专利名称：：肝病的诊断方法和用于筛选治疗这种疾病的分子的方法肝病的诊断方法和用于筛选治疗这种疾病的分子的方法本申请的目的是肝病的诊断方法。其另一个目的是筛选用于治疗这种疾病的分子的方法。载脂蛋白A4(ApoA4)是一种大量流通的载脂蛋白。这种蛋白质的表达在啮齿目动物的下丘脑、小肠和肝脏中一皮证实。在小鼠血浆中存在的ApoA4的大部分被认为是肠源的(Wu等人，JBC254,7316-73221979)。在人类中，Elshourbagy(JBC2621987)名又述ApoA4的合成一皮限制在小肠中。ApoA4具有多种功能。它借助于不同的机理调节脂类的运输和代谢，比如活化自肝组织流出的胆固醇和刺激脂蛋白脂肪酶的活性(Stan等人，BiochimBiophysActa,16312003,177-187)。ApoA4还已知是饱胀感因子。肝病成为公众健康的重大问题。因此借助于特定的敏感测定方法在尽可能早的时期诊断各种肝病是非常必要的。本申请人意外地发现，ApoA4在人的肝脏中被表达，在肝病时编码ApoA4的基因的肝脏表达水平明显地增高。本发明的目的是肝病的检测、诊断或预测的方法，该方法包括测量在肝细胞或肝组织中，或者在这些细胞和组织的提取物中，或者在血液及其衍生物中ApoA4的表达。本发明的另一个目的是不仅测量在该细胞或肝组织中ApoA4的表达，而且还测量在存在肝源ApoA4的血液中的表达。一种方法可包括如下的步骤-分离肝细j包、肝组织或者这些细i包和组织的提取物，或者血液或其书f生物，以及一测量ApoA4的表达。通过溶解肝细胞和肝组织就能够得到这种提取物。肝病应该理解为对肝组织和肝细胞具有影响的各种疾病，可以是慢性的，也可以是病原性的(酒精性、病毒性、毒性、饮食性、环境性等)。更具体说，本发明的目的是对脂肪肝、肝癌发生、肝硬化、病毒性肝炎、肝细胞功能不足、胆汁郁积、门静脉高血压、脂肪变性和脂肪肝、肝脏静脉和动脉疾病、纤维化、月巴胖症和代j射综合症的才全测、诊断或预测的方法。血液书f生物应当理解为通过物理处理(比如离心)或生物处理(例如，凝结)或化学或其它能够得到这些衍生物的处理方法得到的来源于血液的各种细胞或非细胞部分。这样的衍生物优选是血浆和血清。按照本发明的一个实施方式，所述方法包括测量从在希望诊断或预测肝病的个体的肝细胞或肝组织中编码ApoA4的基因转录的信使RNA(mRNA)的量。将所述哺乳动物.的肝细力包或肝组织，或者在其血液或其衍生物中的细胞提取，并且用本领域技术人员已知的方法进行处理，特别是为了避免信使RNA和蛋白质降解，然后测量由编码ApoA4的基因转录的信使RNA的量。按照特别有利的方式，按照所谓定量聚合酶链式反应即QPCR方法，通过扩增来测量转录的信使RNA的量。按照这种技术，提取全部RNA并将其提纯，借助于反向转录酶，将在提取液中所含的信使RNA在第一时间;波转化为互补DNAs(cDNAs)。在本发明中优选使用的聚合酶是Taq聚合酶，但也可以是具有聚合酶活性并可在PCR操作条件下可以使用的各种其它酶。由于其性能，这种酶可4吏在每一个合成周期中初始的DNA的量倍增。对由生物试样中所含的mRNA衍生得到的cDNA的分析是通过定量PCR实时进行的。按照基本上包括周期重复的方法，借助于ApoA4序列的特定引物和探针对cDNA进行扩增，该周期包括如下步骤-通过对由试样制备的cDNA进行加热来分离待扩增的链，-对探针和一对正义引物和反义引物进行杂交，以及-通过用聚合酶延长来进行DNA链的新的合成。正义引物和反义引物有利地含有至少15个核苷酸，并与相应于SEQIDN。13(基因数据库No.NM000482)的人的ApoA4序列或与其互补序列具有至少80%,优选90%,和更优选95%的同一性。在扩增反应过程中，反应产物或amplimdre借助于探针进行^^佥测，该探针由寡核香酸组成，该寡核苷酸包括至少15个核苷酸和与相应于SEQIDN。13(基因数据库No.NM000482)人ApoA4的序列或与其互补序列具有至少80%的同一性，优选90%,更优选95%。对于正义片段和反义片段分别选择两种引物，使得能够进行DNA片段的扩增。探针本身的目标是为了与通过两种引物的位置界定的扩增产生的DNA片段进行杂交。该探针有利地具有比引物的理论Tm高大约10°C±0.5的理论融合温度Tm。所述寡核苷酸(引物和探针)优选含有15~25个核苷酸。该方法实施多个周期，足可以得到能够测量数量的扩增产物(n=40)。用于编码人ApoA4的基因扩增的引物优选具有如下序列SEQIDN01:gcagctggctccctatgct以及SEQIDN。2:ggaaggtcaggccctcaag。探针优选具有SEQIDN°3的序列cacgcaggagaagctcaaccacca,。按照本发明的一个优选实施模式，该探针含有显示的分子或者分子系统。所述显示系统优选由报道基因着色剂和焚光淬灭着色剂构成，它们分别固定在探针的5，和3'末端上。按照一个有利的实施方式，可显示系统由分别固定在探针的5，和3，末端上的6-羧基荧光素(FAM)和6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)表示的"报道基因/淬灭基团，，对构成。为了在本发明的范围内实施PCR,可以参考PCR技术的一般性综述，试剂和热循环器制造商和销售商的i兌明书，特别是由PerkinElmerAppliedBiosystem出片反的才示题为《QuantitationofDNA/RNAUsingReal-TimePCRDetection》的说明书(1999)和PCR操作规程(AcademicPress出版社New-York1989)。4吏用QPCR才企测法的优点之一就是对PCR产物的分析可通过读出在该周期的过程中得到的荧光而直接在PCR周期的末尾进行。因此，不必使用PCR产物，对于后面的分析，这种产物是具有被污染的风险的。另外，对在反应开始时使用的靶的数目进行定量是很可靠的并且是可重现的。借助于荧光探针在PCR周期的过程中进行PCR产物的检测。这对于检测PCR的产物这是必要的，且该检测刚好在PCR指数期而不是在最终点进行。因此，此检测原理是更为灵敏而具有特异性的。QPCR的另一个优点在于，由于"热启动"的原理，避免了非特异性的扩增，PCR是在初期变性时活化的热稳定的DNA聚合酶存在下实时进4亍的。按照本发明的另一个实施模式，按照本发明的方法包括测量在肝细胞或肝组织中，或者在血液或其衍生物中存在的ApoA4蛋白质或蛋白质片段的量。按照一种特别有利的方式，借助于至少一种此蛋白质的特异性抗体，进行ApoA4蛋白质或蛋白质片段数量的测定。此抗体可通过一种方法得到，该方法在于任选在比如Freund助剂的助剂存在下，向比如啮齿目的动物注射提纯的人的ApoA4蛋白质乳液或者大约20个氨基酸的ApoA4肽序列。注射重复进行，收集抗血清。对于希望对肝的ApoA4进行定量的个体，测量在此类抗体与在其肝细月包或肝组织中或者在血液及其书f生物中存在的ApoA4之间的联系，可通过各种适当的方法进4亍。优选可通过ELISA4支术("Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay"的缩写)进行,更优选是通过所谓"三明治(enSandwich)"的方法进行。所谓"三明治"法利用两种抗体第一种捕捉抗体与比如微型板的固定相相连接，而第二种检测抗体能够对蛋白质定量。按照此技术，检测抗体与过氧化酶偶联。与ApoA4蛋白质相结合的抗体就与没有结合的抗体分离，并与过氧化酶底物相接触，优选为O-苯二胺二盐酸盐。比色反应能够对结合的抗体数定量，因此就对结合的蛋白质定量。借助于适当的仪器测量此比色反应，比如测定光密度。通过使用至少两种抗体进行反应的扩增，一种是没有与过氧化酶偶联的抗ApoA4抗体，另一种是识别第一种抗体的与过氧化酶偶联的抗体。另外，可使用另一种抗ApoA4抗体来固定ApoA4抗体在载体上的复合物，如此使此复合物容易分离和分离出非固定的抗体。也可以使用由放射性同位素标记的抗体来测定此抗体与ApoA4之间的连接。在此实施方式中，与蛋白质ApoA4结合的抗体被分离，借助于适合于所用同位素的测量设备来测量抗体-ApoA4复合体的放射性。可以使用ELISA技术和放射性同位素技术以外的技术为蛋白质ApoA4进行测定含量，比如比浊法和浊度测定法。特别地，为了得到抗体和使用ELISA技术以及放射性同位素技术，可以参考手册《Antibodies,ALaboratoryManual》(ColdSpringHarborPress(1988))。本发明的另一个目的是筛选用来预防或治疗肝病的化合物的方法，该方法包括如下步骤-使所述化合物与哺乳动物接触，以及-测定在所述哺乳动物的所述肝源细胞中或在血液和血细胞衍生物中ApoA4的表达。肝脏)表达的各^t哺乳^/物:、它有利地可是啮齿目动物，优选是小鼠:、有利地使用具有肥胖症天然倾向的动物系。因此，比如优选4吏用BalbcByJ、DIOBalbcByJ、DIOBalbcAnN或DIOC57BI/6J系小鼠。可如在上面所叙述的，通过测量在所述哺乳动物的肝细胞或肝组织或者在血液及其^"生物中表达的ApoA4的量或者通过测量由在所述哺乳动物的肝细胞或肝组织中编码ApoA4的基因转录的信使RNA的量来进行ApoA4表达的测定。下面的实施例用来说明本发明而不对其构成限制。实施例1:通过对转录的信使RNA和血浆ApoA4蛋白质定量，来测定正常小鼠(C57B16)或肥胖小鼠(C57B16/obob)的ApoA4表达l.材料和方法实验的操作程序对正常小鼠(C57B16)或肥胖小鼠(C57B16/obob)进4亍血液提取，并在10，000rpm下离心IO分钟，取出血浆。取一'J、块肝脏(75~130mg)放入装有1.5mLRNALater(Ambiom)的2mL试管中。在-20。C下保存肝脏和血浆，以对mRNA和蛋白质ApoA4进4亍测定含量。用QPCR实时分4斤小鼠ApoA4的表达此技术分两个主要步骤，涉及到l.提取并才是纯全部RNA,然后将在试样中所含的ARNm转化为互补DNA(cDNA)。2.用定量PCR实时分析cDNA。以相对于不变内参照基因(比如P2-微球蛋白或18S核糖体RNA)的％给出该基因的相对表达。序列分析仪7900HTFastReal-TimePCRSystem和扩增试剂都由AppliedBiosystem公司提供。方法制备组织溶解液(lysats)切下80mg小鼠的肝脏并立即浸入到2mL的RNALater中，以在操作之前尽可能保存RNA的完整性。将一小块肝脏在保持千燥下被转移到加入了2mL溶解緩冲液(全RNA提取试剂盒，由QIAGEN^>司出售的RNeasyMidiKit)和两个钢球(直径3mm)的Eppendorf试管中。使用组织溶解机(QIAGEN公司出售)通过在30Hz下震荡5分钟进行组织溶解。在此步骤中溶解液可保存在-2(TC。提取全RNA在14,000xg下将溶解液离心3分钟，用QIAshredder(QIAGEN公司出售)(3x0.7mL)过滤。按照RNeasyMidi试剂盒的操作^L程和Dnase步骤进行提取。最后一步是将全RNA洗脱在150jliL水中。通过测定在260nm的光密度(DO)得到RNA的浓度。合成互补DNA(cD圃使用逆转录试剂盒SuperscriptIII(INVITROGEN公司出售)，从5jxg全RNA合成cNDA。将得到的cDNA回收在20pL的最终体积中。用7900HT通过PCR分析基因表达将5|uLcDNA的稀释液添加到15pL特别含有如下物质的反应混合物中緩冲液、PCR反应必需的聚合酶以及引物和对待定量基因的特定探针。后者可以TaqmanGeneExpressionAssays的形式从供应商那里得到。P2-微球蛋白(B2-m)或18S核糖体RNA可用作内标。用于人和小鼠编码ApoA4和0的基因的扩增的引物和探针的序列列在表VII中(SEQIDN°.1至SEQIDN°.12)。基因扩增反应使用温度循环(变性95°C/15s，然后杂交和合成60°C/1分钟)在96穴或384穴的微型板上进行。分析时间为90分钟。将扩增的动力学(作为循环数函数的扩增信号)在指数期线性表示法中进行分析(软件SDS企业数据库)。在此期间内定义了Ct,这是在恒定扩增信号时测量的循环数，Ct反比于在源试样中存在的信使RNA的量。粑基因(ApoA4)和内参照(B2-m)之间Ct的差值(ACt),通过方程式Q二(2)-^t给出了相对多度(给出的值用相对于参照基因的％表示)。通过ELISA三明治法测定小鼠血浆中ApoA4的量抗体4乾才足#元体是由(SantaCruzBiotechnology^〉司,2145DelawareAvenueSantaCruz,California95060,USA)出售的山羊抗-ApoA4。从由对应于小鼠ApoA4的C-封端序列(氨基酸361-380)的肽免疫的兔子得到针对小鼠ApoA4的抗血清。经皮下给动物注射与载体蛋白(KLH)偶联的肽在Freund氏完全佐剂中的乳液。用在Freund氏不完全佐剂偶联的肽的乳液进行后面的注射。在第三次接种10天之后收集抗血清，并且用对与色镨凝胶偶联的肽具有亲合性的色谱提纯此抗血清。实施ELISA三明治法在2(TC下，在96穴板的穴中培养100jiL在PBS中浓度为4|ag/mL的山羊抗ProA4抗体4小时。在用含有0.1%的Tween20的PBS清洗之后，在环境温度下，在60分钟中，用含有0.5%牛血清白蛋白(BSA)的PBS緩沖溶液阻断非特异性结合位点。加入100iuL血浆试样(在含有0.1%BSA的PBS稀释液，1/3000~1/20000)，并在4。C下培养过夜。在清洗之后，加入100juL浓度为0.1jug/mL的抗小鼠ApoA4的兔多克隆抗体，并在环境温度下培养1小时。在清洗之后，加入100juL抗兔IgG-过氧化酶结合物(P正RCE1/200在含有0.:r/。BSA的PBS中)，并在环境温度下培养1小时。在清洗之后加入150juL含有O-苯二胺和过氧化氬的溶液，作为过氧化酶(Sigma)的底物。在20分钟之后，加入50juL的3M的石克酸中止反应，测量在492nm处的光密度。2.结果表IA显示出ApoA4在小鼠中组织分布，ApoA4表达于平滑月几、小肠、肝、结肠、胎盘、胃、卵巢、直肠、脂肪组织等当中。注意到在小肠中有很强的表达。表IB证实了在小肠中的强烈表达和ApoA4在不同区域(十二指肠、空肠、回肠)中的定^i。表II显示出Apo在肝和血浆中的表达，还显示出如果将正常小鼠和肥胖小鼠进行比较，则在肝和血浆中此表达增加。实施例2:通过对转录的信〗吏RNA定量来测定ApoA4在人中的表逸从人的肝制备cDNA,如在前面的实施例中所述的对于从小鼠的肝进行制备那样进行测量。通过QPCR对人ApoA4表达进行实时分析的结果表m显示出ApoA4在人中的组织分布存在于子宫底部、食道、视网膜、胎盘、附睾和脂肪組织中。注意到在小肠当中的强烈表达，这与文献中的数据是符合的。在整个肝中的很小表达，但似乎集中在肝静脉(hepatoportale)区。表IV-A证实了ApoA4在小肠区(空肠、回肠、十二指肠)定位的结果。还显示出ApoA4在肝脏中的局部表达更与某些病理生理状态(肝脏的门静脉系统)有密切联系(表IV-B)。这个结果在表V-A和VI中得到证实，这两个表汇总了对病理肝脏和正常肝脏的不同试样进行的ApoA4分析结果。比4支高的值与如下的疾病相关肝硬化、《良疮、梗塞。通过对其4也载脂蛋白ApoAl、ApoA2和ApoA5的ApoA4的比较分析(表IV和V-B)，显示出ApoA4作为这些疾病潜在标记物的特异性。实施例3:通过ELISA三明治法测量人血浆中ApoA4蛋白的量抗体4乾才足4元体是由(SantaCmzBiotechnology,Inc.2145DalawareAvenueSantaCruz,California95060，USA)销售的山羊抗ApoA4抗体。如WeibergRB、HopkinsRA、JonesJB(MethodsEnzymol.1996;263:282-96.Purification,isoformCharacterization,andquantitationofhumanapolipoproteinA4)所述乂人人血浆得到纯^i的人ApoA4。从兔子得到针对人ApoA4的抗血清。对动物皮下注射纯化的人ApoA4在Freund氏完全佐剂中的乳液。用纯化的ApoA4在Freund氏不完全佐剂中的乳液进行后面的注射。在第三次接种10天之后采集抗血清。实施ELISA三明治法在20。C下用100juL浓度为4jug/mL的在PBS中的山羊抗ApoA4抗体培养96穴板的穴4小时。在用含有0.1%的Tween20的PBS清洗之后，在环境温度下，用含有0.5%牛血清白蛋白(BSA)的PBS緩冲液阻断非特异性结合位点60分钟。加入100ml血浆试样(稀释在含有0.1%bsa的pbs,1/3000~1/20000),并在4。C下培养过夜。在清洗之后加入100juL兔的抗人ApoA4的多克隆血清抗体(在PBSSAB中稀释到1/5000),并在环境温度下培养1小时。在清洗之后，加入100pL抗兔IgG-过氧化酶结合物(PIERCE1/200在含有0.1%BSA的PBS中)，并在环境温度下培养1小时。在清洗之后，加入150iuL含有O-苯二胺和过氧化氢的溶液作为过氧化酶(Sigma)的底物。在20分钟之后，加入50juL的3M硫酸中止反应，并测量在492nm的光密度。实施例4:月巴胖症和人的肝脏ApoA4通过分析ApoA4在超重病人肝脏中的表达，进行着眼于肥胖症的研究。此病理与体重指数(IMC二体重(kg)/身高(m)2)相关。正常的体重对应于IMC<25。通过实验，用前面叙述的QPCR技术，从Asterand公司(TechOneBidg,Suite501,440Burroughs,DetroitMI48202,USA)提供的人类肝脏RNA的采集来分析载脂蛋白的表达。体重指数(IMC,或BMI(身体质量指数))由Asterand给出。结果列于表VIII中。可以看出在ApoA4的表达的百分数和体重指数之间的正相关关系。此结果显示使用ApoA4作为诊断或预测和治疗性跟踪肥胖症的是恰当的。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表IB:ApoA4在小肠各段的表达(%|32-m,平均值土标准偏差(4种动物))<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表II:ApoA4的mRNA在肝脏中的表达和在正常小鼠(C57B16)或肥胖小鼠(C57B16/obob)的血浆中ApoA4的测量<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表IVA:载脂蛋白在肠中的表达<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表VA:人ApoA4在肝脏试样中的表达<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表VB:人ApoAl、A2和A5在肝脏试样中的表达<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表VI:ApoA4在人体试样中的表达<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表VII:通过定量PCR用于人和小鼠P2-微球蛋白和ApoA4计量的底物和探针的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>权利要求1.肝脏病的诊断或预测的方法，该方法包括测定ApoA4在肝细胞或肝组织中或者在血液及其衍生物中的表达。2.按照权利要求1的方法，该方法包括如下步骤-分离肝细胞、肝组织或者这些细胞和组织的提取物，或者血液或其其衍生物，以及-测量ApoA4的表达。3.按照权利要求1和2中之任一项的方法，其特征在于，该方法包括测定在肝细胞或肝组织中表达的、由编码ApoA4的基因转录的信使RNA的量。4.按照权利要求3的方法，其特征在于，此转录信使RNA的量是通过PCR法测定的。5.按照权利要求4的方法，其特征在于，此转录信使RNA的量是通过定量PCR法测定的。6.按照权利要求1和2中之任一项的方法，其特征在于，该方法包括测定在肝细胞或肝组织中，或者在血液及其衍生物中表达的蛋白质ApoA4的量。7.按照权利要求6的方法，其特征在于，借助于此种蛋白质的至少一种特异性抗体来测定ApoA4的量。8.按照权利要求7的方法，其特征在于，将此特异性抗体与过氧化酶偶联关并且用放射性同位素标记。9.按照权利要求7和8中之任一项的方法，其特征在于，通过ELISA技术测定该抗体与该蛋白质的结合。10.筛选或检测用于预防或治疗肝脏病的化合物的方法，该方法包4舌如下步骤-使所述化合物与哺乳动物4妻触，以及胞衍生物中的表达。11.按照权利要求10的方法，其特征在于，该方法包括测量在所述哺乳动物的肝细l包或肝组织中，或者在血液及其々亍生物中表达的ApoA4的量。12.按照权利要求10的方法，其特征在于，该方法包括测量由一种或多种编码ApoA4的基因转录的信使RNA的量，ApoA4在所述哺乳动物的肝细胞或肝组织中或者在血液及其书f生物中表达。13.按照权利要求10至12中之任一项的方法，其特征在于，所述哺乳动物是BalbcByJ、DIOBalbcByJ、DIOBalbcAnN或DIOC57BI/6J系小鼠。全文摘要本申请的目的是肝脏病的诊断方法，该方法包括测定载脂蛋白A4在肝细胞或肝组织中，或者在循环系统(血液、血浆、血清)中的表达。本发明还涉及筛选用于治疗此类疾病的化合物的方法，即使所述化合物与哺乳动物接触，测量载脂蛋白A4在所述哺乳动物的所述肝源细胞或循环系统中的表达。文档编号G01N33/92GK101310187SQ200680042567公开日2008年11月19日申请日期2006年11月10日优先权日2005年11月10日发明者D·西蒙,H·维达尔,I·布伊森,J·马钱德,P·卡塞拉斯,S·加利古申请人:赛诺菲-安万特