作用来介导哮喘和过敏性疾病生理学中的T细胞依赖的途径。由于这些发现，发明进一步的方面是靶向TH2 T细胞中的PKC-θ。因此，发明进一步提供了通过靶向TH2 T细胞中的PKC-θ来预防和/或减轻哮喘症状的治疗干预。尽管已经在附图和前述说明书中详细例证并描述了发明，然而同样被认为是例证性的并在性质上没有限制性，要理解的是已经显示和描述的仅仅是优选实施方案，在发明精神范围之内的所有改变和修正是期望被保护的。
序列表SEQ ID NO1GenBankNM_006257人PKC-θMSPFLRIGLSNFDCGSCQSCQGEAVNPYCAVLVKEYVESENGQMYIQKKPTMYPPWDSTFDAHINKGRVMQIIVKGKNVDLISETTVELYSLAERCRKNNGKTEIWLELKPQGRMLMNARYFLEMSDTKDMNEFETEGFFALHQRRGAIKQAKVHHVKCHEFTATFFPQPTFCSVCHEFVWGLNKQGYQCRQCNAAIHKKCIDKVIAKCTGSAINSRETMFHKERFKIDMPHRFKVYNYKSPTFCEHCGTLLWGLARQGLKCDACGMNVHHRCQTKVANLCGINQKLMAEALAMIESTQQARCLRDTEQIFREGPVEIGLPCSIKNEARPPCLPTPGKREPQGISWESPLDEVDKMCHLPEPELNKERPSLQIKLKIEDFILHKMLGKGSFGKVFLAEFKKTNQFFAIKALKKDVVLMDDDVECTMVEKRVLSLAWEHPFLTHMFCTFQTKENLFFVMEYLNGGDLMYHIQSCHKFDLSRATFYAAEIILGLQFLHSKGIVYRDLKLDNILLDKDGHIKIADFGMCKENMLGDAKTNTFCGTPDYIAPEILLGQKYNHSVDWWSFGVLLYEMLIGQSPFHGQDEEELFHSIRMDNPFYPRWLEKEAKDLLVKLFVREPEKRLGVRGDIRQHPLFREINWEELERKEIDPPFRPKVKSPFDCSNFDKEFLNEKPRLSFADRALINSMDQNMFRNFSFMNPGMERLISSEQ ID NO3人PKC-θ核苷酸1 tgctcgctcc agggcgcaac catgtcgcca tttcttcgga ttggcttgtc caactttgac61 tgcgggtcct gccagtcttg tcagggcgag gctgttaacc cttactgtgc tgtgctcgtc121 aaagagtatg tcgaatcaga gaacgggcag atgtatatcc agaaaaagcc taccatgtac181 ccaccctggg acagcacttt tgatgcccat atcaacaagg gaagagtcat gcagatcatt241 gtgaaaggca aaaacgtgga cctcatctct gaaaccaccg tggagctcta ctcgctggct301 gagaggtgca ggaagaacaa cgggaagaca gaaatatggt tagagctgaa acctcaaggc361 cgaatgctaa tgaatgcaag atactttctg gaaatgagtg acacaaagga catgaatgaa421 tttgagacgg aaggcttctt tgctttgcat cagcgccggg gtgccatcaa gcaggcaaag481 gtccaccacg tcaagtgcca cgagttcact gccaccttct tcccacagcc cacattttgc541 tctgtctgcc acgagtttgt ctggggcctg aacaaacagg gctaccagtg ccgacaatgc601 aatgcagcaa ttcacaagaa gtgtattgat aaagttatag caaagtgcac aggatcagct661 atcaatagcc gagaaaccat gttccacaag gagagattca aaattgacat gccacacaga721 tttaaagtct acaattacaa gagcccgacc ttctgtgaac actgtgggac cctgctgtgg781 ggactggcac ggcaaggact caagtgtgat gcatgtggca tgaatgtgca tcatagatgc841 cagacaaagg tggccaacct ttgtggcata aaccagaagc taatggctga agcgctggcc901 atgattgaga gcactcaaca ggctcgctgc ttaagagata ctgaacagat cttcagagaa961 ggtccggttg aaattggtct cccatgctcc atcaaaaatg aagcaaggcc gccatgttta
1021 ccgacaccgg gaaaaagaga gcctcagggc atttcctggg agtctccgtt ggatgaggtg1081 gataaaatgt gccatcttcc agaacctgaa ctgaacaaag aaagaccatc tctgcagatt1141 aaactaaaaa ttgaggattt tatcttgcac aaaatgttgg ggaaaggaag ttttggcaag1201 gtcttcctgg cagaattcaa gaaaaccaat caatttttcg caataaaggc cttaaagaaa1261 gatgtggtct tgatggacga tgatgttgag tgcacgatgg tagagaagag agttctttcc1321 ttggcctggg agcatccgtt tctgacgcac atgttttgta cattccagac caaggaaaac1381 ctcttttttg tgatggagta cctcaacgga ggggacttaa tgtaccacat ccaaagctgc1441 cacaagttcg acctttccag agcgacgttt tatgctgctg aaatcattct tggtctgcag1501 ttccttcatt ccaaaggaat agtctacagg gacctgaagc tagataacat cctgttagac1561 aaagatggac atatcaagat cgcggatttt ggaatgtgca aggagaacat gttaggagat1621 gccaagacga ataccttctg tgggacacct gactacatcg ccccagagat cttgctgggt1681 cagaaataca accactctgt ggactggtgg tccttcgggg ttctccttta tgaaatgctg1741 attggtcagt cgcctttcca cgggcaggat gaggaggagc tcttccactc catccgcatg1801 gacaatccct tttacccacg gtggctggag aaggaagcaa aggaccttct ggtgaagctc1861 ttcgtgcgag aacctgagaa gaggctgggc gtgaggggag acatccgcca gcaccctttg1921 tttcgggaga tcaactggga ggaacttgaa cggaaggaga ttgacccacc gttccggccg1981 aaagtgaaat caccatttga ctgcagcaat ttcgacaaag aattcttaaa cgagaagccc2041 cggctgtcat ttgccgacag agcactgatc aacagcatgg accagaatat gttcaggaac2101 ttttccttca tgaaccccgg gatggagcgg ctgatatcct gaatcttgcc cctccagaga2161 caggaaagaa tttgccttct ccctgggaac tggttcaaga gacactgctt gggttccttt2221 ttcaacttgg aaaaagaaag aaacactcaa caataaagac tgagacccgt tcgcccccat2281 gtgactttat ctgtagcaga aaccaagtct acttcactaa tgacgatgcc gtgtgtctcg2341 tctcctgaca tgtctcacag acgctcctga agttaggtca ttactaacca tagttattta2401 cttgaaagat gggtctccgc acttggaaag gtttcaagac ttgatactgc aataaattat2461 ggctcttcac ctgggcgcca actgctgatc aacgaaatgc ttgttgaatc aggggcaaac2521 ggagtacaga cgtctcaaga ctgaaacggc cccattgcct ggtctagtag cggatctcac2581 tcagccgcag acaagtaatc actaacccgt tttattctat cctatctgtg gatgtataaa2641 tgctgggggc cagccctgga taggttttta tgggaattct ttacaataaa catagcttgt2701 acttgllSEQ ID NO2NM_008859鼠PKC-θ氨基酸序列
MSPFLRIGLSNFDCGTCQACQGEAVNPYCAVLVKEYVESENGQMYIQKKPTMYPPWDSTFDAHINKGRVMQIIVKGKNVDLISETTVELYSLAERCRKNNGRTEIWLELKPQGRMLMNARYFLEMSDTKDMSEFENEGFFALHQRRGAIKQAKVHHVKCHEFTATFFPQPTFCSVCHEFVWGLNKQGYQCRQCNAAIHKKCIDKVIAKCTGSAINSRETMFHKERFKIDMPHRFKVYNYKSPTFCEHCGTLLWGLARQGLKCDACGMNVHHRCQTKVANLCGINQKLMAEALAMIESTQQARSLRDSEHIFREGPVEIGLPCSTKNETRPPCVPTPGKREPQGISWDSPLDGSNKSAGPPEPEVSMRRTSLQLKLKIDDFILHKMLGKGSFGKVFLAEFKRTNQFFAIKALKKDVVLMDDDVECTMVEKRVLSLAWEHPFLTHMFCTFQTKENLFFVMEYLNGGDLMYHIQSCHKFDLSRATFYAAEVILGLQFLHSKGIVYRDLKLDNILLDRDGHIKIADFGMCKENMLGDAKTNTFCGTPDYIAPEILLGQKYNHSVDWWSFGVLVYEMLIGQSPFHGQDEEELFHSIRMDNPFYPRWLEREAKDLLVKLFVREPEKRLGVRGDIRQHPLFREINWEELERKEIDPPFRPKVKSPYDCSNFDKEFLSEKPRLSFADRALINSMDQNMFSNFSFINPGMETLICS″SEQ ID NO4鼠PKC-θ核苷酸序列1 cttgggtcgc caggcccgcg ccagtccccg ccatccgagc aacagcggcg ctgctctggg61 accgcggccg cgacaccagg gaacaaccat gtcaccgttt cttcgaatcg gtttatccaa121 ctttgactgt gggacctgcc aagcttgtca gggagaggca gtgaacccct actgcgctgt181 gcttgtcaaa gagtatgtgg aatcagaaaa tgggcagatg tacatccaga aaaagccaac241 catgtaccca ccttgggaca gcacctttga cgcccacatt aacaagggaa gggtgatgca301 gatcatcgtg aagggcaaga atgtagacct catctcagaa acaaccgtgg aactctactc361 cctggcggag agatgccgca agaacaatgg gcggacagaa atatggttag agctgaaacc421 tcaaggccga atgctaatga atgcaagata ctttctggaa atgagtgaca caaaggacat481 gagtgagttt gagaatgaag gattctttgc actgcatcag cgccgaggag ccatcaaaca541 ggccaaagtc caccatgtca agtgtcacga gttcacggcc acctttttcc ctcaacccac601 attttgctct gtctgccatg aatttgtctg gggcctgaac aagcagggtt accagtgccg661 acagtgtaat gcagcgattc acaagaagtg cattgataaa gtgatagcca agtgcacagg721 atccgcaatc aatagccgag aaaccatgtt ccataaggag agattcaaga tcgacatgcc781 acacagattc aaagtctaca actacaagag tccaaccttc tgtgagcact gtggtaccct841 gctctggggg ctggcgaggc aaggactcaa atgtgatgca tgtggcatga acgtccacca901 ccgatgccag acaaaggttg ccaatctttg tggtataaac cagaagctaa tggctgaagc961 actagcgatg attgaaagca cccaacaggc tcgctcctta cgagattcag aacacatctt1021 ccgagaaggc ccagttgaaa ttggtctccc atgctccacc aaaaacgaaa ccaggccacc1081 atgcgtacca acacctggga aaagagaacc ccagggcatt tcctgggatt cccctttgga1141 tgggtcaaat aaatcggccg gtcctcctga acccgaagtg agcatgcgca ggacttcact1201 gcagctgaaa ctgaagatcg atgacttcat cctgcacaag atgttgggaa aaggaagttt1261 tggcaaggtc ttcctggcag agttcaagag aaccaatcag tttttcgcaa taaaagcctt1321 aaagaaagat gtggtgttga tggatgatga cgtcgagtgt acaatggtgg aaaagagggt
1381 tctgtccttg gcatgggagc atccatttct aacacacatg ttctgcacat tccagaccaa1441 ggaaaatctc tttttcgtga tggagtatct caatggaggc gacttaatgt accacatcca1501 aagttgccac aaatttgatc tttccagagc cacgttttat gctgctgagg tcatccttgg1561 tctgcagttc cttcattcca aaggaattgt ctacagggac ctgaagcttg ataatatcct1621 gttagacaga gatggacata tcaaaatagc agactttggg atgtgcaaag agaacatgct1681 aggagatgcg aagacaaata ctttctgtgg aactcctgac tacattgctc cggagatctt1741 gctgggtcag aagtacaacc attccgtcga ctggtggtcc ttcggggtgc tcgtttatga1801 gatgctgatt ggccagtccc ccttccacgg gcaggacgag gaggagctgt tccactccat1861 ccgcatggac aaccccttct acccgaggtg gctcgaaagg gaggccaagg accttctagt1921 gaagcttttt gtgagagaac ctgagaagag gctgggagtg agaggagaca tccgccagca1981 tcctttgttt cgagagatca actgggaaga gcttgaaagg aaagagattg acccaccctt2041 cagaccaaaa gtgaaatcac catatgactg tagcaatttc gacaaggaat tcctaagtga2101 gaaaccccgg ctatcattcg ccgacagagc actcatcaac agcatggacc agaacatgtt2161 cagcaacttt tccttcatta acccagggat ggagactctc atttgctcct gaacctcatc2221 tgtctccaga ctggaaggga tttgccttct ctctgggaac tggttcaagt aacacttctg2281 ggggtggggg tctctttttc acgttagaga agaaaagaaa cactgcaaag gcagggagga2341 ctcctgagct ccttgtgtga cttgttacct acagcacaaa ccacgcctac ttcactaatg2401 acatcatccc taatgacatc atcccgttat atctcctgga atctctcaca gcagcccttg2461 aagttagatc attattaact ctagtcattt acttgaaaga tggttcccga tgctgtgaaa2521 gattcgaaat gcagttctgc tcttgcccta gacaacagct gctggttggt gatgaaccaa2581 ggcgcaagtg gaacagattt ctcaagactg gagcagtgat cgcctgttat agaagtcaat2641 tccactcaac cacagagaag gaaccactaa gccacgttga tgtgtgcatg tctgtggaaa2701 tgtcgatgac agaagggagg gaaaggggaa gctctgagca gattgtaatg ggaagctctc2761 caataaacat agcatgaaac ttgaaattta caaatctgtt cattctggct agccccaaaa2821 ttcccaaggc agaggaaagt aaagggcagt gagcttagca gagccctttg tcgccaacag2881 ggaagggtaa ggatgtcgcc tacgtggaac aacttataca cacagaagga aagtataacc2941 aacaagggca gggtggttta cagctgccaa tcaaacctgc cctcccccct ctgttctcag3001 ttgatctctc tgtcagcgta ggtaggcact cattaccatc ctcccatcat acaagaaata3061 aaatgcatga ctcttctaag ataaagaaaa ccaatccctt atcacgttgt tcccagtgat3121 ttgatggcaa ataagtccct ccttaggcat cctgcaagac aacccaaccc atgcatgcta3181 tttgcagtag tcagtcctgt tgagttagag tcctaactat acacaatatc gtgcgatgtt3241 tatatatgtt gatgagatgt tgtgatgata acgtggatat gtaaaaggga ataaaagaag3301 aaagaaagat gccKKRFSFKKSFK(SEQ ID NO5)FARKGSLRQKN(SEQ ID NO6)CAGAATATGTTCAGGAACTTTTCCTTCATGAACCCCG(SEQ ID NO7)QNMFRNFSFMNP(SEQ ID NO8)，
GGAGATGCCAAGACGAATACCTTCTGTGGGACACCT(SEQ ID NO9)GDAKTNTFCGTP(SEQ ID NO10)，SEQ ID NO11PKCθ全长C-末端HA标记的nt序列atgtcgccatttcttcggattggcttgtccaactttgactgcgggtcctgccagtcttgtcagggcgaggctgttaacccttactgtgctgtgctcgtcaaagagtatgtcgaatcagagaacgggcagatgtatatccagaaaaagcctaccatgtacccaccctgggacagcacttttgatgcccatatcaacaagggaagagtcatgcagatcattgtgaaaggcaaaaacgtggacctcatctctgaaaccaccgtggagctctactcgctggctgagaggtgcaggaagaacaacgggaagacagaaatatggttagagctgaaacctcaaggccgaatgctaatgaatgcaagatactttctggaaatgagtgacacaaaggacatgaatgaatttgagacggaaggcttctttgctttgcatcagcgccggggtgccatcaagcaggcaaaggtccaccacgtcaagtgccacgagttcactgccaccttcttcccacagcccacattttgctctgtctgccacgagtttgtctggggcctgaacaaacagggctaccagtgccgacaatgcaatgcagcaattcacaagaagtgtattgataaagttatagcaaagtgcacaggatcagctatcaatagccgagaaaccatgttccacaaggagagattcaaaattgacatgccacacagatttaaagtctacaattacaagagcccgaccttctgtgaacactgtgggaccctgctgtggggactggcacggcaaggactcaagtgtgatgcatgtggcatgaatgtgcatcatagatgccagacaaaggtggccaacctttgtggcataaaccagaagctaatggctgaagcgctggccatgattgagagcactcaacaggctcgctgcttgagagatactgaacagatcttcagagaaggtccggttgaaattggtctcccatgctccatcaaaaatgaagcaaggccgccatgtttaccgacaccgggaaaaagagagcctcagggcatttcctgggagtctccgttggatgaggtggataaaatgtgccatcttccagaacctgaactgaacaaagaaagaccatctctgcagattaaactaaaaattgaggattttatcttgcacaaaatgttggggaaaggaagttttggcaaggtcttcctggcagaattcaagaaaaccaatcaatttttcgcaataaaggccttaaagaaagatgtggtcttgatggacgatgatgttgagtgcacgatggtagagaagagagttctttccttggcctgggagcatccgtttctgacgcacatgttttgtacattccagaccaaggaaaacctcttttttgtgatggagtacctcaacggaggggacttaatgtaccacatccaaagctgccacaagttcgacctttccagagcgacgttttatgctgctgaaatcattcttggtctgcagttccttcattccaaaggaatagtctacagggacctgaagctagataacatcctgttagacaaagatggacatatcaagatcgcggattttggaatgtgcaaggagaacatgttaggagatgccaagacgaataccttctgtgggacacctgactacatcgccccagagatcttgctgggtcagaaatacaaccactctgtggactggtggtccttcggggttctcctttatgaaatgctgattggtcagtcgcctttccacgggcaggatgaggaggagctcttccactccatccgcatggacaatcccttttacccacggtggctggagaaggaagcaaaggaccttctggtgaagctcttcgtgcgagaacctgagaagaggctgggcgtgaggggagacatccgccagcaccctttgtttcgggagatcaactgggaggaacttgaacggaaggagattgacccaccgttccggccgaaagtgaaatcaccatttgactgcagcaatttcgacaaagaattcttaaacgagaagccccggctgtcatttgccgacagagcactgatcaacagcatggaccagaatatgttcaggaacttttccttcatgaaccccgggatggagcggctgatatcctacccatacgatgttccagattacgcttagSEQ ID NO12PKCθ全长C-末端HA标记的aa序列MSPFLRIGLSNFDCGSCQSCQGEAVNPYCAVLVKEYVESENGQMYIQKKPTMYPPWDSTFDAHINKGRVMQIIVKGKNVDLISETTVELYSLAERCRKNNGKTEIWLELKPQGRMLMNARYFLEMSDTKDMNEFETEGFFALHQRRGAIKQAKVHHVKCHEFTATFFPQPTFCSVCHEFVWGLNKQGYQCRQCNAAIHKKCIDKVIAKCTGSAINSRETMFHKERFKIDMPHRFKVYNYKSPTFCEHCGTLLWGLARQGLKCDACGMNVHHRCQTKVANLCGINQKLMAEALAMIESTQQARCLRDTEQIFREGPVEIGLPCSIKNEARPPCLPTPGKREPQGISWESPLDEVDKMCHLPEPELNKERPSLQIKLKIEDFILHKMLGKGSFGKVFLAEFKKTNQFFAIKALKKDVVLMDDDVECTMVEKRVLSLAWEHPFLTHMFCTFQTKENLFFVMEYLNGGDLMYHIQSCHKFDLSRATFYAAEIILGLQFLHSKGIVYRDLKLDNILLDKDGHIKIADFGMCKENMLGDAKTNTFCGTPDYIAPEILLGQKYNHSVDWWSFGVLLYEMLIGQSPFHGQDEEELFHSIRMDNPFYPRWLEKEAKDLLVKLFVREPEKRLGVRGDI
RQHPLFREINWEELERKEIDPPFRPKVKSPFDCSNFDKEFLNEKPRLSFADRALINSMDQNMFRNFSFMNPGMERLISYPYDVPDYASEQ ID NO13；PKCθ全长K409W激酶失活C-末端HA标记的nt序列atgtcgccatttcttcggattggcttgtccaactttgactgcgggtcctgccagtcttgtcagggcgaggctgttaacccttactgtgctgtgctcgtcaaagagtatgtcgaatcagagaacgggcagatgtatatccagaaaaagcctaccatgtacccaccctgggacagcacttttgatgcccatatcaacaagggaagagtcatgcagatcattgtgaaaggcaaaaacgtggacctcatctctgaaaccaccgtggagctctactcgctggctgagaggtgcaggaagaacaacgggaagacagaaatatggttagagctgaaacctcaaggccgaatgctaatgaatgcaagatactttctggaaatgagtgacacaaaggacatgaatgaatttgagacggaaggcttctttgctttgcatcagcgccggggtgccatcaagcaggcaaaggtccaccacgtcaagtgccacgagttcactgccaccttcttcccacagcccacattttgctctgtctgccacgagtttgtctggggcctgaacaaacagggctaccagtgccgacaatgcaatgcagcaattcacaagaagtgtattgataaagttatagcaaagtgcacaggatcagctatcaatagccgagaaaccatgttccacaaggagagattcaaaattgacatgccacacagatttaaagtctacaattacaagagcccgaccttctgtgaacactgtgggaccctgctgtggggactggcacggcaaggactcaagtgtgatgcatgtggcatgaatgtgcatcatagatgccagacaaaggtggccaacctttgtggcataaaccagaagctaatggctgaagcgctggccatgattgagagcactcaacaggctcgctgcttgagagatactgaacagatcttcagagaaggtccggttgaaattggtctcccatgctccatcaaaaatgaagcaaggccgccatgtttaccgacaccgggaaaaagagagcctcagggcatttcctgggagtctccgttggatgaggtggataaaatgtgccatcttccagaacctgaactgaacaaagaaagaccatctctgcagattaaactaaaaattgaggattttatcttgcacaaaatgttggggaaaggaagttttggcaaggtcttcctggcagaattcaagaaaaccaatcaatttttcgcaatatgggccttaaagaaagatgtggtcttgatggacgatgatgttgagtgcacgatggtagagaagagagttctttccttggcctgggagcatccgtttctgacgcacatgttttgtacattccagaccaaggaaaacctcttttttgtgatggagtacctcaacggaggggacttaatgtaccacatccaaagctgccacaag tcgacctttccagagcgacgttttatgctgctgaaatcattcttggtctgcagttccttcattccaaaggaatagtctacagggacctgaagctagataacatcctgttagacaaagatggacatatcaagatcgcggattttggaatgtgcaaggagaacatgttaggagatgccaagacgaataccttctgtgggacacctgactacatcgccccagagatcttgctgggtcagaaatacaaccactctgtggactggtggtccttcggggttctcctttatgaaatgctgattggtcagtcgcctttccacgggcaggatgaggaggagctcttccactccatccgcatggacaatcccttttacccacggtggctggagaaggaagcaaaggaccttctggtgaagctcttcgtgcgagaacctgagaagaggctgggcgtgaggggagacatccgccagcaccctttgtttcgggagatcaactgggaggaacttgaacggaaggagattgacccaccgttccggccgaaagtgaaatcaccatttgactgcagcaatttcgacaaagaattcttaaacgagaagccccggctgtcatttgccgacagagcactgatcaacagcatggaccagaatatgttcaggaacttttccttcatgaaccccgggatggagcggctgatatcctacccatacgatgttccagattacgcttagSEQ I DNO14PKCθ全长K409W激酶失活C-末端HA标记的aa序列MSPFLRIGLSNFDCGSCQSCQGEAVNPYCAVLVKEYVESENGQMYIQKKPTMYPPWDSTFDAHINKGRVMQIIVKGKNVDLISETTVELYSLAERCRKNNGKTEIWLELKPQGRMLMNARYFLEMSDTKDMNEFETEGFFALHQRRGAIKQAKVHHVKCHEFTATFFPQPTFCSVCHEFVWGLNKQGYQCRQCNAAIHKKCIDKVIAKCTGSAINSRETMFHKERFKIDMPHRFKVYNYKSPTFCEHCGTLLWGLARQGLKCDACGMNVHHRCQTKVANLCGINQKLMAEALAMIESTQQARCLRDTEQIFREGPVEIGLPCSIKNEARPPCLPTPGKREPQGISWESPLDEVDKMCHLPEPELNKERPSLQIKLKIEDFILHKMLGKGSFGKVFLAEFKKTNQFFAIWALKKDVVLMDDDVECTMVEKRVLSLAWEHPFLTHMFCTFQTKENLFFVMEYLNGGDLMYHIQSCHKFDLSRATFYAAEIILGLQFLHSKGIVYRDLKLDNILLDKDGHIKIADFGMCKENMLGDAKTNTFCGTPDYIAPEILLGQKYNHSVDWWSFGVLLYEMLIGQSPFHGQDEEELFHSIRMDNPFYPRWLEKEAKDLLVKLFVREPEKRLGVRGDIRQHPLFREINWEELERKEIDPPFRPKVKSPFDCSNFDKEFLNEKPRLSFADRALINSMDQNMFRNFSFMNPGMERLISYPYDVPDYA.
FARKGSLRQ；SEQ ID NO15)KKRFSFKKSFK(SEQ ID NO16)QKRPSQRSKYL(SEQ ID NO17)KIQASFRGHMA(SEQ ID NO18)LSRTLSVAAKK(SEQ ID NO19)AKIQASFRGHM(SEQ ID NO20)VAKRESRGLKS(SEQ ID NO21)KAFRDTFRLLL(SEQ ID NO22)PKRPGSVHRTP(SEQ ID NO23)ATFKKTFKHLL(SEQ ID NO24)SPLRHSFQKQQ(SEQ ID NO25)KFRTPSFLKKS(SEQ ID NO26)IYRASYYRKGG(SEQ ID NO27)KTRRLSAFQQG(SEQ ID NO28)RGRSRSAPPNL(SEQ ID NO29)MYRRSYVFQT(SEQ ID NO30)QAWSKTTRRI(SEQ ID NO31)RGFLRSASLGR(SEQ ID NO32)ETKKQSFKQTG(SEQ ID NO33)DIKRLTPRFTL(SEQ ID NO34)APKRGSILSKP(SEQ ID NO35)MYHNSSQKRH(SEQ ID NO36)MRRSKSPADSA(SEQ ID NO37)TRSKGTLRYMS(SEQ ID NO38)LMRRNSVTPLA(SEQ ID NO39)ITRKRSGEAAV(SEQ ID NO40)EEPVLTLVDEA(SEQ ID NO41)SQKRPSQRHGS(SEQ ID NO42)KPFKLSGLSFK(SEQ ID NO43)AFRRTSLAGGG(SEQ ID NO44)ALGKRTAKYRW(SEQ ID NO45)VVRTDSLKGRR(SEQ ID NO46)KRRQISIRGIV(SEQ ID NO47)WPWQVSLRTRF(SEQ ID NO48)GTFRSSIRRLS(SEQ ID NO49)RVVGGSLRGAQ(SEQ ID NO50)LRQLRSPRRTQ(SEQ ID NO51)KTRKISQSAQT(SEQ ID NO52)NKRRATLPHPG(SEQ ID NO53)SYTRFSLARQV(SEQ ID NO54)NSRRPSRATWL(SEQ ID NO55)RLRRLTAREAA(SEQ ID NO56)
NKRRGSVPILR(SEQ ID NO57)GKRRPSRLVAL(SEQ ID NO58)QKKRVSMILQS(SEQ ID NO59)RLRRLTAREAA(SEQ ID NO60)SEQ ID NO61PELNKERP SLQIKLKIED FILHKMLGKG SFGKVFLAEF KKTNQFFAIKALKKDVVLMD DDVECTMVEK RVLSLAWEHP FLTHMFCTFQ TKENLFFVMEYLNGGDLMYH IQSCHKFDLS RATFYAAEII LGLQFLHSKG IVYRDLKLDNILLDKDGHIK IADFGMCKEN MLGDAKTNTF CGTPDYIAPE ILLGQKYNHSVDWWSFGVLL YEMLIGQSPF HGQDEEELFH SIRMDNPFYP RWLEKEAKDLLVKLFVREPE KRLGVRGDIR QHPLFREINW EELERKEIDP PFRPKVKSPFDCSNFDKEFL NEKPRLSFAD RALINSMDQN MFRNFSFMNP GMERLISSEQ ID NO62MGPELNKERP SLQIKLKIED FILHKMLGKG SFGKVFLAEF KKTNQFFAIKALKKDVVLMD DDVECTMVEK RVLSLAWEHP FLTHMFCTFQ TKENLFFVMEYLNGGDLMYH IQSCHKFDLS RATFYAAEII LGLQFLHSKG IVYRDLKLDNILLDKDGHIK IADFGMCKEN MLGDAKTNTF CGTPDYIAPE ILLGQKYNHSVDWWSFGVLL YEMLIGQSPF HGQDEEELFH SIRMDNPFYP RWLEKEAKDLLVKLFVREPE KRLGVRGDIR QHPLFREINW EELERKEIDP PFRPKVKSPFDCSNFDKEFL NEKPRLSFAD RALINSMDQN MFRNFSFMNP GMERLISSEQ ID NO63MGPELNKERP SLQIKLKIED FILHKMLGKG SFGKVFLAEF KKTNQFFAIKALKKDVVLMD DDVECTMVEK RVLSLAWEHP FLTHMFCTFQ TKENLFFVMEYLNGGDLMYH IQSCHKFDLS RATFYAAEII LGLQFLHSKG IVYRDLKLDNILLDKDGHIK IADFGMCKEN MLGDAKTNTF CGTPDYIAPE ILLGQKYNHSVDWWSFGVLL YEMLIGQSPF HGQDEEELFH SIRMDNPFYP RWLEKEAKDLLVKLFVREPE KRLGVRGDIR QHPLFREINW EELERKEIDP PFRPKVKSPFDCSNFDKEFL NEKPRLSFAD RALINSMDQN MFRNFSFMNP GMERLISHHHHHHNFSFMNPGMER(SEQ ID NO64)ALINSMDQNMFR(SEQ ID NO65)TNTFCGTPDYIAPEILLGQK(SEQ ID NO66)
权利要求
1.用于鉴别PKC-θ蛋白的调节剂的方法，包括(a)将PKC-θ蛋白或其功能性片段与测试试剂接触；以及(b)确定测试试剂是否调节PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性，其中在测试试剂存在下，PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性的变化表明PKC-θ蛋白的调节剂。
2.权利要求1的方法，其中降低激酶活性的PKC-θ蛋白的调节剂是PKC-θ蛋白或其功能性片段的抑制剂。
3.权利要求1的方法，其中增加激酶活性的PKC-θ蛋白的调节剂是PKC-θ蛋白或其功能性片段的激活剂。
4.权利要求1的方法，其中PKC-θ蛋白是全长PKC-θ蛋白。
5.权利要求1的方法，其中PKC-θ蛋白是全长PKC-θ蛋白的功能性变体。
6.权利要求1的方法，其中功能性片段是PKC-θ激酶结构域。
7.权利要求1的方法，其中确定步骤包括比较测试试剂相对于不存在测试试剂的条件下的激酶活性。
8.权利要求1的方法，其中接触步骤是通过提供PKC-θ蛋白或其功能性片段与测试试剂的反应混合物而实现的。
9.权利要求8的方法，其中反应混合物是在含有选自50mM-100mM、100-150mM、150-200mM和200-250mM以及250-300mM的浓度的NaCl的缓冲液中。
10.权利要求9的方法，其中NaCl浓度是250mM。
11.权利要求1的方法，其中PKC-θ蛋白或其片段是从原核细胞获得的。
12.权利要求11的方法，其中原核细胞是大肠杆菌。
13.权利要求1的方法，其中接触步骤是在细胞中实现的。
14.权利要求1的方法，其中PKC-θ蛋白的调节剂对于治疗哺乳动物哮喘是有用的。
15.权利要求14的方法，其中哺乳动物是人。
16.权利要求14的方法，其中哮喘是IgE-介导的哮喘。
17.权利要求1的方法，其中激酶活性是PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化。
18.权利要求17的方法，其中PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化发生在SEQ ID NO1的选自695位丝氨酸残基、685位丝氨酸残基、538位苏氨酸残基和536位苏氨酸残基的氨基酸残基上。
19.权利要求18的方法，其中自身磷酸化发生在SEQ ID NO1的538位苏氨酸残基上。
20.权利要求1的方法，其中步骤(a)进一步包括将PKC-θ蛋白或其功能性片段与测试试剂和PKC-θ底物相接触。
21.权利要求20的方法，其中激酶活性是PKC-θ底物的磷酸化。
22.权利要求20的方法，其中PKC-θ底物含有R-X-X-S基序或者R-X-X-T基序，其中R是精氨酸，X是未知的或任何已知的氨基酸，S是丝氨酸，T是苏氨酸。
23.权利要求22的方法，其中PKC-θ底物具有选自如下的氨基酸序列KKRFSFKKSFK(SEQ ID NO5)，FARKGSLRQKN(SEQ IDNO6)，FARKGSLRQ(SEQ ID NO15)，KKRFSFKKSFK(SEQ IDNO16)，QKRPSQRSKYL(SEQ ID NO17)，KIQASFRGHMA(SEQID NO18)，LSRTLSVAAKK(SEQ ID NO19)，AKIQASFRGHM(SEQ ID NO20)，VAKRESRGLKS(SEQ ID NO21)，KAFRDTFRLLL(SEQ ID NO22)，PKRPGSVHRTP(SEQ IDNO23)，ATFKKTFKHLL(SEQ ID NO24)，SPLRHSFQKQQ(SEQID NO25)，KFRTPSFLKKS(SEQ ID NO26)，IYRASYYRKGG(SEQ ID NO27)，KTRRLSAFQQG(SEQ ID NO28)，RGRSRSAPPNL(SEQ ID NO29)，MYRRSYVFQT(SEQ ID NO30)，QAWSKTTPRRI(SEQ ID NO31)，RGFLRSASLGR(SEQ IDNO32)，ETKKQSFKQTG(SEQ ID NO33)，DIKRLTPRFTL(SEQID NO34)，APKRGSILSKP(SEQ ID NO35)，MYHNSSQKRH(SEQID NO36)，MRRSKSPADSA(SEQ ID NO37)，TRSKGTLRYMS(SEQ ID NO38)，LMRRNSVTPLA(SEQ ID NO39)，ITRKRSGEAAV(SEQ ID NO40)，EEPVLTLVDEA(SEQ IDNO41)，SQKRPSQRHGS(SEQ ID NO42)，KPFKLSGLSFK(SEQID NO43)，AFRRTSLAGGG(SEQ ID NO44)，ALGKRTAKYRW(SEQ ID NO45)，VVRTDSLKGRR(SEQ ID NO46)，KRRQISIRGIV(SEQ ID NO47)，WPWQVSLRTRF(SEQ ID NO48)，GTFRSSIRRLS(SEQ ID NO49)，RVVGGSLRGAQ(SEQ IDNO50)，LRQLRSPRRTQ(SEQ ID NO51)，KTRKISQSAQT(SEQID NO52)，NKRRATLPHPG(SEQ ID NO53)，SYTRFSLARQV(SEQ ID NO54)，NSRRPSRATWL(SEQ ID NO55)，RLRRLTAREAA(SEQ ID NO56)，NKRRGSVPILR(SEQ IDNO57)，GKRRPSRLVAL(SEQ ID NO58)，QKKRVSMILQS(SEQID NO59)，和RLRRLTAREAA(SEQ ID NO60)。
24.权利要求1的方法，其中PKC-θ蛋白的调节剂使PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性降低至少两倍。
25.权利要求1的方法，其中PKC-θ蛋白或其功能性片段是在细胞中的。
26.权利要求25的方法，其中细胞选自肥大细胞和CD4+T细胞。
27.权利要求14的方法，进一步包括在体外或体内哮喘模型中评估步骤(b)中鉴别的测试试剂的效力，其中在体外或体内哮喘模型中显示出相对于对照试剂效力增加的测试试剂就被鉴别为对于治疗哮喘是有用的。
28.用于鉴别PKC-θ蛋白的调节剂的方法，包括(a)将表达PKC-θ蛋白或其功能性片段的细胞与测试试剂接触；以及(b)确定测试试剂是否减少PKC-θ蛋白或其功能性片段在细胞中的自身磷酸化，其中在测试试剂存在下，PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化的变化表明PKC-θ蛋白的调节剂。
29.权利要求28的方法，其中降低激酶活性的PKC-θ蛋白的调节剂是PKC-θ蛋白或其功能性片段的抑制剂。
30.权利要求28的方法，其中增加激酶活性的PKC-θ蛋白的调节剂是PKC-θ蛋白或其功能性片段的激活剂。
31.权利要求28的方法，其中PKC-θ蛋白是全长PKC-θ蛋白。
32.权利要求28的方法，其中PKC-θ蛋白是全长PKC-θ蛋白的功能性变体。
33.权利要求28的方法，其中功能性片段是PKC-θ激酶结构域。
34.权利要求28的方法，其中确定步骤包括比较测试试剂相对于不存在测试试剂的条件下的激酶活性。
35.权利要求28的方法，其中PKC-θ蛋白的调节剂对于治疗哮喘是有用的。
36.权利要求35的方法，进一步包括在体外或体内哮喘模型中评估步骤(b)中鉴别的测试试剂的效力，其中在体外或体内哮喘模型中显示出相对于对照试剂效力增加的测试试剂就被鉴别为对于治疗哮喘是有用的。
37.权利要求28的方法，其中细胞是原核细胞。
38.权利要求37的方法，其中原核细胞是大肠杆菌。
39.权利要求28的方法，其中PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化发生在SEQ ID NO1的选自695位丝氨酸残基、685位丝氨酸残基、538位苏氨酸残基和536位苏氨酸残基的氨基酸残基上。
40.权利要求39的方法，其中自身磷酸化发生在SEQ ID NO1的538位苏氨酸残基上。
41.治疗哮喘的方法，包括给患有哮喘或患有哮喘症状的哺乳动物施用治疗有效量的降低PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性或者减少功能性PKC-θ蛋白产生的试剂。
42.权利要求41的方法，其中试剂是在药学可接受的载体中施用的。
43.权利要求42的方法，其中载体是气雾剂形式。
44.权利要求41的方法，其中试剂是通过选自静脉内、口服、经皮以及肌肉内的途径施用的。
45.权利要求41的方法，其中试剂是经吸入施用的。
46.权利要求41的方法，其中哮喘是IgE-介导的哮喘。
47.权利要求41的方法，其中试剂是与选自β-肾上腺素能试剂、茶碱化合物、皮质类固醇、抗胆碱能剂、抗组胺剂、钙通道阻断剂以及色甘酸钠的药物共施用的。
48.权利要求41的方法，其中试剂是特异性结合PKC-θ蛋白或其片段的抗体。
49.权利要求48的方法，其中抗体是多克隆抗体。
50.权利要求48的方法，其中抗体是单克隆抗体。
51.权利要求41的方法，其中试剂是核酸分子。
52.权利要求51的方法，其中核酸分子是核糖核酸分子。
53.权利要求52的方法，其中核糖核酸分子包括与SEQ ID NO3所述核苷酸序列的部分互补的核苷酸序列。
54.权利要求41的方法，其中激酶活性是PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化。
55.权利要求54的方法，其中PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化发生在SEQ ID NO1的选自695位丝氨酸残基、685位丝氨酸残基、538位苏氨酸残基和536位苏氨酸残基的氨基酸残基上。
56.权利要求55的方法，其中PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化发生在SEQ ID NO1的538位苏氨酸残基上。
57.权利要求41的方法，其中激酶活性是PKC-θ底物的磷酸化。
58.权利要求57的方法，其中PKC-θ底物含有R-X-X-S基序或者R-X-X-T基序，其中R是精氨酸，X是未知的或任何已知的氨基酸，S是丝氨酸，T是苏氨酸。
59.权利要求58的方法，其中PKC-θ底物具有选自如下的氨基酸序列KKRFSFKKSFK(SEQ ID NO5)，FARKGSLRQKN(SEQ IDNO6)，FARKGSLRQ(SEQ ID NO15)，KKRFSFKKSFK(SEQ IDNO16)，QKRPSQRSKYL(SEQ ID NO17)，KIQASFRGHMA(SEQID NO18)，LSRTLSVAAKK(SEQ ID NO19)，AKIQASFRGHM(SEQ ID NO20)，VAKRESRGLKS(SEQ ID NO21)，KAFRDTFRLLL(SEQ ID NO22)，PKRPGSVHRTP(SEQ IDNO23)，ATFKKTFKHLL(SEQ ID NO24)，SPLRHSFQKQQ(SEQID NO25)，KFRTPSFLKKS(SEQ ID NO26)，IYRASYYRKGG(SEQ ID NO27)，KTRRLSAFQQG(SEQ ID NO28)，RGRSRSAPPNL(SEQ ID NO29)，MYRRSYVFQT(SEQ ID NO30)，QAWSKTTPRRI(SEQ ID NO31)，RGFLRSASLGR(SEQ IDNO32)，ETKKQSFKQTG(SEQ ID NO33)，DIKRLTPRFTL(SEQID NO34)，APKRGSILSKP(SEQ ID NO35)，MYHNSSQKRH(SEQID NO36)，MRRSKSPADSA(SEQ ID NO37)，TRSKGTLRYMS(SEQ ID NO38)，LMRRNSVTPLA(SEQ ID NO39)，ITRKRSGEAAV(SEQ ID NO40)，EEPVLTLVDEA(SEQ IDNO41)，SQKRPSQRHGS(SEQ ID NO42)，KPFKLSGLSFK(SEQID NO43)，AFRRTSLAGGG(SEQ ID NO44)，ALGKRTAKYRW(SEQ ID NO45)，VVRTDSLKGRR(SEQ ID NO46)，KRRQISIRGIV(SEQ ID NO47)，WPWQVSLRTRF(SEQ ID NO48)，GTFRSSIRRLS(SEQ ID NO49)，RVVGGSLRGAQ(SEQ IDNO50)，LRQLRSPRRTQ(SEQ ID NO51)，KTRKISQSAQT(SEQID NO52)，NKRRATLPHPG(SEQ ID NO53)，SYTRFSLARQV(SEQ ID NO54)，NSRRPSRATWL(SEQ ID NO55)，RLRRLTAREAA(SEQ ID NO56)，NKRRGSVPILR(SEQ IDNO57)，GKRRPSRLVAL(SEQ ID NO58)，QKKRVSMILQS(SEQID NO59)，和RLRRLTAREAA(SEQ ID NO60)。
60.不表达内源PKC-θ蛋白的分离的肥大细胞。
61.权利要求40的肥大细胞，其中细胞表达外源PKC-θ蛋白或其片段。
全文摘要
公开了对于治疗哮喘有用的试剂的方法。该方法包括筛选抑制PKC－θ蛋白产生的试剂、以及抑制PKC－θ蛋白的激酶活性的试剂、或其功能性片段，其中这些试剂对于治疗哮喘是有用的。该方法也包括筛选抑制由可操作地连接到PKC－θ启动子上的核酸序列编码的报道基因产物产生的试剂。也公开了治疗哮喘的方法，包括施用抑制功能性PKC－θ蛋白或PKC－θ蛋白的激酶活性或其功能性片段的试剂。也公开了不表达内源PKC－θ的分离的肥大细胞。
文档编号G01N33/53GK1898564SQ200480039082
公开日2007年1月17日 申请日期2004年12月22日 优先权日2003年12月24日
发明者D·乔哈里, M·卡塞安, C·威廉斯, S·马鲁西克, R·M·切尔温斯基 申请人:惠氏公司