B细胞疾病的靶的制作方法

专利名称：B细胞疾病的靶的制作方法
专利说明B细胞疾病的靶 发明领域 本发明涉及B细胞疾病如多发性骨髓瘤(MM)的诊断和治疗。特别地，本发明涉及使用与在淋巴样细胞表面上表达的游离λ轻链结合的配体治疗淋巴增生疾病。

背景技术：
多发性骨髓瘤是一种血液癌症，其中恶性细胞是最终分化的单克隆B细胞。对这种疾病的常规治疗是给予高剂量的化疗方案与或无自体干细胞移植。然而，越来越多的临床迹象表明这种治疗方案不可避免地要失败，因为肿瘤最终难以控制(Davies et a1.(2000)Eur.J.Haematol.64359-367；Ryoo et al.(2002)Blood Rev.16167-174；Kyle RA，(2001a)Oncologist 6119-124)。
目前对多发性骨髓瘤的治疗 目前对MM的治疗方法在文献中已经报道，包括多种高剂量的化疗方法(Kyle RA(2001a)Oncologist 6119-124；Kyle RA(2001b)Seminars in Hematology 38；2；3；11-14，Anderson et a1.(1999)Seminars in Hematology 36；1；3-8)。大多数MM患者在诊断时已经具有症状性疾病并需要治疗，然而一些患者无症状，一般未得到治疗直至出现症状。
小于65岁的MM患者选择的治疗方法是自体外周血干细胞移植(autologous peripheral blood stem cell transplantation，APB ST)组合化疗方法(Harousseau and Attal(2002)Blood Reviews 16；245-253)。对于65岁以上的患者或者不可进行移植的较年轻的患者优选最初只进行化疗。APBST可适用于一半以上的MM患者。尽管尝试降低移植物的肿瘤细胞污染，还是示出自体外周血干细胞通常污染了骨髓瘤细胞或其前体。这导致了恶性细胞在骨髓的重新建群(re-population)并最后导致疾病复发。
最初对有症状的MM患者的治疗是高剂量的化疗(Kyle RA，(2001a)The Oncologist 6；2；119-124；Kyle RA，(2001b)Seminarsin Hematology 38；2；3；11-14，Anderson et al.(1999)Seminars inHematology 36；1；3-8)。大多数医师治疗患者是使用长春新碱、阿霉素(Adriamycin)和地塞米松(VAD)治疗3-4个月。这导致骨髓和外周血中肿瘤细胞减少。然后给予高剂量的环磷酰胺和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。G-CSF刺激外周血干细胞(CD34+B-细胞)产生以进行自体外周血干细胞移植。在这个阶段取外周血，使用荧光活化的细胞分选仪(FACS)收集干细胞。
目前在用干细胞进行骨髓移植之前有至少两个治疗方案可以选择。在第一个情况中，给予患者高剂量的化疗和/或全身照射，随后进行APBST。或者，在干细胞收集之后可以给予患者烷化剂直至达到平台期。然后给予α2-干扰素抑制细胞生长和分裂，或者可以不予治疗直至疾病复发。在这个阶段给予患者高剂量的苯丙氨酸氮芥和/或全身照射及输注先前收集的血液干细胞。通常，给予苯丙氨酸氮芥(200mg/m2)，因为其毒性较低，而且看起来使用全身照射无益处。
在MM患者中常规化疗和高剂量化疗组合APBST的比较研究表明后者显著改善无疾病存活和总存活(Harousseau and Attal(2002)Blood Reviews 16；245-253)。目前VAD治疗随后进行APBST治疗在移植组与仅VAD处理组相对比具有更好的5年存活期(52％对12％)。可以持续化疗直至患者处于平台状态或者持续一年的化疗。如果6个月后在平台期疾病复发，则应重新制定化疗方案。尽管近来对治疗方案有所改进，但是对这些临床研究的长期追踪调查示出即使大剂量的化疗和APBST也不能消除患者中的骨髓瘤。
因此，目前的治疗是延长患者的生命而不是治愈。现在很明显这种疾病的进展与遗传不稳定性相关，更特别与参与粘附、凋亡、细胞周期、药物抗性、生长停滞、肿瘤形成、信号化和转录的基因失调相关(Zhan et al.(2002)Blood 99；5；1745-1757)。
疾病的进展是一个多步转化过程 一些研究提示多发性骨髓瘤中疾病的进展与恶性浆细胞的进展性遗传事件相关(Hallek et al.(1998)Blood 91，13-21；Avet-Loiseau et al.(2002)Blood 99；6；2185-2191；Zhan et al.(2002)Blood 99；5；1745-1757)。疾病的进展阶段看起来是由于先发生的称作未确定意义的单克隆丙种球蛋白病(monoclonal gammopathy ofundetermined significance，MGUS)的单克隆浆细胞紊乱引发的，其中所述细胞被永生化而不是转化。进展接下来的阶段是髓内骨髓瘤，发现所述细胞仅在骨髓中并且依赖骨髓间质细胞(BMSC)存活。特别地，在MM细胞和BMSC之间产生白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-6受体(IL-6R)的旁分泌环。IL-6看起来是在骨髓中建立骨髓瘤细胞最重要的细胞因子。最明显的作用是IL-6具有抑制地塞米松在骨髓瘤细胞中诱导凋亡的能力。
伴随的是骨髓瘤细胞刺激与负责骨吸收的破骨细胞，导致在MM中发现特征性的骨损害。在这个阶段之后是髓外阶段，其中细胞增殖更迅速并且在血液中生长(浆细胞性白血病，PCL)或者在其它髓外部位生长。疾病发展最后阶段是细胞完全失调，并且可以在体外增殖。
遗传异常 在细胞水平，疾病进展与和基因失调的特异例子相关的遗传异常密切相关(Hallek et al.(1998)Blood 91，1；3-21)。一些核型分析研究示出非整倍性是骨髓瘤细胞的一个共有特征，其不依赖于疾病阶段。这些研究的综述提示多发性骨髓瘤中有两类主要的遗传异常(Fonseca et al.(2004)Cancer Research 64；1546-1558)。一类是由涉及免疫球蛋白重链基因座(IgH)的易位的患者组成，这组成了骨髓瘤患者中将近一半的遗传异常。还清楚的是亚二倍体核型和染色体13单体性通常与IgH易位相关。最近已经确定了特异性IgH易位的普遍性和临床重要性，并且在Fonseca et al.(2004)Cancer Research 64；1546-1558中报道。
剩余的50％的患者似乎具有超二倍体核型，不具有IgH易位。
涉及轻链(IgL)基因的易位还未充分鉴定。一项研究表明将近10％的MGUS样品和将近20％的骨髓内MM肿瘤中存在IgL-λ易位(Fonseca et al.(2002)Blood，100；1417-1424)。IgL-κ的易位仅在少数髓内MM肿瘤中鉴别(Fonseca et al.(2004)Cancer Research 64；1546-1558)。目前，IgL易位的临床重要性还未知。
骨髓瘤细胞的单克隆蛋白质 尽管在多发性骨髓瘤中发现的核型异常很复杂，但这种疾病的实验室特点是单克隆蛋白质(M-蛋白质)的产生及分泌进血液和/或尿液中。通常，M-蛋白质是一种免疫球蛋白或者免疫球蛋白组分，其未保留正常的抗体功能。骨髓瘤细胞通常产生过量的λ或者κ轻链(本斯-琼斯氏蛋白(Bence Jones protein)，BJP)。BJP存在于细胞质中并且也分泌进血液中。它们通常以单体(22-25kD)和二聚体(50kD)形式分泌，并且足够小可以自由通过进入尿液中(Durie(2003)International Myeloma Foundation，Multiple Myeloma，ConciseReview of the Disease and Treatment Options)。
与重链不相关的膜结合λ轻链的存在提供了对骨髓瘤细胞的新治疗靶。
发明概述 本发明人鉴别了骨髓瘤细胞的新靶，其用于设计用于多发性骨髓瘤及其它B细胞疾病的诊断和治疗的方法中。这个靶是在骨髓瘤细胞表面上表达的游离λ轻链。“游离λ轻链”是指与完整的免疫球蛋白不相关的λ轻链。在骨髓瘤细胞表面上表达的游离λ轻链在本文称作λ骨髓瘤抗原(lambda myeloma antigen，LMA)。
本发明人提议的治疗方法基于将特异性结合LMA的结合部分(binding moiety)或配体给予患有B细胞疾病的对象以耗竭恶性细胞。优选地，所述配体是抗LMA抗体。本文所述的治疗方案呈现了与先前和目前治疗B细胞疾病不同的一种基本原理。
因此，本发明提供了一种治疗对象中B细胞疾病的方法，所述方法包括给予所述对象有效量的抗LMA抗体以抑制所述对象中淋巴样细胞的生长或者杀死淋巴样细胞。
本发明还提供了抗LMA抗体在制备用于治疗B细胞疾病的药物中的应用。
在本发明的一个优选实施方案中，B细胞疾病是一种淋巴增生疾病。优选地，所述淋巴增生疾病选自多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤和巨球蛋白血症。优选地，所述淋巴增生疾病是多发性骨髓瘤，更优选是λ-类型多发性骨髓瘤。
在一个特殊的实施方案中，本发明涉及一种抑制对象中淋巴样细胞生长或者杀死淋巴样细胞的方法，所述方法包括在足以使得抗LMA抗体与淋巴样细胞结合的条件下给予对象抗LMA抗体以抑制所述细胞生长或者杀死所述细胞。例如，淋巴样细胞的抑制或杀死可以通过凋亡或者通过对象的免疫细胞而实现(例如通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))。
本发明还提供了一种抑制或杀死对象中淋巴样细胞的方法，通过在足以使得LMA配体缀合物与癌细胞结合的条件下给予与细胞毒性部分或者生物学调节物(modifier)缀合的LMA配体以抑制该细胞的生长或者杀死该细胞。
在本发明的一个优选实施方案中，所述淋巴样细胞是骨髓瘤细胞。
本文所用术语“LMA配体缀合物”是指与细胞毒性部分或者生物学调节物缀合的LMA配体。
所述LMA配体可以是经鉴别具有LMA结合亲和性的任何多肽或者化合物。配体与LMA之间的结合可以通过共价或者非共价相互作用或者共价和非共价相互作用的组合而介导。当配体与LMA的相互作用产生非共价结合的复合物时，发生的结合典型是静电相互作用、氢键或者是亲水性/亲脂性相互作用的结果。特别优选的LMA配体是抗LMA抗体。
在一个实施方案中，所述细胞毒性部分是一种毒素(可以是光激活的毒素)、化疗剂或者放射性制剂。
所述细胞毒性部分的非限制性例子可以是细胞毒性药物或者细菌或者植物来源的酶促活性毒素(如gelonin)，或者这种毒素的酶促活性片段(A链)。优选酶促活性毒素及其片段，例如gelonin、白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、莫迪素(modeccin)A链、α-八叠球菌、油桐(Aleuritesfordii)蛋白、康乃馨蛋白(dianthin)、Phytoiacca americana蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、石碱草(saponaria officinalis)抑制剂、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素和伊诺霉素。
用于本发明的细胞毒性药物包括但不限于阿霉素(及其衍生物)、顺铂(cis-platinum)复合物(及其衍生物)、博来霉素和氨甲蝶呤(及其衍生物)。这些细胞毒性药物有时用于临床处理再发肿瘤及特别用于乳腺癌，但其应用伴随严重的副作用和导致非靶细胞的损害。抗LMA抗体可作为这种药物的有用载体，是可以将药物输送至癌细胞并增强进入癌细胞中的有效手段。
细胞毒性部分也可以是放射性制剂。特别地，所述细胞毒性部分可以是放射性核素如钇-90(90Y)、铟-111(111In)、碘-131(131I)或者铜-67(67Cu)。
可以与LMA配体偶联并用于本发明中的生物学应答调节物包括但不限于淋巴因子和细胞因子如IL-2和干扰素(α、β或者γ)。这些生物学应答调节物对肿瘤细胞具有多种作用。这些作用包括通过直接作用增加肿瘤杀伤以及通过增加宿主防御作用介导的过程增加肿瘤细胞杀伤。LMA配体与这些生物学应答调节物的缀合可以选择性定位于淋巴样细胞内，并因此改善抗增殖作用同时抑制导致非靶细细胞毒性的非特异性作用。
包含LMA配体的缀合物可以使用多种双功能蛋白质偶联剂制备。这种试剂的例子是SPDP、IT、亚氨酸酯的双功能衍生物如二甲基己二酰亚胺盐酸(dimethyl adipimidate HCl)，活性酯如二琥珀酰亚氨基辛二酸酯，醛如戊二醛，二-叠氮基化合物如二(p-叠氮苯甲酰基)己二胺、双-重氮基衍生物如双-(p-重氮苯甲酰基)-乙二胺，二异氰酸酯如甲代亚苯基2，6-二异氰酸酯及双活性氟化合物如1，5-二氟-2，4-二硝基苯。
在另一个实施方案中，所述细胞毒性部分是编码细胞毒性制剂的核酸分子。在这个实施方案中，LMA配体作为载体将编码胞毒剂的治疗基因导入LMA+细胞如骨髓瘤细胞中，所述基因例如毒素基因如白喉毒素-A、凝集素、假单胞菌外毒素A、石碱草SO-6(SoriaM，(1989)Pharmacol.Res.，21 Suppl 235-46)或者蓖麻毒蛋白；细胞自杀基因如胸苷激酶或者硝基还原酶；激活化疗基因的蛋白质如gangcyclovir或者丝裂霉素C；核酶，RNase，或者反义序列(例如BCL2序列)。优选地，由治疗性基因编码的胞毒剂的极少量分子的表达即足以杀死表达该基因的细胞。优选所述治疗性基因与细胞或者组织特异性转录单位可操纵地连接，例如与细胞或者组织特异性启动子和/或增强子可操纵地连接。优选的转录单位是指导在如下细胞中表达的那些转录单位B细胞(例如如下基因的转录单位Ig重链基因、Igκ基因、Igλ基因、BCL-6基因(Dalla Favera et al.，C.S.H.Smp.Quant.Biol.，59，117(1994))、CD19基因、CD20基因或者CD22基因(Kerhl et al.，Immunol.Today，15，432(1994))、T细胞(例如如下基因的转录单位IL-4基因、IL-2基因、IL-2R基因、T细胞受体基因、IL-5基因、IL-13基因、GM-CSF基因和Fas配体基因(Nagata et al.，Prog.Mol.Subcell.Biol.，16，87(1996))或者髓样细胞。髓样特异性转录单位包括但不限于在美国专利No.5,502,176揭示的那些转录单位，以及如下基因的转录单位PU.1基因(Fisher etal.，Stem Cells，16，25(1998))、CD11c或者CD18基因(Corbi etal.，Leuk.& Lymph.，25，415(1997))、IgH增强子、CSF受体G、GM和/或G基因(Zhang et al.，Cur.Top.Micro.& Immunol.，211，137(1996))、或者C/EBP、Runt/PEBP2/CBF或者Ets基因(Clarke etal.，J.Leuko，Biol.，63，153(1998))。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法进一步包括在给予抗LMA抗体或者LMA配体缀合物之前处理对象以降低对象体液中存在的游离λ轻链水平的步骤。优选地，对象血清中存在的游离轻链水平被降低。血清中游离轻链水平的降低可以通过例如化疗或者血浆置换术实现，或者通过其中LMA配体(如抗LMA抗体)与固体支持物(例如无菌滤膜)结合并用于从体液中捕获游离λ轻链的方法而实现。优选降低对象体液中游离轻链水平的处理就在给予抗LMA抗体或者LMA配体缀合物之前进行。
本发明还提供了一种从分离的细胞样品例如但不限于骨髓细胞中除去淋巴样细胞的方法，通过在所述淋巴样细胞与所述抗体或者缀合物结合的条件下将细胞样品暴露于抗LMA抗体或者LMA配体缀合物，并分离与所述抗体或缀合物不结合的所述细胞样品的细胞级分。这种方法可用于例如从骨髓样品中除去骨髓瘤细胞以进行自体骨髓移植。
本发明还提供了一种用于在对象中自体造血细胞移植的方法，所述方法包括 (i)从对象中移出造血祖细胞群(hematopoietic progenitor cellpopulation)， (ii)用抗LMA抗体或者LMA配体缀合物处理该细胞群，及 (iii)将步骤(ii)处理的细胞群移植进对象体内。
用抗LMA抗体或者LMA配体缀合物处理祖细胞群的步骤优选包括将所述细胞群与抗LMA抗体或者LMA配体缀合物在足以使得抗LMA抗体或者LMA缀合物与细胞群中存在的淋巴样细胞结合的条件下接触以抑制所述淋巴样细胞的生长或杀死所述淋巴样细胞。
在一个优选的实施方案中，所述方法还包括将抗LMA抗体或者LMA配体缀合物静脉内输注进对象。
在另一个优选的实施方案中，自体移植的方法是在细胞减数治疗(cytoreductive therapy)期间或之后进行的。
在另一个优选的实施方案中，抗LMA抗体或者LMA配体缀合物与一种固体支持物结合。
在本发明的另一方面，上述缀合物或者抗LMA抗体可用于在体外抑制细胞样品如骨髓样品中淋巴样细胞的生长或者杀死该细胞。
本发明还涉及抗独特型抗体(anti-idiotypic antibody)，其反映抗LMA抗体的结合位点，并特异于抗体识别的构象表位。本发明进一步涉及这些抗独特型抗体通过主动免疫在治疗B细胞疾病中的应用。
在本发明的另一方面，提供了一种在对象中定位淋巴样细胞的方法，通过给予抗LMA抗体或者LMA配体，使得所述抗体或配体与对象体内的细胞结合，并确定所述抗体或配体在对象内的位置。在这方面的一个优选实施方案中，所述抗体或配体是用例如放射性核素、荧光团、生色团或酶可检测地标记的。
可用于产生标记的配体的标记物包括可以直接检测的部分，如荧光染料和放射性标记，以及必须经过反应或者衍生化才可以检测的部分，如酶。这种标记的例子是32P、125I、3H、14C、荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮、萤光素(luciferia)、2，3-dihydrophthalzainediones、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、溶菌酶、及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。所述配体可以用这种标记通过已知方法进行标记。例如，偶联剂如醛、碳二亚胺、二马来酰亚胺、亚氨酸酯、琥珀酰亚胺、bis-diazotized benzadine等等可以用于将配体与上述荧光标记、化学发光标记和酶标记偶联。
本发明另一方面提供了一种与细胞毒性部分或者生物学调节物缀合的抗LMA抗体。在这方面的一个实施方案中，所述细胞毒性部分是一种毒素、光激活的毒素、化疗剂或者放射性制剂。
在这方面的另一个实施方案中，所述细胞毒性部分是一种核酸分子。因此，本发明提供了导入宿主哺乳动物中的一种治疗组合物，其选择性靶定LMA细胞表面分子，但是作为治疗基因其免疫原性降低或者无免疫原性，优选是环形DNA如质粒DNA形式，而不是免疫原性蛋白质形式。结果，可以将该治疗组合物重复给予哺乳动物，例如骨髓瘤对象，而不产生明显的抗体应答，特别是对该治疗基因编码的细胞毒性制剂的应答。另外，本发明的治疗组合物用于杀死具有其它LMA+血浆增殖性疾病如B细胞淋巴瘤和巨球蛋白血症的对象中的细胞。优选地，用于人体的所述组合物中融合多肽的抗体部分是人源化形式。
另一方面，本发明涉及一种用可检测的部分标记的抗LMA抗体，所述可检测的部分的非限制性例子是荧光团、生色团、放射性核素或酶。
再一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明的抗LMA抗体及一种药物可接受的载体、稀释剂或者赋形剂。
本发明还涉及一种与固体支持物结合的抗LMA抗体或者LMA配体/细胞毒素。
在本发明的一个优选实施方案中，所述抗LMA抗体是一种嵌合抗体或者人源化抗体。
在本说明书中，单词“包含”是指一个指定的元件、整数或步骤，或者一组元件、整数或步骤，但不排除任何其它元件、整数或步骤或一组元件、整数或步骤。
上述各个部分中提到的本发明的不同特征和实施方案在进行适当的修饰后可以用于其它的部分。因此，一个部分中描述的特征可以与其它部分中的特征组合。
附图简述

图1通过ELISA对mAb与游离λ轻链结合的分析。将mAbL7(A)、mab1306(B)和ME 154(C)与固定在ELISA平板上的抗原-起保温，所述抗原由人λ轻链(λLC F、λLC H、λLC K和λLC Q，单体(mon)和二聚体(dim)两种形式)、混杂的(pooled)正常人IgGλ(Hu IgGλ)和游离的人κ轻链(κLC)组成。结合的mAb使用抗小鼠IgG-AP缀合物检测。抗体-抗原复合物通过pNPP酶反应进行观测，在405nm测定吸光度。
图2通过表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)对mAb与游离λ轻链结合的分析。将mAb L7(A)和mab1306(B)固定在Biacore CM5-葡聚糖芯片上。使抗原通过固定的mAb，所述抗原由人λ轻链(Lam F、Lam H、Lam K、Lam L、Lam Q，单体(mon)和二聚体(dim)两种形式)、混杂的正常人IgGλ(Lambda IgG)和游离的人κ轻链(κLC)组成。抗体-抗原结合使用Biacore 2000 Biosensor通过SPR测定。
图3抗λmAb与LP-1骨髓瘤细胞的结合。将LP-1λ骨髓瘤细胞(5×105)与50μL的100μg/mL mAb L7(A)、mab1306(B)或者ME154(C)在冰上保温30分钟。然后将细胞洗涤两次，与PE-标记的山羊抗小鼠F(ab’)2保温，洗涤，通过流式细胞计量术进行分析。实心灰色柱状图代表与不相关的mAb及随后与PE标记的山羊抗小鼠F(ab’)2保温的细胞。
图4与游离λLC的预保温抑制mAb L7与LP-1细胞的结合。将mAb L7(100μg/mL)与200-800μg/mL浓度的游离λ(λF LC、A或者λH LC、B)或者κ轻链(κLC)在37℃预保温30分钟。然后将细胞与被抑制的L7在冰上保温30分钟，洗涤两次并与PE-标记的山羊抗小鼠F(ab’)2保温。洗涤两次后，通过流式细胞计量术分析细胞。实心的灰色柱状图代表与抗κLC mAb(阴性对照)、随后与PE标记的山羊抗小鼠F(ab’)2保温的细胞。
图5通过Western印迹对LP-1λ骨髓瘤细胞表面上游离λLC抗原的鉴别。将LP-1细胞在40mM Tris中裂解，在非还原条件下分离细胞质和膜结合蛋白质级分。级分通过12％SDS-PAGE分离，移至硝化纤维素膜上。在用BSA封闭膜后，使用抗λmAbs L7(A)、mab1306(B)或者ME 154(C)检测λ轻链。图中左侧的数字表示大约的分子量(kDa)。
图6与λ轻链结合的mAb诱导对LP-1骨髓瘤细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。将PKH-26标记的LP-1骨髓瘤细胞与7nM(1μg/mL)或者0.7nM mab 1306(黑色条柱)或者ME 154(阴影条柱)在存在IL-2刺激的鼠NK细胞的条件下保温。16小时后，使用流式细胞计量仪通过TO-PRO-Iodide 3荧光检测死亡的LP-1细胞，计算死亡的LP-1细胞的百分比。为了对照抗体非依赖性细胞介导的细胞毒性(AICC)，将LP-1细胞在存在NK效应细胞的条件下在没有抗体的PBS(空心条柱)中保温(误差条柱示出一式三份SEM)。
发明详述 通用技术 除非特别说明，本文使用的所有技术和科学术语均与本领域技术人员通常理解的含义一致(例如细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学领域)。
除非特别指出，本发明利用的重组蛋白质、细胞培养和免疫学技术均为本领域技术人员熟知的标准程序。这种技术在例如如下文献中描述和阐述J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley and Sons(1984)，J.Sambrook et a1.，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)，T.A.Brown(editor)，Essential Molecular BiologyA PracticalApproach，Volumes 1 and 2，IRL Press(1991)，D.M.Glover and B.D.Hames(editors)，DNA CloningA Practical Approach，Volumes 1-4，IRL Press(1995 and 1996)，和F.M.Ausubel et a1.(editors)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括最新的补充资料)，Ed Harlow and DavidLane(editors)AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarbourLaboratory，(1988)，及J.E.Coligan et al.(editors)Current Protocols inImmunology，John Wiley & Sons(包括最新的补充资料)，在此所述文献并入参考。
LMA配体和抗LMA抗体 本发明人首次揭示了游离λ轻链(LMA)在骨髓瘤细胞表面上表达。针对LMA的抗体通过如ADCC、补体依赖性裂解及凋亡等机制能杀死λ-型骨髓瘤细胞，并因此是对抗λ-型骨髓瘤细胞的有效治疗剂。另外，针对LMA的配体可用于将细胞毒素直接输送至恶性细胞。
本领域技术人员已知λ-型免疫球蛋白由4条多肽链组成，其中两条是重链(每条大约50-70kD)，两条是λ轻链(每条大约26kD)。每条链的N末端是主要负责抗原识别的大约100-110或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VM)分别指这些轻链和重链。编码λ轻链的基因的装配包括在λ轻链基因座的V、J和C基因节段的重排(见Chapter 5，″Organization and Expression ofImmunoglobulin Genes″in Kuby Immunology，4th ed，Goldsby et a1.(Freeman，2000))。
因此，本文使用的术语“LMA”涵盖了与衍生自λ-型免疫球蛋白的轻链相等的任何游离λ轻链。该术语因此涵盖了其可变区序列不同的一系列λ轻链多肽。
在本发明的一个优选实施方案中，所述LMA单体形式为大约26kD，二聚体形式为大约52kD。
本发明使用的LMA配体可以是经鉴别与LMA具有结合亲和性的任何多肽或化合物。当LMA是膜结合或者分离状态(例如没有膜)时，LMA配体优选能结合LMA。特别优选的LMA配体是抗LMA抗体。
尽管不是必需的，但LMA配体可以特异性结合LMA。术语“特异性结合”是指在特定条件下，LMA配体结合LMA而不以显著量结合其它蛋白质或者碳水化合物。在这种条件下的特异性结合LMA可需要根据其特异性选择的抗体。可以使用多种免疫分析选择与LMA特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫分析通常用于选择与蛋白质或碳水化合物特异性免疫反应的抗体。见Harlowand Lane(1988)Antibodies，a Laboratory Manual，Cold Spring HarborPublications，New York，其描述了可用于确定特异性免疫反应性的免疫分析形式和条件。
本领域技术人员已知抗LMA抗体。例如，针对LMA的抗体已经用于检测血清或尿液中的游离λ轻链以诊断多发性骨髓瘤(Bradwell et al.，(2001)Clin.Chem.47673-680)。然而，LMA目前还未用于作为治疗多发性骨髓瘤或者定位患者骨髓瘤细胞的靶。
合适的抗LMA抗体的例子包括RDI-TRK1L7-3D1(RDI；Flanders，NJ，USA)、CBL317(Cymbus Biotechnology Ltd，UK)、2G7(Nakano and Nagata(2003)J Immunol Methods 275；9-17)、L7或者ME-154(AbCam Ltd(Cambridge，UK)或者mAb1306(ChemiconInternational，Australia)。
抗体可以完整的免疫球蛋白形式存在，或者以多种修饰形式存在，包括例如，结构域抗体包括VH或VL结构域、重链可变区的二聚体(VHH，如针对camelid所述)、轻链可变区的二聚体(VLL)、仅含有轻链和重链可变区的Fv片段或者含有重链可变区和CH1结构域的Fd片段。scFv由重链和轻链的可变区组成，连接在一起形成单链抗体(Bird et al.，Science，242424-426(1988)；Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，855879-5883(1988)，这两篇文献并入本文作参考)，术语“抗体”也涵盖了scFv的寡聚体如二元体(diabodies)和三元体(triabodies)。该术语也涵盖了抗体片段，如含有可变区和部分恒定区的Fab、(Fab′)2和FabFc2片段。该术语还涵盖了CDR-移植(CDR-grafted)抗体片段和抗体片段的寡聚体。Fv的重链和轻链成分可以衍生自相同或不同的抗体，从而产生嵌合的Fv区域。抗体可以是动物(尤其是小鼠或大鼠)或者人源的，或者可以是嵌合的(Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，6851-6855(1984)，并入本文作参考)或者是人源化的(Jones et al.，Nature，321，522-525(1986)，及公布的UK专利申请#8707252，均并入本文作参考)。本文所用术语“抗体”包括这些变化形式。使用本文提供的指导及上文引用的参考文献及如Harlow & Lane，Antibodiesa LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，(1988)这种出版物中描述的本领域技术人员熟知的那些方法，可以容易地产生本发明的抗体。
LMA-结合抗体可以是包含可变轻链(VL)和可变重链(VH)的Fv区域。所述轻链和重链可以直接结合或者通过接头结合。如本文所用，“接头”是指与轻链和重链共价连接的分子，在这两条链之间提供足够的间距和灵活性，由此能达到可以特异性结合其针对的表位的构象。特别优选蛋白质接头，因为它们作为融合多肽的Ig部分的固有成分而表达。
本发明的另一个优选实施方案是重组产生的单链scFv抗体，优选人源化的scFv。
编码抗体或其片段的基因的制备 编码抗体的基因、轻链和重链基因或其部分，例如单链Fv区域，可以克隆自杂交瘤细胞系。它们均可以使用相同的一般策略而克隆。典型地，例如，使用随机六聚体作为引物将从杂交瘤细胞中提取的poly(A)+mRNA逆转录。对于Fv区域，VH和VL结构域分别通过两个聚合酶链反应(PCR)扩增。重链序列可以使用5’末端引物和3’末端引物扩增，所述5’末端引物是根据抗LMA重链的氨基末端蛋白质序列设计的，3’末端引物是根据共有的免疫球蛋白恒定区序列设计的(Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest.5th edition.U.S.Department of Health and Human Services，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)，并入作参考)。轻链Fv区域使用5’末端引物组合引物C-kappa扩增，所述5’末端引物是根据抗LMA轻链的氨基末端蛋白质序列设计的。本领域技术人员意识到可以应用许多合适的引物获得Fv区域。
将PCR产物亚克隆进合适的克隆载体中。通过DNA限制鉴别含有正确大小插入体的克隆。然后使用与克隆位点相邻的测序引物，可以从双链质粒DNA中确定重链或轻链编码区的核苷酸序列。可以使用商购的试剂盒(例如the Sequenase.TM.kit，United StatesBiochemical Corp.，Cleveland，Ohio，USA)对DNA进行测序。
因此，编码Fv区域的DNA可以通过任何合适方法制备，包括例如扩增技术，如连接酶链反应(LCR)(见Wu and Wallace，Genomics，4560(1989)，Landegren，et al.，Science，2411077(1988)和Barringer，et al.，Gene，89117(1990))、转录扩增(见Kwoh，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，861173(1989))及自身持续序列复制(见Guatelli，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，871874(1990))，合适序列的克隆和限制或者通过如下方法直接化学合成如Narang et al.，Meth.Enzymol.6890-99(1979)的磷酸三酯方法；Brown et al.，Meth Enzymol.68109-151(1979)的磷酸二酯方法；Beaucage et al.，Tetra.Lett.，221859-1862(1981)的二乙基亚磷酰胺方法；及美国专利No.4,458,066的固体支持物方法，本段中的所有这些参考文献均并入本文参考。
化学合成方法产生单链寡核苷酸。其可以通过与互补序列杂交而转变为双链DNA，或者通过使用该单链作为模板与DNA聚合酶聚合而转变为双链DNA。虽然可以化学合成一整条的单链Fv区域，但优选合成许多较短的序列(大约100-150个碱基)，随后连接在一起。
或者，可以克隆亚序列并使用合适的限制酶切割合适的亚序列。然后连接片段以产生所需的DNA序列。
一旦获得Fv可变轻链和重链DNA，可以直接或者通过编码肽接头的DNA序列将该序列连接在一起，使用本领域技术人员熟知的技术进行。在一个实施方案中，重链和轻链区域通过一个灵活性肽接头(例如(Gly4Ser)3)连接，所述接头起自重链Fv结构域的羧基末端，终于轻链Fv结构域的氨基末端。完整的序列编码单链抗原结合蛋白质形式的Fv结构域。
细胞毒性部分 用于本发明的合适的细胞毒性部分包括但不限于制剂，如细菌或者植物毒素，药物例如环磷酰胺(CTX；cytoxan)、苯丁酸氮芥(CHL；leukeran)、顺铂(CisP；CDDP；platinol)、白消安(myleran)、苯丙氨酸氮芥、亚硝脲氮芥(BCNU)、链脲菌素、曲他胺(TEM)、丝裂霉素C及其它烷化剂；氨甲蝶呤(MTX)、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(VP-16；vepesid)、6-巯基嘌呤(6MP)、6-硫代鸟嘌呤(6TG)、阿糖胞苷(Ara-C)、5-氟尿嘧啶(5FU)、达卡巴嗪(dacarbazine，DTIC)、2-氯脱氧腺苷(2-CdA)及其它抗代谢物；抗生素，包括放线菌素D、阿霉素(DXR；adriamycin)、道诺霉素、博来霉素、光神霉素以及其它抗生素；生物碱，如长春新碱(VCR)、长春花碱等等；以及其它抗癌制剂，包括抑制细胞生长制剂糖皮质激素类，如地塞米松(DEX；decadron)及皮质类固醇类，如强的松，核苷酸酶抑制剂，如羟基脲等等。
本领域技术人员认识到有许多其它放射性同位素和化学细胞毒性制剂可以通过熟知技术与LMA配体偶联并输送以特异性破坏肿瘤组织。见例如Blattler等的美国专利No.4,542,225所述。光激活的毒素的例子包括二氢吡啶-和Ω-芋螺毒素(Schmidt et al.，J Biol.Chem.，1991，266(27)18025-33)。可以使用的成像和细胞毒性试剂的例子包括125I、131I、111In、123I、99mTc、32P、3H和14C；荧光标记如荧光素和罗丹明，及化学发光物如萤光素。抗体可以使用这种试剂利用本领域已知的技术进行标记。例如，见Wenzel and Meares，Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy，Elsevier，N.Y.(1983)关于放射性标记抗体的技术(也见于Colcer et al.，″Use of MonoclonalAntibodies As Radiopharmaceuticals For The Localization Of HumanCarcinoma Xenografts In Nude Mice″，Methods Enzymol.，121802-16，1986″Order，Analysis，Results and Future Prospective of theTherapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy″，inMonoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy，Baldwin etal.(eds)，pp.303-16(Academic Press 1985))。
在一个实例中，通过稳定的硫脲共价键将接头-螯合剂tiuexutan与LMA配体缀合，提供铟-111或者钇-90的高亲和性螯合位点。
当本发明的治疗组合物中存在编码胞毒剂的DNA分子时，所述DNA优选编码是细菌或者植物毒素的多肽。这些多肽包括但不限于天然或修饰的假单胞菌外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、gelonin、木鳖子皂苷II、细菌RIP如志贺(shiga)和志贺样毒素a-链、丝瓜籽毒蛋白(luffin)[见Islam et al.，Agricultural Biological Chem.，54(5)1343-1345(1990)]、atrichosanthin[见Chow et al.，J.Biol.Chem.，2658670-8674(1990)]]、木鳖子皂苷I[见Ho et al.，BBA，1088311-314(1991)]、紫茉莉抗病毒蛋白(Mirabilis anti-viral protein)[见Habuka et al.，J.Biol.Chem.，264(12)6629-6637(1989)]、美洲商陆抗病毒蛋白[见Kung et al.，Agric.Biol.Chem.，54(12)3301-3318(1990)]、byodin 2(美国专利No.5,597,569)、gaporin[见Benatti et al.，Eur.J.Biochem.，183465-470(1989)]以及其遗传工程化变体。天然PE和DT是高毒性化合物，其典型通过肝毒性而致死。优选地，将PE和DT修饰为除去毒素天然靶定成分(例如PE的Ia结构域及DT的B链)的形式。本领域技术人员意识到本发明不限于特定的胞毒剂。
本文所用术语“假单胞菌外毒素”(PE)是指全长天然(天然存在的)PE或者经修饰的PE。这种修饰可包括但不限于消除结构域Ia、结构域II和III中的多种氨基酸缺失、单一氨基酸取代(例如在第590和606位用Gln置换Lys)及在羧基末端加入一或多个序列。见Siegall et al.，J.Biol.Chem.，26414256-14261(1989)所述。因此，例如PE38是指由253-364和381-613氨基酸组成的截短的假单胞菌外毒素。PE的天然C末端，REDLK(残基609-613)，可以用序列KDEL、REDL置换，Lys-590和Lys-606均突变为Gln。
本文所用术语“白喉毒素”(DT)是指全长天然DT或者经修饰的DT。修饰典型包括除去B链中的靶定结构域，更特别包括B链羧基区域的截短。
抗体融合多肽的制备 一旦已经鉴别了编码LMA结合部分(例如抗LMA抗体片段)的DNA序列，则可以通过本领域技术人员已知的方法制备包含该区域的融合多肽。例如，将编码Fv区域的基因与编码细胞毒性部分的基因融合，优选所述部分是一种多肽。任选地，Fv基因与编码肽连接物(connector)的一个节段连接。所述肽连接物可以只是间隔LMA结合部分与细胞毒性部分，或者促进这些区域之间的活动性以使得它们达到其最佳构象。包含连接物的DNA序列也可以提供序列(如引物位点或者限制位点)以便于克隆或者可以保持编码结合部分的序列与编码细胞毒性部分的序列之间的读框。这种连接物肽的设计为本领域技术人员所熟知。
通常，产生融合多肽包括单独制备Fv轻链和重链及编码与之融合的任何其它蛋白质的DNA，将DNA序列在质粒或其它载体中重组以形成编码特定所需的融合多肽的构建体。然而，一种较简便的方法包括将编码特定Fv区域的DNA插入已经编码所需另一多肽的构建体中。使用本领域技术人员熟知的技术将编码Fv区域的DNA序列插入构建体中。
本发明的一个实施方案是一种融合多肽，其包含与DNA结合多肽结合的重组产生的、包含VH和CH或其部分的抗体。所述融合多肽和包含VL和CL或其一部分的抗体一起形成一种重组抗体，用于将预先选择的线性或环形DNA分子靶向携带预先选择的靶分子的细胞或组织。
本发明的另一个优选实施方案是重组产生的单链scFv抗体，优选人源化的scFv。特别地，本发明提供了与DNA结合多肽结合的重组单链抗体，因为这些抗体具有特异性结合DNA的能力，因此用作靶定部分以将与DNA结合多肽结合的DNA靶向携带LMA的细胞或组织。
通过本领域技术人员已知的及可利用的任何方法，可以将本发明的重组单链抗体与细胞毒素或者具有特定活性的其它分子融合或者结合。这两种成分可以通过多种熟知的化学程序化学键合在一起。例如，通过异源双功能交联剂连接，例如SPDP、碳二亚胺、戊二醛等等。多种免疫毒素的产生以及化学缀合方法为本领域所熟知，可见于例如Monoclonal Antibody-Toxin ConjugatesAiming theMagic Bullet，Thorpe et al.，Monoclonal Antibodies in ClinicalMedicine，Academic Press，pp.168-190(1982)；Waldmann，Science，2521657(1991)；Vitetta et al.，1987，Science，2381098；Pastan et al.，1986；Cell，47641；及Thorpe et al.，1987，Cancer Res.，475924所述，所述文献在此并入作参考。这些方法一般通过交联剂在两个多肽之间导入二硫键而将细胞毒素与抗体缀合。已经用不可还原键制备的免疫毒素与通过二硫键交联的相似毒素相比，示出细胞毒性较低。
其它优选的试剂是2-盐酸巯醇亚胺(2-iminothiolanehydrochloride，2IT)、S-4-琥珀酰亚氨基氧基羰基-α-甲基苄基硫代硫酸钠(S-4-succinimidyloxycarbonyl-alpha-methyl benzyl thiosulfate，SMBT)和2IT或者succinimidyloxy carbonyl-α-methyl-α(2-pyrid-yldithio)-toluene及2IT。每组试剂在细胞毒素与抗体之间导入一个可还原的二硫键，但该键对分解有抗性，提供了缀合物在体外和体内的稳定性。在靶细胞中作为溶酶体或内涵体而内在化的基础上，所述键被还原。例如使用具有抗体的重组PE分子，在第287氨基酸位具有半胱氨酸形式的PE分子优选通过半胱氨酸的硫醇部分将毒素与抗体或者其它配体偶联。
在一个实施方案中，LMA结合部分也可以通过重组方式与细胞毒素融合，例如通过使用重组DNA技术产生编码抗体和细胞毒素并且在宿主细胞中表达重组DNA序列的核酸，所述宿主细胞例如是真核宿主如哺乳动物宿主如CHO或者COS细胞，或者原核宿主例如大肠杆菌宿主。编码融合多肽的DNA可以通过本领域技术人员已知的任何克隆方法克隆进cDNA中或者是基因组形式。见例如Sambrook et al.，Molecular Cloninga Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，(1989)所述，在此并入本文作参考。
本领域技术人员意识到在化学合成、生物表达或者纯化后，融合多肽可以具有与天然抗体基本上不同的构象。在这种情况中，必需使得所述多肽变性和还原，然后使得该多肽重折叠为优选的构象。使得多肽还原和变性及诱导其重折叠的方法为本领域技术人员所熟知(见Debinski et al.，J.Biol.Chem，26814065-14070(1993)；Kreitman and Pastan，Bioconjug.Chem.，4581-585(1993)；andBuchner，et al.，Anal.Biochem.，205263-270(1992)，所述文献在此并入本文作参考)。例如，Debinski等描述了在胍-DTE中内涵体蛋白质的变性和还原方法。然后将所述多肽在含有氧化的谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲液中重折叠。
技术人员认识到可以对融合多肽进行修饰而不削弱其生物学活性。可以进行一些修饰以促进克隆、表达，或者将融合多肽的抗体部分掺入融合多肽中。这种修饰为本领域技术人员所熟知，包括例如在氨基末端加入甲硫氨酸以提供起始位点，在多肽的任一末端加入His-标记以便于纯化或者在任一末端加入额外的氨基酸以产生便于定位的限制位点或者终止密码子。
技术人员认识到可以进行其它修饰。因此，例如可以产生氨基酸取代以增加融合多肽的特异性或结合亲和性。或者，分子的非必需区域可以被缩短或者全部消除。因此，在分子存在自身不参与分子活性的区域的情况中，该区域可以被消除或者用较短节段置换，以在分子的活性成分之间保持正确的空间关系。或者，可以将更灵活性的节段置于内结构域(interdomian)区域中，然后可便于分子的折叠或者产生(Brinkmann，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，893075-3079(1992)。
单克隆抗体 针对LMA表位的单克隆抗体可易于由本领域技术人员产生。本领域熟知通过杂交瘤产生单克隆抗体的一般方法。产生抗体的无限增殖细胞系可以通过细胞融合产生，也可以通过其它技术如用致癌DNA直接转化B淋巴细胞或者用Epstein-Barr病毒转染而产生。针对LMA表位产生的单克隆抗体可以针对不同性质筛选，即针对同种型和表位亲和性进行筛选。
小鼠衍生的单克隆抗体可用于在体内直接免疫治疗及在体外进行免疫治疗。然而，已经观测到当小鼠衍生的单克隆抗体用于人体作为治疗剂时，患者产生人抗小鼠抗体。因此，小鼠衍生的单克隆抗体非优选用于治疗，特别不适合长期应用。然而，使用建立的遗传工程技术可以产生具有动物衍生部分和人衍生部分的嵌合或人源化抗体。所述动物可以是小鼠或者其它啮齿类动物如大鼠。
如果嵌合抗体的可变区是小鼠衍生的，而恒定区是人衍生的，则该嵌合抗体与“纯”小鼠衍生的单克隆抗体相比通常免疫原性较低。这些嵌合抗体很可能更适于治疗应用，“纯”小鼠衍生的抗体是不适合的。
嵌合抗体 本领域技术人员可获得产生嵌合抗体的方法。例如，可以使用免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链在单独的质粒中单独表达轻链和重链。然后纯化这些轻链和重链并在体外装配成完整抗体；完成这种装配的方法已经描述。见例如Scharff，M.，Harvey Lectures 69125(1974)所述。也见Oi et al.，Bio Techniques 4(4)214-221(1986)；和Sun et al.Hybridoma 5(1986)Suppl 1517-20所述。这种DNA构建体可包含与编码人恒定区的DNA连接的编码抗LMA抗体的轻链或重链可变区的功能重排基因的DNA。用轻链和重链的DNA构建体转染的淋巴样细胞如骨髓瘤或杂交瘤可表达并装配所述抗体链。
IgG抗体从还原分离的轻链和重链中形成的体外反应参数也已经描述。见例如Beychok，S.，Cells of Immunoglobulin Synthesis，Academic Press，New York，p.69，1979所述。轻链和重链在相同细胞中共表达以实现重链和轻链的细胞内缔合和连接为完整的H2L2IgG抗体也是可能的。这种共表达可以使用相同或不同的质粒在相同的宿主细胞中实现。
人源化抗体 在本发明的另一个优选实施方案中，抗LMA抗体是人源化的，即通过分子建模技术(molecular modelling technique)产生的抗体，其中抗体的人成分最大化，而导致很少或不丧失与鼠抗体的可变区的结合亲和性。
下文描述的方法可用于人源化抗LMA抗体。
有许多因素要考虑以决定在人源化期间使用何种人抗体序列。轻链和重链的人源化彼此独立，但推理基本相似。
这种选择方法基于如下基本原理给定的抗体的抗原特异性和亲和性主要由可变区CDR的氨基酸序列决定。可变结构域构架残基很少或者无直接作用。构架区的主要功能是保持CDR的正确空间方向以识别抗原。因此，如果人可变结构域构架与啮齿类动物可变结构域的构架高度同源，则在人可变结构域构架中源自该啮齿类动物可变结构域的CDR的取代很可能使其正确的空间方向得以保持。因此人可变结构域优选与啮齿类动物可变结构域高度同源。合适的人抗体可变结构域序列可如下选择。
步骤1使用计算机程序搜索所有可获得的蛋白质(和DNA)数据库中与啮齿类动物抗体可变结构域最同源的那些人抗体可变结构域序列。合适程序输出与啮齿类动物抗体最同源的序列列表、每个序列的同源百分比、及每个序列与啮齿类动物序列的排列对比。对于重链和轻链可变结构域序列单独进行搜索。如果只包括人免疫球蛋白序列，则上述分析更易于完成。
步骤2列出人抗体可变结构域序列并进行同源对比。首先对比CDR的长度，除外非常可变的重链CDR3。将人重链及κ和λ轻链分成亚组，重链分成3个亚组，κ链分成4个亚组，λ链分成6个亚组。每个亚组内CDR大小相似，但亚组之间不同。通常可以将啮齿类动物抗体CDR与所述人亚组之一匹配，作为同源的第一个近似值。然后对比携带相似长度CDR的抗体的氨基酸序列同源性，尤其是CDR内，但也在周围构架区内对比。选择最同源的人可变结构域作为构架进行人源化。
现行人源化方法/技术 可以根据EP-A-0239400所述将所需的CDR移植于人构架上而将抗体人源化。因此从其CDR希望被重构(reshape)的人DNA开始，可以产生编码所需被重构抗体的DNA序列。将含有所需CDR的啮齿类动物可变结构域氨基酸序列与选择的人抗体可变结构域序列进行对比。标明人可变结构域中需要改变为啮齿类动物中相应残基的残基，以产生掺入啮齿类动物CDR的人可变区。这些残基也可以是人序列中需要取代、添加或者缺失的残基。
合成可用于诱变人可变结构域构架以含有所需残基的寡核苷酸。那些寡核苷酸可以是任何常规大小的。通常长度仅受所利用的特定合成仪的能力的限制。寡核苷酸体外定向诱变的方法为本领域所熟知。
或者，人源化可以使用WO 92/07075的重组聚合酶链反应(PCR)方法实现。使用这种方法，可以在人抗体构架区之间剪接CDR。
通常，WO 92/07075的技术可以使用包含两个人构架区AB和CD的模板进行，在这两个构架区之间所述CDR被供体CDR置换。引物A和B用于扩增构架区AB，引物C和D用于扩增构架区CD。然而，引物B和C在其5’末端还均含有相应于全部或者至少部分供体CDR序列的一个额外序列。引物B和C重叠足够的长度，以使得其5’末端在可以进行PCR的条件下彼此退火。因此，扩增的AB和CD区域通过重叠延伸而经历基因剪接，在一个反应中产生人源化产物。
重构抗体的转染和表达 在进行诱变反应以重构抗体之后，诱变的DNA可以与编码轻链或者重链恒定区的合适DNA连接，克隆进表达载体中，并转染进宿主细胞优选哺乳动物细胞中。这些步骤可以常规方式进行。重构抗体因此可通过包括如下步骤的方法制备 (a)制备第一种可复制的表达载体，其包括与编码至少Ig重链或轻链的可变结构域的DNA序列可操纵地连接的合适启动子，所述可变结构域包含来自人抗体的构架区和本发明人源化抗体所需的CDR； (b)制备第二种可复制的表达载体，其包括与分别编码至少互补Ig轻链或重链可变结构域的DNA序列可操纵地连接的合适启动子； (c)用第一种或者这两种制备的载体转化细胞系；及 (d)培养所述转化的细胞系以产生所述改变的抗体。
优选地，步骤(a)中的DNA序列编码人抗体链的可变结构域和每个恒定结构域。人源化抗体可以使用任何合适的重组表达系统制备。被转化以产生改变的抗体的细胞系可以是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系或者无限增殖化的哺乳动物细胞系，优选是淋巴源的，如骨髓瘤、杂交瘤、三杂交瘤(trioma)或者四杂交瘤(quadroma)细胞系。所述细胞系还可以包含正常的淋巴样细胞，如已经用病毒如Epstein-Barr病毒转化而无限增殖化的B细胞。最优选地，所述无限增殖化的细胞系是骨髓瘤细胞系或其衍生物。
用于表达本发明抗体的CHO细胞可以是二氢叶酸还原酶(dhfr)缺陷的，并因此依赖胸苷和次黄嘌呤以生长(Urlaub et al.，Proc.Natl.Acac.Sci.U.S.A.，77 4216-4220(1980))。将亲代dhfr-CHO细胞系用编码所述抗体和dhfr基因的DNA转染，可以选择dhfr阳性表型的CHO细胞转化体。将所述集落在没有胸苷和次黄嘌呤的培养基上培养以进行选择，胸苷和次黄嘌呤的缺乏可以防止未转化的细胞生长及转化的细胞恢复叶酸途径并因此绕过(bypassing)选择系统。这些转化体依靠转染的感兴趣的DNA和编码dhfr的DNA的共整合而通常表达低水平感兴趣的DNA。编码所述抗体的DNA的表达水平可以使用氨甲蝶呤(MTX)通过扩增而增加。这种药物是dhfr酶的直接抑制剂，并且可以分离扩增其dhfr基因拷贝数足以在这些条件下存活的抗性集落。由于编码dhfr和所述抗体的DNA序列在原始的转化体中紧密连接，因此通常伴随扩增，并因此增加所需抗体的表达。
与CHO或骨髓瘤细胞使用的另一种优选的表达系统是WO87/04462所述的谷氨酰胺合成酶(GS)扩增系统。这个系统包括用编码酶GS的DNA及编码所需抗体的DNA转染细胞。然后选择在无谷氨酰胺的培养基中生长的细胞，因此推测所述细胞具有整合的编码GS的DNA。然后用甲硫氨酸磺酰亚砜亚铵(methioninesulphoximine，Msx)将这些选择的克隆进行GS酶抑制。为了存活，细胞将扩增编码GS的DNA，编码所述抗体的DNA伴随扩增。
尽管用于产生人源化抗体的细胞系优选是哺乳动物细胞系，但可另外使用任何其它合适的细胞系，如细菌细胞系或者酵母细胞系。特别地，可以使用大肠杆菌衍生的细菌菌株。检测获得的抗体的功能性。如果功能性丧失，则需要返回步骤(2)及改变所述抗体的构架。
一旦表达，则可以回收本发明的完整抗体、其二聚体、各个轻链和重链、或者其它免疫球蛋白形式，根据本领域的标准方法对其进行纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等等(见Scopes，R.，Protein Purification，Springer-Verlag，N.Y.(1982))。药物应用优选至少大约90-95％同质性的、并最优选98-99％或更高同质性的基本上纯的免疫球蛋白。一旦纯化，如所需部分地或同质性，则人源化抗体可以治疗性应用或者产生和进行分析程序、免疫荧光染色等等(见Immunological Methods，Vols.I and II，Lefkovitsand Pernis，eds.，Academic Press，New York，N.Y.(1979 and1981))。
Greenwood和Clark((1993)Eur.J.Immunol.231098-1104)进行的研究表明人效应细胞对抗体Fc区域的识别可以通过对免疫球蛋白分子的恒定区进行工程化而优化。这可以通过将具有所需特异性的抗体可变区基因与编码免疫球蛋白同种型的人恒定区基因融合而实现，所述免疫球蛋白同种型在人对象中具有经论证有效的ADCC，例如IgG1和IgG3同种型(Greenwood and Clark(1993)ProteinEngineering of Antibody Molecules for Prophylactic and TherapeuticApplications in Man.Edited by Mike Clark，published by AcademicTities.Section II 85-113)。所得LMA的嵌合或人源化抗体在诱导ADCC中应特别有效。
针对LMA的具有完全人可变区的抗体也可以通过给予已经修饰的转基因动物所述抗原以应答抗原攻击而产生抗体而制备，但是转基因动物内源基因座已经失效。可以进行多种随后的操纵以获得抗体或其相似物(见例如美国专利No.6,075,181)。
治疗方法 一方面，本发明的方法利用未经修饰的抗体或结合片段，依赖于所述抗体或片段与骨髓瘤细胞表面的LMA原位结合而刺激免疫攻击。例如，其中抗原结合位点与人Fc区域连接的嵌合抗体，例如IgGl，可以用于促进抗体依赖性介导的细胞毒性或者补体介导的细胞毒性。
另一方面，本发明的治疗方法可以使用胞毒剂或者生物学调节物与之结合的LMA结合部分进行。所得缀合物与肿瘤细胞的结合抑制所述细胞生长或杀死所述细胞。
本发明抗体的抗独特型单克隆抗体也可以治疗性应用于主动肿瘤免疫和肿瘤治疗中(见例如Hellstrom et al.，″Anti Idiotypes″inCovalently Modified Antigens and Antibodies in Diagnosis andTherapy，supra at pp.35-41)。
在多发性骨髓瘤中，本发明的抗体或抗体片段可进一步用于制备其中除去了骨髓瘤细胞的细胞样品。这种应用在自身骨髓移植中特别重要，其中骨髓样品从在进行高剂量化疗之前的癌症患者中获取。高剂量化疗的目标是杀死癌细胞，这样也导致了骨髓细胞的耗竭。经过这种处理后，将获取的骨髓细胞再导入患者体内。
在骨髓瘤和相关疾病中，获取的骨髓污染了骨髓瘤细胞；因此再导入未经处理的骨髓易于再次引起疾病发生。先前防止癌细胞再次导入的方法包括用化疗剂及其它抗肿瘤制剂在体外处理骨髓样品。其它方法包括净化癌细胞样品。
在本发明的进一步实践中，本文描述的单克隆抗体和片段可用于从患者骨髓样品中除去骨髓瘤细胞之后再导入患者体内。在一个非限制性实例中，所述单克隆抗体或结合片段与一种基质如珠附着。这可以通过制备包含抗体或其结合片段的亲和基质的几种熟知方法实现。然后将骨髓样品暴露于该基质，在促进样品中骨髓瘤细胞通过抗原/抗体相互作用与附着于基质的抗体或结合片段结合的条件下，将细胞穿经含有所述基质的柱。样品中的骨髓瘤细胞附着于所述基质，而柱流出物，即未附着的细胞群，没有骨髓瘤细胞。这种方法的效力可以通过检验剩余的骨髓瘤细胞而监测，例如下文描述的使用可检测标记的抗体进行。所述方法可以重复进行或加以改变以增加效力。
这种净化方法(见例如Ramsay et al.，J.Clin.Immunol.，8(2)81-88，1988)可以与除去或杀死癌细胞的其它方法一起进行，包括但不限于将纯化的骨髓细胞暴露于化疗剂。这种化疗剂包括使用与胞毒剂缀合的本发明的抗体或抗体结合片段，如上述在体内进行治疗。因此，本发明的抗体或抗体片段与胞毒剂的缀合物可用于离体(exvivo)杀死细胞样品中的肿瘤细胞。所述方法可另外包括将细胞暴露于细胞因子(例如GM-CSF、IL-6)、细胞因子受体(例如IL-6受体)、促细胞分裂原(例如美洲商陆促细胞分裂原(PWM))或者粘附分子(例如CD40配体)以刺激骨髓瘤细胞快速分化并从而上调癌症特异性抗原在其细胞表面上的表达。这些处理形式是通过将骨髓瘤细胞与本发明的单克隆抗体或其片段一起保温而使其易受体外介导的细胞毒性攻击。
在本发明治疗方法的另一方面，与胞毒剂如化疗剂、光可激活的毒素或者放射性核素缀合的所述抗体或其结合片段可用于不用上述净化技术而在体外或者离体抑制或杀死骨髓样品中的骨髓瘤细胞。用细胞毒性抗体或抗体片段处理样品可与其它杀死癌细胞的方法组合，通过从被移植的组织中除去细胞而增加骨髓移植、特别是自身骨髓移植的效力。这些方法可包括另外将所述细胞暴露于细胞因子等。因此，本文描述了一种从分离的细胞样品中除去骨髓瘤细胞的方法，包括如下步骤将所述细胞样品暴露于在其中骨髓瘤细胞与单克隆抗体或其结合片段粘附的条件下所述单克隆抗体或抗体结合片段与之结合的固体支持物，分离与所述基质不结合的细胞样品级分。非限制性例子是使用骨髓细胞，特别是进行移植、优选自身骨髓移植的骨髓细胞。
本领域技术人员意识到，一些骨髓瘤患者在其循环中具有显著水平的游离λ轻链。因为抗LMA抗体与这些游离轻链反应，因此其存在于对象体液中可降低治疗效力。因此，在本发明的一个优选实施方案中，所述治疗方法进一步包括处理对象以降低其体液(例如血液)中循环的游离λ轻链水平，之后给予抗LMA抗体。这个额外的处理步骤可包括例如血浆置换术。如本领域技术人员所熟知，血浆置换术是其中通过细胞分离仪从血细胞中除去血浆的方法。所述分离仪通过高速旋转血液或者通过将血液流经具有只可以使血浆通过的孔的膜而从体液中分离细胞。将细胞回输给对象，而弃去含有游离κ轻链的血浆并代以其它液体。在所述方法进行期间可通过静脉给予防止血液凝集的药物(例如抗凝剂)。
本领域技术人员意识到包括使用抗LMA抗体的治疗B细胞疾病如多发性骨髓瘤的方法可以单独进行，或者作为已知的化疗或放疗方案的辅助疗法。例如，抗LMA抗体治疗可以与药物如苯丙氨酸氮芥或者环磷酰胺治疗联合进行，或者在所述药物治疗之后进行。
药物组合物、剂量和给药途径 本发明还涉及药物组合物，其包含抗LMA抗体与药物可接受的载体或稀释剂。
本发明的抗体和药物组合物用于胃肠外给药、局部给药、口服例如通过气雾剂或者经皮局部给药，以预防和/或治疗性处理。优选的抗LMA抗体的给药途径是胃肠外给药，如本文所用术语“胃肠外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道或者腹膜内给药。这些给药途径中，最优选静脉内给药。
给予的组合物通常包含所述抗体溶解于药物可接受的载体、优选水溶液载体的溶液。可以使用多种水溶液载体，例如缓冲的盐水等。这些溶液是无菌的，并通常没有非所需的物质。这些组合物可以通过熟知的常规灭菌技术灭菌。所述组合物可含有近似生理条件需要的药物可接受的辅助物，如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等等。这些制剂中抗体的浓度可以变化很大，根据选择的特定给药模式和患者的需要而主要基于液体体积、粘度、体重等加以选择。
肿瘤细胞的生长可以通过给予需要治疗的对象有效量的抗LMA抗体而抑制或降低。典型地，所述抗体可以每剂量大约0.001-2000mg/kg体重的量、优选大约0.01-500mg/kg体重的量给予。根据主治医生的处方可以重复给予。然而，其它量也是适合的。通常，抗体的给予是通过输注进行的，由此可产生不利作用的抗体量可以通过改变给予速度而控制。典型地，输注一个剂量可持续几个小时。然而，本发明还涵盖了持续输注治疗剂，使得血清中抗体水平保持恒定。抗LMA抗体的输注可如下述进行。对静脉内(I.V.)输液管用例如0.9％NaCl和5％人血清白蛋白进行预处理，进行静脉内给药。I.V.输注液可包括总体积为250ml的0.9％NaCl和5％人血清白蛋白，根据观测到的任何与速度相关的副作用在大约2小时的时间输注。在输注期间每15分钟及输注后每1小时检查生命迹象直至稳定。可以在输注之前和结束后进行彻底的心肺检查。准备包括对乙酰氯萨罗、苯海拉明、肾上腺素和皮质类固醇在内的药物以处理发生的变态反应。根据主治医生的观测可重复给予所述抗体。
在本发明的一个实例中，放射性标记形式的抗λ抗体作为治疗剂通过静脉内注射给予表达LMA的靶细胞。放射性标记抗体的前例及治疗性给予患者的方法为本领域技术人员所已知。所述标记例子包括I131标记的Lym-l，针对HLA-DR的β亚基(DeNardo SJ et al.Antibody Immunoconj Radiophar(1988)117-33；DeNardo SJ et al.IntJ Biol Markers(1987)249-53)及抗CD20铟111和钇90标记的Ibritumomab Tiuxetan(IDEC-Y2B8，ZEVALIN)和碘I131Tositumomab(BEXXAR)。
在任何治疗方案中，所述治疗组合物可以单独给予患者，或者在含有其它治疗剂、组合物等的混合物中给予患者，所述其它治疗剂、组合物包括但不限于免疫抑制剂、耐受诱导剂、增效剂和副作用减轻剂。特别优选免疫抑制剂用于抑制宿主的变态反应。优选的免疫抑制剂包括强的松、苯丙氨酸氮芥、强的松龙、DECADRON(Merck，Sharp & Dohme，West Point，Pa.)、环磷酰胺、环孢霉素、6-巯基嘌呤、氨甲蝶呤、咪唑硫嘌呤和i.v.的γ球蛋白或者其组合。优选的增效剂包括莫能菌素、氯化铵、哌克昔林、异搏定、金刚烷胺和氯奎。所有这些制剂通常以在接受的有效剂量范围内给予，如Physician′s Desk Reference，41st Ed.，Publisher Edward R.Barnhart，N.J.(1987).Patent Cooperation Treaty(PCT)，1989年8月10日公布的专利申请WO 89/069767所述，所述文献并入本文作参考。
诊断分析和试剂盒 本发明的抗体也用于在体外和体内的诊断性应用，以检测人多发性骨髓瘤细胞。体外诊断方法包括免疫组织化学检测肿瘤细胞。免疫组织化学技术包括用本发明的抗体染色生物学标本如组织标本，然后检测与其抗原作为抗原-抗体复合物复合的抗体。标本中这种抗体-抗原复合物的形成表明所述组织中存在多发性骨髓瘤细胞。对标本进行抗体检测可以使用本领域已知的技术进行，如免疫酶学技术，例如免疫过氧化物酶染色技术或者抗生物素蛋白-生物素技术，或免疫荧光技术(见例如Ciocca et al.，″ImmunohistochemicalTechniques Using Monoclonal Antibodies″，Methods Enzymol，121562-79，1986及Kimball，(ed)，Introduction to Immunology(2.sub.ndEd)，pp.113-117(Macmillan Pub.Co.，1986)。
在一个优选的实施方案中，检测与融合多肽结合的标记。标记多肽的方法为本领域技术人员所熟知。标记可以通过共价键直接连接或者通过典型地具有能与标记和抗体分别形成共价键的反应位点的连接分子共价连接。一种常用的方法是使用抗生物素蛋白或者链霉抗生物素蛋白或者生物素标记所述多肽，所述标记彼此不可逆地结合。
合适的标记为本领域技术人员所熟知。本文所用术语“标记”是指通过分光、光化学、生物化学、免疫化学或者化学方式可检测的组合物。例如，有用的标记包括放射性分子如32P、14C、125I、3H、和35S，荧光染料如荧光素或罗丹明，电子致密试剂，异硫氰酸酯/盐；生色团，酶(通常用于ELISA中)，发光酶如萤光素酶等等。
这种标记的抗体或结合片段可用于抗原的组织学定位、ELISA、细胞淘选及其它免疫学技术例如检测和/或量化抗原和携带抗原的细胞。如上所述，这种标记的抗体或其片段的特殊应用是在移植、特别是自身骨髓移植之前，确定骨髓组织中骨髓瘤细胞耗竭的效力。
本发明还涉及使用上述抗LMA抗体对多发性骨髓瘤成像的方法。携带LMA的其它癌症也适合这些诊断方法。所述方法包括给予或输注本发明所述单克隆抗体或结合片段，与或不与一种可检测部分例如放射性核素缀合。在给予或输注后，所述抗体或抗体片段与肿瘤细胞结合，之后检测所述抗体或抗体片段的位置。对于可检测标记的抗体或其结合片段，如用放射性核素标记的那些抗体或其结合片段，可以使用成像检测设备鉴别体内所述试剂的位置。对于使用未标记的抗体或片段，可以给予第二种可检测的试剂定位所述抗体或抗体片段，因此可适当地检测。这些方法已经用于其它抗体，技术人员熟知这些不同的成像体内抗体或片段的位置的方法。
携带LMA的癌细胞的解剖位置的检测可用于随后对每个特殊患者设计抗肿瘤治疗方案。特别地，使用本发明的融合多肽可以对组织切片(例如活检组织)、体液样品(例如血液)或者细胞制品进行免疫组织化学病理学诊断。
本发明还包含进行研究或诊断目的的试剂盒。试剂盒典型包括含有抗LMA抗体的一或多个容器。所述抗LMA抗体可以用标记衍生化，或者其可与另一种标记结合以进行随后的检测。如上所述，这种标记可包括放射性标记、荧光标记、酶标记，即辣根过氧化物酶(HRP)等等。所述试剂盒还可含有合适的另外的标记(例如绵羊抗小鼠-HRP等等)。所述试剂盒还可含有促进融合多肽结合、除去非特异性结合抗体及检测结合的标记的多种试剂。这种试剂为本领域技术人员所熟知。
另一方面，本发明提供了包含与固体支持物结合的本发明的单克隆抗体或抗体结合片段的组合物。用于本发明中的固体支持物在进行结合的反应条件下是惰性的。用于本发明中的固相支持物必须具有反应基团或者活性基团以附着所述单克隆抗体或其结合配偶体(partner)。在另一个实施方案中，所述固相支持物可以是层析支持物，如碳水化合物聚合物SEPHAROSE.RTM.、SEPHADEX.RTM或者琼脂糖。如本文所用，固相支持物不限于特定类型的支持物。大量支持物是可以利用的，这些为本领域技术人员所已知。固相支持物包括例如硅胶、树脂、衍生化塑料膜、玻璃珠、棉制物、塑料珠、氧化铝凝胶、磁珠、膜(包括但不限于硝化纤维素膜、纤维素膜、尼龙和玻璃棉)、塑料和玻璃皿或孔等等。
上述研究和诊断试剂盒的使用方法为本领域所熟知，通常在试剂盒的使用说明书中提供。
为了更清楚地理解本发明，参考如下非限制性实例进行描述。
实施例 材料和方法 抗体 这些研究中使用的鼠单克隆抗体(mAb)是针对人游离λ轻链(λLC)产生的，是同种型IgG2a。在本文称作L7(克隆3D12)和ME154(克隆ME-154)的mAb得自AbCam Ltd.(Cambridge，UK)。在本文称作mab1306(克隆HP6054)的mAb得自Chemicon InternationalInc.(Melbourne，Victoria，Australia)。
细胞系 人λ-型多发性骨髓瘤细胞系(LP-1)得自德国微生物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，Germany)。将细胞根据DSMZ的建议在Iscoves MDM和20％FBS中、在37℃和5％CO2条件下维持。
ELISA mAbs L7、mab1306和ME 154对于多种人游离λ轻链(λLC)的特异性通过酶联免疫吸附测定(ELISA)确定。特异性抗原由分离自λ型多发性骨髓瘤患者尿液的人游离λ轻链(本斯-琼斯氏蛋白质，BJP)组成。纯化四种λLCLam F、Lam H、Lam K和Lam Q，并在Australian Proteomic Analysis Facility(APAF)使用HPLC分离为单体和二聚体级分。与重链相关的λ轻链由纯化自正常人血清的完整多克隆λ-型人γ球蛋白(IgGλ)呈递，得自Bethyl Laboratories，Inc.(Montgomery，Tx，USA)。不相关的对照抗原由单体和二聚体形式的人游离κ轻链(κLC)组成。
将ELISA平板的孔用每种抗原包被，所述抗原于具有0.02％叠氮化钠的pH 7.4磷酸盐缓冲盐水中(PBS-az)。在37℃保温1小时后，将孔用PBS-az洗涤3次并用于PBS-az中的3％BSA在4℃封闭过夜。将mAb与抗原在37℃保温3小时，然后将孔用PBS-az洗涤3次。向每个孔中加入山羊抗小鼠IgG-AP缀合物(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)，在37℃保温1小时。最后，将孔如上述洗涤并向每个孔中加入底物(pNpp；Sigma)。颜色的产生与和抗原结合的mAb的量成比例，在ELISA平板读器上在405nm吸光度测定。
表面等离子共振(SPR) mAbs L7和mab1306对于人游离λ轻链的特异性在Biacore 2000生物传感器上使用SPR证实。将mAbs L7和mab1306通过胺偶联固定在葡聚糖包被的Biacore CM5芯片上，将与在ELISA中使用的相同的本斯-琼斯氏抗原以10μg/mL注射固定的mAb 12分钟。mAb-抗原结合在共振单位(resonance unit)中通过SPR测定，其与芯片表面由于抗原的mAb捕获导致的质量(mass)增加成比例。
流式细胞术 mAbs L7、mab1306和ME 154与LP-1骨髓瘤细胞表面的结合通过流式细胞计量术评估。收获LP-1细胞，通过离心洗涤并以1×106细胞/mL浓度重悬于具有1％BSA的PBS-az中。使等份5×105细胞沉淀，然后与mAb(100μg/mL)在冰上保温30分钟。对照样品由相同浓度的同种型(IgG2a)匹配的对照mAb组成，或者只由具有1％BSA的PBS-az组成。在与抗体保温后，将细胞在具有1％BSA的750μL的PBS-az中洗涤两次，在50μL的1∶20稀释的PE-缀合的山羊抗小鼠F(ab’)2(Dako)中在冰上保温30分钟。将细胞洗涤两次，之后在FACSCalibur流式细胞计量仪(BD Biosciences)的FL-2通道中分析。
游离λLC对L7与LP-1细胞结合的抑制 将L7(100μg/mL)与不同浓度的游离λ轻链二聚体(Lam F和Lam H)或者与κLC(800μg/mL)在37℃预保温1小时。在预保温之后，将抗体混合物加入5×105细胞中，如上述通过流式细胞计量术确定结合。
通过荧光显微镜鉴别LP-1细胞表面上的游离λLC抗原 通过双色荧光显微镜观测免疫球蛋白重链(γ)和轻链(λ)的定位。使用与异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的、得自Open Biosystems(Huntsville，AL，USA)的山羊抗人γ-特异性抗体检测γ链。使用与德克萨斯红(Texas Red)缀合的、得自EY Laboratories Inc.(SanMateo，CA，USA)的山羊抗人λ抗体检测λ链。抗λ抗体与游离的和重链相关的轻链均结合。抗体与LP-1细胞的结合通过将106的细胞与200μg/mL抗γ-FITC和抗λ-德克萨斯红在冰上于具有1％BSA的PBS-az中保温30分钟而证明。将细胞洗涤两次，之后用BX51荧光显微镜(Olympus，Tokyo，Japan)分析。表面免疫球蛋白的定位在UV光下使用470-490nm带通激发滤波器(bandpass excitationfilter)检测，示出FITC染色(绿色)。表面λ轻链的定位在UV光下使用520-550nm带通激发滤波器检测，示出德克萨斯红染色(红色)。然后将FITC和德克萨斯红图像重叠产生双色图像。FITC和德克萨斯红位于同一位，红色和绿色融合产生黄色。这样可以确定λ轻链是否在γ链占据的那些区域之外的区域中出现。
通过Western印迹鉴别LP-1细胞的细胞膜级分中游离λLC抗原 LP-1细胞的细胞膜级分中游离λLC抗原的存在通过Western印迹证明。将LP-1细胞(4.5×107)通过离心用PBS洗涤两次，然后以107细胞/mL的浓度重悬于40mM Tris pH 7.2和完全蛋白酶抑制剂(Roche)中。将细胞涡旋30秒，超声15分钟，然后再次涡旋30秒。在室温保温20分钟后，将细胞涡旋，然后在4000g离心10分钟。细胞质级分得自上清，细胞膜级分由沉淀组成。将沉淀通过离心用PBS洗涤两次，然后重悬于含有1％NP 40的Tris缓冲盐水(TBS)中。将溶解的细胞膜在冰上保温30分钟，然后在4000g离心10分钟。收集上清作为溶解的细胞膜级分。将等份的细胞质和细胞膜级分使用非变性条件进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后印迹在硝化纤维素膜上。游离λLC抗原通过与mAbs L7、mab1306和ME 154在室温保温90分钟、随后在含有0.05％Tween和0.3％BSA的TBS中洗涤3次进行检测。然后将膜与抗小鼠GAM-AP缀合物(Sigma)保温90分钟，如上述洗涤3次。通过将该膜与BCIP和NBT(SigmaFASTTM)一起保温进行蛋白质条带显色。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC) mab1306和ME 154诱导ADCC的能力在体外使用Wilkinson等所述的流式细胞计量方法(Journal of Immunological Methods 2001 258pp183-91)评定。天然杀伤(NK)细胞用作效应细胞，LP-1骨髓瘤细胞用作靶。
小鼠NK细胞分离自从健康Balb/c小鼠收获的脾淋巴细胞悬浮液，使用MACS磁性细胞分选仪(Miltenyi Biotech，Germany)进行。使用Miltenyi Biotech NK细胞分离试剂盒，除去除了NK细胞之外的所有淋巴细胞，剩下纯化的未标记的NK细胞。将NK细胞在补加了125ng/mL重组鼠IL-2(Sigma-Aldrich，USA)的RPMI 10％FCS中培养6天。
在U形底的96孔组织培养平板(Nunc，Denmark)中进行分析。就在分析之前，将靶细胞(LP-1骨髓瘤细胞)用荧光膜染料PKH-26(Sigma-Aldrich，USA)根据厂商指导进行标记。将LP-1细胞(3×104细胞/mL)与于无菌PBS中的ME 154或者mab1306(7nM和0.7nM终浓度)在37℃和5％CO2条件下预保温15分钟。然后加入在RPMI中洗涤并重悬于其中的效应细胞，鼠NK细胞，使得NK与LP-1的比率为25∶1、12.5∶1和6.25∶1。混合细胞，然后将该平板在400g离心10分钟，以保证细胞与细胞紧密接触。将平板在37C保温16小时。
16小时后，将50μL的DNA结合染料TO-PRO-Iodide 3(1μM于PBS中；Molecular Probes Inc.，USA)加入每个测试样品中。TO-PRO-Iodide 3只可进入细胞膜不健全的细胞中，与双链DNA结合。只有在这种DNA结合的基础上，TO-PRO-Iodide 3才发荧光。2-5分钟之后，将细胞在FACSCalibur流式细胞计量仪(BD Inc.，USA)上运转。死亡的细胞通过由于TO-PRO-Iodide 3/DNA复合物所致的在FL4通道中的阳性荧光而鉴别。靶细胞(LP-1)通过由于PKH-26标记所致的在FL2通道中的阳性荧光而鉴别。死亡的靶细胞因此经鉴别是在FL2和FL4通道中均阳性荧光的那些细胞。细胞毒性百分比如下式计算 (FL4-FL2双阳性细胞数)/(FL2阳性细胞数)×100 实施例1抗体L7、mab1306和ME 154对于λ轻链的特异性 L7与人游离λ轻链结合的特异性示于图1A和2A。这些结果表明L7与单体和二聚体形式的三种不同λ轻链(Lam F、Lam H和LamK)均结合，并且与单体形式的第四种λ轻链(Lam Q)结合。所述抗体与正常人免疫球蛋白中重链相关的λ轻链不结合，与游离κ轻链也不结合。
mab1306与一系列人λ轻链的抗原结合性质示于图1B和2B。这些结果表明mab1306结合一系列游离的和免疫球蛋白相关的λLC，但是不结合游离κLC。相似地，mAb ME 154结合游离的和重链相关的λLC(图1C)。所有这三种mAb均示出与单体形式的LamQ结合，但与二聚体形式的这种抗原不结合。
实施例2LP-1骨髓瘤细胞上λ轻链的鉴别 流式细胞计量术结果表明L7、mab1306和ME 154均特异性结合LP-1骨髓瘤细胞细胞表面抗原(图3)。对于mAb L7，抗体与LP-1细胞的结合通过与两种不同的单体游离λ轻链(Lam F和Lam H)预保温而抑制(图4)。这种抑制以浓度依赖性方式发生(图4B)，然而L7结合不被相同浓度的游离κ轻链抑制。
使用荧光显微镜证明与Ig重链不相关的游离λ轻链抗原存在于LP-1细胞表面上(数据未示出)。细胞与荧光标记的特异于IgGγ链的多克隆抗体(抗γ-FITC)一起保温，示出LP-1细胞的绿色染色的不均匀强度，而λ轻链的多克隆抗体，抗λ-德克萨斯红，示出细胞表面上一些片状强红色染色(数据未示出)。最强的红色片状染色(λ轻链)似乎与绿色染色(Ig相关γ链)在不同的位置。这个观测结果通过重叠相同细胞的两种颜色图片而证实(数据未示出)。组合红色和绿色产生黄色，而仅用一种抗体染色的区域保持原来的颜色。细胞表面上的黄色代表与免疫球蛋白相关的λ轻链。然而，明显的片状红色表示与Ig不相关的λ轻链，因此游离λ轻链区域在细胞表面上。
通过非还原SDS-PAGE的Western印迹，使用mAbs L7、mab1306和ME 154检测LP-1骨髓瘤细胞的膜相关λ轻链(图5)。阳性对照组由纯化的人游离λ轻链组成，其可以通过所有三种抗体检测到。mab 1306(图5B)和ME 154(图5C)均检测到在细胞的膜和胞质级分中单体(25kD)和二聚体(50kD)形式的游离λ轻链。mAb L7示出与膜结合的单体和二聚体形式的游离λ轻链结合，但是在胞质中看起来只检测到单体形式的抗原。
讨论 鼠单克隆抗体L7特异性结合四种不同的人游离λ轻链，但是不结合与重链相关的λ轻链。对抗体结合λ型骨髓瘤细胞系LP-1的分析表明，该抗体结合细胞表面抗原。与细胞表面抗原的结合可以通过将该抗体与两种不同的λ轻链预保温而阻断。另外，可溶形式的游离λ轻链可以完全消除L7与LP-1细胞上细胞表面抗原的结合。这些数据提示所述抗体识别含有与在游离λ轻链上发现的相似表位的细胞表面抗原。
荧光显微镜检表明细胞表面游离λ轻链可以与λ型骨髓瘤细胞表面上Ig相关的λ轻链相区别。另外，25kD单体和50kD二聚体形式的细胞膜游离λ轻链可以通过所有三种mAb在λ骨髓瘤细胞的细胞膜级分中检测到。
λ骨髓瘤细胞的特异性抗原依赖性细细胞毒性可以使用抗体mab1306和ME 154证明。这些结果提示结合细胞表面上单体和二聚体形式的游离λ轻链的抗体在存在效应细胞的条件下可诱导细胞死亡。
本文详述的实验表明针对游离λ轻链的一些鼠单克隆抗体可以检测细胞膜上λ抗原的单体(25kD)和二聚体(50kD)形式。我们提出这种LMA由与细胞膜相关的游离λ轻链组成，并且可用于使用单克隆抗体特异性靶定λ型多发性骨髓瘤患者的骨髓瘤细胞。
另外，注意到LMA在多种B细胞疾病的B细胞上呈递。这种细胞的例子是DOHH-2(人B细胞淋巴瘤)、WSU-NHL(人B细胞淋巴瘤)、DB(人B细胞淋巴瘤)、KARPAS-1106P(人B细胞淋巴瘤)、WSU-DLCL2(人B细胞淋巴瘤)、SU-DHL-5(人B细胞淋巴瘤)、MHH-PREB-1(人B细胞淋巴瘤)GRANTA-519(人B细胞淋巴瘤)和MC-116(人B细胞淋巴瘤)。
由于LMA对于恶性B细胞的细胞膜是独特的，因此提议能选择性结合这些抗原的任何mAb均可用于治疗如多发性骨髓瘤的疾病。其次的作用是，能结合LMA的合适同种型的任何mAb均能通过使用宿主效应细胞引起ADCC而诱导细胞死亡。这个其次作用有助于耗竭B细胞疾病患者中的B细胞。
以上说明书中提及的所有出版物在本文均并入作参考。在不偏离本发明的范围和精神的前提下，本领域技术人员可以对本发明描述的方法和系统作各种修改和改变。尽管结合特别优选的实施方案对本发明进行了描述，但应理解请求保护的本发明不限于这些特殊的实施方案。事实上，分子生物学或相关领域技术人员熟知的对本发明所述模式进行的各种修改，其也在本发明的范围内。
权利要求
1.一种治疗或者预防对象中B细胞疾病的方法，所述方法包括给予所述对象有效量的抗LMA抗体以抑制所述对象中淋巴样细胞生长或者杀死所述对象中的淋巴样细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述B细胞疾病是选自多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤和巨球蛋白血症的一种淋巴增生疾病。
3.权利要求1或2的方法，其中所述B细胞疾病是多发性骨髓瘤。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述抗LMA抗体与一种细胞毒性部分或者生物学调节物缀合。
5.权利要求4的方法，其中所述细胞毒性部分是毒素、化疗剂或者放射性制剂。
6.权利要求4的方法，其中所述细胞毒性部分是编码细胞毒性多肽的核酸分子。
7.权利要求4的方法，其中所述生物学应答调节物是淋巴因子、细胞因子或者干扰素。
8.一种抑制对象中淋巴样细胞生长或者杀死淋巴样细胞的方法，所述方法包括在LMA配体缀合物足以与淋巴样细胞结合的条件下给予对象与细胞毒性部分或者生物学调节物缀合的LMA配体，以抑制所述细胞的生长或者杀死该细胞。
9.权利要求8的方法，其中所述LMA配体是抗LMA抗体。
10.权利要求8或9的方法，其中所述细胞毒性部分是毒素、化疗剂或者放射性制剂。
11.权利要求8或9的方法，其中所述细胞毒性部分是编码细胞毒性多肽的核酸分子。
12.权利要求8-11任一项的方法，其中所述生物学应答调节物是淋巴因子、细胞因子或者干扰素。
13.权利要求1-12任一项的方法，其进一步包括在给予抗LMA抗体或者LMA配体缀合物之前处理对象以降低对象体液中存在的游离λ轻链水平的步骤。
14.权利要求13的方法，其中对象血清中存在的游离轻链的水平通过化疗或者血浆置换术而降低。
15.一种用于对象的自体造血细胞移植的方法，所述方法包括
(i)从对象取出造血祖细胞群，
(ii)用抗LMA抗体或者LMA配体缀合物处理该细胞群，及
(iii)将步骤(ii)的处理的细胞群移植进所述对象。
16.权利要求15的方法，其进一步包括给对象静脉内输注抗LMA抗体或者LMA配体缀合物。
17.权利要求15或16的方法，其中将所述抗LMA抗体或者LMA配体缀合物与一种固体支持物结合。
18.一种在对象体内定位淋巴样细胞的方法，所述方法包括给予对象抗LMA抗体或者LMA配体，使得所述抗体或配体与对象的细胞结合，及确定对象中所述抗体或者配体的位置。
19.权利要求18的方法，其中所述抗体或配体是可检测地标记的。
20、权利要求1-19任一项的方法，其中所述抗LMA抗体是嵌合抗体或者人源化抗体。
21.一种与细胞毒性部分或者生物学调节物缀合的抗LMA抗体。
22.权利要求20的抗LMA抗体，其中所述细胞毒性部分是毒素、化疗剂或者放射性制剂。
23.权利要求20的抗LMA抗体，其中所述细胞毒性部分是编码细胞毒性多肽的核酸分子。
24.权利要求20的抗LMA抗体，其中所述生物学应答调节物是淋巴因子、细胞因子或干扰素。
25.一种用可检测部分标记的抗LMA抗体。
26.一种药物组合物，其包含抗LMA抗体或者LMA抗原缀合物及一种药学可接受的载体、稀释剂或者赋形剂。
27.一种结合于固体支持物的抗LMA抗体或者LMA配体缀合物。
全文摘要
本发明涉及B细胞疾病如多发性骨髓瘤(MM)的诊断和治疗。特别地，本发明涉及使用结合淋巴癌细胞表面上表达的游离λ轻链的配体治疗B细胞疾病。
文档编号G01N33/532GK1946425SQ20058001315
公开日2007年4月11日 申请日期2005年2月28日 优先权日2004年2月27日
发明者罗萨尼·多罗西·邓恩, 达伦·罗斯·琼斯, 帕里萨·阿斯瓦蒂, 罗伯特·雷森, 安德鲁·塔斯曼·哈钦森 申请人:派克迈伯有限公司