一种分析糖蛋白的方法

专利名称：一种分析糖蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种分冊唐蛋白的方法，具体是一种翻 驗素芯片，结錄面增强激 光解析离子化飞行时间质谱技术对糖蛋白进行检测和鉴定的方法。
背景技术：
糖类化合物是生物体维持生命活动所需育糧的主要来源，是生物体合皿它化合物 的基本原料，是充当生物体的结构原料，是涉及生命活动本质的生物大^T之一。糖类
具有多个羟基，W^又有a、 p构型之分，单瞎的连接可能产生数目很大的异构体， 因此，IH连结构蕴含十分丰富的生物语言信息，是高密度的信息载体。细胞是生物体的 基本单位，禾中类繁多的细胞形成各种组织，所有细胞表面均SM着一层禾BI。糖连和蛋 白质构成的共价复合物，即糖基化蛋白，简称糖蛋白。蛋白质糖基化是一种重要的翻译 后修饰，约有一半以上的蛋白质是发生糖基化的。糖基化作为一种主要的翻译后傲布对
蛋白质的结构和功能有着重要影响，如对蛋白质的折叠、运输、定位等。在许多生物
过程中蛋白质糖基化起着重要的作用，如免疫保护、病毒的复制、细胞生长、细胞与细 胞之间的黏附、炎症的产生等。
许多蛋白都发现有糖基化这种翻译后i針妨式。如转录因子、核小孔蛋白、热休克
蛋白、RNA聚合酶II、致癌基因翻译产物、酶等。许多疾病的发生、^jlil程中糖基化 蛋白的糖基化禾號都发生了改变，糖基化异常经常导致疾病的发生，如在帕錢病、风 湿性关节炎和其他与自由 目关的疾病患者体内，检测到铁转移蛋白糖基4bK平过高。 铁转移蛋白是一种糖基化的金属^MlfiL清蛋白，糖基化稳定了铁转移蛋白，间接地调节 了铁离子的平衡。另有大量文献报道糖割七的紊乱与腿发展的肌营养不良相关。在目 飾院床应用的肿瘤筛査标志物中绝大部分是糖基化蛋白，特别是有些糖基化发生改变的 糖基化蛋白已应用于人类疾病的诊断、分期和预后刑古，例如，诊断原发幽干癌涉及到 甲胎蛋白(AFP)是胎儿发育过程中由胎月拾成的一种含糖量为戦的糖蛋白，由590个 氨基酸歹錢组成。^^ AFP含一条辦连，胎儿出生时，脐带血中含AFP为10-100mg/L， 出生1年后，降至与正常人水平，含量极低，难以检测。原发性肝癌病AlfiL清AFP明显 上升，因此临床上用免疫生化技术测定AEP做为诊断肝癌的依据。在后的研究表明胃 癌、肠癌、劂7鱸等消化系纟划中瘤血清AFP含量也升高，而肝炎、肝硬化病AlfiL清也可 伴有暂时性的AFP上升。
近年研究发现糖基化的改变与肿瘤的发拨展和转移密切相关。肿瘤细胞糖割七改变可分为4种类型(l)肿瘤组织出现了正常组织没有或含量很少的糖连结构。(2)某些 经傲布的辦连结构在肿瘤组织中有较高鋭，构驢要的肿瘤相关抗原。某些多B錄圣糖
化后可改变其抗原性，成为肿瘤抗原；(4)某些MI连结构的魏丰度增加。糖基化蛋白 是含有共辦唐基的蛋白质，由糖连、糖肽键和多肽链3部分乡賊，其中糖肽键是糖割七蛋
白最重要的结构特征，相同脚l页序的蛋白质常含有不同结构的擗连，这一结构的特点成
为糖链的异质性，可表现在糖基组成，顺J争和联结方式上的差异。糖基化蛋白根据连接
的糖苷类型主要分为(1)由N-乙酰M葡萄糖和天门冬氨翻安连接的N-irip型糖謝七 蛋白，(2) ^^-乙酰氨基半乳糖与丝氨酸或苏氨麟接的(h蹄型糖割七蛋白。糖基化 蛋白以溶解状态和与细胞膜结合状态存在于细胞膜表面和细 卜液，人体中绝大多fOfiL 清蛋战附多重要的生物活性物质的化学本质都是糖基化蛋白。近年来随着实验方法的 不断改进，发现细鹏莫糖基化蛋白糖链的变化与细胞突变癌基因的活化、肿瘤细胞的转
移和侵袭密切相关。月中瘤细胞糖割七蛋白的变《柱要分为3类(l)膜糖基化蛋白的丢失: 现己发现各类肿瘤转化细胞和活体肿瘤有粘蛋白的丢失，肿瘤细胞蛋白水解作用加强是
其丢失的主要原因，但合成下降，脱落及化学微市也是部分原因。(2)出现新合成的糖 基化蛋白。(3)糖基化蛋白糖链的变化,ilJ:增加岩藻糖、唾液^SN-糖割七糖连分
枝王嫁，普遍见于各类肿瘤细胞。正常肝细胞与肝癌细鹏莫糖基化蛋白上的高甘露繊 链在量和结构上存在明显不同。许多酶、免疫球蛋白、载体蛋白、激素、毒素、)線素 等大多数蛋白质都是糖蛋白。在糖蛋白中，各种糖蛋白擗连的长短与结构，f麟的数目
均相差很大，因而含糖量也相差很大。例如卵白蛋白分子含一条糖能而羊的颔下腺
粘蛋白力吁含800条 1连，焦原蛋白含 不到1%;可溶1 型物质含糖量高达85%。 细胞与细胞的相互粘附、相互识别、相互作用、相互制约与调控均与糖蛋白的糖链有关。 大量的研究已表明，各种错综复杂的生淑见象的产生与疾病的形成过程均包含了许多分 子变化和复杂的代谢过程，其中糖蛋白的糖链在受精、发生、发育、分化、炎症与自身 免疫疾病，在癌细胞异常增5I&转移，病原^ii染，植物与病原体相互作用，豆科植物 与根瘤菌的共生过程中，都具有重要作用。
凝集素(Lectin)是狭义上的糖结合蛋白，是广泛存在于自然界的一大类非免M 源的蛋白质^H蛋白，它能与ltt一性地、非共你也可逆结合，并且有^Jfil细胞的作 用，故称为凑操素。通常以^l皮提取的植物命名，如刀豆素A (Concorwalina， ConA)、 麦胚素(Wheat genii agglutinin, WGA)、花生;驗素(Peanut agglutinin, PNA)和 大豆^,素(Soybean agglutinin, SBA)等，7鱗素是它们的总称。目前己有近千种植 物被测得具有凑據素活性，植物中，不只种子中存在 麟素，根、茎、叶、皮、果实汁 中也发现有凑碟素。除植物外，其它生物，如各种真菌、某醜毒、无脊椎动物、脊椎动物及至人体的各种组织和器官中者降招驗素。凝集素具有多方面的特性，最大的特 点在于它们能识别糖蛋白和糖肽中，特别是细鹏中錢的糖连结构。 一种 驗素具有 对某一种特异性糖基专一性结合的能力，因此，凑據素可以作为一种櫞十来研究细M 上或糖基化蛋白中特定的糖基。目前按结舒唐的类型，？驗素可分为六类D"甘露糖或 D-葡萄糖；N-乙酰錢葡萄糖；N-乙酰驢半乳糖；D"半乳糖；L-岩藻糖以及唾液酸。 在植物凝集素中，只有麦胚凍據素(WGA)可专一结合唾液酸。细胞间的粘附是细胞间相 互作用起决定性作用的起始步骤。作为致病的微生物，首先对宿主细 ，界占着，然后 才能感染和致病。细胞表面的凑據素旨转一地识别并结合另一细胞的,。？驗素的这 禾中特性，在细胞与细胞，细胞与基质的粘附中起一定作用。由于凝集素与糖^f具有专 一性可逆结合的特性，目前已有^l據素固定化制成亲和层析柱用于分离纯化糖蛋白的
产品或各券l據素固定化于磁性微粒(Magnetic particles)分离纯化各种类型糖蛋白
的产品。
带有反射功能的基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-T0F-MS)和纳升电 喷雾串联质谱(nano-ES工-Q-T0F)等具有软电离方式，具有高灵 和强有力的分析混 合物能力，可^f共生物大^ 的分子量、序列、 一级结构信息以及结构转换、斷布等。 目前，采用质謝爐行糖基化分析的方法如下
a. 分离纯化各种类型糖基化蛋白。用各券麟素固定化制成的亲和层析柱或磁性微 粒分别固定有各类凑襍素，分离纯化出各种类型糖基化蛋白。
b. 糖基化蛋白的双向电泳。分离纯化出的糖基化蛋白经双向电泳(2-D电泳)，采用 Pro-Q300或基于过碘酸氧化原理的488荧光染料，染色2-D )^h的糖基化蛋白的糖链部 分，然后用SYPR0 Ruby荧光染料只染蛋白质部分，对同一块2-D胶的总蛋白质进行她。 在同一i划交上研究糖基化变化和蛋白质表ii7jC平的改变。
c. 质谱法测定(MALDI-T0F-MS/MS): iAK上将蛋白质点切下，经预处理后，点样于 MALDI-TOF质谱耙禾肚，进行质谱分析，得至朋対敏图娜，检索IPI織库，确定蛋 白质。
d. 糖基化蛋白进行Hf魏科斤，确定糖基化蛋白糖链的组^^相应的糖謝七位点。采 用蛋白酶酶解与糖苷内切酶酶解相结合的方法，把蛋白链上的寡糖切下来，结合 MALD-T0F及GC-MS技术鉴定糖连的^^量和^T组成，确定糖基化蛋白的糖^[七位点， 研究蛋白部分和^f唐部分的结构。
综上所述，目前糖蛋白分析中，糖蛋白多采用固定于固相载体上的各类 素 分离纯化，用二维电泳、光谱、质谱等分析化学的研究技术，所需技术剝牛高，仪器昂
贵，步骤繁琐，耗时，不适于大规模筛查和临床检测应用。其并蹈页问题如下1. 在分离纯化糖蛋白过程中占一定比例的低丰度糖蛋白质可能会丢失。
2. 适用范围窄。无法用于分离跨膜蛋白，不能检出样品中的众多低丰度糖蛋白。
3. 检测通量低。只能依次鉴定单个蛋白斑点，P蹄lJ了检测通量，不适于大规模医学
临床筛査。
4. 检测步骤繁琐，周期长，不能实现全自动化的分析检测。
5. 检测费用高。应用所需技术剝牛高，仪器昂贵，导致检测费用高，不适用于临床
T 6.蛋白质芯片联用飞行时间质谱仪技术无法明确检测糖蛋白。

发明内容
本发明的目的在于衛共一种分析糖蛋白的方法，其解决了背景技术中检测通量低， 检测步骤繁琐，周期长的技术问题。
本发明的技术解决方案如下
一种分柝瞎蛋白的方法，该方法的实现步骤包括
(1) 制备凝集素芯片
(1. l)点制芯片将各券M素或糖结合蛋白溶于点样缓冲液中，制成l 5m^mL 的点样缓冲液；用芯片点样仪将点样缓冲液点制于衍生化的固相载体上；于25 6(TC温 育12小时，得l據素芯片；
(1.2) 封闭用封闭缓冲^X^I據素芯片进行1 2小时封闭；
(1.3) 保存用超術JC凊洗凝集素芯片，离心千燥后，于4。C千燥保存
(2) 加载生物样品
(2.1) 将被测生物样品直接加至7麟素芯片上；
(2.2) 孵育0.5 2小时，糖蛋白,M与M素的特异识别结合至PM素芯片 上；生物样品中的特定糖蛋白,连与凑據素芯片上的》驗素特异识别，结合到 ^m芯 片上；
(3) 去除杂质用清洗缓冲液清洗 M素芯片，去除凑M素芯片表面的非特异结合
蛋白；
(4) 形成晶体将會遣吸收^T或基质加至凑據素芯片上，于室温千燥，则育糧吸 收^f或基质与》驗素芯片上与 驗素特异结合的糖蛋白结合形成混合晶体；
(5) 解离晶体用激光解吸电离的方法使结合在凑據素芯片上的特定糖蛋白解离， 形礙唐蛋白荷电离子；
(6) 纟魏顿谱图用飞行质谱仪检测糖蛋白荷电离子在真空电场中飞行的时间， 根据得到的糖蛋白图谱信息，会飾顿谱7(7)鉴定蛋白质的差异 :将被测生物样品的糖蛋白图i普信息与样本图i普信息进 行比照，得至嗟异敏的被测生物样品中的糖蛋白信息。
上3^寸闭缓冲液可OT乙醇胺或含BSA的封闭缓冲液等。
上述点样缓冲液可采用磷,缓冲液、碳Kk缓冲液、Tris-HC1缓冲液、Bis-tris 缓冲液劍印es缓冲液等。
上述衍生化的固相载体可采用环氧乙烷基，也可采用 或统 团衍生化的固相 载体；战固相载体可采用玻片、金属片、硝酸纤维素膜、瓷片或磁性微粒等。
細青洗缓冲液具体可采用2XPBS的清洗缓冲液等。
上述能量吸收^^具体可采用白芥子酸，上述^M具体可采用2， 5-二f5S苯甲酸或 a-氰S"4-羟基肉桂酸等。
，生物样品可以是血液、尿液、细胞裂解、脑脊液、关节腔滑液或支气管 洗脱液等。
本发明具有以下优点
U喿作简便。可直接用于未纯化的样品分析，不需要对待分析样品进fi^踪标己。
2. 灵敏度高，重复性好，适合于医争临床盼決速分析应用。
3. 所需样品量少，应用范围广泛。可用于未纯化的尿液、血液、脑脊液、关节 腔滑液、支气管洗脱液、细胞裂解液及各种分泌物等的分析、筛査。
4. 具有高通量的分析能力，可同时快速发现多个生物标志物，进行快速、准确的 早期检测、分析。具有与"双相电泳加飞行质谱"相似的功能，同时可用于测定il7乂蛋 白质。
'5.在同一系统中集发现和检测为一体，不需要对革鹏蛋白进行分离纯化、特异性高， 可发现低丰度、小^f量的蛋白质，可鉴定功能蛋白质。 具体实駄式
凝集素芯片是检测糖蛋白的高通量技术，本发明采用 驗素芯片，结錄面增强激 光解析离子化飞行时间质谱技术，对糖蛋白进行检测、分析、鉴定，比较不同生物样品 中糖蛋白的含鼓结构差异，研究和确定生物标志物。具体实现步骤如下 (1)帝1J^^操素芯片
(1.1)点制芯片:将各类凑據素或糖结合蛋白溶于点样缓冲液中，审喊1 5 mg/mL 的点样缓冲液；用芯片点样仪将点样缓冲液点制于衍生化的固相载体上；于25 60。C温 育12小时，徵疑集素芯片。点样缓冲液可采用磷鹏缓冲液、碳離缓冲液、Tris-HCl 缓冲液、Bis-tris缓冲液或H印es缓冲液等。衍生化的固相载体可采用环氧乙烷基，也 可采用氨基或巯錢团衍生化的固相载体。固相载体可采用玻片、金属片、硝酸纤维素膜、瓷片或磁性微粒等。
(1.2) 封闭用封闭缓冲^X寸凑操素芯片进行1 2小时封闭。封闭缓冲液可翻
乙醇胺或含BSA的封闭缓冲液等。
(1.3) 保存用超纟^K清洗凑襍素芯片，离心^B喿后，于4。C千燥保存。
(2) 加载生物样品
(2.1) 将被测生物样品直接加至凑襍素芯片上。生物样品可以题液、尿液、细
胞裂解、脑脊液、关节腔滑液或支气管洗脱液等。生物粗样品一般是指含有高盐、 去垢齐轉杂质的未纯化的生物样品。
(2.2) 孵育0.5 2小时，糖蛋白糖连M与凑襍素的特异识别结合至lM^素芯片 上，凝集素以共价偶联方式固定于凑據素芯片表面，生物样品中的特定糖蛋白IH转凝 集素il31特异的相互识别和作用，吸附于凑據素芯片上。生物样品中的特定糖蛋白llf连 与凝集素芯片上的凑碟素特异识别，结合到凝集素芯片上。
(3) 去除杂质用清洗缓冲液清洗凑據素芯片，去隙驗素芯片表面糊照异结合
蛋白以及弱结合蛋白，以消除干扰。清洗缓冲液具体可采用2XPBS的清洗缓冲液等。
(4) 形成晶体将育糧吸收好或基质加至凑據素芯片上，于室温千燥，贝脂讀吸
收分子或基质与凝集素芯片上与凝集素特异结合的糖蛋白结合形成混合晶体。混合晶体 有禾盱〈腿蛋白质在检测中的解吸附和离子化。育糧吸收好具体可采用白芥子酸，基
质具体可采用2， 5-二羟基苯甲酸*-氰蒼4-羟基肉桂酸等。
(5) 解离晶体用激光解吸电离的方制吏结合在 M素芯片上的特定糖蛋白解离，
形成糖蛋白荷电离子。
(6) 绘制质谱图用飞行质谱仪检测糖蛋白荷电离子在真空电场中飞行的时间，
根据得到的糖蛋白图谱信息，^魏顿谱图。由于不同质荷比的荷电离子在真空电场中飞 行的时间长短不同，用飞行质谱仪检测荷电离子在真空电场中飞行的时间，得到糖蛋 白质谱图，可直观显示被测生物样品中蛋白质的》子量、丰度對言息。
(7) 鉴定蛋白质的差异《:将被测生物样品的糖蛋白图i剖言息与样本图谱信息进
行比照，得到差异載的被测生物样品中的糖蛋白信息。
权利要求
1.一种分析糖蛋白的方法，该方法的实现步骤包括(1)制备凝集素芯片(1.1)点制芯片将各类凝集素或糖结合蛋白溶于点样缓冲液中，制成1～5mg/mL的点样缓冲液；用芯片点样仪将点样缓冲液点制于衍生化的固相载体上；于25～60℃温育12小时，得凝集素芯片；(1.2)封闭用封闭缓冲液对凝集素芯片进行1～2小时封闭；(1.3)保存用超纯水清洗凝集素芯片，离心干燥后，于4℃干燥保存；(2)加载生物样品(2.1)将被测生物样品直接加至凝集素芯片上；(2.2)孵育0.5～2小时，糖蛋白糖链通过与凝集素的特异识别结合到凝集素芯片上；生物样品中的特定糖蛋白糖链与凝集素芯片上的凝集素特异识别，结合到凝集素芯片上；(3)去除杂质用清洗缓冲液清洗凝集素芯片，去除凝集素芯片表面的非特异结合蛋白；(4)形成晶体将能量吸收分子或基质加至凝集素芯片上，于室温干燥，则能量吸收分子或基质与凝集素芯片上与凝集素特异结合的糖蛋白结合形成混合晶体；(5)解离晶体用激光解吸电离的方法使结合在凝集素芯片上的特定糖蛋白解离，形成糖蛋白荷电离子；(6)绘制质谱图用飞行质谱仪检测糖蛋白荷电离子在真空电场中飞行的时间，根据得到的糖蛋白图谱信息，绘制质谱图；(7)鉴定蛋白质的差异表达将被测生物样品的糖蛋白图谱信息与样本图谱信息进行比照，得到差异表达的被测生物样品中的糖蛋白信息。
2. 根据权利要求1戶腿的分| 蛋白的方法，其特征在于戶脱的封闭缓冲液是乙醇 胺或含BSA的封闭缓冲液。
3. 根据权利要求域2戶脱的分t赚蛋白的方法，期寺征在于戶服的点样缓冲液是 磷酸盐缓冲液、碳,缓冲液、Tris-HC1缓冲液、Bis-tris缓冲液細印es缓冲液。
4. 根据权利要求3戶腿的分附唐蛋白的方法，其特征在于戶腿的衍生化的固相载体是环氧乙烷基，或是氨基或巯 团衍生化的固相载体；所述的固相载体是玻片、金属 片、硝酸纤维素膜、瓷片或磁性微粒。
5. 根据权利要求4戶，的分tM蛋白的方法，其牛寺征在于戶皿的清洗缓冲液是2X PBS的清洗缓冲液。
6. 根据权利要求5戶诚的分蹄唐蛋白的方法，^tf征在于戶脱的能量吸收好是白芥子酸；戶，的基质是2， 5-二羟基苯甲酸或(x-氰蒼4-羟基肉桂酸。
7. 根据权利要求6戶舰的分俯唐蛋白的方法，其特征在于戶舰的生物样品题液、 尿液、细胞裂解、脑脊液、关节腔滑液或支气管洗脱液。
全文摘要
一种分析糖蛋白的方法，其首先配制点样缓冲溶液、点制芯片、封闭、清洗、干燥后，得凝集素芯片。将生物样品直接加在凝集素芯片上，进行孵育、清洗去除杂蛋白、形成晶体、解离晶体，用飞行时间质谱仪检测荷电离子在真空电场中飞行的时间，得到糖蛋白图谱信息，直观显示被测生物样品中分子量、丰度等糖蛋白信息，鉴定糖蛋白差异表达。将被测生物样品的糖蛋白图谱信息与样本图谱信息进行比照，得到差异表达的糖蛋白信息。本发明解决了背景技术中检测通量低，检测步骤繁琐，周期长的技术问题。本发明操作简便，灵敏度高，重复性好，适合于医学临床的快速分析应用。
文档编号G01N33/68GK101308141SQ20071001787
公开日2008年11月19日 申请日期2007年5月16日 优先权日2007年5月16日
发明者孙士生, 铮 李, 婷 王, 芬 王, 强 简, 超 陈 申请人:陕西北美基因股份有限公司