用于体外诊断癌症具体是乳腺癌、甲状腺癌或肺癌的ProNGF测定的方法以及ProNGF的治...的制作方法

专利名称：：用于体外诊断癌症具体是乳腺癌、甲状腺癌或肺癌的ProNGF测定的方法以及ProNGF的治...的制作方法用于体外诊断癌症具体是乳腺癌、甲状腺癌或肺癌的ProNGF测定的方法以及ProNGF的治疗用途本发明涉及癌学领域。更具体地，本发明涉及在人类患者中通过体外确定来自这一患者的生物学样品中或患者体内肿瘤中神经生长因子前体(ProNGF)的存在而诊断癌症、更具体地乳腺癌、甲状腺癌、肺癌或前列腺癌的方法，所述方法可用于癌症的早期诊断、筛查、治疗随诊和预后，也可用于诊断癌症复发。另外，由于癌细胞更具体地乳腺癌、甲状腺癌、肺癌或前列腺癌细胞产生ProNGF的能力，本发明也涉及治疗。在女性中，在工业化国家中乳腺癌是最常见的因癌死亡因素。据估计，乳房X线照相术可检测的最小肿瘤大小是几个毫米(mm)。乳腺癌发展缓慢。但是，在这一小肿瘤被诊断时，其已经演化平均8年了。乳腺癌的病因学尚未完全了解。家族倾向已被证实。年龄是最重要的风险因子。因此，在西方国家中风险随着年龄每年增加0.5%。已知其它风险因素，如妊娠数和首次妊娠年龄、乳房喂养、青春期和绝经期年龄、绝经期后雌激素治疗、应激和营养。用于乳腺癌大量筛查的测试是成像技术乳房X线照相术。通过这一技术，乳腺癌致死率大大降低(死亡率降低30%)，这表明了肿瘤筛查在公共健康方面的重要性。但是，筛查技术有一些缺陷。乳房X线照相术需要高效设备和合格人员，这在大规模筛査方面是昂贵的。甲状腺癌是少见的癌症。在法国一般人群癌症中约占1%。它的年发生率低，每10万个体约2.5个(Cancers:Valuation,traitementetsurveillance[Cancers:assessment,treatmentandmonitoring].JMAndrieu&PColonnaEd.ESTEM，Paris1997)。在2006年美国甲状腺癌新病例数估计为30000，死亡为1500(AmericanCancerSociety.:CancerFactsandFigures2006.Atlanta,Ga:AmericanCancerSociety,2006)。甲状腺癌通常以甲状腺内结节形式发生，它可以是正常大小或放大的(甲状腺肿)。它是一种少见的癌症，在年轻个体中更常见，当癌症在其乳头状形式时其预后良好，因为在90%病例中发生痊愈。根据筛査手段，甲状腺结节的流行性是可变的。其在女性、老年个体和在碘缺乏区域生活的个体或在婴儿期进行过颈部辐射的个体中更常见，但这些结节在超过90%病例中是良性的。年轻个体更多地暴露于癌症发生，因为甲状腺对辐射更高的敏感性。根据国际组织学分类，可以区分4种主要组织学类型的甲状腺癌-乳头状上皮瘤，-滤泡上皮瘤(follicularepitheliomas)，-髓样上皮瘤(medullaryepitheliomas)，-间变性(或未分化)上皮瘤。这些肿瘤可以是实体的(solitary)或多灶性的(multifocal)。乳头状癌更常见。它们在年轻个体中占优势并且代表了约80°/。的甲状腺癌。滤泡癌代表约10%甲状腺癌并在约40岁附近特别常见。乳头状和滤泡癌代表了放射敏感性分化甲状腺癌组，它们分泌甲状腺球蛋白。髓样癌代表了5%甲状腺癌并相应于衍生自神经嵴的(:细胞或滤泡旁细胞的肿瘤。C细胞分泌降钙素。间变性或未分化癌是少见的(小于5%病例)并且是特别严重的。在存在恶性甲状腺结节时，基本治疗是手术。如果残余功能组织保留，在总甲状腺切除术后4-6周在隔离室中给予碘131剂以完全清除之。约40Q/c甲状腺癌转移(metastasis)固定碘并因此可被这一方法治疗。在总甲状腺切除术和用碘131清除后，给予抑制TSH分泌的激素甲状腺素。这一激素疗法也使得能保证满意的甲状腺功能平衡。新的诊断和预后标记和耙向治疗剂的发现能够完善这一癌症的治疗和诊断工具库。肺癌在法国每年新增病例25000例，可被认为是主要公共健康问题。其是男性中最常见的癌症并事实上是男性中因癌死亡的最常见因素，是女性中第三常见因素。在2006年美国肺癌新病例数(非小细胞和小细胞肺癌合并)估计是174470例，死亡162460例(AmericanCancerSociety.:CancerFactsandFigures2006.Atlanta,Ga:AmericanCancerSociety,2006)。在原发癌中，癌细胞的检查(解剖病理学检查)使得可以区分-表皮样癌(35-40%);-腺癌(25-35%);-大细胞癌(10-15%);-小细胞癌(20-25%).这四类代表了接近95%的肺癌，前三类归在一起为"非小细胞肺癌"(NSCLC)。小细胞癌进展快得多并更易于扩散到其它器官。类癌瘤和粘膜表皮样瘤(muco印idermoidtumor)更少见，代表了其余的1-20/0。这些分类可被概括为"小细胞肺癌"(13%)或"非小细胞肺癌"(87%)，其具有不同的治疗含意。已经表明使用目前工具(肺X光、痰分析和纤维镜不改善存活率)对于早期检测的努力不是有效的。螺旋扫描或痰分子学分析使得可能进行更早的检测，使得癌症可以更容易切除。但是，尚未发现筛査工具，特别是由于与肺活检和手术相关的风险所致，特别是在吸烟的患者中。不经治疗，小细胞肺癌是最具侵略性的肺肿瘤，中位(median)存活仅2-4个月。与其它类型的肺癌相比，小细胞肺癌倾向于在诊断前扩散，但是其对于化疗和放疗更敏感。非小细胞肺癌(NSCLC)包括各种组织学。最常见的组织学是表皮样癌或鳞癌、腺癌和大细胞癌。这些组织学通常分类在一起，因为诊断方法、分级、预后建立和治疗是类似的。显示可切除癌的患者可通过手术或手术辅助化疗而治愈。在大量具有不可切除癌症的患者中，疾病的局部控制可以用放疗进行。显示局部晚期和不可切除疾病的患者使用放疗合并化疗可具有长期存活。显示晚期转移疾病的患者用化疗可有症状改善和存活改善。在诊断中，患有NSCLC的患者可被分为3组类似治疗。第一组患者包括手术可切除肿瘤(通常I期、II期和一些III期患者)。这一组具有最佳预后。显示可切除癌症并有手术医学禁忌症的患者是治疗性放疗的候选者。第二组包括具有局部(T3-T4)和/或区域(N2-N3)晚期肺癌的患者。第三组包括具有在诊断时发现的远处转移(Ml)的患者。这一组可用缓解性放疗或化疗治疗。已经尝试了多项研究以鉴别决定性预后因子(AlbainKS，CrowleyJJ，LeBlancM,etal.:Survivaldeterminantsinextensive-stagenon-small-celllungcancer:theSouthwestOncologyGroupexperience.JClinOncol9(9):1618-26，1991;MacchiariniP，FontaniniG,HardinMJ，etal,:BloodvesselinvasionbytumorcellspredictsrecurrenceincompletelyresectedTlNOM0non-small-celllungcancer.JThoracCardiovascSurg106(1):80-9,1993;IchinoseY,YanoT，AsohH,etal,:Prognosticfactorsobtainedbyapathologicexaminationincompletelyresectednon-small-celllungcancer.Ananalysisineachpathologicstage.JThoracCardiovascSurg110(3):601-5，1995;MartiniN,BainsMS,BurtME，etal.:IncidenceoflocalrecurrenceandsecondprimarytumorsinresectedstageIlungcancer.JThoracCardiovascSurg109(1》120-9，1995;FontaniniG，BiginiD，VignatiS，etal.:Microvesselcountpredictsmetastaticdiseaseandsurvivalinnon-smallcelllungcancer.JPathol177(1):57-63，1995).与不利的预后相关的因子包括-存在肺部症状-大尺寸肿瘤(>3厘米).-非表皮样组织学.-淋巴结中的结转移，由TNM确定-血管侵袭类似地，有关在肺癌中一些蛋白质的异常表达的预后重要性的互相矛盾的结果已经被报道。对于患有不可手术的癌症的患者，预后由差的一般状况和体重减轻>10%而连累。由于治疗对于几乎所有患有NSCLC的患者都不是令人满意的，有必要发现新的治疗靶和用于早期诊断的新的工具。前列腺癌是50岁以上男性中最常见的癌症并在发达国家中是次于肺癌的第二最常见因癌死亡因素。其发生随着年龄而增加。在法国，1990年的总体发生率是每100000人中71.4(在35-49岁年龄范围是2.6;在50-69岁年龄范围是133.8;在70岁年龄范围是726.9)。前列腺癌的平均年龄是70岁左右，但是一些男性在更早年龄发病。在过去20年中与前列腺癌相关的死亡率增加23%，反映了期望寿命的增加和更加认识到前列腺癌是主要死亡因素。在法国，总体因癌死亡率在1990年是每100000人33.4，即每年死亡超过9000人。前列腺癌占全部死亡中的3.4%，因癌死亡的10.7%。前列腺癌通过进展非常缓慢，并在开始时保持局部化。当癌症进展时，其可以通过直接侵袭位于前列腺附近的组织和器官而扩散出前列腺，并且其可以扩散到远离前列腺的其它器官。前列腺特异性抗原(PSA)是用于检测前列腺癌的肿瘤标记。血中PSA水平以每毫升纳克(ng/ml)表示并且如果水平低于4ng/ml被认为是正常的。在前列腺癌情况中PSA水平越高，癌症远处扩散的风险越高，其通常意味着恢复或长期存活的机会降低。但是，PSA不是一种理想的标记这是因为由升高的PSA水平检测的某些癌症可能具有非常缓慢的进程，无需治疗。因此，有必要发现新的诊断工具(用于在组织水平诊断或在生物学液体水平诊断)，以精确检测具有迅速蔓延性(aggressivepotential)的癌症，以与具有非常缓慢进程的癌症重新区分。为了明确诊断，使用前列腺的直肠内回波描记术，其可以非常精确地支配针在前列腺的给定位点取样。只有活检能证实癌症，因为癌细胞在显微镜下是可见的。活检因此对于确定疾病的预后是非常重要的。参考治疗是根治性前列腺切除术(radicalprostatectomy)。这一手术除去完整前列腺和精囊。其仅是在癌症未超出前列腺界限时进行。约10%的患者在局部前列腺癌的根本性前列腺切除术后5年内会局部复发。放疗用于治疗位于前列腺内的癌症，或者已经到达邻近组织的癌症。其可用于降低肿瘤大小或防止局部并发症。激素治疗的目的是对抗刺激前列腺的雄性激素(雄激素)的作用。因此，降低主要雄性激素睾酮的水平阻断癌细胞增殖并降低前列腺的体积。激素治疗仅具有短暂效应，其阻断癌增殖而非治愈它。当前列腺癌已进展到扩散出前列腺并且不再响应激素治疗时使用化疗。化疗降低肿瘤生长并且可以降低与癌相关的疼痛。上述治疗可能有一些副作用，包括尿失禁、阳萎、肠道问题(腹泻、大肠炎)，以及主要在治疗过程中发生的泌尿问题(尿频、尿流变小、排尿急迫、排尿时灼热感、尿中有血)。长期激素治疗可导致骨质疏松、骨易碎。新的靶向治疗剂使得可以防止一些副作用，改善前列腺癌治疗的效果。新的诊断和预后工作可使得区分缓慢进展的癌症和具有转移趋势的迅速蔓延的癌症。在临床实践中，在肿瘤被发现后，在规定的实验室中通过组织学方200780004023.8说明书第7/33页法鉴定肿瘤恶性程度。使用一系列参数如肿瘤大小、其组织病理学级别、相关炎症和淋巴结侵袭来决定治疗法和评估疾病预后。对于许多癌症，包括乳腺癌、甲状腺癌、肺癌和前列腺癌，可以区分肿瘤细胞和正常细胞的标记已经被寻找和研究了很多年。它们使得可以早期诊断疾病、确定所述级别的预后和对治疗的敏感性、以及监控所述疾病的进程。直至目前，已被鉴别和研究的候选标记是癌基因、组织标记和与血管发生相关的标记或与肿瘤的转移能力相关的标记。目前，鉴别的乳腺癌标记主要被用于治疗随诊。对于乳腺癌的早期诊断或筛查没有验证的生物学测试，许多其它癌症也没有(对于结肠直肠癌的大规模筛查，检测粪便中的血红蛋白)。在前列腺癌情况中，PSA可被用于辅助诊断并指示前列腺活检的需要。血浆中降钙素的免疫测定是髓样甲状腺癌的优异标记。在一些国家中，其可被用于筛查前列腺癌，但是其尚未基于人群验证这一指示。仅在乳腺肿瘤组织上检测雌激素受体使得可以确定乳腺肿瘤是或不是激素敏感的。检测乳腺癌中的HER-2/neu受体使得可以确定肿瘤对Herceptin是否敏感。在癌性乳腺细胞中已经鉴别了有限数目的抗原标记，特别是CA15-3(Basuyau,J.P.，M.P.Blanc-Vincent,J.M.Bidart,A.Daver,L.Deneux，N.Eche，G.Gory國Delabaere,M.F.Pichon,andJ.M.Riedinger.2000.[Standards,OptionsandRecommendations(SOR)fortumormarkersinbreastcancer.SORWorkingGroup].BullCancer.87:723-37)。这一标记的通常实践是用于患者跟踪，特别是检测复发，但是因为其敏感性低，不建议其用于筛査测试或诊断测试。若干年来，与乳腺癌相关的抗原的有关研究已被开发，不是为了寻找标记，而是寻找免疫治疗靶。这些研究从抗T/Tn抗原的体液免疫的证实(Springer，G.F.1997.ImmunoreactiveTandTnepitopesincancerdiagnosis,prognosis,andimmunotherapy.JMolMed.75:594-602)，至廿最近发现的针对p53(Gnjatic，S.,Z.Cai，M.Viguier，S.Chouaib，J.G.Guillet，andJ.Choppin.1998.Accumulationofthep53proteinallowsrecognitionbyhumanCTLofawild-typep53epitopepresentedbybreastcarcinomasandmelanomas.JImmunol.160:328-33)和HER-2/neu(Disis,M.L.，andM.A.Cheever.1997.HER-2/neuprotein:atargetforantigen-specificimmunotherapyofhumancancer.AdvCancerRes.71:343-71)的抗体禾口T细胞应答。最近，已通过SEREX(血清学表达克隆)途径基于构建肿瘤细胞cDNA文库并用自体血清筛选而揭示了一系列新的潜在抗原。血清学乳腺癌文库筛选因此己使得可以揭示i7VG7抗原(Jager,D.,E.Stockert，M.J.Scanlan,A.O.Gure，E.Jager，A.Knuth,L.J.Old,andY.T.Chen.1999.Caneer-testisantigensandINGltumorsuppressorgeneproductarebreastcancerantigens:characterizationoftissue-specificINGltranscriptsandahomologuegene.CancerRes.59:6197-204.)，和新的分化抗原A^-AR-7，根据作者，其在80。/。乳腺癌中表达并在患者中诱导产生IgG抗体(Jager,D.，E.Stockert,A.O.Gure，M.J.Scanlan,J.Karbach,E.Jager,A.Knuth，L.J.Old,andY.T.Chen.2001.Identificationofatissue-specificputativetranscriptionfactorinbreasttissuebyserologicalscreeningofabreastcancerlibrary.CancerRes.61:2055-61)。这一类型的途径主要被用于寻找可潜在被用于开发疫苗的靶，推理不排除存在于正常组织中的抗原(这是A^-^-7的情况)，也不排除由有限数目的患者血清识别的抗原(2/14，对于/AW/);它们因此不能被开发用于筛査或早期诊断策略。通过相同途径，已经揭示了诱导患者中的体液免疫应答的其它抗原，如NY-BR-62，NY-BR-85和D52蛋白。这些抗原据认为分别在60%、卯％和60%的乳腺癌中过表达(Scanlan，M.J.,andD.Jager.2001.Challengestothedevelopmentofantigen-specificbreastcancervaccines.BreastCancerRes.3:95-8.)。导致癌症、更具体地乳腺癌的发生的分子学现象包括结构修饰和癌基因(如m"表达的修饰以及肿瘤抑制基因如p53的突变。大部分乳腺癌中肿瘤生长依赖于雌激素(雌二醇和孕酮)以及依赖于控制增殖、迁移和凋亡的生长因子。前列腺癌的生长是雄激素依赖性的。一些甲状腺癌的生长是甲状腺剌激激素(TSH)依赖性的。这些生长因子协同作用刺激或抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和分化，以促进癌症的生长和转移。例如，胰岛素型生长因子、转化生长因子a(TGF-a)和成纤维细胞生长因子(FGF)全都可以刺激乳腺癌细胞增殖，而乳腺衍生生长因子抑制剂(MDGI)和转化生长因子P(TGF-P)抑制它们的生长。在专利申请W02004/040312中，申请人描述了使用NGF作为肿瘤标记和作为治疗靶。因此，NGF由乳腺癌细胞产生，而相应的正常乳房表皮细胞不产生之。另外，NGF刺激癌性乳房表皮细胞的存活和增殖，而其对正常乳房表皮细胞无作用。NGF基因编码一蛋白前体称作ProNGF(26kDa)，其通过酶裂解产生NGF(13.6kDa)(Seidahetal.,1996,BiochemJ,,314:951-960)。哺乳动物中NGF的主要来源是颌下腺，其仅含NGF和非常少的ProNGF。很长时间，已知ProNGF的唯一作用是具有非常短暂寿命的代谢前体的作用。最近，在各种组织中已经示出ProNGF以大于NGF的量被发现(Bierletal,,2005,NeurosciLett,380:133-137)。Hasanetal.描述了ProNGF可以被分泌，其意味着其可以潜在地以自分泌、旁分泌或甚至内分泌方式起作用(2003,JNeurobiol,57:38-53)。最后，最近证实ProNGF在神经元细胞表面有高亲和性结合位点，通过该位点其具有特异性作用，不同于NGF。因此，ProNGF能结合sortilin，一种100kDa糖蛋白(Mazellaetal.,1998，JBiolChem，273:26273-26276)，诱导神经元细胞体外凋亡(Nykjaeretal.，2004,Nature,427:843-848)。专利申请WO2004/056385和WO2005/076695显示neurotr叩hin(NGF或ProNGF)之间的相互作用可以用特异化合物修饰，如使得可以治疗与一些泌尿生殖系统疾病相关的疼痛或神经系统被损伤的患者的调节。体内促凋亡活性也己经被赋予ProNGF(Pedrazaetal.，2005,AmJPathol，166:533-543)。清楚的是在NGF和ProNGF的表达和生物学作用方面有分离，其似乎是不同的。更一般地，原肽长期被认为仅是代谢前体；一些最近的例子，特别是在神经肽领域，表明在某些情况下，原肽具有它们自己的生物学活性，与它们所能产生的成熟肽不同。ProNGF就是这样的例子，其可以被细胞分泌，有其自己的受体并表明有与NGF不同的对神经元的生物学作用。ProNGF因此组成了与NGF不同的特异性分子和生物学实体。承认的是，NGF的序列包含在ProNGF中，但是它们等电点和分子量不同，它们的生物学活性也不同。申请人现已令人惊奇地证实上皮癌细胞特别是上皮乳腺癌、甲状腺癌、肺癌和前列腺癌细胞本身以显著的量产生和分泌ProNGF，而相同器官的正常上皮细胞不产生之，因而ProNGF可以被用作肿瘤标记或用作治疗靶。申请人还明确了在癌细胞中过表达的ProNGF对于这些细胞有促转移活性，而NGF具有抗凋亡和促有丝分裂活性。因此，本发明的一个主题是体外诊断癌症特别是乳腺癌、甲状腺癌、肺癌或前列腺癌的方法，其通过确定来自怀疑患有癌症特别是乳腺癌、甲状腺癌、肺癌或前列腺癌的患者的生物学样品中ProNGF的存在而进行。本发明的方法因此使得可以通过简单测试诊断癌症特别是乳腺癌、甲状腺癌、肺癌或前列腺癌，所述简单测试包括检测取自患者的生物学样品或在患者体内肿瘤中ProNGF的存在。申请人已令人意外地表明癌细胞产生ProNGF，而相应的非癌细胞不能这样做，以下将详细证明。因此，确定样品中ProNGF的存在使得可以得出结论所检测的病理学是存在的，ProNGF不存在说明病理学不存在。ProNGF在肿瘤中的存在也可以体内、在肿瘤原位显示。为了显示体内肿瘤中ProNGF的存在，可以使用本领域技术人员已知的任何成像方法。为此，可以将特异性ProNGF结合配偶体与成像示踪剂偶联。所述特异性ProNGF结合配偶体是任何能结合ProNGF的配偶体。例如，抗体、抗体部分、受体和其它能结合ProNGF的分子。结合配偶体抗体是例如多克隆抗体或单克隆抗体。"将结合配偶体与成像示踪剂偶联"是指可以被本领域技术人员已知的任何成像方法检测的和能直接或间接产生可检测信号的示踪剂的附着。因此，示踪剂可以是放射性示踪剂如锝-99。在这种情况中，被原发癌或转移侵袭的器官将结合ProNGF及其示踪剂。由该器官发出的辐射可以由特殊的相机例如相机照相。该装置收集由放射性物质产生的光闪烁并因此显现该器官。在本发明的另一种方法中，示踪剂包括发出正电子的放射性物质(氟1S)。图像然后被正电子发射层析成像系统捕捉。在本发明的另一种优选的方法中，ProNGF配偶体可以与纳米颗粒偶联。例如，它们可以是超磁性纳米颗粒(supramagneticnanopartides);例如阴离子磁性纳米颗粒，其用于直接细胞标记和通过核磁共振成像迸行的体内检测。它们也可以是金纳米颗粒。通过本发明的可以体内检测ProNGF的方法，可以显现下述身体区域，即具有ProNGF结合配偶体的结合、产生ProNGF的癌症特别是乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌和肺癌、以及它们的远处转移的位置和淋巴结牵涉。体外确定ProNGF的存在可以直接检测ProNGF，通过培养对ProNGF敏感的细胞，或者通过本领域技术人员己知的任何其它确定样品中蛋白质的存在的方法进行。通过ProNGF的直接检测而确定ProNGF的存在是本发明的具体实施方案。术语"ProNGF的直接检测"是指证实生物学样品中的ProNGF本身。生物学样品中的ProNGF的直接检测可以通过本领域技术人员已知的任何手段进行，例如免疫测定、质谱，其是本发明的一个具体实施方案。免疫测定可以是本领域技术人员广泛知道的涉及免疫反应即ProNGF和特异的ProNGF结合配偶体之间的反应的任何测定。特异的ProNGF结合配偶体是能结合ProNGF的任何配偶体。例如，可提及的有抗体、抗体部分和能结合ProNGF的任何其它分子。结合配偶体抗体是例如多克隆抗体或单克隆抗体。多克隆抗体可以如下获得，用ProNGF免疫接种动物，然后通过取所述动物的血清样品并从其它血清组分中分离所述抗体而回收纯化形式的希望抗体，所述分离具体是通过在柱上亲和层析而进行，所述的柱附着由所述抗体特异识别的抗原，具体是ProNGF。单克隆抗体可以通过杂交瘤技术获得，其一般原则总结如下。最初，动物、通常是小鼠(或者在体外免疫接种情况中，培养细胞)用ProNGF免疫，所述动物的B淋巴细胞然后能产生抗此抗原的抗体。这些产生抗体的淋巴细胞随后与"永生化"骨髓瘤细胞(在例子中是小鼠的)融合以产生杂交瘤。从如此获得的异种细胞混合物中，选择能产生特定抗体并能无限繁殖的细胞。每个杂交瘤以克隆形式繁殖，每个产生单克隆抗体，可以通过例如ELISA、用一维或二维免疫印迹、用免疫荧光、或用生物传感器测试其识别ProNGF的性质。如此选择的单克隆抗体随后被纯化，特别是根据上述亲和层析技术纯化。单克隆抗体也可以是通过基因工程、本领域技术人员熟知的技术获得的重组抗体。抗ProNGF抗体的例子是已知的并且可特别得自Chemicon目录。当结合配偶体被用作检测试剂时，特异的ProNGF结合配偶体可以被标记以显现ProNGF/结合配偶体的结合，并因此用于生物学样品中的ProNGF的直接检测。术语"结合配偶体的标记"是指能直接或间接产生可检测信号的标记的附着。这些标记的非限制性列表包括产生可通过例如比色法、荧光或发光检测的信号的酶，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、ot-半乳糖苷酶或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，发色团如荧光、发光或染料化合物，放射性分子如34,35S或1251,及荧光分子如Alexas或藻蓝蛋白。也可以使用间接系统，如能与抗配体反应的配体。配体/抗配体对是本领域技术人员熟知的，例如其是如下配对生物素/链霉抗生物素蛋白、半抗原/抗体、抗原/抗体、肽/抗体、糖/凝集素、多核苷酸/与多核苷酸互补的序列。在本申请中，配体携带结合配偶体。抗配体可以通过前述段落描述的标记而直接检测或者可以本身通过配体/抗配体检测。在一些条件下，这些间接检测系统可以放大信号。这一信号放大技术是本领域技术人员熟知的，可参见申请人之一的先前的专利申请FR98/10084或WO-A-95/08000，或文章J.Histochem.Cytochem.45:481-491,1997。根据所用标记类型，本领域技术人员能添加用于显现标记的试剂。上述免疫测定的例子可以提及的是"夹心"法如ELISA，IRMA和RIA，"竞争"法和直接免疫检测法如免疫组织化学、免疫细胞化学、Westem印迹和斑点印迹。在"竞争"方法中，ProNGF如以上对结合配偶体描述的那样进行标记。质谱也可以用于直接检测生物学样品中的ProNGF。谱分析原则是本领域技术人员广泛知道的并且在例如Patterson,S.，2000，Massspectrometryandproteomics.PhysiologicalGenomics2，59-65中描述。为此，可使经预处理或未经预处理的生物学样品通过质谱仪，并将获得的谱图与ProNGF的进行比较。样品预处理的一个例子包括使其通过免疫捕获载体，该免疫捕获载体包含一种ProNGF结合配偶体，例如抗ProNGF的抗体。样品预处理的另一个例子可以是生物学样品的预分级分离，以分离样品中的各个蛋白质。在本领域技术人员熟知的技术中，样品中的主要蛋白质可以例如首先被耗竭。用于ProNGF的直接检测的生物学样品可能含有ProNGF等，其可以包括生物学液体或源自被考虑的患者的肿瘤或转移的活检的组织。可以提及的生物学液体是全血及其衍生物如血清或血浆、骨髓、乳汁、脑脊液、尿液和渗出物。血液或其衍生物是优选的。为检测ProNGF，组成本发明一个具体实施方案的生物学液体可能需要特殊处理。这是因为生物学液体可能含有ProNGF等，或者可能含有循环型肿瘤细胞(recyclingtumorcell),所述细胞含有ProNGF，禾卩/或能分泌ProNGF的循环型肿瘤细胞。因此，根据本发明的一个实施方案，生物学液体被预处理以分离所述液体所含的循环型肿瘤细胞。术语"分离循环型肿瘤细胞"是指获得循环型肿瘤细胞中富含的细胞级分。处理液体以分离循环型肿瘤细胞可以通过在流式细胞仪中的细胞淘选、通过在Ficoll上富集、通过用包被有特异抗体的磁珠富集或通过本领域技术人员已知的其它特异富集方法进行。在血液或骨髓作为生物学液体的情况中，循环型肿瘤细胞可以通过在Ficoll上进行细胞分离并结合用偶联至磁珠的抗CD45抗体耗竭血细胞的技术进行分离(DynalBiotechASA,Norway)。PmNGF的直接检测可以然后直接在分离自生物学液体的循环型肿瘤细胞上进行，例如在将循环型肿瘤细胞经cytospin沉积在玻片上之后用抗ProNGF抗体对这些细胞进行免疫细胞化学标记。ProNGF的直接检测也可以直接用流式细胞术在循环型肿瘤细胞中进行，所述流式细胞术女口M6t6zeauP,RonotX，LeNoan-MerdrignacG,RatinaudMH,Lacytom6trieenfluxpourl'6tudedelacellulenormaleoupathologique[Flowctyometryforstudyingnormalorpathologicalcells](TomeI),publishedbyMedsi-MacGrawhill所述在这些条件下，所述循环细胞可以在使得ProNGF被阻断在所述细胞内部的条件下处理。这种处理在例如IntracellularFlowCytometry,AppliedreagentsandTechniques,pp1-21,BDPharmingen中描述。在使细胞膜透化以使得特异的ProNGF结合配偶体进入后，进行ProNGF的检测。使用循环细胞的ProNGF的直接检测也可以通过申请人之一的专利申请WO03/076942中描述的方法进行。肿瘤细胞中的ProNGF的直接检测也可以在使细胞分泌ProNGF的条件下培养细胞后在所述细胞的培养基中进行。这些培养条件是常规条件，如37'C、潮湿环境和5%(:02。当被测试的生物学样品是源自患者的肿瘤或转移的活检组织时，其是本发明的一个具体实施方案，ProNGF的直接检测在获得的切片上直接进行，无需预处理所述组织。另一种检测PmNGF的存在的方法包括在生物学样品存在下培养ProNGF敏感性细胞，其组成了本发明的一具体实施方案。在这种情况中，检测生物学样品中ProNGF的存在由ProNGF敏感性细胞的反应而证实。术语"ProNGF敏感性细胞"是指在ProNGF存在下被刺激(生长、凋亡等)的任何细胞。可提及的ProNGF敏感性细胞包括神经元来源的细胞如P12细胞(Pedrazaetal.Am.JPathol.2005，166，533-543)。可被用于通过培养ProNGF敏感性细胞而检测ProNGF存在的生物学样品可以是上述任何样品。因此，生物学样品可以包括生物学液体，其被合适预处理以分离循环型肿瘤细胞，这些细胞本身可随后在使得其分泌ProNGF的条件下被培养，如上所述。本发明的方法可以用于癌症特别是乳腺癌、甲状腺癌、肺癌或前列腺癌的早期诊断和筛查、治疗性跟踪、预后和复发诊断，因为只有癌细胞产生ProNGF，并且这一产生依赖于癌症级别。因此，本发明的另一个主题是本发明的方法在癌症特别是乳腺癌、甲状腺癌、肺癌或前列腺癌的早期诊断、筛查、治疗性跟踪、预后和复发诊断中的用途。除了肿瘤标记作用之外，ProNGF还可以具有作为治疗靶的作用。事实上，由于癌细胞特别是乳腺癌、甲状腺癌、肺癌或前列腺癌细胞产生ProNGF的能力，而正常细胞不产生ProNGF，乳腺癌、甲状腺癌、肺癌或前列腺癌细胞的远处播散以及细胞的侵袭可以被能阻断ProNGF活性的ProNGF抑制剂阻断。另外，ProNGF单独或与其它分子组合可以用作靶向治疗工具的治疗靶。在此情况中治疗工具可以是可活化的纳米颗粒、细胞毒性剂或可以摧毁癌细胞的任何其它分子。ProNGF抑制剂因此可以被用作药物。因此，本发明的一个主题还包括ProNGF抑制剂在制备特别是用于治疗癌症、更具体地乳腺癌、甲状腺癌、肺癌或前列腺癌的药物中的用途。根据本发明的一个具体实施方案，所述药物可被用于阻断患有癌症、更具体地乳腺癌、甲状腺癌、肺癌或前列腺癌的患者中的细胞迁移或肿瘤细胞侵袭。术语"细胞迁移"是指患有癌症、更具体地乳腺癌、甲状腺癌、肺癌或前列腺癌(转移)的患者中的远处播散，术语"侵袭"是指癌细胞的局部穿透。本发明还包括药物组合物，其包含作为活性成分的至少一种ProNGF抑制剂，任选地与药物学可接受的赋形剂组合。可被用于抗癌的药物组合物包含作为活性成分的至少一种能阻断细胞迁移或侵袭的ProNGF抑制剂。术语"ProNGF抑制剂"是指ProNGF的直接抑制剂，即阻断蛋白质的生物学活性的抑制剂，如ProNGF结合配偶体，还指ProNGF受体的抑制剂或ProNGF信号途径的任何抑制剂，以及能特异地结合ProNGF而无论是否阻断生物学活性的任何分子。在肿瘤性和正常的乳腺上皮细胞中表达的ProNGF受体的一个例子是Sortilin。适合作为活性成分的特异的ProNGF结合配偶体特别如上述在免疫测定中定义的那些并可以是本领域技术人员已知的能阻断细胞迁移或侵袭的任何其它配偶体。根据一个具体实施方案，能阻断乳腺癌细胞的迁移或侵袭的特异的配偶体是抗ProNGF抗体。ProNGF的直接抑制剂的另一个例子是可溶形式的ProNGF受体的类似物，如可溶形式的Sortilin类似物，其也组成了本发明的一个实施方案。术语"由肿瘤和正常乳腺上皮细胞表达的ProNGF受体的抑制剂"是指例如通过所述受体或通过阻断其产生而阻断ProNGF的活性的任何分子。通过所述受体阻断ProNGF活性可以通过阻止ProNGF与所述受体的结合而进行，例如使用能结合所述受体并因而占据ProNGF的位置的物质。这种抑制剂的一个例子包括保留了结合所述受体的性质的ProNGF衍生的肽或抗所述受体的抗体。ProNGF的活性也可以通过用所述受体的mRNA的抑制剂或编码所述受体的基因的抑制剂阻断所述受体的产生而被阻断。作为受体mRNA的抑制剂，可以使用这mRNA的合成片段。事实上，干扰RNA技术(小干扰RNA或siRNA)是基于使用相应于待被抑制的细胞mRNA的短序列的双链RNA寡核苷酸。这一双螺旋形式的寡核苷酸(可能被导入质粒中)在进入细胞后，被Dicer/Risc酶系统处理，导致相应的细胞mRNA的降解(DykxhoomDetal.,2003，NatureReviews,vol.4，p457-467)。编码受体的基因的抑制剂可以提及的是所述受体的反义寡核苷酸。这一寡核苷酸可以容易地由本领域技术人员制备(Lefran90isSetal.Biol.Proced.online.2005，7(1):17-25)。根据本发明的一个具体实施方案，ProNGF抑制剂是ProNGF受体的siRNA。术语"ProNGF信号途径抑制剂"是指阻断ProNGF的生物学活性如其对细胞迁移和侵袭的活性的任何分子。为了靶向各种抑制剂的治疗作用，后者可以被置于使其特异地穿透进感兴趣细胞如肿瘤细胞的条件下，这组成了本发明的另一个实施方案。为此，它们可以例如被附着于允许这种穿透的配偶体，例如载体分子，聚合物如基因治疗中使用的聚合物，或也用于基因治疗中的病毒载体如腺病毒和痘病毒。例如，在乳腺癌的情况中，载体分子可以是抗MUC1抗体或抗上皮细胞抗体，或者抗HER/2/neu抗体。在甲状腺癌的情况中，载体分子可以是抗甲状腺球蛋白抗体或抗上皮细胞抗体。在前列腺癌中，载体分子可以是抗PSA抗体或抗上皮细胞抗体。在肺癌情况中，载体分子可以是抗上皮细胞抗体。ProNGF信号途径抑制剂还可以附着于抗癌剂。术语"抗癌剂"是指对于癌细胞是毒性的化合物。例如，ProNGF配偶体可以与治疗性纳米颗粒结合，当它们被活化时可以靶向破坏肿瘤。在本发明的另一种方法中，ProNGF配偶体可以与细胞毒性剂偶联或与用于阻断癌发生过程的分子偶联。优选地，当药物组合物包含作为活性成分的ProNGF抑制剂如直接抑制剂或ProNGF信号途径抑制剂时，它们被置于使其特异地穿透进入感兴趣的肿瘤细胞的条件下，ProNGFmRNA抑制剂和编码NGF的基因的抑制剂具有天然穿透进入所述细胞的能力。赋形剂的量和性质可以容易地由本领域技术人员确定。它们根据药物形式和希望的给药方法选择。本发明的药物组合物适于口服、舌下、皮下、肌肉内、肿瘤内、静脉内、局部(topical)、局部(local)、气管内、鼻内、真皮内、直肠、眼内或耳内给药，所述活性成分可以以单位给药形式给药。单位给药形式可例如是片剂、凝胶胶囊、颗粒、粉末、可注射口服溶液或悬液、贴剂、舌下、颊内、气管内、眼内、鼻内或耳内给药形式，通过吸入给药的形式，局部、真皮内、皮下、肌肉内、肿瘤内或静脉内形式，直肠给药形式或移植物。对于局部给药，可以包括乳膏、凝胶、软膏剂、洗剂或洗眼液。这些盖伦(galenical)制剂形式根据本领域常用方法制备。所述单位形式含有的剂量使得根据盖伦制剂形式日给药O.OOl-10mg活性成分/千克体重。可以有特殊的情形，其中更高或更低的剂量是合适的，这种剂量不偏离本发明范围。根据通常实践，每个患者合适的剂量根据给药方法和患者体重和应答而由医生确定。根据另一个实施方案，本发明还涉及治疗乳腺癌的方法，其包括给予患者有效剂量的ProNGF结合配偶体或ProNGF抑制剂。本发明根据以下非限制性实施例和表1和表2以及附图1-10会变得更清楚，其中-图l是Western印迹照片，显示了癌性乳腺上皮细胞(MCF-7，T47-D,BT-20和MDA-MB-231)产生ProNGF，而正常细胞(NMEC细胞)不产生，肌动蛋白被用作阳性对照。-图2是Western印迹照片，显示了在癌性乳腺活检样本(ST-1至ST-4)中存在ProNGF,但在正常活检样本(SS-l至SS-4)中不存在ProNGF，肌动蛋白被用作归一化对照。-图3是\^^111印迹照片，显示了參图3A:MCF-7癌细胞分泌ProNGF(浓縮的条件培养基泳道)，右边两个泳道是对照泳道，，图3B:用于图3A的浓縮/脱盐装置能保留NGF。-图4是Western印迹照片，显示了在用癌细胞注射的小鼠血清中存在ProNGF而在正常小鼠血清中不存在。-图5是用质谱检测在用MCF-7细胞条件化的培养基中的ProNGF(图5A,5C和5E)或用质谱检测重组ProNGF(图5B和5D)的图，给出作为质量的函数的相对丰度。-图6是Western印迹照片，显示了在癌性乳腺上皮细胞(MCF-7，T47-D,BT-20和MDA-MB-231)和正常细胞(NMEC细胞)中Sortilin的存在，肌动蛋白被用作阳性对照。-图7是给出培养24、48和96小时后在EMEM培养基中生长的MDA细胞数的图，所述细胞已经用如下物质转染仅培养基(模拟)，阴性对照干扰RNA(siGFP，由部分互补序列SEQIDN0.1和SEQIDN0.2组成的双链RNA分子，其中核苷酸N代表胸腺嘧啶T)，或降低Sortilin的表达的干扰RNA(siSORT,由部分互补序列SEQIDN0.3和SEQIDN0.4组成的双链RNA分子，其中核苷酸N代表胸腺嘧啶T)，序列siGFP:SEQIDNo.15'-GCUGACCCUGAAGUUCAUCNN-3'SEQIDNo.25，-GAUGAACUUCAGGGUCAGCNN-3'序歹UsiSORT:SEQIDNo.35'-GGUGGUGUUAACAGCAGAGNN-3'SEQIDNo.45，-CUCUGCUGUUAACACCACCNN-3'-图8给出使用MCF-7细胞的细胞迁移百分比，所述MCF-7细胞浸在如下培养基中仅饥饿培养基(starvingmedium)，补加200ng/mLProNGF的饥饿培养基，补加200ng/mLProNGF和20galardin的饥饿培养基，或补加20jiMgalardin的饥饿培养基，或补加200ng/mLNGF的饥饿培养基。-图9给出使用MCF-7细胞的侵袭指数，所述MCF-7细胞浸在如下培养基中仅饥饿培养基，补加200ng/mLProNGF的饥饿培养基，补加200ng/mLProNGF和20jiMgalardin的饥饿培养基，或补加20pMgalardin的饥饿培养基，或补加200ng/mLNGF的饥饿培养基。-图10是从Western印迹照片绘图而来，其显示了培养24或48小时后在转染ProNGF干扰RNA(siProNGF)后MCF-7细胞中ProNGF表达的降低。肌动蛋白被用作阳性对照，用于验证等上样量。MCF-7细胞用如下物质转染针对GFP的干扰RNA(siRNA)(siGFP，由部分互补序列SEQIDNo.l和SEQIDNo.2组成)，针对ProNGF的干扰RNA(siProNGF，由部分互补序列SEQIDNo.5和SEQIDNo.6组成的双链RNA分子，其中碱基N蛋白胸腺嘧啶T)。由印迹分析检测的ProNGF的相对量用QuantityOne软件(Bio-Rad)评价，与等上样量相关联并以柱状图形式提供，其中100M是siGFP对照条件，序列siGFP:SEQIDNo.15，-GCUGACCCUGAAGUUCAUCNN-3'SEQIDNo.25'-GAUGAACUUCAGGGUCAGCNN-3'序列siProNGF:SEQIDNo.55，-CAGUGUAUUCAAACAGUAUNN-3'SEQIDNo.65'-GUACUGUUUGAAUACACUGNN-3'实施例1:细胞培养1.1.材料所用细胞是得自ATCC(美国典型培养物保藏中心)的已建立的乳腺癌细胞系(BT-20,MCF-7,MDA-MB-231，T-47D)和得自在CentreOscarLambretinLille进行乳房成形术的患者的NMEC(正常乳腺上皮细胞)的原代培养物。MCF-7，MDA-MB-231和T-47D是上皮细胞，它们源自患有腺癌的患者的胸腔积液；BT-20部分源自原位癌。MCF-7和T-47D被称作"激素敏感的"是因为它们表达雌二醇受体，而BT-20和MDA-MB-231被称作"激素不敏感的"是因为它们不表达这些受体。活检样本源自进行了非恶性组织乳房成形术(ProfesseurPdlerinCHRU,Lille)或癌组织切除术(DocteurLaurent，Crois6Laroche，MarcqenBaroeul)的患者。含有肿瘤和正常乳腺组织斑点的免疫组织化学玻片(组织阵列)源自Biochainlnc.(Cat,No.T8235731)。含有衍生自各种器官的组织(癌组织和相应的正常组织)的其它免疫组织化学玻片源自SuperbioChips(Cat.No.MA(癌组织)，MAN(需要的正常组织)和AA(各种正常器官))。雌性6周龄SCID(Femalesix-week-oldSCID(重症联合免疫缺陷)小鼠得自IffaCredo(France)并驯化至少2周。这些小鼠在20画22。C饲养，同时保持交替12小时昼/夜(光照从6am至6pm)，并随意喂养，遵照InstitutionalAnimalCare设立的规定。所用ProNGF是人重组NGF，由SCILproteins(Germany)销售。重组EGF、HGF和NGF得自R&Dsystems(France)。皮质醇、胰岛素、DMSO(二甲基亚砜)、霍乱毒素、转铁蛋白、C2神经酰胺类似物(N-乙酰-D-鞘氨醇)和Hoechst33258(双苯甲亚胺)得自Sigma(France)。EMEM(Eagle，s极限必需培养基)、DMEM/F12(Dulbecco，s改良的Eagle，s培养基)，胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸)、HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N'-2'-乙磺酸)，L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/链霉素和庆大霉素由Cambrex(France)销售。FCS(月台牛血清)由GibcoInvitrogenCorporation(France)销售。所用的各种塑料制品lmL冻干管、15mL和50mL离心管、100mm直径皮氏皿、75cma咅养皿、175cm4咅养皿和6孔板(35mm直径的孑L)由Starstedt(Germany)出售。transwell得自Costar(France)。纤连蛋白f寻自BectonDickinson(France)。glycergel由Dako(France)出售。Galardin得自Tebu-Bio(France)。胶原I型由Upstate(UnitedStatesofAmerica)出售。1.2.细胞解冻和维持从液氮中取出细胞冻干管并在37"C解冻2分钟。然后回收悬浮液并转移至含有19mLMEM(极限必需培养基)的50mL离心管中。在200g离心(15分钟)以除去痕量DMSO(二甲基亚砜)。回收细胞沉淀，然后用10mL完全培养基(组成如下)悬浮并转移进75cn^培养皿中。24小时后更换培养基，在24小时后传代细胞。细胞然后在进行实验之前维持2周。癌细胞系维持在75cm2培养皿中，它们粘附在培养皿上并在完全培养基中生长为单层，完全培养基为EMEM补加10WFCS,20mMHEPES,2g/L碳酸氢钠，2mML-谷氨酰胺，1%非必需氨基酸，40|ig/mL青霉素/链霉素和50jig/mL庆大霉素。NMEC维持在75cm2培养皿中，它们粘附在培养皿上并在完全培养基中生长为单层，完全培养基为:DMEM/F12补加5%FCS,10ng/mL胰岛素，5pM皮质醇，2ng/mLEGF,0.01ng/mL霍乱毒素，100pg/mL青霉素和45ng/mL庆大霉素。在潮湿环境中于37°(:和5%C02下培养细胞。维持培养基每2天更换并在铺满时传代细胞。实施例2:ProNGF的检测2.1.方法学裂解乳腺细胞和活检样本蛋白质提取细胞接种在3个直径为100mm的皮氏皿中，然后在95%铺满时，在冰上用PBS(磷酸缓冲盐水)洗细胞2次107mMKCl，59mMKH2P04,137mMNaCl，56mMNa2HP04，用100pL/皿裂解缓冲液裂解细胞，所述裂解缓冲液含有50mMtris-HCl，pH7.5,150mMNaCl,1%NonidetP-40,1%SDS(十二烷基硫酸钠)，和蛋白酶活性抑制剂mM苯基甲基亚砜氟化物，1mM正矾酸盐，1mMNa4P207,10|ag/mL亮抑蛋白酶肽和10pg/mL抑肽酶。将培养皿冷冻12小时，然后刮擦并合并裂解物，在100。C加热5分钟，在10000g离心(10分钟，4°C)，回收上清。将活检样本称重并与10倍体积的裂解缓冲液(上述)一起置于一轮子(wheel)上(l小时，4°C)。然后在冰上用杜恩斯匀浆器研磨它们，冷冻(20分钟，-80°C)，在冰上解冻。最后在13000g离心(IO分钟，4°C)，去除脂质层并回收上清。用双金鸡宁酸方法测定上清，与一系列牛血清白蛋白比较，然后分成50pL等份冷冻。获得条件培养基和血清将MCF-7细胞在完全培养基中接种到175cm4咅养皿中。在卯％铺满时，在饥饿培养基中洗培养皿2次，然后用14mL饥饿培养基饥饿细胞24小时。之后，回收由细胞条件化的培养基并在1000g离心(15分钟，4°C)。上清随后直接使用或在-2(TC冷冻。截留阈值为10kDa的浓縮/脱盐装置(CentriconPlus20,Millipore，France)各加载14mLMCF-7条件培养基然后在4000g离心(15分钟，4°C)。这些相同装置进一步用14mL条件培养基再加载3次(产生起始培养基的4倍浓縮)。这些装置然后用mQ质量的水(18.205111)脱盐，其是通过加载14mL并在4000g离心(15分钟，4。C)而进行，这一步骤根据厂商推荐进行2次。最后，倒转装置回收浓縮液，在l000g离心(4分钟，4。C);回收250pL。浓縮的条件培养基然后分成50pL等份并在-20。C冷冻。然后实现4xl4000/250的浓縮倍数，即224倍。MDA-MB-231细胞(3x106)被重悬于PBS中，然后皮下注射进8周龄SCID小鼠的胁腹。两周后，每2天测量肿瘤体积。7周后，小鼠用乙醚麻醉，通过心内取样采血，之后处死动物。血液在4x:过夜以使得凝集，离心后回收血清，测定并在-2(TC冷冻。SDS-PAGE在使用前解冻等份(50pL)，加入12.5jiL5xLaSmmli缓冲液5°/。SDS，5。/oj3-巯基乙醇，500/0甘油，50mMTris,pH6.8，0.30/0溴酚蓝。蛋白质上样到12.5%聚丙烯酰胺凝胶的孔中。迁移后(30mA,5小时)转移到硝基纤维素膜上(200mA，l小时)，转移质量用Ponceau红染色评价。免疫检测膜用在含有0.1%Tween20的TBS(Tris缓冲盐水)溶液(17.54gNaCl，2.42gTris，2mLtween20,QSP2L，pH调节至7.4)中的4%牛血清白蛋白在室温饱和2小时。饱和后，膜与各种一抗在4'C在饱和溶液中保温过夜l:2000的抗ProNGF(AB9040,来自Chemicon),l:2000在饱和溶液中的抗NGF(SC-548，来自Sigma)或1:5000的抗肌动蛋白(A-2066，来自Sigma)。用TBS0.P/。Tween20洗涤后，膜与1:20OOO在饱和溶液中的偶联有辣根过氧化物酶的抗兔二抗(A-1949，来自Sigma,France)在室温保温1小时。洗涤后，用ECL系统(PierceInterchim，France)根据推荐使用的数据进行显影。免疫组织化学在第一步中，将组织阵列玻片脱蜡。为此，将它们依次在下列浴中保温10分钟甲基环己烷(2次)、100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇和水。玻片然后用TBS0.1。/。Tween20(TBS-T)振荡洗10分钟。通过加热至9(TC40分钟，然后冷却至室温30分钟而在10mM柠檬酸盐缓冲液，pH6中再活化抗原。通过在含有3MH202的TBS-T中保温5分钟抑制内源过氧化物酶。玻片然后在湿室中用含3%BSA的TBS-T在37'C饱和1小时。玻片然后与在含3%BSA的TBS-T中稀释至1/200的抗ProNGF—抗(AB9040，来自Chemicon)保温2小时(在湿室中于37。C保温)。用TBS-T洗10分钟共3次后，玻片在湿室中与在饱和溶液中稀释至l/400的偶联有辣根过氧化物酶的抗兔二抗(Cat.No.711-035-152JacksonImmunoresearch)于37。C保温2小时。玻片用TBS-T洗3次各10分钟，再用PBS洗3次各10分钟。用SigmaFast底物(Cat.No.D-4168,Sigma-Aldrich)显影5分钟。在PBS中洗涤而终止染色。用Harris苏木精(CatNo.MHS16，Sigma-Aldrich)复染30秒。用水和用PBS洗涤后，玻片在显微镜下观察。质谱(MS)将MCF-7条件培养基注射到C4LC(LiquidChromatography)纳米柱(Dionex,Fmnce)中，其使得可以根据增加的疏水性梯度分离全部蛋白质。因此，最疏水的蛋白质最后洗脱。分离后，全部蛋白质用nanoESI(ElectroSprayIonization)离子化，然后在离子阱(LCQDecaXP+TMstationfromThermoElectron)中根据它们的质量(m)和它们的电荷(z)而分析它们。我们使用SIM(SelectedIonMonitoring)扫描技术，使得可以仅扫描感兴趣的某些离子。这些多电荷离子是重组ProNGF的特征，它们事先用nanoLC-nanoESI/MS确定。用SIM在条件培养基中检测到ProNGF后，分辨相应的多电荷质谱以发现产生这一质谱的蛋白质的质量。2.2.结果使用上皮细胞的检测将50^乳腺上皮细胞的总蛋白提取物上样到凝胶中进行505-PAGE。转移到硝基纤维素膜上之后，用AB9040抗体和A-2066抗体(等上样对照)进行免疫检测。NMEC:正常乳腺上皮细胞，BT-20，MCF-7，MDA-MB-231和T-47D是癌性乳腺上皮细胞系。结果见图l，其代表Westem印迹照片，显示出癌性乳腺上皮细胞(MCF-7,T47-D,BT-20和MDA-MB-231)产生ProNGF，但正常细胞(NMEC细胞)不产生，肌动蛋白被用作阳性对照。用乳腺活检样本经Western印迹进行的检测50pg活检样本的蛋白质提取物上样到凝胶中进行SDS-PAGE。转移到硝基纤维素膜上之后，用AB9040抗体和A-2066抗体(等上样对照)进行免疫检测。SS-x:正常乳腺活检样本编号x，ST-x:肿瘤乳腺活检样本编号x。结果见图2，其代表Westem印迹照片，显示出癌性乳腺活检样本(ST-l至ST-4)中存在ProNGF，但在正常活检样本(SS-l至SS-4)中不存在，肌动蛋白被用作阳性对照。用乳腺活检样本经免疫组织化学进行的检测使用组织阵列玻片筛选大量样品。这些是点样到玻片上的乳腺活检样本。所用组织阵列含有60个活检样本点，相应于l个对照，4个正常供体和25个患有乳腺癌的患者，一式两份。患者的特征和用抗ProNGF抗体进行的免疫标记的强度见表l。在来自正常供体的乳腺活检样本中存在弱标记(在全部4个患者中强度为+)，而在癌性乳腺组织中信号强得多(在20/25个患者中强度为++/+++)。另外，标记谱在两种类型组织中是不同的在癌组织中，标记基本上是上皮的，而在正常活检样本中不是。表1.乳腺癌组织阵列上存在的乳腺活检样本特征以及用抗ProNGF抗体进行的免疫组织化学标记的强度标识符分化标记TNM分类阶段标记强度<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>用肺和甲状腺活检样本经免疫组织化学进行的检测使用其它组织阵列玻片分析ProNGF在乳腺癌之外的癌症类型中的表达。每种癌症我们筛选了9个患者并平行分析了肿瘤组织和取自相同患者的肿瘤附近的正常组织。因此，我们能够证实在肺癌和甲状腺癌中ProNGF的过表达。患者的特征以及用抗PmNGF抗体免疫标记的强度见表2。肺癌和甲状腺癌一样，在9个患者中的7个中肿瘤组织的标记要比正常组织中强得多。对于其它患者(每种癌症的2/9)，信号在肿瘤和正常组织中保持相同强度。应注意的是我们的分析技术仅是半定量的，其不能揭示表达中的小差异。表2.组织阵列上存在的肺和甲状腺活检样本的特征和用抗ProNGF抗体免疫组织化学标记的强度标识符诊断分化水平TNM分类阶段fe^3^贞癌组织正常组织ProNGF的分泌为了确定ProNGF是否分泌，我们浓縮了MCF-7条件培养基。为^:，在电泳和转移后，100^^浓縮224倍的条件培养基被用于进行用80548抗体进行的免疫检测。重组NGF和重组ProNGF被用作对照进行分析。结果见图3A，其是Westem印迹照片，显示了MCF-7癌细胞分泌ProNGF，不分泌NGF(浓縮条件培养基泳道)，右边2条泳道是对照泳道。可以注意的是在此未观察到NGF分泌，因为实验终止得太早未能观察到NGF，原因是ProNGF丰富。当继续实验时，也观察到NGF条带。这证实不仅ProNGF是肿瘤标记，而且也大量分泌。为验证所用的截留阈值为10kDa的浓缩/脱盐装置能够保留NGF(13.6kDa)，我们在相同实验条件下浓縮了重组ProNGF和重组NGF的混合物20ngProNGF和20ngNGF被加入到未条件化的培养基中，然后置于与条件培养基相同的条件下。肺癌T2N0MOIB+++++T2N0M0IB+++++T2N0M0IB+/++++T2N體IIB++++T4N0M0IIIB+++T2N0M0IB+++T2N画IIB++++T3N2M01IIA++++T2N1M0IIB++++甲状腺癌TIT2T3T4T5T6T7T8T9乳头状癌乳头状癌乳头状癌乳头状癌乳头状癌乳头状癌乳头状癌乳头状癌乳头状癌T2N0M0I+++T2N0M0I++++T2N0M0I++++++T2N0M0II++++/++T2NOM0II++/++++T3NlaM0III++++T1N0M0I++++T2N薩0IVA++/++++T3N0M0m++/++++高中中中高中中高癌癌大癌癌癌棒棒棒皮皮皮表表表癌癌样表样样皮皮表表1234567009ppppppppp结果(图3B)证明浓縮X脱盐装置能保留NGF和ProNGF。血清中的检测100jug小鼠血清的蛋白质提取物被上样到凝胶上进行SDS-PAGE。转移到硝基纤维素膜上之后，进行用AB9040抗体的免疫检测。在等上样对照中，在用Ponceau红染色后显示出在膜上可见24kDa的条带。癌来自用MDA-MB-231细胞注射的小鼠的6份血清，正常来自用PBS注射的小鼠的2份血清。结果见图4，其显示出在来自用癌细胞注射的小鼠的6个血清中的5个中ProNGF免疫反应的条带在26kDa(ProNGF的重量)出现；在来自对照动物的血清中未检测到条带。质谱检测我们进行了如上所述的程序。结果见图5，其是质谱检测MCF-7条件培养基中的ProNGF(图5A、5C和5E)或重组ProNGF(图5B和5D)的图，给出了作为质量函数的相对丰度。图5A和B相应于来自nanoLC的蛋白质级分，所述nanoLC相应于ProNGF的3种特征离子中的至少一种的SIM。图5C相应于在A中于29.43分钟洗脱的蛋白质的质谱。图5D相应于重组ProNGF的质谱，其3种特征离子为红色。最后，图5E显示在A中于29.43分钟洗脱的蛋白质的质谱的去巻积。这些结果表明相应于与重组ProNGF(31.17分钟，图5B)在相同时间洗脱的ProNGF(29.43分钟，图5A)的SIM(选择离子监控)的蛋白质在MCF-7条件培养基中出现。这一蛋白质在离子化后产生与重组ProNGF(996.2，1037.5，1082.6，图5.D)相同的多电荷离子(998.2,1039.9，1083.4,图5.C)。另外，该蛋白质的质量的去巻积计算得到值25971Da(图5,E)。因此，这些结果表明首先我们确实鉴别了MCF-7条件培养基中的ProNGF，其次由质谱检测ProNGF是可能的。实施例3:ProNGF治疗靶3.1.方法学ProNGF受体Sortilin的表达蛋白质提取方法与针对ProNGF所述的相同(见上述2.1)。为进行Westem印迹，膜在室温用在TBS(Tris缓冲盐水)0.1°/。Tween20(17.54gNaCl,2.42gTris，2mLtween20，QS2L，pH调整至7.4)溶液中的4%牛血清白蛋白饱和2小时。饱和后，膜在(C与各种一抗保温过夜在饱和溶液中1:2000稀释的抗-Sortilin(BD612101,来自BDBiosciences)，l:5000稀释的抗肌动蛋白(A-2066，来自Sigma)。用TBS0.1%Tween20洗涤后，膜在室温与在饱和溶液中l:20000稀释的偶联有辣根过氧化物酶的抗兔二抗(A-1949，来自Sigma,France)保温l小时。洗涤后，用ECL系统(PierceInterchim,France)根据推荐使用数据显影。干扰RNA(siRNA)的转染干扰RNA(siRNA)转染实验用来自Amaxa的CellLineNucleofector试剂盒和相应的电穿孔装置进行。这一系统使得可以获得高效核基因转移(核染)。MDA-MB-231细胞在转染前传代2天，以在实验时达到80%铺满。待被转染的细胞被胰蛋白酶化，然后计数。细胞沉淀(1百万个细胞)溶于100jilNucleofectorKitV溶液并加入3pgsiRNA。这一细胞悬液被转移进电穿孔小池，置于Amaxa装置中，根据X-13程序进行电穿孔。细胞随后在6孔板的孔中进行培养24-72小时。随时间跟踪细胞增值并定期计数细胞。根据前述段落"Sortilin的表达"中描述的方案在各种时间回收的裂解物上进行抗SortilinWestern印迹。MCF-7在转染前传代3-4天，以在实验时达到50%铺满。2百万个细胞溶于100NucleofectorKitV溶液中并加入3ngsiRNA。用于Nucleofector的转染程序是E-14。根据2.1中描述的方案在24小时或48小时后回收的裂解物上进行抗ProNGFWestern印迹。由印迹检测的ProNGF的相对量用QuantityOne软件(Bio-Rad)相对于等上样(肌动蛋白)评价，并以柱状图形式表示，其中100%是siGFP对照条件。ProNGF生物学活性测量使用"饥饿"培养基，"饥饿"是指无血清并补加2Hg/mL纤连蛋白和30ng/mL转铁蛋白的完全培养基。对于各种生物学活性测量，将各种测试分子(ProNGF，NGFandgalardin)加入到这一饥饿培养基中。在处理中，培养基每24小时更新一次。迁移和侵袭根据先前Brackeetal.(1999，JNatlCancerInst，91:354-359)所述进行迁移和侵袭测试。使用Boyden室和用于胶原凝胶侵袭的方案见下述。含有孔径为12pm的transwdls⑧的12孔板用饥饿培养基平衡并置于37°C、5%C02下2小时。然后吸掉培养基并在下室中用含有各种测试分子的饥饿培养基更换，而在上室内将40000个细胞接种在单独的饥饿培养基中。24小时后，transwells⑧用PBS洗涤，刮擦上表面，然后迸行Hoechst标记(如存活测试所述)，以显现跨过膜的细胞。通过一滴加热到55匸的glycergel将transwells⑧固定在载玻片和盖玻片之间，然后在黑暗中将玻片在4"C保存直至计数。每种条件进行双份；每种条件计数至少40块视野。数据代表这40块视野计数的平均值，用标准差加权。它们以迁移百分比表示，其中100%迁移为50ng/mL的HGF对照。皮獻微虔颜试胶原I型凝胶以如下方式制备2.1mL胶原I型.，0.8mLEMEM(10x),4.6mLPBS，0.8mL的0.25MNaHC03禾口0.15mL1MNaOH。将1.25mL沉积在6孔板的孔中。凝胶固化后，将100000个细胞用饥饿培养基和各种测试分子接种24小时。随后计数细胞并确定侵袭指数(深部细胞数相对于表面细胞数)。每种条件进行三份，每种条件最少计数45块视野。3.2.结果ProNGF受体Sortilin的表达50pg乳腺上皮细胞的总蛋白质提取物被上样至凝胶进行SDS-PAGE。转移到硝基纤维素膜上后，用BD612101抗体和A-2066抗体(等上样对照)进行免疫检测。NMEC:正常乳腺上皮细胞，BT-20，MCF-7,MDA-MB-231和T-47D是癌性乳腺上皮细胞系。结果见图6，其为Westem印迹照片，显示出Sortilin在癌性乳腺上皮细胞(MCF-7,T47-D,BT-20和MDA-MB-231)和对照细胞(NMEC细胞)中的存在，肌动蛋白被用作阳性对照。因此，Sortilin在所有这些细胞中出现。另一方面，这一条带似乎在癌性细胞中比在正常细胞中强度更大，而上样对照肌动蛋白无变化。人们因此可能会认为在正常乳腺上皮细胞中的Sortilin比在癌细胞中少。由干扰RNA导致的Sortilin表达的降低(Sortilin敲低)在EMEM培养基中维持的MDA-MB-231细胞用培养基(模拟)或用针对GFP蛋白的干扰RNA(siGFP)或用针对Sortilin的干扰RNA(siSORT)转染。表7结果显示，在所选的培养条件下，培养的MDA-MB-231细胞数在siSORT存在下不随时间增加。在模拟或siGFP对照组，细胞数在24和48小吋培养物之间加倍。因此，MDA-MB-231癌性乳腺细胞系通过针对Sortilin的干扰RNA的转染而慢下来。我们通过Western印迹验证了siSORT转染确实降低了Sortilin蛋白的表达水平。因此，这一实验使得我们表明可以通过用干扰RNA靶向PrNGF受体Sortilin而控制乳腺癌细胞的异常增殖。迁移ProNGF对乳腺上皮细胞迁移的作用通过在Boyden室(tmnswell⑧)中的测试而了解。每种条件进行一式两份并计数最少40块视野。MCF-7细胞接种在transwel⑧上表面的饥饿培养基中，而下表面浸在仅饥饿培养基或含有如下成分的饥饿培养基中200ng/mLProNGF,或者含有或不含200ng/mLProNGF的20jiMgalardin,或者200ng/mLNGF。然后计数跨过transwdl⑧的细胞。*p<0.05，与饥饿培养基条件相比。结果见图8，其是用浸入各种培养基中的MCF-7细胞获得的细胞迁移百分比的图。这些结果证实用ProNGF处理MCF-7癌细胞使得可以增强它们迁移的能力，在等剂量与NGF类似。向培养基中添加能抑制从ProNGF合成NGF的galardin证实迁移活性的促进是由于ProNGF所致而非其能产生的NGF所致。侵袭ProNGF剌激的MCF-7细胞的侵袭能力在胶原I型凝胶中测试。每种条件进行3份并且每种条件计数最少45块视野。MCF-7细胞在仅饥饿培养基或含有如下成分的饥饿培养基中接种到胶原I型凝胶上，所述成分为200ng/mLProNGF，或者含有或不含200ng/mLProNGF的20pMgalardin，或者200ng/mLNGF。*p<0.05,与饥饿培养基条件相比。结果见图9，其是显示使用浸入各种培养基中的MCF-7细胞获得的侵袭指数的图。这些测试表明ProNGF刺激MCF-7侵袭。干扰RNA降低ProNGF的表达MCF-7细胞用3pg针对GFP(siGFP)或ProNGF(siProNGF)的干扰RNA(siRNA)转染。24-48小时培养后，裂解细胞并进行ProNGFWestern印迹。由印迹检测的ProNGF的相对量用QuantityOne软件(Bio-Rad)相对于肌动蛋白等上样评价，并以柱状图形式表示，其中100%是siGFP对照条件(图10)。在印迹照片上，我们已经能够观察到siProNGF的转染降低了MCF-7细胞中ProNGF蛋白的表达。通过光密度评价在转染24小时后降低59%。这一实验使得我们显示能够用千扰RNA策略降低乳腺癌细胞中ProNGF的表达水平。权利要求1.一种体外诊断癌症的方法，其特征在于其包括确定来自可疑患有癌症的患者的生物学样品中ProNGF的存在。2.权利要求l的体外诊断癌症的方法，其特征在于所述癌症是乳腺癌、甲状腺癌或肺癌。3.权利要求2的体外诊断癌症的方法，其特征在于所述癌症是乳腺癌。4.权利要求2的体外诊断癌症的方法，其特征在于所述癌症是肺癌°5.权利要求2的体外诊断癌症的方法，其特征在于所述癌症是甲状腺癌。6.权利要求l-5任一项的方法，其特征在于通过直接检测所述生物学样品中的ProNGF而证实ProNGF的存在。7.权利要求6的方法，其特征在于ProNGF的检测通过免疫测定或质谱而进4亍。8.权利要求6或7的方法，其特征在于所述生物学样品由生物学液体或源自肿瘤或转移的活检的组织组成。9.权利要求8的方法，其特征在于所述生物学样品由源自患者的肿瘤或转移的活检的组织组成。10.权利要求8的方法，其特征在于所述生物学样品由生物学液体组成，所述生物学液体优选地被预处理以分离所述液体中含有的循环型肿瘤细胞。11.权利要求10的方法，其特征在于所述循环型肿瘤细胞随后在使它们分泌ProNGF的条件下培养。12.权利要求10或11的方法，其特征在于所述循环型肿瘤细胞还在使得能阻断所述细胞内的ProNGF的条件下培养。13.权利要求l-5任一项的方法，其特征在于ProNGF的检测通过在所述生物学样品存在下培养ProNGF敏感性细胞而进行。14.权利要求13的方法，其特征在于所述生物学样品由生物学液体样品组成，所述生物学液体样品优选地被预处理以分离所述液体中含有的循环型肿瘤细胞。15.权利要求14的方法，其特征在于所述循环型肿瘤细胞随后在使它们分泌PmNGF的条件下培养。16.权利要求1-15任一项的方法在癌症的早期诊断、筛查、治疗随诊、预后和复发诊断中的用途，所述癌症优选地是乳腺癌、甲状腺癌或肺癌。17.ProNGF抑制剂在制备用于治疗癌症、更具体地乳腺癌、甲状腺癌或肺癌的药物中的用途。18.权利要求17的用途，其特征在于所述药物是用于阻断患有癌症、更具体地乳腺癌、甲状腺癌或肺癌的患者中的细胞迁移或侵袭。19.权利要求17或18的用途，其特征在于所述ProNGF抑制剂是抗ProNGF抗体或可溶形式的ProNGF受体类似物。20.权利要求17-19任一项的用途，其特征在于所述ProNGF抑制剂已被置于使其可特异性穿透进入感兴趣的细胞的条件下。21.权利要求17或18的用途，其特征在于所述ProNGF抑制剂是ProNGF受体的siRNA。.22.—种药物组合物，其特征在于其包含至少一种ProNGF抑制剂作为活性成分。全文摘要本发明涉及一种体外诊断癌症、特别是乳腺癌、甲状腺癌或肺癌的方法，其包括确定来自可疑患有癌症特别是乳腺癌、甲状腺癌或肺癌的患者的生物学样品中ProNGF的存在。所述方法可用于癌症特别是乳腺癌、甲状腺癌或肺癌的早期诊断、筛查、治疗随诊、预后和复发诊断。本发明还涉及ProNGF抑制剂的制药用途，所述药物特别用于阻断患有癌症、特别是乳腺癌、甲状腺癌或肺癌的患者中的远处播散和细胞侵袭。本发明可用于诊断和治疗领域。文档编号G01N33/574GK101395478SQ200780004023公开日2009年3月25日申请日期2007年1月30日优先权日2006年1月31日发明者G·肖凯-凯斯狄拉维斯基,H·亨德尔马克,Y·德蒙申请人:生物梅里埃公司;里尔科技大学