用于分析细胞的样本的方法和装置的制作方法

专利名称：用于分析细胞的样本的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及细胞分析领域。更具体而言，本发明涉及一种通过 使用数字全息显微镜的手段，来分析和表征细胞培养容器中含有活细胞和/ 或死细胞的样本的非破坏性方法和装置。这可以用于测量样本中细胞的增 殖和存活率。
背景技术：
为了对几乎为透明的细胞进行分析，通常要对细胞进行染色或通过某 种方式使其变得可见。因为这种方法可能会杀死标本，而又需要研究标本 的生活过程，因此上述方法在很多方面都不令人满意。例如在测定细胞培 养容器中的细胞数量时，上述方法还m^费时间，因此成4^艮高。
因此，目前需要一种不影响样本的用于分析样本的新方法。
数字全息(DH)显微镜使用全息原理对目标成像。用激光器照射目标， 散射光就会与由同一激光器发出的参比光源的光线发生干涉。可以在照相 底板或数字传感器(例如CCD传感器)上记录干涉模式。
与例如相衬比显微镜或共焦显微镜的常规显微镜不同，在DH显微镜上 可以同时记勤目衬比图像和振幅衬比(ampl itude contrast)图像。"同时的 振幅衬比和相村比图像"指的是所述目标的两个图像可以记录在同一个全 息图上，其中一个图像具有振幅衬比，而另一个图像具有相衬比。可以对 上述图像分别进行分析或彼此对比。可将它们含有的信息用于建立目标的 计算机化三维图像。
在D. Carl等人出版于APPLIED OPTICS, vol. 43， No. 36， 20 December 2004的文献"Parameter-optimized digital holographic microscope for high-resolution living-cell analysis"中公开的实验结果显示，数字 全息显微术可提供快速、非破坏性、全视野、高分辨率的定量振幅衬比和 相村比显微术，还能够检测在干涉仪灵敏度方向上的光通路长度的改变。 所公开的方法是用来分析单个细胞的细胞结构。
现有技术的问题是不能够分析大量细胞的特征和测定样本中活细胞和/或死细胞的数量。
因此，需要一种新的非破坏性的方法和装置，用于分析包括多个细胞 的样本和测量样本中细胞的增殖和存活率。
因此， 一种改进的方法和装置，特别是灵活性更高和耗时更少的非破 坏性方法是有利的。

发明内容
因此，本发明优选地通过提供一种用于分析包括透明的活细胞和/或死 细胞的样本的方法、用途和装置，试图单独地或以任何组合的方式来緩解、 减少或消除一种或多种上述的现有技术中的缺陷和弱点，并至少解决上述 的问题。
根据本发明的一个方面，提供了一种通过数字全息显樣沐的手段以分析 包括透明的活细胞和/或死细胞的样本的方法，其中所述样^^皮置于细胞培养 容器中并暴露于来自激光器的光线之下，所述方法包括产生一个全息图，所 述全息图包括至少一个矩阵元素，其中所述矩阵元素包樹目和振幅信息。所
述方法包括下述步骤使用所勘目信息计算在所述全息图中的每一矩阵元素 的相移；使用所述振幅信息或组合的相和振幅的信息测定所述细胞的焦点深 度；使用所述全息图中每一矩阵元素的相移构建所述全息图的相图像。此外， 所述方法还包括通过使用所勤目图像测定所述样本中所述细胞的特征；以 及佳月所述特征分析所述细胞的发育阶段。
此外，所述方法还包括使用总相移测定样本中活细胞的体积分数的步
骤。分析活细:;积中细l^育阶段的步骤可包括、记录至少两个全息图； 在至少两个不同的时间点计算每一矩P车元素的相移，即第 一相移和至少第二 相移；并比较所述第一相移和至少第^目移。可以使用所勤目移重建相图像 和使用所述振幅信息重建振幅图像，将所勤目移显示于所勤目图像中或将所 述振幅信息显示于所述振幅图像中，或以不同的灰色阴影或不同的颜色在组 合的相和振幅图像中显示相移和振幅信息。所述方法可以使用相衬比显微镜 采集的相衬比图像组合所勤目图像。可使用计算机来进行计算和分析步骤。 根据本发明的另一方面，提供了一种通过数字全息显微术手段来分析 包括透明的活细胞和/或死细胞的样本的装置，其中所述样^^皮置于细胞培 养容器中并暴露于来自激光器的光线之下，所述装置包括产生全息图的 手段，所述全息图包括至少一个矩阵元素，所述矩阵元素包括相和振幅信
息；通过使用所勤目信息计算所述全息图中每一矩阵元素的相移的手段； 使用所述振幅信息或组合的相和振幅信息测定所述细胞的焦点深度的手 段；以及构建所述全息图的相图像的手段，包括累加所述全息图中每一矩 阵元素的所勤目移的手段。所述装置还包括使用所i^目图像来测定所述样 本中所述细胞的特征的手段；以^^使用所述特征分析所述细胞的发育阶段 的手段。此外，用于测定所述细胞的特征的手段包括用于测定细胞的体积、 细胞的大小和细胞的折射率的手段。
此外，所述装置可包括4^1所述总相移来测定活细胞的体积分数和细胞 存活率的手段。为了分析活细胞体积的发育阶段，所述装置可包括用于记 录至少两个全息图的手段；用于在至少两个不同的时间点计算每一矩阵元素 的相移即第一相移和至少第二相移的手段；用于比较所述第一相移和至少笫 二相移的手段；以及使用不同时间点的所述第一相移和第二相移来测定所述 细胞洋本的增殖的手段。
所述装置还可包括使用所勤目移重建相图像或使用所述振幅信息重建 振幅图像的手段，其中所勤目移或振幅信息可显示于所i^目图像或振幅图像 中，或以不同的灰色阴影或不同的颜色显示于组合的相和振幅图像中。
所述装置可包括使用由相衬比显微镜采集的相衬比图像组合所勤目图 像的手段。
用于全息显微术的手段可由一种装置提供，所述装置产生菲涅耳全息 图或傅立叶全息图.
根据本发明的又另一方面，提供了数字全息显樣沐用于分析包括透明的 活细#/或死细胞的样本的用途。所迷分析可用于测定所述样本中活细胞的 体积分数。此外，所述分析可用于测定所述样本中所述细胞的特征。
本发明与现有技^M目比的优势在于，通过结合与常规光学显微斜目近 的分辨率，在不需将样本移出细胞培养容器的条件下，它为检测包括活细 胞和/或死细胞的未染色细胞样本在一段时间内的形状变化和相改变提供 了新的可能。在其后的一段时间内还能够进行分析，还能够定量甚至自动 地设置合适的焦点深度。这将简化和补充目前的分析方法。


在参考附图和一些实施方案的描述之后，本发明的其他目的、特征和 优点将可显而易见，附图中
图1为用于实行本发明方法的实验装置的侧视图2为图1中附图标记9所显示的束流收集器装置内部的一部分的放
大图3为用于实行本发明方法的傅立叶全息设备的实验装置的示意图； 图4为包括移动超出样本的波阵面的样本的示意图； 图5a为一张照片，显示了 Tl时间点的才艮据本发明的样本的相图像； 图5b为一张照片，显示了 T2时间点的才艮据本发明的样本的相图像； 图6为一张照片，显示了根据本发明的组合的相图像和相衬比图像。
具体实施例方式
下文主要针对本发明使用数字全息显微术，在不影响细胞的条件下分 析细胞的样本的装置和方法的实施方案进行了描述。
图1中显示的实施方案包括相衬比显微镜1。所述实施方案还包括发 射633 nm波长的光的激光器2,例如为He-Ne激光器。来自^Ut器2的光 束通过反射镜3被导向至第一分束器4,所述第一分束器4将光束分为目标 光束和参比光束。目标光束穿过空间滤光器5射向第二分束器7。放置样本 8以使得目标光束穿过样本后到达束流收集器装置9。参比光束穿过空间滤 光器6，然后被反射镜10反射，反射镜10使参比光束转向射向束流收集器 装置9。如图2所示，参比光束18和透过样本的目标光束15在分束器16 处^M合在一起并彼此干涉，然后被数字传感器17 (例如CCD或CMOS)收集， 由此产生一个数字全息图。还可以通过使用数字相机和光源11与此同时产 生一个相衬比图像，而且还可以通过显微镜物镜14获得常规的可视显微图。
图1所示的装置使用了菲涅耳全息装置。目标光束穿过样本8之后进 入聚焦透镜系统，该系统将衍射的目标光束聚焦后使其ii^束流收集器装 置9。使用透镜系统iM:大图像(在这种情况下为干涉模式)。
也可以使用图3所示的傅立叶全息装置。目标光束21通过目标22之 后i^X分束器23。参比光束24通过透镜26之后在分束器处与衍射的目标 光束21相组合，然后被数字传感器25(例如CCD或CMOS)收集，在此处产 生一个数字全息图。使用透镜26来产生参比光束之外的一个点光源。
在才艮据所述实施方案的方法中，可以对例如生物标本的透明目标成^f象， 而无需任何准备步骤，也无需将样本从细胞培养容器中移出。在现有技术中，要对标本进行常规染色。而这种方法在很多方面都不令人满意。例如， 染色可能会杀死标本，而又需要研究标本的生活过程。此外，只有从细胞 培养容器中移出的样本才能进行分析，在分析结束后样本就^殳有用处了 。
含有细胞的样本被置于用于细胞培养的瓶、微孔板、亚或管中。分析 可在不将样本从细胞培养容器中移出的条件下进行，这一点在多种细胞应 用中都具有优势，因为这样不会干扰样本。也可以从培养瓶中取样并置于 物镜下。
在根据所述实施方案的方法中，待分析的包括样本8的细胞培养容器 被置于相衬比显微镜l中的合适位置。然后获得样本的单个全息图。所述 全息图包括的信息可被用于产生所述样本的三维图像。可以保留或储存所 述全息图。随后可以产生样本的图像，并在以后进4亍分析。如果需要，可
以使用计算4;^呈序来产生样本的图像。
所述全息图为包括一些矩阵元素的矩阵。每一矩阵元素包括相信息。
使用这种相信息来计算每一矩阵元素的相移。由于全息图是根据透射itit: 明样本的光波记录的，因此振幅衬比与吸收和散射的改变相关，而相衬比 依赖于样本的厚度和/或折射率的变化，或者更广义地依赖于光通路长度的 变化。因此，每一矩阵元素中的相移依赖于两个因素样本的厚度和该具 体元素的积分折射率。
在一个实施方案中，使用含有透明细胞的样本，例如生物标本。所述 细胞基本上不吸收任何光，但是穿过所述细胞的光线与穿过周围介质的光 线相比会在光通路长度上产生差异。因此如图4所示，由细胞出射的波阵 面会发生相移。这一畸变可在数字全息图中以相差或相移的形式4皮检测到， 所述数字全息图由数字传感器17(例如CCD或CMOS)检测到的干涉模式重 建。由所述数字全息图可以定量地(numerica 1 ly)重建相图像和振幅图像或 它们的组合。用于重建全息图的方法可为任何常规的重建方法，在本文中 不予详述。
然后可使用相图像中的每一元素的相移来分析样本中细胞的特征。细 胞的特征可为细胞的体积和积分折射率，可使用它们来分析细胞处于哪个 发育阶段，例如细胞是否正在死亡或仍在增殖。
由于认为死细胞的有效折射率与周围的介质基^目同，即死细胞产生 的相差或相移要比活细胞小得多，因此可以检测出死细胞并将其从总相移 中去除。
在不同时间点重复测定总相移。分析总相移的测量值并用于测定样本
中的细胞发育阶段，例如细胞是否正在死亡或仍在增殖。如图5a和图5b 所示，这两个图为在不同时间点T1(图5a)和T2(图5b)的来自同一样本的 两个不同相图像。
在T1时间点，活细胞被显示为图5a中的灰色或黑色的点。显示为黑 点的少数几个细胞表明具有较大的相移。这意味着相移较大，表明所述细 胞形成高密度的球体并可能接近细胞分裂期。在T2时间点，如图5b中更 多的黑色和灰色点所示，可以看到更多的细胞，表明样本中具有更多的活 细胞，也就是说样4^T1时间点至T2时间点发生了增殖。
还可以通it^J"图像中细胞核通过视觉及手动计数或使用专门的计算机 软件自动计数，获得正在增殖和死亡的细胞的总数。
上述构建的全息图中的每个像素代表光穿过位于该像素的目标时产生 的相移值。这种相移可用于产生相图像。可以通过计算M序来产生图像 以表示相移，其中所述的相可在图像中显示为，例如，不同的灰色阴影或 不同的颜色。还可通过计算M序来测定具有比周围介质的折射率更大或 更小的不同目标的数量。由相图像可得出样本中相变化的图镨，由此可得 出折射率或光通路长度的变化。
另 一个可用的M为细胞的面积。在相图像中每一细胞由几个像素组 成。每一像素的面积是已知的，因此可测得细胞的面积。
根据本发明，可将由数字全息图重建的相图像与相衬比显微镜采集的 相衬比图像相组合。图6显示了一个这样的图像。进行上iii且合的目的是 为了得到一个增强显示的图像。使用者熟悉由相村比图像产生的图像，并 且因为相图像而增加了额外的维度。不同的灰色阴影4议光强度。图6显 示了具有不同特征的细胞。长方形或梨形的细胞生长于细胞培养容器的底 部。从底部脱离的细胞会形成高密度的圆球体。有一些细胞呈薄层分布并 且密度很低。
此外，还可以描绘包括透明细胞的样本的振幅图像和相图像。全息图 可以被记录在透射几何体系(transmission geometry)中。由于样本是透 明的，因此重建的振幅图像中显示的细节要比相图像中少，因为相图像中 的村比取决于样本的折射率和/或厚度的不同。活细胞产生相移并显示在该 图像中。在图像中，在折射率高于(低于)周围介质的区域，相会降低(升高)。
此外，还可以组合同时采集自同一样本的相图像和振幅图像。这样可 以得出关于细胞特征的更多的信息。
上文参考附图中显示的具体实施方案描述了本发明。然而，本领域技 术人员在阅读本说明书之后可以认识到在实施方案中指出的各种特征的其 他组合，而本发明的范围也意在包括这些组合。本发明的范围仅由后附的 权利要求书限定。
权利要求
1.一种通过数字全息显微术的手段以分析包括透明的活细胞和/或死细胞的样本的方法，其中所述样本被置于细胞培养容器中并暴露于来自激光器的光线之下，所述方法包括下述步骤产生一个全息图，所述全息图包括至少一个矩阵元素，其中所述矩阵元素包括相和振幅信息；使用所述相信息计算在所述全息图中的每一矩阵元素的相移；使用所述振幅信息或组合的相和振幅的信息测定所述细胞的焦点深度；使用所述全息图中每一矩阵元素的所述相移构建所述全息图的相图像，其特征在于通过使用所述相图像测定所述样本中所述细胞的特征；使用所述特征分析所述细胞的发育阶段。
2. 根据权利要求1的方法，其特M于所述计算、构建、测定和分析是通 过计算城行。
3. 根据权利要求1的方法，其特征在于使用所勘目图像测定所述样本中活 细胞的体积分数并测定所述细胞的存活率。
4. 根据权利要求1的方法，其特征在于测定所述细胞的特征包括测定细胞 的体积、细胞的大小和细胞的折射率。
5. 根据权利要求4的方法，其特征在于通过使用所述特征测定所述样本中 细胞的数量。
6. 根据权利要求l的方法，其特征在于分析所述细胞的发育阶段包括 记录至少两个全息图；在至少两个不同的时间点计算每一矩阵元素的相移，即第 一相移和至少 第二相移；并比较所述第 一相移和至少第二相移；使用不同时间点的所述第一相移和第二相移来测定所述细胞样本的增 殖。
7. 根据权利要求1的方法，其特征在于使用所勤目移重建相图像和使用所 述振幅信息重建振幅图像，将所勤目移显示于所勤目图像中或将所述振 幅信息显示于所述振幅图像中，或以不同的灰色阴影或不同的颜色在组 合的相和振幅图像中显示相移和振幅信息。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于使用相衬比显微镜采集的相衬比图 像组合所勤目图像。
9 数字全息显微术用于分析包括透明的或细胞和/或死细胞的样本的用途。
10. 根据权利要求9的用途，其中所述分析是用于测定所述样本中活细胞的 分数。
11. 根据权利要求9的用途，其中所述分析是用于测定所述样本中所述细胞 的特征。
12. —种通过数字全息显微术手段来分析包括透明的活细胞和/或死细胞的 样本的装置(1)，其中所述样本(8)被置于细胞培养容器中并暴露于来自 激光器(2)的光线之下，所#置包括产生全息图的手段，所述全息图 包括至少一个矩阵元素，所述矩阵元素包括相和振幅信息；通过使用所 勤目信息计算所述全息图中^""矩P车元素的相移的手段；使用所述振幅信息或组合的相和振幅信息测定所述细胞的焦点深度的手 段；构建所述全息图的相图像的手段，包括累加所述全息图中每一矩阵元素的所述相移的手段，其特在于使用所述相图像来测定所述样本中所述细胞的特征的手段； 以及使用所述特征分析所述细胞的发育阶段的手段。
13. 根据权利要求12的装置，其特征在于使用所述总相移来测定所述样本中 活细胞的体积分数和细胞存活率的手段。
14. 根据权利要求12的装置，其特征在于用于测定所述细胞的特征的手段包 括用于测定细胞的体积、细胞的大小和细胞的折射率的手段。
15. 根据权利要求13和14的装置，其特征在于所述装置包括使用所述特征 来分析所述活细胞体积分数中所述细胞的发育阶段的手段。
16. 根据权利要求13的装置，其特征在于分析活细胞的所述体积的发育阶段 的手段包括用于记录至少两个全息图的手段；用于在至少两个不同的时间点计算每一矩阵元素的相移即第 一相移和至 少第一相移的手段；以及用于比较所述第一相移和至少第一相移的手段；以及使用不同时间点的所述第一相移和第二相移来测定所述细胞样本的增殖的手段。
17. 根据权利要求12的装置，其特征在于使用所勤目移重建相图係或使用所 述振幅信息重建振幅图像的手段，其中所勤目移或振幅信息可显示于所 ^目图^^振幅图像中，或以不同的灰色阴影或不同的颜色显示于组合 的相和振幅图像中。
18. 根据权利要求16的装置，其特征在于使用由相衬比显微镜采集的相衬比 图像组合所勤目图像的手段。
19. 根据权利要求12的装置，其特絲于全息显孩沐的手段由产生菲涅耳全 息图或傅立叶全息图的装置提供。
全文摘要
一种通过数字全息显微镜的手段而分析含有透明的活细胞和/或死细胞的样本的非破坏性方法和装置，其中所述样本(8)暴露于来自激光器(2)的光线之下。穿过样本中的细胞的光线与穿过周围介质的光线相比将在光通路长度上产生差异，并且因此由细胞出射的波阵面会发生相移。这一畸变可在数字全息图中以相差或相移的形式被检测，并由此产生一个数字全息图，所述数字全息图由数字传感器(17)(例如CCD或CMOS)检测到的干涉模式重建。然后使用所述全息图中的每个要素的相移来分析样本中细胞的特征。
文档编号G01B9/021GK101346673SQ200680048900
公开日2009年1月14日 申请日期2006年12月22日 优先权日2005年12月22日
发明者M·古斯塔夫森, M·西贝斯塔 申请人:相位全息成像Phi有限公司