专利名称：用于将动物血中的白细胞分类的方法及试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于将动物血中的白细胞分类的方法及试剂。
背景技术：
在狗或猫的疾病治疗或诊断中，血液检查是不可缺少的检查。检查白细胞可得到对白血病、感染症或过敏疾病等的治疗或诊断有用的信息，检查血红蛋白可得到对贫血症等的治疗或诊断有用的信息。
测定人的白细胞的方法已经被确立。在该方法中，向人的血样加入溶血剂，溶解红细胞，用血细胞计数装置计数剩下的白细胞。通过研究溶血剂的成分，不仅能计数总白细胞数，还能够将白细胞分类成多种的亚群(sub-populations)，计数特定的白细胞的亚群(例如参照美国专利第4346018号、美国专利第4485175号、美国专利第5116539号、日本专利第2654811号、日本专利第2778745号)。而且，从血样准备多个的等分试样，对各等分试样分别加入不同的溶血剂，分别测定特定的白细胞的亚群，由所得到的结果也能够将白细胞分类成5种亚群。
测定血红蛋白时，作为国际标准法采用氰化高铁血红蛋白法。可是，氰化高铁血红蛋白法使用有毒的氰化物，因此废液处理成为必要。于是，近年来也采用不使用氰化物的方法(例如SIS血红蛋白法、高铁血红蛋白法等)测定(例如参照美国专利第5250437号、美国专利第5968832号)。
动物血用的血细胞计数装置已经在市场销售。在该血细胞计数装置中，使用人血液用的试剂。根据测定的动物种类变更分析程序(例如参照美国专利第6391263号)。
需要说明的是，使用含有季铵盐的人血液(human blood)用的溶血剂用电阻检测法测定狗或猫的血样的场合，白细胞的粒度分布为单峰，不能将白细胞分类为多种的亚群(例如参照国际公开WO2002/014861、J Anim Clin Med，10(3)129-134，2001)。这是因为狗或猫的白细胞与人的白细胞比，对季铵盐脆弱而敏感的缘故。
对于此，以比人血液用季铵盐低的浓度使用季铵盐(也就是说，白细胞在所测定的溶液中的浓度是1.5g/L-4.5g/L)，测定白细胞的方法记载于国际公开WO2002/014861中。其中记载着根据这种方法能够将狗或猫的血样的白细胞分类成淋巴细胞、主要由单核细胞组成的“混合细胞群”及颗粒细胞这3种亚群。
可是，在国际公开WO2002/014861中记载的方法中，不能将嗜酸性细胞与其他的白细胞区别地分类成亚群。在白细胞的检查中，嗜酸性细胞数在过敏疾病或寄生虫症的诊断中是有用的信息。特别是在宠物中，狗或猫的寄生虫症已广为人知，并且，狗或猫的过敏疾病近年来激增。因此，为了对狗或猫诊断过敏疾病或寄生虫症，在血液检查中将嗜酸性细胞与其他的白细胞区别相分类是重要的。
而且，本发明人等比较了用在国际公开WO2002/014861中记载的方法得到的结果和用目视法得到的结果，它们的相关性低。
发明内容
本发明目的是提供将狗或猫的血样中所含的白细胞区分嗜酸性细胞和其他的白细胞并分类成3种群的方法及试剂。
本发明的第1观点涉及用于将动物血中的白细胞分类的方法，该方法包括以下的工序·混合狗或猫的血样和溶血剂制备测定用试样的工序，在上述测定用试样中，红细胞溶解，白细胞收缩；·测定与测定用试样中的白细胞大小相关的信息(data)的工序；·基于所测定的信息，将白细胞分类成含有淋巴细胞的第1群、含有中性粒细胞和单核细胞的第2群及含有嗜酸性细胞的第3群的工序。
本发明的第2观点涉及一种试剂，该试剂用于将狗或猫的血样中的白细胞分类成含有淋巴细胞的第1群、含有中性粒细胞和单核细胞的第2群及含有嗜酸性细胞的第3群，包含·用于溶解血样中的红细胞，并使白细胞收缩的季铵盐、以及·用于溶解上述季铵盐的水系溶剂(aqueou ssolvent)，上述季铵盐的浓度满足以下的条件(1)充分地溶解红细胞；(2)使白细胞收缩而使白细胞能够基于大小分类成第1群、第2群、第3群。
图1表示在测定例1中使用溶血剂1测定人血样而得的一例粒度分布。
图2表示在测定例1中使用溶血剂1测定狗血样而得的粒度分布。
图3表示在测定例1中使用溶血剂1测定猫血样而得的粒度分布。
图4表示在测定例2中使用溶血剂2测定狗血样而得的粒度分布。
图5表示在测定例2中使用溶血剂3测定狗血样而得的粒度分布。
图6表示在测定例2中使用溶血剂4测定狗血样而得的粒度分布。
图7表示在测定例2中使用溶血剂5测定狗血样而得的粒度分布。
图8表示在测定例2中使用溶血剂6测定狗血样而得的粒度分布。
图9表示在测定例2中使用溶血剂5测定猫血样而得的粒度分布。
图10表示在测定例2中使用溶血剂6测定猫血样而得的粒度分布。
图11表示在测定例3中使用溶血剂7测定狗血样而得的一例粒度分布。
图12表示在测定例3中使用溶血剂7测定狗血样(狗1)而得的粒度分布。
图13表示在测定例3中使用溶血剂7测定狗血样(狗2)而得的粒度分布。
图14表示在测定例3中，关于狗血样，使用溶血剂7得到的小型白细胞比率(SCR)和采用目视法得到的淋巴细胞比率的相关性。
图15表示在测定例3中，关于狗血样，使用溶血剂7得到的小型白细胞数(SCC)和采用目视法得到的淋巴细胞数的相关性。
图16表示在测定例3中，关于狗血样，使用溶血剂7得到的中型白细胞比率(MCR)和采用目视法得到的中性粒细胞比率的相关性。
图17表示在测定例3中，关于狗血样，使用溶血剂7得到的中型白细胞比率(MCR)和采用目视法得到的中性粒细胞比率+单核细胞比率的相关性。
图18表示在测定例3中，关于狗血样，使用溶血剂7得到的中型白细胞数(MCC)和采用目视法得到的中性粒细胞数+单核细胞数的相关性。
图19表示在测定例3中，关于狗血样，使用溶血剂7得到的大型白细胞比率(LCR)和采用目视法得到的嗜酸性细胞比率的相关性。
图20表示在测定例3中，关于狗血样，使用溶血剂7得到的大型白细胞比率(LCR)和采用目视法得到的嗜酸性细胞比率+单核细胞比率的相关性。
图21表示在测定例3中，关于狗血样，使用溶血剂7得到的大型白细胞数(LCC)和采用目视法得到的嗜酸性细胞数的相关性。
图22表示在测定例3中，使用溶血剂7测定猫血样得到的一例粒度分布。
图23表示在测定例3中，使用溶血剂7测定猫血样(猫1)得到的粒度分布。
图24表示在测定例3中，使用溶血剂7测定猫血样(猫2)得到的粒度分布。
图25表示在测定例3中，关于猫血样，使用溶血剂7得到的小型白细胞比率(SCR)和采用目视法得到的淋巴细胞比率的相关性。
图26表示在测定例3中，关于猫血样，使用溶血剂7得到的小型白细胞数(SCC)和采用目视法得到的淋巴细胞数的相关性。
图27表示在测定例3中，关于猫血样，使用溶血剂7得到的中型白细胞比率(MCR)和采用目视法得到的中性粒细胞比率的相关性。
图28表示在测定例3中，关于猫血样，使用溶血剂7得到的中型白细胞比率(MCR)和采用目视法得到的中性粒细胞比率+单核细胞比率的相关性。
图29表示在测定例3中，关于猫血样，使用溶血剂7得到的中型白细胞数(MCC)和采用目视法得到的中性粒细胞数+单核细胞数的相关性。
图30表示在测定例3中，关于猫血样，使用溶血剂7得到的大型白细胞比率(LCR)和采用目视法得到的嗜酸性细胞比率的相关性。
图31表示在测定例3中，关于猫血样，使用溶血剂7得到的大型白细胞比率(LCR)和采用目视法得到的嗜酸性细胞比率+单核细胞比率的相关性。
图32表示在测定例3中，关于猫血样，使用溶血剂7得到的大型白细胞数(LCC)和采用目视法得到的嗜酸性细胞数的相关性。
具体实施例方式
首先本发明人等使用人血液用的溶血剂，测定人、狗和猫的血样，比较了白细胞的分类结果。
实施例1本发明人基于美国专利第5968832号的记载，制备了能将人的白细胞分类成淋巴细胞、中性粒细胞、其他的白细胞这3种亚群的溶血剂(溶血剂1)。溶血剂1的组成如下。
溶血剂1月桂基三甲基氯化铵 7.9g/l(30mM)硬脂基三甲基氯化铵 0.84g/l(30mM)氯化钠 4.13g琥珀酸 3.0gEDTA-2K 2.5g
氢氧化钠1.55g精制水 1LpH5.3使用溶血剂1采用自动血细胞计数装置pocH·100iV(Sysmex株式会社)测定了人、狗和猫的血样。在该装置中，用稀释液pocH·packD(Sysmex株式会社)稀释血样，制备成500倍稀释试样。对于2容量的稀释试样添加1容量的溶血剂1，制备测定用试样。从添加溶血剂13秒后开始用6秒钟用电阻式的检测部计数白细胞。在本实验例中，测定的信号从检测部通过RS·232C电缆被传递到个人计算机中，从取得的信号解析计数值和粒度分布。
另外，关于测定中使用的血样，制作涂抹标本，进行May-Grünwald-Giemsa染色，采用目视法将白细胞分类、计数。
图1是测定人血样得到的粒度分布。图2是测定狗血样而得的粒度分布。图3是测定猫血样而得的粒度分布。与粒度分布上的各亚群和白细胞的各亚群的对应，通过比较采用目视法分类的数据、和采用使用了上述溶血剂的方法测定的数据就能够确认。
在图1的粒度分布中，与美国专利第5968832一样地从最左开始出现了溶血了的红细胞群、含有淋巴细胞的群、含有中性粒细胞的群、含有其他的白细胞的群。另一方面，在图2和图3的粒度分布中从最左开始出现了溶血了的红细胞群、含有白细胞的群。由图1-3知道，溶血剂1能将人的白细胞分类成3种亚群，但不能将狗或猫的白细胞分类成亚群。由此知道，即使将人用的溶血剂用于狗或猫的白细胞分类，与人的情况同样，对狗或猫的白细胞分类是困难的。
另外，在图1中，嗜酸性细胞未被分类成与其他白细胞区别的独立的亚群。可是，如上述，在宠物、尤其是狗或猫的血液检查中，将嗜酸性细胞与其他白细胞区别地分类在诊断过敏疾病或寄生虫症上是非常重要的。
从以上的情况看，本发明人等关于用于对狗或猫的白细胞分类的溶血剂，特别地研讨了能够将嗜酸性细胞分类成为与其他白细胞区别的独立的亚群的溶血剂。在进行研讨的基础上，本发明人等着眼于溶血剂所含的季铵盐。其结果发现了能够将狗或猫的白细胞分类成含有淋巴细胞的第1群、含有中性粒细胞和单核细胞的第2群、含有嗜酸性细胞的第3群这3种亚群的溶血剂。
该溶血剂含有季铵盐及水系溶剂。上述季铵盐溶解血样中的红细胞，并使白细胞收缩。上述水系溶剂溶解上述季铵盐。
上述季铵盐的浓度是满足以下条件范围的浓度(1)充分地溶解红细胞的浓度；(2)使白细胞收缩从而使得白细胞能够基于大小分类成含有淋巴细胞的第1群、含有中性粒细胞和单核细胞的第2群及含有嗜酸性细胞的第3群这3种亚群。
具体讲，作为季铵盐的浓度，为了充分地溶解红细胞，优选为大于等于1.5mM。另外，为了将白细胞如上述那样地分类，优选为小于等于20mM，更优选为小于等于14.5mM。
作为季铵盐，例如使用具有碳数10-20的烷基的烷基三甲基铵盐。优选是具有碳数12-18的烷基的烷基三甲基铵盐。作为烷基可举出十烷基、月桂基、肉豆蔻基、鲸蜡基、硬脂基等。
烷基三甲基铵盐有随着烷基的碳数变大，溶解红细胞的力和使白细胞收缩的力(以后将之略记为溶血力)变大的倾向。另外，烷基三甲基铵盐有随着烷基的碳数变大，雾点变低的倾向。因此，当使用一种烷基三甲基铵盐时，有可能引起红细胞的溶血不良、或相反连白细胞也过度地收缩。另外有可能发生沉淀等。于是，为了对白细胞的亚群更明了地分类，优选组合多种的烷基三甲基铵盐，来控制溶血剂整体的溶血力。作为该组合，优选组合烷基的碳数小的烷基三甲基铵盐(第1种烷基三甲基铵盐)和烷基的碳数大的烷基三甲基铵盐(第2种烷基三甲基铵盐)。具体讲，作为第1种烷基三甲基铵盐，可举出十烷基三甲基铵盐或月桂基三甲基铵盐，作为第2种烷基三甲基铵盐，举出鲸蜡基三甲基铵盐和硬脂基三甲基铵盐。作为更优选的组合，可举出第1种烷基三甲基铵盐是月桂基三甲基铵盐、第2种烷基三甲基铵盐是硬脂基三甲基铵盐的组合。
另外，组合的场合，优选第2种烷基三甲基铵盐的浓度比第1种烷基三甲基铵盐的浓度低。具体讲，月桂基三甲基铵盐的浓度优选是小于等于20mM，更优选是8-20mM。硬脂基三甲基铵盐的浓度优选是小于等于2mM，更优选是0.4-2mM，最优选是1-2mM。
作为第2种烷基三甲基铵盐，可代替硬脂基三甲基铵盐而使用鲸蜡基三甲基铵盐。烷基三甲基铵盐随着烷基的碳数变大，溶血力变大，因此与硬脂基三甲基铵盐比，鲸蜡基三甲基铵盐的溶血力小。由此看来，使用鲸蜡基三甲基铵盐的场合的浓度优选是小于等于3mM，更优选是1.5-3mM。
也可以在上述的组合中进一步组合少量的肉豆蔻基三甲基铵盐。据此即使对于各种各样的检体作为溶血剂也能发挥更稳定的溶血力。肉豆蔻基三甲基铵盐的浓度优选0.5-1.3mM，更优选0.6-0.8mM。
另外，也可以在溶血剂中添加少量的烷基二甲基乙基铵盐。据此能够更有效地使溶血了的红细胞收缩。作为烷基二甲基乙基铵盐，例如举出鲸蜡基二甲基乙基铵盐，其浓度优选0.4-1.1mM，更优选0.5-0.8mM。
而且，当向溶血剂中添加HLB(油水分配系数，Hydrophilic-Lipophilic-Balance)17-20的非离子性表面活性剂时，对使溶解的红细胞收缩，将收缩的白细胞稳定化，得到精度高的粒度分布是有效的。作为非离子性表面活性剂的例子，举出聚氧乙烯鲸蜡基醚、聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯油醚、聚氧乙烯二十二烷基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚或聚氧乙烯辛基苯基醚，聚氧乙烯链的数量优选20以上100以下。非离子性表面活性剂的优选浓度是0.05-0.5w/v％，更优选是0.1-0.2w/v％。
另外，作为血红蛋白稳定剂，也可以将5-30mM的亚硝酸盐或硝酸盐、或者5-50mM的具有碳数1-8的烷基的烷基三甲基铵盐或四烷基铵盐添加到溶血剂中。作为烷基，可举出甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基及辛基。作为烷基三甲基铵盐或四烷基铵盐的例子，可举出乙基三甲基铵盐、辛基三甲基铵盐、四乙基铵盐、四丁基铵盐等。
作为溶解上述季铵盐的水系溶剂，可举出水或缓冲液。
优选溶血剂的渗透压保持在200mmol/kg-350mmol/kg。渗透压能够用氯化钠或氯化钾之类的碱金属盐调整。
另外，优选溶血剂的pH维持在4-9。pH的调整可使用公知的缓冲剂。
通过使用上述的溶血剂，能够分类、计数狗或猫的白细胞。在该方法中，首先混合狗或猫的血样和溶血剂，制备测定用试样。在该工序中，试样中的红细胞溶解。另一方面，白细胞收缩并残留。红细胞的溶解和白细胞的收缩，能够通过调整在使用的溶血剂中含有的季铵盐的种类和浓度而同时发生，还能够错开时间使得使红细胞溶解之后白细胞收缩从而分别地发生。呈不清楚白细胞如何收缩，但大体认为，通过血样和溶血剂的混合，试样中的白细胞的细胞膜受到损伤，导致细胞质流出，裸核化等，从而最终白细胞发生收缩。由于收缩了的白细胞的大小，每个亚群都不同，因此基于其大小能够将白细胞分类成亚群计数。具体讲，通过使用使白细胞收缩而使得收缩后的大小根据淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞、嗜酸性细胞而不同的溶血剂，最终能将白细胞分类成含有淋巴细胞的第1群、含有中性粒细胞和单核细胞的第2群及含有嗜酸性细胞的第3群这3种亚群。予以说明的是，也可以用稀释液稀释血样，并向该稀释血样中添加溶血剂，使之反应规定的时间(例如11秒-15秒)，从而制备测定用试样。作为稀释液，可使用生理盐水或pH4-9、渗透压200mmol/kg-350mmol/kg的缓冲液。
如此制备测定用试样后，接着测定与测定用试样中的白细胞大小(size)相关(correlate)的信息(data)。然后，基于所测定的信息，将白细胞分类成含有淋巴细胞的第1群、含有中性粒细胞和单核细胞的第2群及含有嗜酸性细胞的第3群。例如，在测定时利用电阻法的场合，作为与白细胞大小相关的信息，可举出电阻。具体讲，首先将所制备的测定用试样送至测定装置的电阻式检测部。在电阻法中，检测部上设有细孔，在细孔的两侧设置着电极。当在该电极间施加直流电流，在细孔中通过血细胞时，电阻与血细胞的容积成比例地变化。检测该电阻的变化作为脉冲信号，计数所规定的脉冲高以上的信号作为白细胞。另外，将脉冲高转换成容积，通过计数检测了各自的脉冲高的频度能够作成粒度分布。在所作成的粒度分布中出现了含有淋巴细胞的第1群、含有中性粒细胞和单核细胞的第2群及含有嗜酸性细胞的第3群。
另外，在测定时也能利用光学的方法。该场合下，作为与白细胞大小相关的信息，可举出前方散射光。具体讲，首先将所制备的测定用试样送至测定装置的检测部。在光学的方法中，当对检测部照射光，血细胞在检测部通过时，检测与血细胞大小相应的前方散射光。然后，基于该前方散射光的强度作成粒度分布，从而能够将白细胞分类成含有淋巴细胞的第1群、含有中性粒细胞和单核细胞的第2群及含有嗜酸性细胞的第3群。
予以说明，在粒度分布上出现的各亚群、和白细胞的各亚群的对应，测定从血样只分离了各亚群的试样(例如淋巴细胞分离试样)，能够从粒度分布上的出现位置确认。另外，制作血样的涂抹标本，通过比较用目视法对白细胞分类的数据和采用使用上述溶血剂的方法测定的数据，能够确认粒度分布上的各亚群和白细胞的各亚群的对应。而且，可以在两者数据之差最小的位置设定用于区分粒度分布上的各亚群的阈值。另外，阈值，能够可变地设定以使得对各检体检出粒度分布的谷，将谷的位置作为阈值。
能够采用使用上述溶血剂的白细胞分类方法，可将狗或猫的白细胞基于大小分类成小型白细胞、中型白细胞、大型白细胞。小型白细胞包含淋巴细胞，中型白细胞包含中性粒细胞和单核细胞，大型白细胞包含嗜酸性细胞。由于嗜碱性细胞在血中的出现频度非常低，因此难以特定属于哪个群，但大致推定为属于中型白细胞。
血红蛋白浓度通过检测上述制备的测定用试样的555nm附近的吸光度就能够测定。
以下示出使用上述溶血剂测定狗或猫的血样的测定例。
实施例2制备对于溶血剂1的组成，季铵盐浓度或组合各异的溶血剂2-6，使用各溶血剂测定狗或猫的白细胞。使用的季铵盐如下。
烷基三甲基铵盐·十烷基三甲基溴化铵(DTAB)烷基的碳数是10·月桂基三甲基氯化铵(LTAC)烷基的碳数是12·肉豆蔻基三甲基溴化铵(MTAB)烷基的碳数是14·硬脂基三甲基氯化铵(STAC)烷基的碳数是18烷基二甲基乙基铵盐·鲸蜡基二甲基乙基溴化铵(CDMBB)烷基的碳数是16溶血剂2-6中的季铵盐浓度及组合见表1。
表1
使用表1记载的溶血剂2-6，用自动血细胞计数装置pocH·100iV(Sysmex株式会社)测定了狗的血样。测定方法与例1同样。
另外，与例1同样地对于测定使用的血样制作涂抹标本，进行May-Grünwald-Giemsa染色，通过目视将白细胞分类、计数。
图4是使用溶血剂2测定狗血样而得的粒度分布。
图5是使用溶血剂3测定狗血样而得的粒度分布。
图6是使用溶血剂4测定狗血样而得的粒度分布。
图7是使用溶血剂5测定狗血样而得的粒度分布。
图8是使用溶血剂6测定狗血样而得的粒度分布。
在图4-8的粒度分布中均出现了3种白细胞亚群(X、Y、Z)。与采用目视法分类的数据比较，结果知道图中的X群是含有淋巴细胞的群，图中的Y群是含有中性粒细胞和单核细胞的群，图中的Z群是含有嗜酸性细胞的群。另外，比较了粒度分布上的各亚群的数据和利用目视法得到的各亚群的数据，结果尤其在图7和图8中得到高的相关性。
由以上情况知道，使用溶血剂2-6，能够将狗的白细胞分类成含有淋巴细胞的群、含有中性粒细胞和单核细胞的群及含有嗜酸性细胞的群这3种亚群。另外知道，使用溶血剂5和溶血剂6，能够以更高的精度将白细胞分类。
其次，使用溶血剂5和溶血剂6，采用与狗血样同样的方法测定了猫血样。图9是使用溶血剂5测定猫血样而得的粒度分布。图10是使用溶血剂6测定猫血样而得的粒度分布。
在图9和图10的粒度分布中均出现了3种白细胞亚群(X、Y、Z)。与采用目视法分类的数据比较，结果知道图中的X群是含有淋巴细胞的群，图中的Y群是含有中性粒细胞和单核细胞的群，图中的Z群是含有嗜酸性细胞的群。
由以上情况知道，与狗的情况同样，使用溶血剂5和溶血剂6，能够将猫的白细胞分类成含有淋巴细胞的群、含有中性粒细胞和单核细胞的群及含有嗜酸性细胞的群这3种亚群。
实施例3使用添加了非离子性表面活性剂的以下组成的溶血剂7，测定了狗和猫的血样。在溶血剂7中含有作为非离子性表面活性剂的エマルジツト9(第一工业制药(株))。エマルジツト9是聚氧乙烯壬基苯基醚型的非离子性表面活性剂，相当于HLB(Hydrophilic-Lipophilic-Balance)17-20的非离子性表面活性剂。
溶血剂7阳离子·AB 2.16g(日本油脂(株)，含有硬脂基三甲基氯化铵23％)月桂基三甲基氯化铵 2.39g鲸蜡基二甲基乙基溴化铵 0.2g肉豆蔻基三甲基溴化铵 0.2gエマルジツト9 1.0g(第一工业制药(株)，聚氧乙烯壬基苯基醚)氯化钠 4.13g琥珀酸 3.0gEDTA·2K·2H2O2.5g氢氧化钠 1.55g亚硝酸钠 0.69g精制水 1LpH5.3、渗透压280mmol/kg在上述的溶血剂7中含有作为季铵盐的1.43mM的硬脂基三甲基氯化铵、9mM的月桂基三甲基氯化铵、0.53mM的鲸蜡基二甲基乙基溴化铵及0.6mM的肉豆蔻基三甲基溴化铵。使用溶血剂7用自动血细胞计数装置pocH·100iV(Sysmex株式会社)测定狗血样111个检体、猫血样37个检体。测定方法与实施例1同样。另外，与实施例1同样地将测定使用的血样制成涂抹标本，进行May-Grünwald-Giemsa染色，通过目视将白细胞分类、计数。
<狗血样的场合>
图11表示测定狗血样的场合的一例粒度分布。在图11中，最左边的群是溶血了的红细胞的群。接着，从尺寸小的一方开始依次是第1群(小型白细胞)、第2群(中型白细胞)、第3群(大型白细胞)。
各群的阈值根据所得到的粒度分布的状态而有若干不同，但溶血了的红细胞群与第1群的阈值在48f1附近，第1群与第2群的阈值在90f1附近，第2群与第3群的阈值在162f1附近，上限值设定在300f1。
图12和图13是测定的狗检体之中2个检体(狗1和狗2)的粒度分布。任何粒度分布都与图11同样，在最左边出现溶血了的红细胞群，接着从尺寸小的一方开始依次出现了第1群(小型白细胞)、第2群(中型白细胞)、第3群(大型白细胞)。
然后，比较了在图12和图13的粒度分布中出现的小型白细胞、中型白细胞、大型白细胞的数据与采用目视法对白细胞分类、计数得到的数据。表2表示出其结果。
表2
在表2中，SCR(％)、MCR(％)、LCR(％)是基于在图12和图13的粒度分布中出现的小型白细胞、中型白细胞、大型白细胞的数据算出的值。SCR(％)是小型白细胞数对于总白细胞数的比率(small cellratio；SCR)。MCR(％)是中型白细胞数对于总白细胞数的比率(Middlecell ratio；MCR)。LCR(％)是大型白细胞数对于总白细胞数的比率(large cell ratio；LCR)。另一方面，淋巴细胞比率(％)、中性粒细胞比率(％)、单核细胞比率(％)及嗜酸性细胞比率(％)是基于采用目视法对白细胞分类、计数得到的数据算出的值。淋巴细胞比率(％)是淋巴细胞数对于总白细胞数的比率。中性粒细胞比率(％)是中性粒细胞数对于总白细胞数的比率。单核细胞比率(％)是单核细胞数对于总白细胞数的比率。嗜酸性细胞比率(％)是嗜酸性细胞数对于总白细胞数的比率。
由表2知道，SCR值与淋巴细胞比率的值近似。同样地知道，MCR值与单核细胞比率(％)和中性粒细胞比率(％)的合计值近似。而且知道，LCR值与嗜酸性细胞比率的值近似。
在此，对于狗血样(111个检体)调查了SCR和利用目视法得到的淋巴细胞比率的相关性，结果两者的相关性良好(图14)。因此知道，小型白细胞群含有淋巴细胞。另外，小型白细胞数(SCC；small cellcount)与采用目视法得到的淋巴细胞数的相关性也良好(图15)。
其次，调查了MCR与采用目视法得到的中性粒细胞比率的相关性(图16)。另外，调查了MCR与采用目视法得到的中性粒细胞比率+单核细胞比率的相关性(图17)。与图16比，图17的相关性良好。另外，中型白细胞数(MCC；middle cell count)与采用目视法得到的中性粒细胞数+单核细胞数的相关性也良好(图18)。
其次，调查了LCR与采用目视法得到的嗜酸性细胞比率的相关性(图19)。另外，调查了LCR与采用目视法得到的嗜酸性细胞比率+单核细胞比率的相关性(图20)。与图20比，图19的相关性良好。另外，大型白细胞数(LCC；large cell count)与采用目视法得到的嗜酸性细胞数的相关性也良好(图21)。
予以说明，在本实施例中，用目视法未看见出现嗜碱性细胞的检体。
由此可知，中型白细胞群含有中性粒细胞和单核细胞，大型白细胞群含有嗜酸性细胞。
<猫血样的场合>
图22表示测定猫血样的场合的一例粒度分布。在图22中，最左边的群是溶血了的红细胞群。接着，从尺寸小的一方开始依次是第1群(小型白细胞)、第2群(中型白细胞)、第3群(大型白细胞)。
各群的阈值根据所得到的粒度分布的状态而有若干不同，但溶血了的红细胞群与第1群的阈值在48f1附近，第1群与第2群的阈值在96f1附近，第2群与第3群的阈值在174f1附近，上限值设定在300f1。
图23和图24是测定的猫检体之中2个检体(猫1和猫2)的粒度分布。任何粒度分布都与图22同样，在最左边出现溶血了的红细胞群，接着从尺寸小的一方开始依次出现了第1群(小型白细胞)、第2群(中型白细胞)、第3群(大型白细胞)。
然后，比较了在图23和图24的粒度分布中出现的小型白细胞、中型白细胞、大型白细胞的数据与采用目视法对白细胞分类、计数得到的数据结果。表3表示出其结果。
表3
在表3中，SCR(％)、MCR(％)、LCR(％)是基于在图23和图24的粒度分布中出现的小型白细胞、中型白细胞、大型白细胞的数据算出的值。SCR(％)是小型白细胞数对于总白细胞数的比率(small cellratio；SCR)。MCR(％)是中型白细胞数对于总白细胞数的比率(Middlecell ratio；MCR)。LCR(％)是大型白细胞数对于总白细胞数的比率(large cell ratio；LCR)。另一方面，淋巴细胞比率(％)、中性粒细胞比率(％)、单核细胞比率(％)及嗜酸性细胞比率(％)是基于采用目视法对白细胞分类、计数得到的数据算出的值。淋巴细胞比率(％)是淋巴细胞数对于总白细胞数的比率。中性粒细胞比率(％)是中性粒细胞数对于总白细胞数的比率。单核细胞比率(％)是单核细胞数对于总白细胞数的比率。嗜酸性细胞比率(％)是嗜酸性细胞数对于总白细胞数的比率。
由表3知道，SCR值与淋巴细胞比率的值近似。同样地知道，MCR值与单核细胞比率(％)和中性粒细胞比率(％)的合计值近似。而且知道，LCR值与嗜酸性细胞比率的值近似。
在此，对于猫血样(37个检体)调查了SCR和利用目视法得到的淋巴细胞比率的相关性，结果两者的相关性良好(图25)。因此知道，小型白细胞群含有淋巴细胞。另外，小型白细胞数(SCC)与采用目视法得到的淋巴细胞数的相关性也良好(图26)。
其次，调查了MCR与采用目视法得到的中性粒细胞比率的相关性(图27)。另外，调查了MCR与采用目视法得到的中性粒细胞比率+单核细胞比率的相关性(图28)。与图27比，图28的相关性良好。另外，中型白细胞数(MCC)与采用目视法得到的中性粒细胞数+单核细胞数的相关性也良好(图29)。
其次，调查了LCR与采用目视法得到的嗜酸性细胞比率的相关性(图30)。另外，调查了LCR与采用目视法得到的嗜酸性细胞比率+单核细胞比率的相关性(图31)。与图31比，图30的相关性良好。另外，大型白细胞数(LCC)与采用目视法得到的嗜酸性细胞数的相关性也良好(图32)。
予以说明，在本实施例中，用目视法未看见出现嗜碱性细胞的检体。
由此可知，中型白细胞群含有中性粒细胞和单核细胞，大型白细胞群含有嗜酸性细胞。
<血红蛋白浓度>
关于狗血样和猫血样，使用溶血剂7和现有制品ストマトライザ·WH(Sysmex株式会社)，用pocH·100iV进行血红蛋白浓度测定并比较，结果相关性良好。由此证实了用溶血剂7能测定血红蛋白浓度。
根据上述的对狗和猫的白细胞分类的方法和试剂，得到比过去详细、准确的血液检查的结果，因此对于包括寄生虫症和过敏疾病在内的狗和猫的疾病，能进行更合适的诊断或治疗监控。
权利要求
1.一种用于将动物血中的白细胞分类的方法，包括以下的工序·混合狗或猫的血样和溶血剂制备测定用试样的工序，其中在上述测定用试样中，红细胞溶解，白细胞收缩；·测定与测定用试样中的白细胞大小相关的信息的工序；·基于所测定的信息，将白细胞分类成含有淋巴细胞的第1群、含有中性粒细胞和单核细胞的第2群及含有嗜酸性细胞的第3群的工序。
2.根据权利要求1所述的白细胞的分类方法，其中，采用电阻法测定电阻作为与测定用试样中的白细胞大小相关的信息。
3.根据权利要求1所述的白细胞的分类方法，其中，在制备上述测定用试样的工序中，白细胞收缩并使得收缩后的大小从小的一方开始依次为淋巴细胞、中性粒细胞及单核细胞、嗜酸性细胞。
4.根据权利要求1所述的白细胞的分类方法，其中，上述群从与白细胞大小相关的信息的小的一方开始依次是第1群、第2群、第3群。
5.根据权利要求1所述的白细胞的分类方法，其中，上述溶血剂含有季铵盐，上述季铵盐的浓度是满足以下条件的浓度(1)充分地溶解红细胞；(2)使白细胞收缩并使得能够基于大小将白细胞分类成上述第1群、上述第2群、上述第3群。
6.根据权利要求5所述的白细胞的分类方法，其中，上述季铵盐的浓度是1.5mM-20mM。
7.根据权利要求5所述的白细胞的分类方法，其中，上述季铵盐是具有碳数10-20的烷基的烷基三甲基铵盐。
8.根据权利要求7所述的白细胞的分类方法，其中，上述烷基三甲基铵盐至少含有第1种烷基三甲基铵盐和第2种烷基三甲基铵盐，上述第1种烷基三甲基铵盐选自月桂基三甲基铵盐，上述第2种烷基三甲基铵盐选自硬脂基三甲基铵盐和鲸蜡基三甲基铵盐。
9.根据权利要求8所述的白细胞的分类方法，其中，上述月桂基三甲基铵盐的浓度是8-20mM，上述硬脂基三甲基铵盐的浓度是0.4-2mM，上述鲸蜡基三甲基铵盐的浓度是1.5-3mM。
10.根据权利要求8所述的白细胞的分类方法，其中，上述溶血剂还进一步含有肉豆蔻基三甲基铵盐。
11.根据权利要求8所述的白细胞的分类方法，其中，上述溶血剂还进一步含有烷基二甲基乙基铵盐。
12.根据权利要求5所述的白细胞的分类方法，其中，上述溶血剂还进一步含有HLB 17-20的非离子性表面活性剂。
13.根据权利要求1所述的白细胞的分类方法，其中，上述溶血剂的pH是4-9。
14.一种试剂，用于将狗或猫的血样中的白细胞分类成含有淋巴细胞的第1群、含有中性粒细胞和单核细胞的第2群及含有嗜酸性细胞的第3群的试剂，含有溶解血样中的红细胞、使白细胞收缩的季铵盐；和溶解上述季铵盐的水系溶剂，上述季铵盐的浓度满足以下条件(3)充分地溶解红细胞；(4)使白细胞收缩并使得能够基于大小将白细胞分类成第1群、第2群、第3群。
15.根据权利要求14所述的试剂，其中，上述季铵盐的浓度是1.5mM-20mM。
16.根据权利要求14所述的试剂，其中，上述季铵盐是具有碳数10-20的烷基的烷基三甲基铵盐。
17.根据权利要求16所述的试剂，其中，上述烷基三甲基铵盐至少含有第1种烷基三甲基铵盐和第2种烷基三甲基铵盐，上述第1种烷基三甲基铵盐选自月桂基三甲基铵盐，上述第2种烷基三甲基铵盐选自硬脂基三甲基铵盐和鲸蜡基三甲基铵盐。
18.根据权利要求17所述的试剂，其中，上述月桂基三甲基铵盐的浓度是8-20mM，上述硬脂基三甲基铵盐的浓度是0.4-2mM，上述鲸蜡基三甲基铵盐的浓度是1.5-3mM。
19.根据权利要求14所述的试剂，其中，还进一步含有HLB 17-20的非离子性表面活性剂。
20.根据权利要求14所述的试剂，其中，上述水系溶剂是将pH维持在4-9的缓冲液。
全文摘要
提供将动物血中的白细胞的亚群更准确地分类的方法及试剂。(1)混合含有动物血的血样和溶血剂，溶解上述血样中的红细胞，同时使白细胞收缩，制备测定用试样；(2)用电阻法测定上述测定用试样中的白细胞大小；(3)将上述白细胞基于其大小分类成含有淋巴细胞的第1群、含有中性粒细胞和单核细胞的第2群及含有嗜酸性细胞的第3群。
文档编号G01N27/02GK1811417SQ20061000604
公开日2006年8月2日 申请日期2006年1月24日 优先权日2005年1月24日
发明者松本英彬, 白石顺一, 平山英树 申请人:希森美康株式会社