评价治疗方案有效性的方法

专利名称：评价治疗方案有效性的方法
技术领域：
本发明涉及i貪断和对治疗方式评-价的领域。
背景技术：
哺乳动物的上皮包含被称为闭合小带(zonula occludens ， ZO )的结构， 闭合小带也被称为紧密连接(TJs)。这些结构通过控制通向上皮细胞之间 的空间的通路(细胞旁路途径)来调节穿过上皮的物质通道。为了应付上 皮所经受的多种不同的生理和病理刺激，紧密连接或闭合小带必须能够作 出快速的、生理性的、可逆的、瞬时的、能量依赖性的、协调的反应，而 这需要复杂的调控系统的参与。包含紧密连接的上皮的例子包括，但不限 于肠(特别是小肠)和血脑屏障。
当没有刺激时，紧密连接被关闭从而限制细胞旁路途径的通行。而当 存在刺激时，紧密连接被可逆地打开。在美国专利Nos. 5,945,510和 5,948,629中，具有哺乳动物紧密连接的生理调节元件功能的新型哺乳动物 蛋白质已经被鉴定和纯化。这些被称作"zo皿lin"的哺乳动物蛋白质具有 哺乳动物紧密连接的生理效应器的功能。某些细菌已经表现出其含有刺激 紧密连接打开的毒素。霍乱弧菌(P%n'oc/2o/erae)产生已知的导致紧密连 接打开的毒素(闭合小带毒素，ZOT)。据显示，6组氨酸-AG保留了打 开紧密连接的能力，所述6组氨酸-△ G是指ZOT的N末端的删除部分， 其中前264个氨基酸已经被删除并且^^六个组氨酸纯化标记替换。
在自身免疫性疾病中，以及在包括食物过敏、肠道感染、例如乳糜泻 的吸收障碍综合征和炎性肠道疾病的影响胃肠道的多种临床病症中会出 现肠紧密连接功能障碍。具有完好的紧密连接的健康且成熟的肠粘膜成为 大分子通过的主要障碍。在健康状态下，少量的免疫活性蛋白质会穿过肠
宿主(host)屏障。当早熟或在暴露于辐射、化疗和/或毒素之后，紧密连 接系统的完整性遭到损害，会产生针对环境中的抗原(包括自身免疫疾病 及食物过敏)的有害反应。
乳糜泻(CD)是一种由谷蛋白(gluten)(—种存在于小麦、黑麦和大 麦中的蛋白质)吸收导致的肠紧密连接的通透性异常升高的病症。众所周 知，乳糜泻还与其它自身免疫性疾病(AD)有关。然而，仍不清楚与CD 相关的其它AD风险是否与正在进行的谷蛋白吸收有关，或是仅取决于通 常的遗传因素。目前，用于乳糜泻的唯一治疗手段是不含谷蛋白的饮食 (GFD )。
为了评估治疗与异常上皮通透性相关的疾病的治疗剂的功效，使用随 疾病进程而变化的标记将是^艮有用的。用于调节肠通透性的zonulin在CD 以及例如1型糖尿病的其它AD中被上调。本发明证明了 zonulin能够作为 评价治疗与异常上皮通透性相关疾病的治疗剂的功效的标记。
发明概述
本发明提供了用于评价治疗有效性的材料及方法。因此，在一个实施 方案中，本发明提供了一种评价治疗有效性的方法，所述有效性是指治疗 需要治疗的受试者的病症的有效性。典型地，该方法包括从受试者获得样 品以及测定样品中的zonulin浓度。样品可以是本领域技术人员已知的任 何类型。在一个实施方案中，样品可以是血液才羊品。样品可以通过本领域 技术人员熟知的方法进行处理。在一个实施方案中，本发明的方法可以包 括从样品中分离血清以及测定血清中的zonulin浓度。
本发明可以被用于评价许多种病症的治疗。典型地，本发明可以被用 于评价以异常的紧密连接通透性为特征的病症的治疗。因此，本发明可以 被用于评价对与上皮通透性升高相关的病症进行治疗的有效性。可以被评 价的病症的治疗包括，但不限于对自身免疫性疾病的治疗、对乳糜泻的治 疗以及对乳糜泻相关的疾病的治疗。
在一个实施方案中，本发明的方法可以包括通过采用 一种或多种抗体 的方法，例如ELIS As来测定样品中zonulin的浓度。在一个实施方案中， 本发明的方法可以包括在结合条件下，将结合zonulin的第一抗体与样品 相接触，在结合条件下，将结合zonulin的第二抗体与结合的样品相接触； 以及检测存在的结合的第二抗体。在上述方法中，第一抗体可以^皮固定于
固体支持物上，例如小球或微量滴定板中的孔。在某些实施方案中，可以 制备至少一种抗包含闭合小带毒素片段的蛋白质的抗体，例如可以制备抗
包含闭合小带毒素片段的蛋白质的第一抗体。可以使用包含任何适合的闭 合小带毒素片段的蛋白质，例如包含闭合小带毒素的AG片段的蛋白质。 在一个实施方案中，包含适合的闭合小带毒素片段的蛋白质可以是其中的
△ G片段包含N末端六个组氨酸标记的蛋白质。在本发明的某些方法中，
可以制备至少一种抗包含闭合小带毒素的蛋白质的抗体，例如可以制备抗 包含闭合小带毒素的蛋白质的第二抗体。第二抗体可以包含一种或多种可 检测的部分。在一个实施方案中，第二抗体可以包含生物素。
在一个特定实施方案中，本发明提供了一种评价治疗有效性的方法， 所述治疗是指对需要治疗的受试者的乳糜泻的治疗。上述方法可以包括从
受试者获取样品；以及测定样品中zonulin的浓度。在某些实施方案中， 样品可以是血液样品。该方法可以进一 步包括从样品中分离血清；以及测 定在血清中zonulin的浓度。在某些实施方案中，测定zonulin浓度可以包 括将第一抗体固定于支持物；在引起样品中的zonulin与第一抗体结合的 条件下，将第一抗体与样品相接触；在引起第二抗体与结合了第一抗体的 zonulin结合的条件下，将结合的zonulin与第二抗体相接触；以及检测结 合的第二抗体。在某些实施方案中，第二抗体可以包含可检测的部分。可 检测的部分可以是可直接检测的，例如当所述部分是荧光基团时。在本发 明的某些实施方案中，可检测的部分可以与结合可检测部分的试剂相接 触。例如，可^全测部分可以是生物素，并且可以加入结合生物素(例如， 抗生物素蛋白或与例如碱性磷酸酶的酶偶连的抗生物素蛋白链菌素)的试 剂。当结合可检测部分的试剂包含酶时，典型的本发明的方法包括向结合
测底物向产物的转化。
本发明还涉及了用于评价病症的治疗，例如乳糜泻的治疗的有效性的 试剂盒。典型的这样的试剂盒包括检测zonulin的工具。用于检测zonulin 的工具可以包括一种或多种抗-△ G抗体、生物素化的抗-△ G抗体、抗-ZOT 抗体以及生物素化的抗-ZOT抗体，因此本发明的试剂盒可以包括一个或 多个包含一种或多种抗-AG抗体、生物素化的抗-AG抗体、抗-ZOT抗体 以及生物素化的抗-ZOT抗体的容器。在某些实施方案中，本发明的试剂 盒可以包括包含抗体的容器。该抗体可以是抗-IgG抗体、抗-IgA、抗-IgM
抗体和/或抗-IgE抗体。用于本发明试剂盒的抗体可以包含一种或多种可检
测的部分。在某些实施方案中，本发明试剂盒可以包括包含zonulin的容 器和/或包含△ G的容器。本发明的试剂盒可以包含一种或多种自身抗体的 蛋白结合伴侣(protein binding partners )。例如，本发明的试剂盒可以包括 一个或多个包含一种或多种人谷氨酰胺转移酶(tTG )、肌内膜抗原(EMA )、 酪氨酸磷酸酶(IA-2)、曱状腺过氧化物酶(TPO)、曱状腺球蛋白(TG)、 胰岛细胞或其中的蛋白质、胰岛素或谷氨酸脱羧酶(GAD)的容器。
本发明还涉及了用于评价乳糜泻治疗的有效性的试剂盒。典型的试剂 盒包括用于检测zonulin的工具。用于检测zonulin的工具可以包含一种或 多种抗-AG抗体、生物素化的抗-AG抗体、抗-ZOT抗体以及生物素化的 抗-ZOT抗体，因此本发明的试剂盒可以包括一个或多个包含一种或多种 抗-AG抗体、生物素化的抗-AG抗体、抗-ZOT抗体以及生物素化的抗 -ZOT抗体的容器。在某些实施方案中，本发明的试剂盒包括包含抗体的 容器。这些抗体可以是抗-IgG抗体、抗-IgA、抗-IgM抗体和/或抗-IgE抗 体。用于本发明的试剂盒的抗体可以包含一种或多种可检测的部分。在某 些实施方案中，本发明的试剂盒可以包括包含zonulin的容器和/或包含A G的容器。本发明的试剂盒可以包含一种或多种自身抗体的蛋白结合伴倡 (protein binding partners )。例如，本发明的试剂盒可以包4舌一个或多个包 含一种或多种人谷氨酰胺转移酶(tTG)、肌内膜抗原(EMA)、酪氨酸磷 酸酶(IA-2)、曱状腺过氧化物酶(TPO)、曱状腺球蛋白(TG)、胰岛细 胞或其中的蛋白质、胰岛素或谷氨酸脱羧酶(GAD)的容器。
附图简要说明


图1为显示进行GFD饮食的乳糜泻患者的乳糜泻生物标记的分析结 果的柱状图。
图2为显示进行GFD饮食的乳糜泻患者的自身抗体的分析结果的柱 状图。
图3为显示未进行GFD饮食的乳糜泻患者的乳糜泻生物标记的分析 结果的柱状图。
图4为显示未进行GFD饮食的乳糜泻患者的自身抗体的分析结果的 柱状图。
图5为显示患有相关AI病症的受试者的自身抗体的分析结果的柱状
图，其中显示与已存在的自身免疫(AI)病症(1型糖尿病、格雷夫斯病 或类风湿性关节炎)相关的自身抗体的含量。
图6为显示未患有相关的AI病症的受试者的自身抗体的分析结果的 柱状图，其中显示与已存在的自身免疫(AI)病症(1型糖尿病、格雷夫 斯病或类风湿性关节炎)相关的自身抗体的含量。
图7为显示进行GFD的受试者中抗曱状腺过氧化物酶(TPO )的自身 抗体的分析结果的线形图。
图8为显示进行GFD并且开始时具有TPO自身抗体的受试者的 zonulin分析结果的线形图。
图9为显示进行GFD的受试者中抗曱状腺球蛋白(TG)的自身抗体 的分析结果的线形图。
图10为显示进行GFD并且开始时具有TG自身抗体的受试者的血清 zonulin水平的分析结果的线形图。
图11为显示进行GFD的受试者中抗胰岛细胞(ICA)的自身抗体的 分析结果的线形图。
图12为显示进行GFD并且开始时具有ICA自身抗体的受试者的血清 zonulin水平的分析结果的线形图。
图13为显示进行GFD的受试者中抗谷氨酸脱羧酶(GAD)的自身抗 体的分析结果的线形图。
图14为显示进行GFD并且开始时具有GAD自身抗体的受试者的血 清zonulin水平的分析结果的线形图。
图15为显示经测试与HLA型相关的自身抗体呈阳性的受试者的百分 比的圆形分析图。
图16为显示与受试者年龄相关的自身抗体的含量的柱状图。
图17显示了患有所示的自身免疫性疾病HC (健康对照)、CD(乳糜 泻)、AIH (自身免疫性肝炎)、PBC (原发性胆汁性肝硬化)、DM (退化 性脊髓疾病)、APS-l ( 1型自身免疫性多腺体综合征)、MS (多发性硬化 症)的患者的血清zonulin水平的分析结果。
发明详述
本发明使用的受试者是指接受治疗的例如哺乳动物的任何动物。受试 者包括但不限于人类。
本领域技术人员应该理解本发明被用于评<介对以升高的血清zonulin 水平为特征的任何疾病进行治疗的有效性。特别地，本发明可以被用于评 价对与血清zonulin水平的升高相关的自身免疫性疾病进行治疗的有效性， 所述自身免疫性疾病例如乳糜泻、原发性胆汁性肝硬化以及退化性脊髓疾 病。
本发明的材料与方法可以被用于评价乳糜泻治疗的有效性。例如，在 治疗方案开始之前或伴随着治疗方案的开始，对需要治疗乳糜泻的受试者 的血清zonulin水平进行测定。在治疗过程中和/或后的适当时间，可以另 外一次或多次测定血清zonulin水平，并与治疗开始时获得的血清zonulin 水平相对比。因此，在本发明的某些实施方案中，本发明的方法需要从正 在接受治疗或已经接受完治疗的受试者中重复获取样品并且测定样品中 zonulin的水平。本发明的方法还需要将样品的zonulin水平与参考样品的 zonulin水平进行对比，所述参考样品可以来自相同的受试者(例如从治疗 开始时取得的样品)或不同来源。血清zonulin水平的降低是病症改善的 标志，表明治疗是有效的。
本发明的材料与方法可以被用于评价乳糜泻相关疾病的治疗的有效 性。本领域技术人员知道多种疾病都与乳糜泻相关联(参见，例如Lee和 Green, CwreW Qp/w'ow i /zewwato/ogy 2006, 18:101-107中第104页的表 1 )，本发明的材料与方法可以被用于评价乳糜泻相关疾病的治疗的有效 性。与乳糜泻相关的疾病可以包括例如周围神经病、小脑共济失调、癫 痫以及偏头痛的神经病；例如l型糖尿病、自身免疫性曱状腺障碍、阿狄 森氏病以及斑秃的内分泌疾病；例如先天性扩张性心月几病以及自身免疫性 心肌炎的心脏病；例如原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎以及自身免 疫性胆管炎的肝病；例如少关节型关节炎(oligoarticular arthritis )、幼年关 节炎、系统性红斑狼疮以及史格兰氏综合征的风湿病；以及例如贫血症、 骨质疏松症或骨质减少、特纳氏综合征、唐氏综合征、牙齿釉质缺损(dental enamel defects)、肉状瘤病、乳糖不耐受症、疱渗样皮炎(灼烧、骚痒、水 疱渗(blistering rash))的其它疾病以及其它皮肤障碍、原因不明性不孕、 流产以及复发性急性胰腺炎。
本发明的材料与方法可以被用于评价对包括但不限于自身免疫性疾 病的多种病症进行治疗的有效性。自身免疫性疾病的例子包括但不限于 IgA肾病、魏格纳肉芽肺病、多发性硬化、硬皮病、系统性硬化病、类风
湿性关节炎、克罗恩氏病、红斑狼疮、桥本氏曱状腺炎(曱状腺功能减退
(underactive thyroid ))、格雷夫斯病(甲状腺功能亢进)、自身免疫性内耳 疾病、大疱性类天疱痴、德维克病、肺出血肾炎综合征(Goodpasture's syndrome ) 、 Lambert-Eaton肌无力综合征(Lambert-Eaton myasthenic syndrome, LEMS )、自身免疫性淋巴增生性综合征(ALPS )、副癌综合征 以及多腺体自身免疫综合征(PGA)。
本发明的材料与方法可以被用于评价引起肠通透性升高的胃肠炎症 的治疗的有效性。因此，本发明可以用于评价例如引起蛋白损失的肠病的 肠道病症的治疗。产生蛋白损失的肠病的原因
例如艰难梭状芽孢杆菌(C7oyfrWz^4界"7e)感染、小肠結肠炎、志 贺氏菌病、病毒性胃肠炎、寄生虫侵染、细菌过度生长、惠普尔病；
例如胃炎的伴有黏膜糜烂或溃疡的疾病、胃癌、胶原性结肠炎、炎症 性肠病；以及
例如梅内特雷尔病的不伴有溃疡的都膜疾病、乳糜泻、嗜酸细胞性胃 肠炎。
本发明还包括用于评价治疗有效性的试剂盒以及用于测定例如血清 中的zonulin浓度的试剂盒。典型的本发明的试剂盒包括一个或多个包含 一种或多种用于实施本发明的试剂的容器。用于实施本发明的试剂包括但 不限于緩冲液、緩冲盐、金属离子、发色的化合物、抗体、酶、荧光化合 物等。本发明的试剂盒可以包括一个或多个包含zonulin、 AG或其它可用 作参考标准的化合物的容器。本发明的试剂盒可以包括包含一种或多种抗
体的容器，其中抗体与可检测的部分偶连。可检测部分可以是本领域技术 人员已知的任何物质，例如酶(例如过氧化物酶、荧光素酶)、其它蛋白 质(例如绿色荧光蛋白质)、光学上可检测的化合物(例如荧光基团、发 光团)、配对结合(binding pair)成分(例如生物素/抗生物素蛋白链菌素、 异羟基洋地黄毒戒元/抗异羟基洋地黄毒甙元)、或其它本领域技术人员已 知的任何可才企测的部分。当本发明的试剂盒包含酶时，该试剂盒可以包括 一个或多个包含酶的底物的容器。
提供以下实施例的目的仅是用于说明，决不是要限制本发明的范围。
实施例1
病人与方法
病人为54名经诊断患有CD的病人(20名男性和34名女性；平均年 龄39岁；经活组织;险查证实42/54)。在8名受试者中发现相关的AD (2名1型糖尿病、l名格雷夫斯病、5名类风湿性关节炎)。
在诊断时和进行平均周期为17个月的GFD (范围乂人10至49)后收 集血清样品。测定所有血清样品中与CD (抗谷氨酰胺转移酶-tTG、抗肌 内膜抗体-EMA)、 1型糖尿病(IA-2:酪氨酸磷酸酶，IAA:抗胰岛素抗 体，GAD:谷氨酸脱羧酶)、曱状腺炎(TPO:曱状腺过氧化物酶抗体， TG:曱状腺球蛋白抗体)相关的自身抗体以及zonulin水平。
通过夹心酶联免疫吸收分析来测定血清zo皿lin。根据El Azmar等 Gastroenterology 123:1607-1615, 2002的记载并稍加变化，进4亍zonulin夹心 酶4关免疫吸收分析(ELISA)。
简言之，塑料微量滴定板(Costar， Cambridge, MA )经兔zonulin包 被，所述兔zonulin与抗闭合小带毒素(Zot )的衍生物△ G IgG抗体(0.1mol/l 碳酸钠緩沖液中lOug/ml, pH9.0)进行交叉反应。使用标准方法通过用A G对兔免疫来制备这些抗体。
在4。C下孵育过夜后，在含0.05%吐温20的Tris援冲盐(TBS-T)中 清洗滴定板四次，用TBS-T在37。C下孵育l小时进行封闭。在TBS-T清 洗四次后，力。入五种AG系列标准品(50、 25、 12.5、 6.2、 3.1以及0ng/ml) 和病人血清样品(在TBS-T中以1: 101稀释)，在4。C下孵育过夜。用含 0.2%吐温20的Tris緩冲盐清洗四次后，将滴定板在4。C下与生物素化的 抗Zot IgG抗体(美国专利No. 5，945，510) —起孵育4小时，并且与抗生 物素蛋白链菌素偶连的碱性磷酸酶相接触。使用商业化的试剂盒(ELISA 扩增试剂盒；Invitrogen)进行显色反应。利用微板自动读数仪(Molecular Devices Thermomax微板读数4义)测量495nm下的吸收^i 。
使用商业上可获得的试剂盒检测自身抗体抗(人)-谷氨酰胺转移酶 (抗-tTG)酶联免疫吸收分析(ELISA)， Scimedx公司，新泽西州；抗-肌内膜抗体(抗-EMA)间接免疫荧光抗体分析(IFA)，其利用了猴食管 组织，Scimedx公司，新泽西州；抗-酪氨酸磷酸酶(抗IA-2 )放射免疫 分析(RIA)， Kronus Boise研究中心，爱达荷州；抗-曱状腺过氧化物酶 抗体(抗-TPO)酶免疫分析(EIA), Scimedx公司，新泽西州；抗-甲状 腺球蛋白(抗-TG)EIA, Scimedx公司，新泽西州；抗-胰岛细胞抗体(抗 -ICA) IFA，其利用了猴胰腺组织，Scimedx公司，新泽西州；抗-胰岛素
抗体(IAA) RIA， Kronus Boise研究中心，爱达荷州；以及抗-谷氨酸脱 羧酶(抗誦GAD) RIA， Kronus Boise研究中心，爱达荷州。
在经诊断患有CD的病人中，76%表现出血清zonulin升高，39%检测 到自身抗体(TPO: 21.7 % , TG 19.6 % ， GAD 6.5 。/。 ， ICA 4.4 %以及IA-2 2.5 % )。经过GFD后，13 %的病人的EMA和zonulin，以及35 %的受试者 的tTG保持变化的状态。某些自身抗体降低(TPO: 10.9%， GAD4.4%), 而其它保持不变(TG23.9%, ICA 4.4 %以及IA-2 2.2 % )。 53个病人中有 7人没有进行GFD。这些受试者的zonulin、 EMA以及tTG发生变化，他 们当中的14%的自身抗体呈阳性。在这些受试者中，在随后的评价中 zonulin水平与血清自身抗体都不发生变化。结论未治疗的CD特异性地 显示出zonulin上调并且血清自身抗体的含量升高。经GFD治疗后，血清 zonulin水平趋于正常，出现了与某些自身抗体(特别是TPO)的含量降低 相关联的情形。上述结果间接地表明肠屏障功能的恢复可以降低相关自身 免疫现象的风险。这些结果还表明如果早期(年龄低于30岁)进行GFD 治疗，自身抗体会出现血清转化，这表明如果CD被及早地诊断并开始进 行GFD，则可能产生对抗自身免疫共同发病的保护作用。
实施例2
图17显示了从病人获得的血清进行血清zonulin水平分析的结果，所 述病人患有所示的自身免疫疾病HC(健康对照)、CD(乳糜泻)、AIH(自 身免疫性肝炎)、PBC (原发性胆汁性肝硬化)、DM(退化性脊髓疾病)、 APS-1 (l型自身免疫性多腺体综合征)、MS(多发性硬化)。乳糜泻、自 身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化以及退化性脊髓疾病均与升高的血清 zonulin水平相关。
尽管本发明已经通过参考其中的特定实施方案的方式进行了详细描 述，然而对于本领域的普通才支术人员而言显而易见的是，可以在不脱离本 发明的精神和范围的条件下做出各种变化和修正，并且这样的变化和修正 可以在所附的权利要求书的范围内实施。引入本发明作为参考的所有专利 和公开出版物均被特意地和分别地指明引用其全文作为参考。
权利要求
1.一种评价对受试者病症的治疗的有效性的方法，所述受试者需要所述治疗，所述方法包括从所述受试者获取样品；以及测定所述样品中的zonulin浓度。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述样品为血液样品。
3. 根据权利要求2所述的方法，进一步包括 从所述样品中分离血清；以及测定所述血清中的zonulin浓度。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述病症与上皮通透性的升高有关。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述上皮活性的升高与紧密连 接的通透性的升高有关。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述病症为与升高的血清zonulin 水平相关的自身免疫性疾病。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述病症为乳糜泻。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中所述病症为与乳糜泻相关的疾病。
9. 根据权利要求1所述的方法，其中所述与乳糜泻相关的疾病选自 周围神经病、小脑共济失调、癲痫、偏头痛、1型糖尿病、自身免疫性曱 状腺障碍、阿狄森氏病、斑秃、先天性扩张性心脏病、自身免疫性心肌炎、 原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎、自身免疫性胆管炎、少关节型关 节炎、幼年关节炎、系统性红斑狼疮、史格兰氏综合征、贫血、骨质疏松 症、骨质減少、特纳氏综合征、唐氏综合征、牙齿釉质缺损、肉状瘤病、 乳糖不耐受、疱渗样皮炎、原因不明性不孕、流产以及复发性急性胰腺炎。
10. 根据权利要求1所述的方法，其中所述测定zonulin浓度包括 在结合条件下，将所述样品与结合zonulin的第 一抗体相接触； 在结合条件下，将所述结合的样品与结合zonulin的第二抗体相接触；以及检测所述结合的第二抗体的存在。
其中制备至少一种抗包含闭合小 其中制备抗包含闭合小带毒素片 其中制备抗包含闭合小带毒素的 其中所述AG片段包含N末端六 其中制备至少一种抗包含闭合小 其中制备包含闭合小带毒素的蛋 其中所述第二抗体包含可检测的
11. 根据权利要求10所述的方法 带毒素片段的蛋白质的抗体。
12. 根据权利要求10所述的方法 段的蛋白质的第一抗体。
13. 根据权利要求10所述的方法 △ G片段的蛋白质的第一抗体。
14. 根据权利要求13所述的方法， 个组氨酸标记。
15. 根据权利要求10所述的方法 带毒素的蛋白质的抗体。
16. 根据权利要求10所述的方法 白质的第二抗体。
17. 根据权利要求16所述的方法 部分。
18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述可检测的部分为生物素。
19. 一种评价对乳糜泻治疗的功效的方法，包括 从受试者中取得样品；以及测定所述样品中的zonulin浓度。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述样品为血液样品。
21. 根据权利要求19所述的方法，进一步包括 从所述样品中分离血清；以及 测定在所述血清中的zonulin浓度。
22. 根据权利要求21所述的方法，其中所述测定zonulin浓度包括 在结合条件下，将所述样品与结合zonulin的第一抗体相接触； 在结合条件下，将所述结合的样品与结合zonulin的第二抗体相接触;以及检测所述结合的第二抗体的存在。
23. 根据权利要求22所述的方法，其中制备至少一种抗包含闭合小 带毒素片段的蛋白质的抗体。
24. 根据权利要求23所述的方法，其中制备抗包含闭合小带毒素片 段的蛋白质的第一抗体。
25. 根据权利要求22所述的方法，其中制备抗包含闭合小带毒素的 △ G片段的蛋白质的第一抗体。
26. 根据权利要求25所述的方法，其中所述AG片段包含N末端六 个组氨酸标记。
27. 根据权利要求22所述的方法，其中制备至少一种抗包含闭合小 带毒素的蛋白质的抗体。
28. 根据权利要求22所述的方法，其中制备抗包含闭合小带毒素的 蛋白质的第二抗体。
29. 根据权利要求28所述的方法，其中所述第二抗体包含可检测的 部分。
30. 根据权利要求29所述的方法，其中所述可检测的部分为生物素。
31. —种用于评估治疗功效的试剂盒，包括用于检测zonulin的工具。
32. 根据权利要求31所述的试剂盒，其中所述用于检测zonulin的工 具包括包含第一抗体的容器和包含第二抗体的容器。
33. 根据权利要求31所述的试剂盒，进一步包括包含闭合小带毒素 的AG片段的容器。
34. 根据权利要求31所述的试剂盒，其中制备至少一种抗包含闭合 小带毒素片段的蛋白质的抗体。
35. 根据权利要求31所述的试剂盒，其中制备抗包含闭合小带毒素 片段的蛋白质的第一抗体。
36. 根据权利要求31所述的试剂盒，其中制备抗包含闭合小带毒素 的△G片段的蛋白质的第一抗体。
37. 根据权利要求36所述的试剂盒，其中所述AG片段包含N末端 六个组氨酸标记。
38. 根据权利要求31所述的试剂盒，其中制备至少一种抗包含闭合 小带毒素的蛋白质的抗体。
39. 根据权利要求31所述的试剂盒，其中制备抗包含闭合小带毒素 的蛋白质的第二抗体。
40. 根据权利要求39所述的试剂盒，其中所述第二抗体包含可检测 的部分。
41. 根据权利要求40所述的试剂盒，其中所述可检测的部分为生物 素。
42. 根据权利要求31所述的试剂盒，进一步包括包含zonulin的容器。
43. —种用于评价乳糜泻治疗功效的试剂盒，包括用于检测zonulin 的工具。
44. 根据权利要求43所述的试剂盒，其中所述用于检测zonulin的工 具包括包含第一抗体的容器和包含第二抗体的容器。进一步包括包含闭合小带毒素其中制备至少一种抗包含闭合其中制备抗包含闭合小带毒素其中制备抗包含闭合小带毒素其中所述AG片段包含N末端其中制备至少 一种抗包含闭合其中制备抗包含闭合小带毒素其中所述第二抗体包含可检测其中所述可检测的部分为生物54.根据权利要求43所述的试剂盒，进一步包括包含zonulin的容器。
45. 根据权利要求43所述的试剂盒, 的AG片段的容器。
46. 根据权利要求43所述的试剂盒， 小带毒素片段的蛋白质的抗体。
47. 根据权利要求43所述的试剂盒, 片段的蛋白质的第一抗体。
48. 根据权利要求43所述的试剂盒， 的AG片段的蛋白质的第一抗体。
49. 根据权利要求48所述的试剂盒， 的六个组氨酸标记。
50. 根据权利要求43所述的试剂盒， 小带毒素的蛋白质的抗体。
51. 根据权利要求43所述的试剂盒， 的蛋白质的第二抗体。
52. 根据权利要求51所述的试剂盒， 的部分。
53. 根据权利要求52所述的试剂盒，
全文摘要
本发明提供用于评价治疗功效的材料和方法。在某些实施方案中，本发明提供一种通过测定接受治疗的受试者的血清zonulin水平来评价乳糜泻治疗的功效的方法。
文档编号G01N33/543GK101189518SQ200680016527
公开日2008年5月28日 申请日期2006年5月11日 优先权日2005年5月13日
发明者A·法撒诺 申请人:马里兰巴尔的摩大学