专利名称：疾病相关朊病毒的检测方法
技术领域：
本发明涉及动物和人朊病毒病的检测方法。
背景技术：
传染性海绵状脑病(TSE)或朊病毒病是动物和人的致死性神经变性性疾病。经过数月至数十年的较长潜伏期，才出现临床疾病。TSE的临床症状包括痴呆和运动协调力丧失。八十年代发现，TSE的共同特征是受染动物和人中宿主编码的朊病毒蛋白(PrPc)的异常抗蛋白酶同种型(PrPres或PrPSc)的蓄积。PrPSc的发现提供了一种分子标记物，它对于所有朊病毒病是特异的，也是感染颗粒主要而很可能唯一的成分，此感染颗粒称为朊病毒。
为了解瘙痒病传染性，通过分析叙利亚仓鼠脑的表观分子质量为27-30kDa的蛋白酶K处理部分，发现了抗蛋白酶的PrPSc核，称为PrP27-30。PrP-27-30的N末端测序在非感染动物中引起宿主编码PrP基因的克隆以及朊病毒蛋白(PrPC)蛋白酶敏感同种型的识别。TSE的关键致病性事件是宿主编码的朊病毒蛋白(PrPC)构象改变为致病性同种型，它被称为PrPSc(在实验性瘙痒病感染啮齿动物中首次识别后)。这种构象改变包括PrPC的α-螺旋结构重折叠为PrPSc的β-片状。这种重折叠的朊病毒蛋白PrPSc只是在其三级结构上与PrPC不同，因此它具有相同的氨基酸序列以及相同的翻译后修饰，诸如N-连接糖基化和GPI锚。PrPSc聚集为淀粉样小纤维，并在神经组织和较小范围的淋巴网状内皮组织中蓄积。
在感染宿主中，PrPSc水平与朊病毒滴度成正比。应用TSE剂对啮齿动物进行实验室接种后，通常在发病前数周可在中枢神经系统中检测到PrPSc，而且其水平到达最大并可在动物死亡前持续数月。在无症状阶段，在淋巴网状内皮组织中均易检测到传染性和PrPSc。最近，还发现PrPSc可在经口感染瘙痒病的仓鼠和实验室感染的转基因小鼠的肌肉组织中蓄积。
尽管人类认识所有朊病毒病的原型-绵羊和山羊的瘙痒病-已超过两个世纪，但自从1986年在英国首次发现一种新型动物朊病毒病-牛海绵状脑病(BSE)以来，这种病便发展为一种动物传染病。感染BSE家畜进入人类食物链到达何种程度仍在进行讨论，而且这些问题已成为许多研究的主题。伦敦Imperial College(Donnelly，C.A.，Ferguson，N.M.，Ghani，A.C.& Anderson，R.M.，StatisticalMethods in Medical Research 12，177-190(2003))发表的最新研究提出，根据新的流行病数据，高达1.6Mio感染BSE家畜可能已走上了英国消费者的餐桌。
人朊病毒病包括克罗伊茨费尔特-雅各布病(CJD)、Gerstmann-Straeussler-Scheinker病(GSS)、致死性家族性失眠症(FFI)和库鲁病。这些疾病表明了朊病毒病通常的三种表现，即疾病的散发类型(所有CID病例的80-90％)、与人PrP基因突变相关的遗传类型(家族性GSS、家族性CJD和FFI)以及通过移植、感染或摄入朊病毒污染组织的产品而获得的感染类型(医源性CJD、vCJD和库鲁病)。随着1996年新型克罗伊茨费尔特-雅各布病在英国出现，则开始了一场针对食物传播病原体所致人类疾病的斗争。迄今为止，英国已经报道了146例变异型CJD(vCJD)，而且让人感兴趣的科学证据表明BSE和vCJD之间存在因果关系。因为在这些患者中未确定任何明显的危险因素，所以暴露于BSE污染食品似乎很有可能是一种因果联系。尤其迫切的是在患者出现临床症状之前检测vCJD，因为它可极大地减小血液供应和医院设备被污染的危险性。最近，一名英国患者在接受输血后6.5年发生vCJD，而此献血员在献血后3.5年出现vCJD症状(Llewelyn etal.，2004，The Lancet 363，417-421)。此情况增加了vCJD可能通过输血传播的可能性，而且强调了对血液及其成分进行朊病毒诊断性检测的必要性。在本发明中公开了一种TSE感染哺乳动物血浆中疾病相关类型PrP的检测方法。
因为PrPSc是朊病毒病唯一可靠的分子标记，所以免疫学检测脑组织中抗蛋白酶的PrPSc部分是快速诊断试验的基础，此试验常用于BSE和瘙痒病的活动性监测。由于该病临床前阶段中PrPSc缓慢蓄积的动力学，现有诊断能力严重受限于潜伏期中对该病的早期检测。这里公开的本发明提供了临床前阶段中朊病毒病的检测方法。
尽管PrPSc最初被定义为一种部分抗蛋白酶和去污剂不溶解的同种型PrP，但已经识别的几种朊病毒病与异常PrP相关，这些异常PrP缺乏典型的蛋白酶抵抗性。与这些朊病毒病相关的PrP类型称为“蛋白酶敏感性”PrPSc，这样可将它们与抗蛋白酶的PrPSc类型区别开。
对动物或人组织中朊病毒蛋白疾病相关构象的检测被认为是对朊病毒病的诊断。为了区分疾病相关PrP与细胞前体PrPC，可能用蛋白酶处理以完全破坏PrPC，但仅仅除去了PrPSc的蛋白酶敏感N-末端部分，或者也可以应用一种可区分PrPC和PrPSc的抗体。我们的专利申请WO 98/37210和Korth等(1997，Nature 39074-77)的题目为“朊病毒的免疫学检测”中已经公开了这种抗体，它仅与自然PrPSc反应，而不与PrPC反应，在此引用这篇论文以公开这种抗体，并对其进行描述。
目前用于诊断朊病毒病的大多数试验是在中枢神经系统的组织上进行的，该组织是在显示临床疾病或者怀疑患有疾病的动物或人死后获得的。这种诊断检测方法依赖于使用预处理，以水解朊病毒蛋白的蛋白酶敏感类型，然后通过免疫学方法检测朊病毒蛋白的抗蛋白酶类型。但是，这些方法不能检测PrPSc的蛋白酶敏感类型。例如，专利申请WO 00/52197要求保护在TSE感染哺乳动物血清中检测PrPSc的方法。此方法的主要缺点在于，应用蛋白酶进行预处理，以水解蛋白酶敏感性PrP。
现在迫切需要一种简单而有效的检测TSE相关抗蛋白酶类型PrP和蛋白酶敏感类型PrP的方法和诊断试剂盒，以便在活体哺乳动物中对该疾病进行检测。
发明目的本发明的目的是克服现有技术的缺点和不足，提供活体动物和人的朊病毒病的检测方法和诊断试剂盒。
这种方法的优势是，通过筛选血液以确定疾病相关PrP的存在，可检测出传染性海绵状脑病的携带者，而且例如此方法可防止vCJD意外地通过输血传播。
定义名词“PrP”指朊病毒蛋白同种型的共同氨基酸序列，而不是不同的构象。
名词“PrPC”指正常哺乳动物中大量存在的朊病毒蛋白同种型，而且与TSE无关。
名词“PrPD”指疾病(TSE)相关类型的PrP，它被定义为正常宿主朊病毒蛋白构象改变的同种型。PrPD包括疾病相关PrP的抗蛋白酶类型和蛋白酶敏感类型。
名词“PrPD”与例如羊、牛或人构象改变的PrP同义，这里的羊、牛或人仅是引用的一些实例。
名词“抗体”指通过动物免疫或者通过体外选择/淘选步骤而产生的任何抗体。该抗体可为多克隆或者单克隆抗体，包括其片段，诸如Fab或单链抗体。此抗体可为基因工程抗体，诸如嵌合或人源化抗体。
发明总结按照本发明，公开了一种检测动物或人PrPD的方法，此方法包括采集样品，此样品优选是血液或易于从活体哺乳动物中获得的其他体液，然后将此样品与仅识别PrPD的抗体接触，最后应用免疫学方法检测抗体/PrPD复合物的量。
本发明的方法考虑到与TSE相关同种型PrPD既可为蛋白酶敏感同种型，也可为抗蛋白酶同种型存在。在上下文中提到，应用特异性捕获抗体处理样品，此捕获抗体可识别TSE相关同种型PrPD上的构象表位。选择对TSE相关同种型PrPD特异的，但不是朊病毒蛋白的抗蛋白酶同种型所必须标示的表位。通过应用可识别所述构象表位的捕获抗体，可获得最佳结果，尤其是在可含有TSE相关PrPD的样品中，此TSE相关PrPD既可为蛋白酶敏感同种型中也可为抗蛋白酶同种型。
在优选实施方式中，应用此方法分析包括仅为蛋白酶敏感同种型的PrPD的样品。按照本发明，仅通过应用捕获抗体即可处理这些样品。
在本发明的优选实施方式中，检测PrPD的方法是对血浆进行的，按照作为本发明一部分的一种步骤由血液样品制备此血浆。
在另一种优选实施方式中，用化学品处理血浆样品，使抗体/PrPD复合物的结合条件达到最佳。
在本发明的另一种实施方式中，应用抗体15B3仅检测PrPD，而不检测正常类型的PrP。可从瑞士苏黎世的Prionics AG获得抗体15B3，WO 98/37210公开了产生这些抗体的方法。WO 98/37210中公开的可产生抗体15B3的Hybridomacells被保藏于DSMZ-Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，登记号为DSM ACC2298。
在本发明另一种优选实施方式中，通过免疫学方法直接或间接检测抗体/PrPD复合物。
本发明另一种实施方式提供了应用夹心ELISA法检测抗体/PrPD复合物的方法，此方法应用一种识别朊病毒蛋白N一末端的标记抗体。
本发明的一种优选实施方式是应用检测PrPD的方法检验人血液样品，以确定该血液是否可安全用于输血。
本发明另一种优选实施方式中提供了用于诊断活体哺乳动物TSE的诊断试剂盒。
优选实施方式的详细描述按照本发明，在诊断TSE中PrPD的检测方法包括1)采集动物或人的血液样品2)由血液样品制备全血、血浆、血清、红细胞(RBC)或白细胞(WBC)，并处理血浆，以便分析物PrPD与抗体结合3)用作为捕获抗体的PrPD特异抗体孵育此血液样品4)冲洗抗体/PrPD复合物，除去污染的蛋白5)用敏感的免疫学分析检测抗体/PrPD复合物。
下面将参照具体实施例更详细地对个别步骤进行描述。应当清楚，公开的方法和成分并不受限于特殊样品、化学药剂、抗体、标记物或方法，这些都可以改变。除非另行定义，这里所用的所有技术和科学名词的含义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义相同。
抽取哺乳动物的血液样品，将其置于含抗凝剂的容器中，此抗凝剂诸如为EDTA、枸橼酸钠或肝素。优选抗凝剂为EDTA，而应用其他抗凝剂也可具有相似的结果。通过1000xg离心分离血浆和血细胞。其他优选样品为体液，诸如唾液、尿或脑脊液。如果应用血清，则将血液抽至不含抗凝剂的容器中，并在室温下使血液凝结至少30分钟，然后1000xg离心，分离血块和血清。
将血浆样品与含去污剂的等量缓冲液混合，防止PrPC与抗体发生非特异性结合。适于阻断非特异性结合的去污剂有很多种，而且本领域专业技术人员对它们很熟悉。优选去污剂有月桂酰肌氨酸钠、脱氧胆酸钠、磺基三甲铵乙内酯、Triton X-100、NP-40、ZWITTERGENT、Tween-20、Tween-80。特定分析方式所用的优选去污剂以及用于特定物种的优选去污剂可以改变。优选浓度为0.05-1％。
将血浆样品与抗体接触。在本发明优选实施方式中，应用对疾病相关类型PrPD特异的抗体。优选抗体为抗体15B3，已显示它对PrPD是特异的，但也可以类似方式应用其他抗体。在特别优选实施方式中，抗体包被在微量滴定板的孔上，或者包被在珠上以捕获样品中的PrPD。然后通过免疫学方法，应用识别PrP的检测抗体检测抗体与PrPD的复合物。通过各种免疫学方法可完成检测。本领域专业技术人员熟知这些方法，它们可包括蛋白印迹法(免疫印迹法)、酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫-PCR或者荧光激活细胞分选法(FACS)。应用可与酶缀合的朊病毒蛋白的抗体可进行直接检测，所述酶诸如为过氧化物酶、碱性磷酸酶或者荧光分子或核酸。可替代的是，可应用未标记初级抗体(抗朊病毒蛋白抗体)和标记的次级抗体进行间接检测。
通过下面非限制性实施例和附图对本发明进行举例说明实施例1BSE阴性和阳性牛血浆中PrPD的检测。
实施例2瘙痒病阴性和阳性羊血浆中PrPD的检测。
实施例3瘙痒病阴性和阳性羊脑匀浆中PrPD的检测。
实施例4瘙痒病阴性和阳性羊血清中的PrPD的检测。
实施例5瘙痒病阴性和阳性羊白细胞中PrPD的检测。
附图简述附
图1是显示实施例1结果的图表。在此实施例中，对感染BSE(Pos 1-Pos 2)和正常牛(Neg 1-Neg 23)的血浆样品进行夹心免疫法，15B3用作捕获抗体，可识别PrP N-末端的抗体用作检测抗体。
附图2是显示实施例2结果的图表。在此实施例中，对感染瘙痒病(Pos 1-Pos 6)和正常羊(Neg 1-Neg 16)的血浆样品进行夹心免疫法，15B3用作捕获抗体，可识别PrP N-末端的抗体用作检测抗体。
附图3是显示实施例3结果的图表。所示数据表明，应用FACS分析可区分瘙痒病阳性脑匀浆(B)和瘙痒病阴性脑匀浆(A)。灰色曲线显示抗体15B3包被珠所接收的荧光信号。黑线显示同种型对照珠所获得的荧光信号。
附图4是显示实施例4结果的图表。所示数据表明，应用FACS分析可区分源自感染瘙痒病羊的血清(B)和源自未感染瘙痒病羊的血清(A)。在阳性样品(B)中采用在阴性样品(A)中设定为5％的右上象限，并清楚地显示出5-32％的变化。
附图5是显示实施例5结果的图表。所示数据表明，应用FACS分析可区分源自感染瘙痒病羊的白细胞(B)和源自未感染瘙痒病羊的白细胞(A)。在阳性样品(B)中采用在阴性样品(A)中设定为5％的右上象限，并清楚地显示出5-36.9％的变化。
实施例1附图1所示图表显示第一种实验的结果。其数据表明，应用夹心免疫测定法可将BSE阳性血浆样品与阴性样品区分开。这里显示两次测量值的均值，而误差棒显示与高值的差异。
室温下，用稀释于pH 7.4磷酸盐缓冲盐水(PBS)、0.1％牛血清白蛋白(BSA)的2μg/ml抗-IgM抗体包被96孔平板1小时。用含0.05％Tween-20的pH 7.4的PBS将平板冲洗3遍，除去未结合的抗体。然后，将平板封阻2小时，并用含0.05％Tween-20的pH 7.4的PBS冲洗3遍。室温下，将浓度为2μg/ml于pH7.4的PBS中的构象特异性抗体15B3与抗-IgM结合1小时。用含0.05％Tween-20的pH 7.4的PBS将平板冲洗3遍后，用含0.4％脱氧胆酸盐(DOC)的Tris缓冲盐水(TBS)1∶1稀释的110μl BSE阴性和阳性牛的血浆被加至这些平板上，并在室温下将它们孵育1.5小时。用含0.2％DOC的TBS将未结合蛋白冲掉。在含有pH 7.4的PBS、0.02％ Casein、0.1％Tween-20的缓冲液中将过氧化物酶标记的单克隆抗体805稀释为10ng/ml，此抗体可识别PrP的氨基酸25-40，并将其加至孔中1小时。用含0.05％Tween-20的pH 7.4的PBS冲洗3遍，除去未结合抗体。将100ml化学发光底物溶液加至孔中，并在平板发光计中读数。值表示为相对光单位。
实施例2附图2的图表显示第二种实验的结果。所示数据表明应用夹心免疫测定法可将羊瘙痒病阳性血浆样品与阴性样品区分开。这里显示两次测量值的均值，而误差棒显示与高值的差异。
按照实施例1所述，用15B 3抗体包被平板。用含0.2％ Sarcosyl的TBS1∶1稀释的瘙痒病阴性和阳性羊的血浆被加至平板上，并在室温下孵育1.5小时。用含0.1％ Sarcosyl的TBS将未结合蛋白冲掉。在含有pH7.4的PBS、0.02％ Casein、0.1％Tween-20的缓冲液中将POD标记的单克隆抗体805稀释为10ng/ml，此抗体可识别PrP的氨基酸25-40，并将其加至孔中1小时。用含0.05％Tween-20的pH7.4的PBS冲洗3遍，除去未结合抗体。将100ml化学发光底物溶液加至孔中，并在平板发光计中读数。值表示为相对光单位。
实施例3附图3的图表显示第三种实验的结果。所示数据表明应用FACS分析可将瘙痒病阳性脑匀浆与阴性样品区分开。这里显示了一个直方图，其中y轴表示事件，x轴表示FL-2检测器所测定的荧光相对强度。
室温下，在旋转轮上，将60ng单克隆15B 3抗体或同种型对照IgM抗体(Becton Dickinson 550963)包被在3μl pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的磁性抗-IgM Dynabeads(Dynal 110.15)上，进行1小时，此磷酸盐缓冲盐水含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)。用含0.1％BSA的pH7.4的PBS冲洗小珠三遍，除去未结合抗体。将这些小珠加至1ml含0.25％Sarkosyl的Tris缓冲盐水(TBS)和10μl 10％瘙痒病阳性或阴性脑匀浆中，并在4℃，在旋转轮上孵育过夜。此后，用含0.2％Sarkosyl的TBS将小珠冲洗三遍，除去未结合蛋白。然后将这些小珠加入200μl含2μg生物素化单克隆抗体805的pH 7.4的PBS、0.1％Tween-20、0.02％Casein中，并在室温于旋转轮上孵育15分钟。用200μl含0.1％Tween-20和0.02％Casein的pH7.4的PBS冲洗三遍后，加入含于200μl pH7.4的PBS、0.1％Tween-20、0.02％Casein中的2.5μg链亲和素-藻红蛋白共轭物(Becton Dickinson554061)，并在室温下再孵育5分钟。通过冲洗除去未结合共轭物后，将这些小珠置于400μl pH7.4的PBS、0.1％Tween-20和0.02％Casein中，并通过FACS(荧光激活细胞分选法)(MoFlow)分析。对FSC/SSC以线性模型获得读数，对FL2以对数模型获取读数。以listmode形式进行数据采集。FL2基线在未预先进行样品孵育的15B3小珠上设定。
实施例4附图4的图表显示第四种实验的结果。所示数据表明应用FACS分析可将瘙痒病阳性血清(B)与阴性样品(A)区分开。这里显示斑点印迹，其中y轴表示颗粒大小(向前散射)，x轴表示FL2检测器所测定的荧光相对强度。
室温下，在旋转轮上，将60ng单克隆15B3抗体包被在3μl pH7.4磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的磁性抗-IgM Dynabeads(Dynal 110.15)上，进行1小时，此磷酸盐缓冲盐水含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)。用含0.1％BSA的pH7.4的PBS冲洗小珠三遍，除去未结合抗体。将这些小珠加入500μl含0.2％Sarkosyl的Tris缓冲盐水(TBS)和250μl分别获自感染瘙痒病动物和未感染瘙痒病动物的血清中，并于4℃，在旋转轮上孵育过夜。此后，用含0.2％Sarkosyl的TBS将小珠冲洗三遍，除去未结合蛋白。然后将这些小珠加入200μl含2μg生物素化单克隆抗体805的pH7.4的PBS、0.1％Tween-20、0.02％Casein中，并在室温于旋转轮上孵育15分钟。用200μl含0.1％Tween-20和0.02％Casein的pH 7.4的PBS冲洗三遍后，加入含于200μl pH7.4的PBS、0.1％Tween-20、0.02％Casein的2.5μg链亲和素-藻红蛋白共轭物(Becton Dickinson 554061)，并在室温下再孵育5分钟。通过冲洗除去未结合共轭物后，将这些小珠置于400μl pH7.4的PBS、0.1％Tween-20和0.02％Casein中，并通过FACS(MoFlow)分析。对FSC/SSC以线性模型获得读数，对FL2以对数模型获得读数。以listmode形式进行数据采集。FL2基线在未预先进行样品孵育的15B3小珠上设定。
实施例5附图5的图表显示第五种实验的结果。所示数据表明应用FACS分析可将从瘙痒病阳性(B)羊中提取的白细胞与瘙痒病阴性羊(A)的白细胞区分开。这里显示斑点印迹，其中y轴表示颗粒大小(向前散射)，x轴表示FL2检测器所测定的荧光相对强度。
室温下，在旋转轮上，将60ng单克隆15B3抗体包被在3μl pH7.4磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的磁性抗-IgM Dynabeads(Dynal 110.15)上，进行1小时，此磷酸盐缓冲盐水含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)。用含0.1％BSA的pH7.4的PBS冲洗小珠三遍，除去未结合抗体。将这些小珠加入500μl含0.2％Sarkosyl的Tris缓冲盐水(TBS)和2百万个分别获自感染瘙痒病动物和未感染瘙痒病动物的白细胞中，并在4℃，在旋转轮上孵育过夜。此后，用含0.2％Sarkosyl的TBS将小珠冲洗三遍，除去未结合蛋白。然后将这些小珠加入200μl含2μg生物素化单克隆抗体805的pH7.4的PBS、0.1％Tween-20、0.02％Casein中，并在室温于旋转轮上孵育15分钟。用200μl含0.1％Tween-20和0.02％Casein的pH7.4的PBS冲洗三遍后，加入含于200μl pH7.4的PBS、0.1％Tween-20、0.02％Casein的2.5μg链亲和素-藻红蛋白共轭物(Becton Dickinson 554061)，并在室温下再孵育5分钟。通过冲洗除去未结合共轭物后，将这些小珠置于400μl pH7.4的PBS、0.1％Tween-20和0.02％Casein中，并通过FACS(MoFlow)分析。对FSC/SSC以线性模型获得读数，对FL2以对数模型获得得数。以listmode形式进行数据采集。FL2基线在未预先进行样品孵育的15B3小珠上设定。
权利要求
1.体液和体液成分中，尤其是血液或者尿液中朊病毒蛋白同种型(PrPD)的检测方法，其中此同种型PrPD与TSE相关，而且它既可为蛋白酶敏感同种型，也可为抗蛋白酶同种型存在，此检测方法包括a.用捕获抗体处理体液或其成分，此捕获抗体可识别TSE相关同种型PrPD上的构象表位，此表位是对该TSE相关同种型PrPD特异的，但不必定表明朊病毒蛋白的抗蛋白酶同种型，以及b.检测可能的PrPD-捕获抗体复合物。
2.按照权利要求1的方法，其中体液包含仅为蛋白酶敏感同种型的PrPD。
3.按照权利要求1或2的方法，其中应用附加的检测抗体处理体液或其成分，此附加的检测抗体可识别朊病毒蛋白(PrP)的N末端。
4.按照前述权利要求任一项的方法，其中对血浆进行PrPD的检测方法，此血浆由血液样品制备。
5.按照权利要求的方法，其中用化学品处理血浆样品，使此抗体/PrPD复合物的结合条件达到最佳。
6.按照前述权利要求任一项的方法，其中抗体15B3用作捕获抗体。
7.按照前述权利要求任一项的方法，其中通过免疫学测定方法直接或者间接检测抗体/PrPD复合物。
8.前述权利要求的方法在血液或者血液成分，尤其是与人体输血相关的检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了朊病毒蛋白疾病相关构象的检测方法，此蛋白为传染性海绵状脑病(TSE)的指征，该方法包括感染活体动物和人的临床前检测，以及死后检测方法。在本发明的一个方面中，将受试者的组织或体液样品与一种抗体接触，此抗体仅与非变性条件下的朊病毒蛋白疾病相关构象结合。
文档编号G01N33/68GK1947017SQ200580012923
公开日2007年4月11日 申请日期2005年5月13日 优先权日2004年5月14日
发明者M·皮罗, D·茨瓦尔德, J·施密德, K·比菲格尔, F·库恩, B·厄施, A·拉贝尔 申请人:普利奥尼克斯股份公司