对存在发生心力衰竭风险的受试对象进行诊断和/或治疗的装置和方法

专利名称：：对存在发生心力衰竭风险的受试对象进行诊断和/或治疗的装置和方法
技术领域：
：本发明总体上涉及医学领域，更具体地讲，本发明涉及心脏病学领域。本发明具体涉及对存在发生心力衰竭风险的受试对象进行诊断和/或治疗的装置和方法。
背景技术：
：众所周知，在长期高血压、心瓣膜病或者比如糖尿病的其它慢性疾病的过程中发生的慢性心脏负荷导致心脏肥大，而心脏肥大是心力衰竭的最重要的危险因素之一。充血性心力衰竭(HF)是一种常见的并且严重而复杂的临床综合症，在老年人中尤为常见，充血性心力衰竭的特点在于心脏收缩功能减退和运动耐力下降。心力衰竭的症状还包括肺及外周性水肺、疲劳和/或呼吸困难。因为其它器官接收不到足够的血液，所以严重的心力衰竭还会导致其它器官的功能下降。然而，并不是所有肥大的心脏最终都会衰竭。因此，尽管相当多的病人发生有威胁生命的并发症，但是其他病人可以长时间地保持稳定。到目前为止，还没有完全了解在这种从肥大向心力衰竭转变之前并且预示这种转变的分子变化。因为早期鉴别存在发生高血压终末器官损害(例如，心力衰竭)的风险的病人可以防止病情的快速发展，所以优选的是能够在实际发生心力衰竭之前鉴别(诊断)可能出现心力衰竭的那些病人。因此可以对早期诊断的病人进行治疗，从而防止心力衰竭发作。另外，优选的是能够鉴别那些经历心力衰竭痛苦的病人，这些病人处于发生严重并发症的风险中。目前的方法能够可靠地排除实际出现心力衰竭，但是不能可靠地证明存在心力衰竭，这些方法也不能预测已确诊的心力衰竭的结果，或者预测心力衰竭的发生。因此，需要有一种筒单且可靠的方法来预测心力衰竭发作的可能性和/或预测已确诊的心力衰竭的结果。另外，开发在心力衰竭和/或其并发症出现之前对存在发生心力衰竭风险的病人进行治疗的装置和方法在临床上是非常重要的。
发明内容本发明的目的在于提供可以鉴别具体存在发生心力衰竭风险的病人和/或具体存在发生心力衰竭并发症的风险的病人的"^断方法。本发明的又一个目的是提供对存在发生心力衰竭风险和/或存在发生心力衰竭并发症的风险的病人进4于治疗的装置和方法。通过提供对存在发生心力衰竭风险的受试对象进行诊断的方法来实现本发明的目的，该方法包括以下步骤(a)确定一个或多个生物标记在所述受试对象的生物样品中的水平；(b)将所述生物标记的水平与同一生物标记的标准水平进行比较；(c)确定生物标记的水平是否表示存在发生心力衰竭的风险，其中，所述生物标记是溶酶体整合膜蛋白-2(LIMP-2)和/或Kriippel样因子15(KLF-15)。在为获得本发明而进行的研究中，许多基因被鉴别为与发生心力衰竭的过程相关。被鉴别的基因已经列在了表2中。另外，已经表明用所述基因编码的特定多肽确实在机制上联系到心力衰竭。已经具体地表明通过表2的基因编码的特定蛋白与造成从心脏肥大向心力衰竭转变的分子机制相关，从而这些特定蛋白可以用作鉴别存在发生心力衰竭风险的病人的生物标记。另外，这些蛋白、和/或对所述蛋白编码的基因、和/或所述蛋白和/或基因的多肽和/或多核苷酸片段或变异体可以用作治疗那些存在风险的病人的目标。根据本发明，已经具体示出了特定的闰盘组分(具体地为溶酶体整合膜蛋白-2(LIMP-2)和Kriippel样转录因子15(KLF-15))与预测从心脏肥大向心力衰竭转变的分子机制相关，并且可以被合适地用作鉴别存在发生心力衰竭风险的个体的生物学标记(生物标记)。根据本发明，由此发现可以通过确定所述受试对象的生物样品中的一个或多个被鉴别的生物标记的水平并且将所述标记的水平与标准水平进行比较来鉴别存在发生心力衰竭风险的受试对象。所述标准水平来自于健康的受试对象，即，标准水平是健康人(即，没有心脏疾病的人)的所述生物样品中的所述生物标记的水平。如果与所述标准水平相比，才企测的生物标记的水平发生改变，例如，被提高或被降低(取决于有关的特异性生物标记)，则受试对象存在发生HF的风险和/或发生严重心力衰竭并发症的风险。例如对于成功地寻找潜在的疾病和/或通过例如对确诊病人进行治疗来防止进一步的心肌功能障碍和临床恶化来说，早期诊断心力衰竭，优选地在出现临床症状之前诊断心力衰竭是必要的。在为获得本发明而进行的研究中，调查了来自由于高血压而肥大但是通过传统技术(超声波心动描记术)呈现良好功能并且代偿的、然而随后被证明发生心力衰竭的心脏的大量基因的基因表达谱。将上述表达谱与从也是由于高血压而肥大、通过传统技术(超声波心动描记术)呈现相同的良好功能并且代偿的、但是随后证明没有发生心力衰竭而是保持稳定的心脏获得的基因表达语进行比较。可见，根据本发明，被鉴别的预测随后发生心力衰竭的基因已经被证明成为肥大和向心力衰竭转变的新颖的且关键的调节剂。这些基因已经在表2中列出。接着，鉴别特定的优选生物标记，具体地为，与特定闰盘有关的生物标记。闰盘(1D)形成构成心脏中的心脏纤维的心脏肌细胞之间的连接。由此闰盘是提供细胞之间的机械结合和电结合并且支持心脏组织的同步收缩的专门的细胞-细胞结合。根据本发明，由此已经证明与表达的标准水平相比，心脏中的LIMP-2的表达增加鉴别出那些有倾向发生明显心力衰竭倾向的肥大心脏。因此，尽管在LIMP-2缺失小鼠中心脏发育是正常的(Gamp等，2003),但是在这些小鼠中，高血压导致扩张性心肌病。已经证明了LIMP-2结合到重要的心脏粘着连接蛋白N4丐粘蛋白，并且对于确保N-钙粘蛋白和(3-连环蛋白之间的合适的相互作用是必需的。还发现LIMP-2的表达在处于发生心力衰竭边缘的肥大的大鼠心脏中增加，从而表明心脏肌细胞的LIMP-2表达增加预示心脏肌细胞不能正常响应机械力。这样，增加的LIMP-2表达可以被视为肌细胞竭力响应变差的负荷，并且指示即将到来的衰竭。此外，证明了在临床上具有严重压力负荷的病人中，LIMP-2表达明显增力口。通过确定高血压的受试对象中的LIMP-2蛋白水平和/或编码LIMP-2的基因表达水平，并且将上述水平与标准水平进行比较，随后确定该水平是否表示存在发生心力衰竭的风险，从而可以在非常早的阶段鉴别可能屈服于压力的心肌。具体地讲，与标准水平相比，LIMP-2蛋白的水平增加和/或LIMP-2基因表达的水平增加表示存在发生心力衰竭和/或与心力衰竭有关的并发症的风险。在为获得本发明而进行的研究中，还示出了编码Kriippel样因子15(KLF-15)的基因表征了快速发展为心力衰竭的肥大心脏。通过实时PCR证实了以上发现，实时PCR证明了在代偿的LVH中，KLF-15被下调；而在快速发展为衰竭的肥大心脏中，KLF-15被进一步明显地抑制。还证明了KLF-15在心脏肌细胞中起到心脏肥大的抑制剂的作用。因此，确定高血压的受试对象中KLF-15蛋白水平和/或编码KLF-15的基因表达水平，并且将上述水平与标准水平进行比较，对于在非常早的阶段鉴别可能发生心力衰竭的那些病人也是有用的。在KLF-15的情况下，与标准水平相比，生物样品中KLF-15蛋白的水平下降和/或KLF-15基因表达下降表示发生心力衰竭。本发明涉及体内方法和体外方法，体内方法为在体内确定生物样品中的生物标记的水平的方法。在本发明的优选实施例中，对从个体获得的生物样品中，在体外确定生物标记的水平。为了在体外确定本发明的生物标记的水平，可以使用任何体液的任何适合的生物样品，所述生物样品可以包括通过该研究确定的生物标记。优选地，从由血液、血浆、血清、心脏组织组成的组中选择生物样品。更优选地，生物样品是外周血样品、或者从外周血得到的血浆或血清样品。例如，可以容易地从病人取得外周血样品，而不需要复杂的侵入过程，例如，不需要导管插入术。可以根据公知技术来处理生物样品，从而制备待测的样口口C0为了测量本发明的生物标记的水平，可以采用本领域y^知的传统方法。当生物标记是蛋白和z或蛋白的片段和/或变异体时，可以采用几种传统方法来确定特定蛋白、和/或该蛋白的片段和/或变异体的水平，这些传统方法是本领域技术人员所公知的。例如，可以通过利用免疫检测方法(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA))来测量标记的水平，从而提供简单的、能够重现的并且可靠的方法。在这样的检测中使用的抗体是可以获得的，并且可以利用开发抗体的公知的标准技术来开发另外的(多克隆和单克隆)抗体。此外，用于测量生物蛋白标记的水平的其它方法可以包括(免疫)组织化学、免疫蛋白印迹、流式细胞计量术、RIA、竟争检测等以及它们的任意组合。在体内，可以通过标记并跟踪针对感兴趣的蛋白之一的特异性抗体来确定例如非分泌蛋白的水平。通过所谓的"分子成像"技术呈现心脏中的蛋白量。当生物标记是基因、和/或基因的多核香酸片段和/或变异体例如DNA、cDNA、RNA、mRNA等(例如，编码特定蛋白的基因或转录后的mRNA))时，可以通过例如公知的分子生物检测(例如，利用指向特定多核苦酸的探针的原位杂交技术)来测量例如心脏活检物中的生物标记。根据本发明可以使用的其它核酸类检测包括RT-PCR、核酸类ELISA、Northern印迹等以及它们的任意组合。为了提高诊断方法的特异性和/或灵敏性，本发明的方法可以包括检测一个或多个其它(生物)标记的水平，即，本发明的生物标记的检测可以适当地与指示发生心力衰竭的其它标记的检测相结合。本发明还涉及用于执行如上所述的诊断方法的试剂盒。本发明具体涉及用于鉴别存在发生心力衰竭风险的受试对象的这样的诊断试剂盒，所述试剂盒包括用于容纳所述受试对象的一个或多个生物样品的装置和用于确定所述受试对象的所述生物样品中的生物标记的水平的装置。因此，提供了一种试剂盒，该试剂盒可以用作可靠并且简易的诊断工具。用于容納生物样品的装置例如可以包括标准微量滴定板的孔。用于确定所述受试对象的所述生物样品中的与闰盘相关的生物标记的水平的装置例如可以包括适于检测根据本发明鉴别的生物标记的一个或多个特异性抗体、多核苦酸探针、引物等。所述试剂盒还可以包括校准装置和使用说明书。本发明也涉及本发明的生物标记和/或它们的片段和/或功能性变异体在用于鉴别预防和Z或治疗心力衰竭的化合物的筛选方法中的用途。在具体实施例中，用于鉴别预防和/或治疗心力衰竭的化合物的方法包括以下步骤(a)用在表2中列出的多核苷酸编码的多肽与一种或多种化合物接触，优选地，表2中列出的多核苦酸为KLF-15和/或LIMP-2、和/或它们的片段和/或变异体；(b)确定所述化合物与所述多肽的结合亲和力；(c)用表现出至少IO微摩尔的结合亲和力的化合物接触哺乳动物细胞群；(d)鉴别能够预防和/或治疗心力衰竭的化合物。在本发明的筛选方法中，待测的多肽可以在体外进行检测，例如，在溶液中游离、附于固体载体、负载在细胞表面上、或者位于细胞内，或者可以在体内进行检测。为了执行所述方法，可行的是将本发明的多肽或者化合物固定从而便于将多肽的复合体与非复合体分离，以及提供自动的检测。本发明的多肽与化合物的相互作用(例如，结合)可以在适于容纳反应物的任何容器中完成。这种容器的示例包括微量滴定板、试管和微型离心管。化合物与多肽的结合亲和力可以通过例如本领域已知的方法来测量，例如，利用表面等离子体共振生物传感器(Biacore)、通过利用标记化合物的饱和结合分析(例如，Scatchard和Lindmo分析)、经过置换反应、通过差示UV分光光度计、荧光偏振检测、荧光成像板阅读仪(FLIPR)系统、突光共振能量转移和生物发光共振能量转移。化合物的结合亲和力也可以用解离常数(Kd)或者IC50或EC50来表示。IC50表示将另一配体与多肽的结合抑制50。/。所需要的化合物的浓度。EC50表示获得体外的最大效果的50%所需要的浓度。解离常数Kd是配体与多肽的结合程度的尺度，它相当于使多肽上的结合位刚好饱和一半所需要的配体浓度。具有高亲和力结合的化合物具有低的Kd、IC50和EC50值，即，在100nM到lpM的范围内；中等到低的亲和力结合涉及高的Kd、IC50和EC50值，即在孩i摩尔范围内。本发明还涉及表2中列出的基因和/或蛋白(优选地为KLF-15和/或LIMP-2基因和/或蛋白)在制备药物中的用途，所述药物是预防和/或治疗心力衰竭的预防性和/或治疗性的药物。优选地，本发明涉及表2中列出的基因和/或蛋白(优选地为KLF-15和/或LIMP-2基因和/或蛋白)的调节剂在制备预防和/或治疗心力衰竭的预防性和/或治疗性的药物中的用途。在本申请中，调节剂可以为刺激根据本发明被发现为降低的一种或多种生物标记的表达和/或增加所述一种或多种生物标记的水平的任何化合物(例如，激动剂)，或者可以是抑制根据本发明被发现为增加的一种或多种生物标记的表达和/或降低所述一种或多种生物标记的水平的任何化合物(例如，拮抗剂)。所述药物可以为蛋白类分子，例如，针对蛋白标记的抗体、和/或它们的片段和Z或变异体。本发明还包括嵌合的单链和人化抗体，以及Fab片段和Fab表达库的产物与Fv片段和Fv表达库的产物。可选地，所述药物可以为核酸类分子。基因下调可以利用例如反义核酸在翻译或转录水平上实现。反义核酸是能够与编码蛋白和/或对应的mRNA的核酸中的全部或者一部分进行特异性杂交的核酸。反义核酸、编码反义RNA的DNA的制备在本领域是已知的。所述药物还可以包含小干扰(发夹)RNA(siRNA)。siRNA通过在序列上与沉默RNA同源的双链DNA(dsDNA)来调节基因沉默的翻"i,后加工。siRNA的制备在本领域是已知的。类似地，基因上调(或过表达)可以通过本领域已知的几种方法来实现。在本发明的优选实施例中，调节剂是TGFfi的抑制剂。根据本发明，示出了KLF-15的抑制是发生衰竭倾向形式的肥大的关^t步骤，并且TGFfi强烈抑制了KLF-15。现在在不同领域正在开发TGFJ3的抑制剂，从而可以适当地用于开发预防和/或治疗心力衰竭的预防性和/或治疗性的药物。根据本发明可以使用的合适的TGFfi抑制剂的示例是美国洛杉矶的Scios有限公司制造的TGFJ3受体抑制剂，该公司在他们的网站(http:〃www.sciosinc.com/scios/tgf)上指出"ScioshasdevelopednovelandpotentsmallmoleculeinhibitorsdesignedtoinhibittheactionofTGF-betaatitsreceptor.Thesesmallmoleculeshavebeenshowntobeeffectiveinreducingscarformation(fibrosis)whengivenorallytoanimals.Sciosexpectstoadvancetwoleadmolecules,representingdifferentchemicalclasses,intopreclinicaldevelopmentthatcouldpotentiallybeusedtotreatdiseaseconditionsinpatientswithsignificantunmetmedicalneeds(Scios已经开发出新颖的并且有效的小分子抑制剂，用来通过抑制TGFJ3的受体来抑制TGFJ3的行为。这些小分子已经示出当对动物进行口服时在減少瘢痕形成(纤维化)方面是有效的。Scios希望使代表不同化学类的两种主导分子进入临床前开发，这种开发可以潜在地用于应对医学需要严重未满足的病人的病情)，,。本发明还涉及根据本发明鉴别的蛋白在提供诊断装置方面的用途，所述诊断装置用于对鉴别的蛋白中的一种或多种进行(分子)成像，从而评价蛋白的水平，并因此鉴别存在发生心力衰竭风险的受试对象。所述诊断装置例如可以包括针对生物蛋白标记的标记抗体。通过下面的附图和示例进一步示出本发明。附图图1:LIMP-2在Ren-2大鼠中的表达增加。图1A:在IO周周龄获取左心室心脏活检物，Ren-2大鼠显示出相当的心脏肥大，縮短率不能将即将发生心力衰竭的大鼠或保持代偿的大鼠区别开。在15周和18周周龄之间，一部分Ren-2大鼠发生心力衰竭，剩余的大鼠保持代偿直到在21周周龄被处死。*,尸〈5e—6。图1B:通过对10周周龄的肥大的Ren-2大鼠进行微阵列分析，与保持代偿的肥大LV(compLVH，n=6)和对照大鼠(n=4)相比，发现在有衰竭倾向的大鼠(有HF倾向的LVH,n=4)中LIMP-2mRNA明显过表达。图1C:与代偿的Ren-2大鼠(comp,n=6)相比，在晚期衰竭的Ren-2大鼠(HF，n=9)中LJMP-2蛋白被上调。与对照大鼠(n=6)相比，衰竭和代偿的Ren-2大鼠均显著增加了LIMP-2蛋白的水平。*,与对照大鼠相比尸<0.05;**,与对照大鼠相比尸<0.01;$,与comp相比尸0.05;Mwm,分子量标记；au,任意单位。图2:AngII处理的LIMP-2KO(KOAng)小鼠具有扩张性心肌病。图2A:WTAng小鼠(n=4)明显增加了它们的LV重量，而KOAng(n=14)小鼠没有明显增加LV重量(*,与WT(n=8)和KOAng相比)。在KOAng小鼠中，单个M^细胞没有增加它们的体积(WT和KO,n=4;WTAng和KOAng，n=5;肌细胞面积(au):264±42对WTAng中的308士14;*，尸O.Ol)。条状物表示50pm。图2B:LIMP-2KO(n=3)和WT(n=4)小鼠响应AngII示出了相当的血压。图2C:AngII处理的WT(n=8)和KO(n=8)在BNP和ANFmRNA表达方面示出了相当的增加(*,与基础状态相比(n=4)P<0.05)，同时使得askamRNA表达在KOAng小鼠中明显较小的增加，这与它们减小了的肌细月包体积一致(*，与KO(n=4)相比);$，与WTAng相比Z3〈0.05。图2D:WT(n=10)和KO(n=ll)小鼠(0天)的基础状态的超声波心动描记术参数类似。AngII注射14天和28天之后，野生型小鼠的LV壁明显变得肥大，而剔除小鼠没有显示出肥大而是扩张(*，与基础状态和KOAng相比PO.005;$，与基础状态和WTAng相比PO.005)。图2E:在KOAng小鼠中，p-肾上腺素响应多巴酚丁胺而下降(WT和KO，n=14;WTAng，n=4;KOAng，n=9;*，尸<0.005)。LVW/BW,相对于体重而才交正的LV重量。图3:AngII处理的LIMP-2KO小鼠具有大块间质纤维化。AngII处理的LIMP-2剔除(n=4)和野生型(n=5)小鼠的LV的天狼猩红染色显示在剔除小鼠中存在明显的间质纤维化(*，与WTAng和KO基础状态相比/30.02),而用AngII处理的野生型和剔除的小鼠均显示出类似程度的血管周纤维化。条状物表示250(im。图4:AngII处理的LIMP-2KO小鼠显示出肌细胞混乱。结蛋白染色的AngII处理的LIMP-2KO小鼠的心脏月几细胞显示出混乱，并且具有混乱的内部结构，如这些小鼠的更高的和更多的反复无常的结蛋白表达所示。条状物表示250拜。图5:在其它形式的心脏压力下，LIMP-2表达被上调。图5A:在新生大鼠心脏肌细胞中，6小时拉伸增加了LIMP-2mRNA表达(每组n=4)。图5B:将经过10周训练的大鼠(每周5天，11=6)与没有肥大的对照大鼠(11=7)进行比较，在经过10周运动训练的大鼠的肥大心肌中，LIMP-2mRNA也被上调。图5C:将经受主动脉狭窄的病人(LVH,n=20)与没有肥大的对照病人(n=7)进行比较，在主动脉狭窄的病人的心肌中LIMP-2mRNA也被上调。*，与对照物相比尸O.05;**,与对照物相比PO.01;LVH,左心室肥大。图6:LIMP-2存在于心脏肌细胞的质膜中，并且对于闰盘功能是重要的。图6A:用抗LIMP-2免疫染色的压力超负荷小鼠LV的埋在石蜡中的组织切片显示阳性染色不仅存在于室间隔中(*)，而且也存在于心脏肌细胞的质膜中()。刻度条表示250|im。图6B:压力超负荷大鼠的LV组织切片的采用抗LIMP-2的免疫电子显微技术也示出了LIMP-2存在于质膜中()。刻度条表示lpm。图6C:电子显微技术示出了AngII处理的野生型小鼠的正常的闰盘，而在AngII处理的LIMP-2KO小鼠中，闰盘具有更高程度的巻曲和更高浓度的粘着连接(右图的黑色斑点增加)，这与这些小鼠中的扩张性心肌病并发。条状物表示2pm。M,线粒体；ID,闰盘；a,粘着连接；d,桥粒。图7:LIMP-2调节钙粘蛋白分布。图7A:在新生大鼠心室肌细胞中，LIMP-2结合到钙粘蛋白。LIMP-2被免疫沉淀(IP),在全细胞裂解液(输入)、上清液(sup)和沉淀的蛋白裂解液(IP)中，钙粘蛋白被免疫印迹(IB)。心脏肌细胞的钙粘蛋白含量的一部分被LIMP-2结合。图7B:利用抗全鈣粘蛋白(红色)和抗LIMP-2(绿色)将对照受试对象和2位心力衰竭病人的组织切片免疫荧光染色。箭头()示出了LIMP-2和4丐粘蛋白在心脏肌细胞的ID中共位。条状物表示50|im。图7C:利用抗全4丐粘蛋白将AngII处理的LIMP-2剔除和野生型LV的组织切片染色。在野生型小鼠中，钩粘蛋白分布被限制于闰盘，引起钙粘蛋白规则地出现，而在LIMP-2K0小鼠中，定位后的钙粘蛋白已经丟失了处于闰盘的严格位置而产生的典型图案。条状物表示250,图8:LIMP-2通过调节磷酸化的(3-连环蛋白与钙粘蛋白的结合来调节闰盘完整性。图8A:用针对LIMP-2的shRNA(shLIMP-2)或对照shRNA处理过的新生大鼠心脏肌细胞的裂解液的免疫印迹(IB)。培养10天之后，心脏肌细胞显示抑制了92%的LIMP-2蛋白。通过GAPDH确认了相等的蛋白负荷。图8B:与对照裂解液相比，在shLIMP-2裂解液中用抗全4丐粘蛋白进行免疫沉淀反应(IP)之后，免疫印迹(IB)显示了P-f3-连环蛋白的水平下降。在对照的和shLIMP-2的IP裂解液中，4丐粘蛋白负荷相当。在总shLIMP-2和对照蛋白裂解液中的(3-连环蛋白的磷酸化是相当的。*，ZM)細6。图8C:免疫印迹示出了用抗全钙粘蛋白进行免疫沉淀反应的特异性。当向蛋白裂解液中添加IgG来代替全钙粘蛋白抗体时，没有P-p-连环蛋白结合。图9:图9A:通过对来自10周周龄的Ren-2大鼠的左心室活检物进行实时PCR来评价KLF-15表达。活检之后，使大鼠恢复并且接着确定它们是否将发生衰竭或者保持代偿。在保持代偿的肥大心脏中，KLF-15的表达明显被下调，而在快速发展为明显衰竭的肥大心脏中，KLF-15的表达明显地被进一步抑制，这表明KLF-15抑制的水平鉴别了衰竭倾向形式的心脏肥大。图9B:与肥大的心肌相比，正常血压的对照心脏中KLF-15的原位杂交。在大量的肌细胞中，缺失了正常心脏中广泛分布的核染色，而在非肌细胞核中存在剩余的染色，这表明KLF-15表达特异性地出现在心脏肌细胞中。图9C:通过短发夹RNA的慢病毒引入来稳定地抑制KLF-15,诱导BNP在培养的NRVM中的表达。图10:图10A:向培养的心脏肌细胞中添加TGF(3(10ng/ml)几乎完全抑制KLF-15mRNA表达。短发夹RNA的慢病毒引入稳定地抑制TGF(3I型受体，从而消除了这种效果，这表明TGF卩经过它的TGF卩I型受体能够抑制KLF-15表达。图10B:针对TGF(3I型受体而被免疫印迹的全心脏匀浆示出了TGF(3I型受体的表达的本质上的并且显著的下降，但是没有完全缺失受体。图10C:免疫组织化学法表明，当将WT心脏与MerCreMer-TGF卩I型小鼠心脏进行比较时，肌细胞的cre特异性激活导致从心脏肌细胞中明显的并且强烈的缺失TGF(3I型受体。图10D:血管紧张素II注射导致在WT小鼠中的明显的肥大响应，这种现象在MerCreMer-TGF(3I型小鼠中被消弱。图10E:血管紧张素II注射导致作为心脏功能缺失的指示标的缩短率明显降低，这种现象在MerCreMer-TGF卩受体小鼠中被消弱。图10F:血管紧张素II注射和后续的肥大导致KLF-15被下调，这种现象在MerCreMer-TGF(3受体小鼠被消弱。图11:上图示出了与绿色荧光蛋白(AAV9-GFP)注射相比，AAV9-KLF-15注射后，在小鼠心脏中KLF-15mRNA明显上调。**:与GFP组相比尸<0.05。*:与GFP组相比尸<0.05。#:与GFP+AngII组相比尸<0.05。下图示出了与具有AngII的AAV9-GFP组相比AngII刺激后在AAV9-KLF-15组中明显减少的肥大。用学生t-检验来进行统计学分析，11=3-5只动物/组。具体实施例方式示例示例1溶酶体整合膜蛋白-2是闰盘的新组分并且预防心肌病才才泮牛和方法Ren-2大鼠、微阵列分析和免疫印迹如早先所述(VanHaaften等，2006),从十周大的Ren-2、Sprague-Dawley(SD)大鼠(M。llegard，LilleSkensveld,Denmark)中取出LV的活检物。在10周、12周、15周、16周、18周、19周和21周周龄，对大鼠进行连续的超声波心动描记术，当大鼠出现心力衰竭的临床体征(心力衰竭倾向/HF倾向的大鼠)时，大鼠在15周至18周被处死；或者当没有出现衰竭的临床体征(代偿的/comp大鼠)时，大鼠在21周被处死。如早先所述(Schroen等，2004;Heymans等，2005),从LV活检物分离总RNA并且使总RNA扩增，并且总RNA^皮杂交到Affymetrix大鼠2302.0基因芯片，用MicroarrayAnalysisSuiteSoftware5.0进行分析。用多克隆兔抗LIMP-2(NovusBiologicals,Littleton,CO,1:500)和多克隆兔抗GAPDH(Abcam，Leusden，Netherlands;1:10,000)对LV蛋白提取物(50吗)进行免疫印迹。剔除了LIMP-2的小鼠，RNA分离和定量PCR分析采用十周至十二周大的雄性LIMP-2KO、重量为20克至25克的WTC57/B16小鼠。为了研究AngII的血压效应，在每分钟以0.5ng、1.5ng、5ng、15ng和50ng的剂量进行静脉注射期间监测动脉压。为了研究LV肥大的发展，通过渗透性孩i泵2004(Alzetosmoticpumps，Cupertino,CA)皮下注射AngII(1,5吗/g/天),持续28天。在0天、14天和28天进行超声波心动描记术。去除LV之后，在基础的和多巴酚丁胺(dobutamin)刺激的条件下，利用Millar⑧对28天的小鼠进行血液动力学监测(dP/dt)。利用RNeasy小型试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)分离RNA,并且在BioRadiCycler上进行SYBRGreen定量PCR分析，从而确定BNP、ANF和a-骨骼肌肌动蛋白(aska)的表达(表1)。如早先所述(J皿queira等，1979)，用苏木素伊红(HE)和苦味酸天狼猩红(SR)给LV切片染色，或者用单克隆小鼠抗全钙粘蛋白(anti陽pan-cadhenn)(Sigma,SaintLouis,美国；1:500)和单克隆小鼠抗人结蛋白(anti-hum肌desmin)(DakoCytomation，丹麦，1:50)对LV片^殳进行免疫组织化学染色。如早先所述(Schroen等，2004),通过透射电子显微镜进行超微结构分析。主动脉狭窄和心力衰竭病人中的LIMP-2如早先所述(Heymans等，2005),将RNA与从20位主动脉狭窄病人和7位非肥大的对照病人得到的透壁活检物分离，并且执行SYBRGreen定量PCR分析，从而确定LIMP-2的表达(表1)。对1位对照对象和2位死于明显心力衰竭的病人(定义为射血分数小于35%)的切片进行用兔抗LIMP-2(1:250,Cy2)和小鼠抗全钙粘蛋白(1:500，Cy3)的双免疫萸光染色。用Topro-3(Invitrogen,Breda,荷兰)对核配对物(nuclearcounterpart)进4亍染色。采用激光扫描共聚焦系统(Leica,Rijswijk,荷兰)对切片照相，按照126倍的最终放大倍率进行数字化，并且用LeicaConfocalSoftware进行分析。马斯特里赫特学术医院的4仑理委员会和卢维思大学医院的伦理委员会批准了该项研究，并且所有的病人知情同意。细胞培养和慢病毒载体通过将互补的shLIMP-2寡核苷酸(表1)退火，并且通过Hpal、Xhol内切连入到pLL3.7嘌呤霉素载体DNA(从美国剑桥的麻省理工学院的LukvanParijs友情提供的改良得到)，产生表达慢病毒载体rat-LIMP-2shRNA。利用Lipofectamine2000(Invitrogen),通过将3pgshLIMP-2/pLL3.7。票呤霉素和包装载体或者将3)ig空的pLL3.7。票呤霉素和包装载体共转染到293FT细胞，从而获得了慢病毒产物，48小时后收集包含病毒的上清液。如早先所述(DeWindt等，1997),通过对一天到两天大的幼鼠进行酶分裂，大鼠心室心肌细胞(RCM)被分离。为了慢病毒侵染，以每孔5xl()S个细胞，将RCM放置到6孔胶质板上，并在加有10%的马血清、5%的新生牛血清、葡萄糖、庆大霉素和AraC的DMEM/M199(4:1)培养基中过夜培养，第二天通过聚凝胺(Sigma)促进shLIMP-2或空的慢病毒侵染RCM。经过噤呤霉素(3吗Zml)筛选后，侵染率在80%以上。培养10天后，细胞蛋白通过抗LIMP-2(1:100)、单克隆小鼠抗全钙粘蛋白(Sigma,1:100)或IgG的免疫沉淀(IP)来分离。利用单克隆抗全钙粘蛋白(1:5000)、多克隆抗磷p-连环蛋白(Ser33/37/Thr41;CellSignalingTechnology,Danvers,MA,美国，1:1000)和单克隆抗卩-连环蛋白(BDTransductionLaboratories,FranklinLakes,美国，1:1000)对IP裂解液进4亍免疫印迹。对于拉伸试验，将RCM在包覆有I型胶原的硅橡胶膜(SpecialtyManufacturing,Inc,美国)上培养，并且经历4争止，等双轴4立伸(equibiaxialstretch)6小时。为了进行LIMP-2SYBRGreen定量RT-PCR(表1)，利用RNeasy小型试剂盒(Qiagen)分离RNA。涉及到动物试验的所有研究方案都经过马斯特里赫特大学动物关爱和使用委员会批准，并且根据基于对试验动物的关爱和使用在荷兰法律中制定的官方规则(与NIH的规则非常类似)进行。统计分析数据以平均士SEM呈现。每个研究组的数据都利用MannWhitney或者学生t-检验比较，均为合理的。PO.05被认为是在统计学上具有显著性。结果在表2中，呈现了与代偿的Ren-2大鼠相比有衰竭倾向的大鼠中表达有差异的基因的列表。因为这些基因来自于当所有的大鼠仍然存在代偿性肥大时在IO周周龄提取的心脏活检物，所以这些基因的差异表达发生在Ren-2大鼠心力衰竭之前。在表3中，呈现了在基础状态和AngII处理14天和28天后LIMP-2WT、KO小鼠的详细的超声波心动描记术的数据。有衰竭倾向的LV肥大的基因表达谱在代偿的LV肥大阶段中在10周周龄获得10只纯合Ren-2大鼠中的心脏活检物。在取出活^企物之后五周内，四只大鼠快速发展为心力衰竭，而剩余的六只大鼠在活检之后的11周保持代偿(图1A)。在对这些活检物(GEO号GSE4286)进行线性的基于T7的扩增和后续的Affymetrix2302.0基因表达分析之后，仅在发展为心力衰竭的肥大心脏中检测到上调或下调的143个有差异的表达基因(表2)。LIMP-2，即溶酶体整合膜蛋白是有心力衰竭倾向的大鼠中的上调的mRNA之一(图1B),并且特别有趣的是，LIMP-2是能够与血小板反应素(TSP)1(Crombie等，1998)和2(未示出数据)相互作用的mRNA之一，早先已经示出了血小板反应素2是从肥大向心力衰竭转变的关键。图1C示出了LIMP-2蛋白在Ren-2大鼠的晚期心力衰竭中也起作用。血管紧张素II导致剔除了UMP-2的小鼠的扩张性心肌病由于溶酶体蛋白中的功能缺失突变导致了心力衰竭(Eskelmen等，2003;Nishmo等，2000;Stypmann等，2002)，所以进一步研究了LIMP-2在血管紧张素II(AngII)导致的高血压的小鼠模型中的作用。对LIMP-2剔除的小鼠和对照小鼠进行4周的AngII皮下注射。AngII处理结果为在野生型小鼠中，LV质量指数增加30。/。，但是在AngII处理的剔除了LIMP-2的小鼠中肥大响应被减小(LV质量指数增加14%;PO.01)(图2A)。这通过测量单个心脏肌细胞面积来确定。AngII处理的剔除小鼠的LV肌细胞面积明显小于AngII处理的WT对照物的LV肌细胞面积(任意单位的肌细胞面积AngII处理的剔除小鼠的为264±42,而AngII处理的野生型小鼠的为308士14;PO.Ol)。另外，当AngII导致在剔除了UMP-2的小鼠和野生型小鼠(未示出数据)中血管周纤维化明显增加时，与野生型对照的同窝小鼠相反，AngII导致剔除了LIMP-2的小鼠的LV的大块间质纤维化响应(间质纤维化AngII处理的剔除小鼠的为15.0±6.0%,而AngII处理的对照小鼠的为1.8±0.1%;PO.002)(图3)。对结蛋白进行免疫组织化学染色示出了AngII处理的LIMP-2缺失小鼠的肌细胞混乱(图4)。确定的是，在野生型小鼠和剔除小鼠中AngII引起类似的血压响应(图2B)。尽管LV肥大有所下降，但是对于肥大LV的脑利钠肽(BNP)和心房利钠因子(ANF),LIMP-2缺失小鼠示出了典型标记的正常响应(图2C),这表明在AngII处理时正常启动了肥大基因表达程序。相反，与AngII处理的野生型相比，AngII处理的剔除了LIMP-2的小鼠中结构细胞肥大标记a-骨骼肌肌动蛋白明显较少(图2C),这反映出心脏肌细胞的肥大响应降低(Stilli等，2006)。连续的超声波心动描记术显示出AngII在AngII处理的LIMP-2缺失小鼠中引起明显的心脏扩张，而AngII处理的野生型小鼠示出了向心型LV肥大，而没有扩张(图2D和表3)。另外，如通过响应于多巴酚丁胺注射(AnglI处理的剔除小鼠的+dP/dt为79.8/秒士5.1,而Angll处理的对照物的+dP/dt为100.0/秒土4.0;尸<0.005)引起的收缩减小所示出的，AngII导致LIMP-2缺失小鼠的收缩储备的损失(图2E)。总而言之，在LIMP-2缺失小鼠中，高血压没有导致正常的肥大响应，而是导致扩张性心肌病以及反应间质纤维化和心脏功能损失。根据心脏负荷来调节LIMP-2表达AngII处理的LIMP-2缺失小鼠没有作出肥大响应而是正常地引起BNP和ANF的表达，这一发现表明LIMP-2是对机械负荷进行正常响应的关键部分。实际上也示出了LIMP-2表达在将心脏肌细胞在体外拉伸之后明显增加(P=0.02)，并且运动引起的生理肥大也有所增力口(PK).04)(图5A和图5B)。为了确定在适应了心脏压力负荷的人中也包括LIMP-2，通过对20位明显心脏肥大的主动脉狭窄病人和7位对照病人的心脏活检物进行定量RT-PCR来分析LIMP-2的表达。该试验示出了通过Mann-Whitney检验，与对照物相比，在主动脉狭窄病人的肥大心脏中LIMP-2上调明显(1.23倍；P=2.3e-4)(图5C)。LIMP-2存在于心脏闰盘中接下来，通过免疫组织化学来分析LIMP-2在压力超负荷的鼠科动物心肌中的表达模式。如所预料的，在心脏肌细胞和内皮细胞的细胞内液泡形隔室中表达了蛋白，但是还发现蛋白非典型地分布在心脏肌细胞的质膜上(图6A)。免疫电镜证实了这种发现(图6B)。需要注意的是，AngII处理的剔除了LIMP-2的小鼠和对照小鼠的左心室切片的电镜显示LIMP-2缺失小鼠中的ID的异常形态，这表明在ID正常的生物中可能包含LIMP-2。在细胞间的接触位置，AngII处理的KO-ID的膜显示出了更高程度的巻曲和更高浓度的粘着连接蛋白(图6C)，这表明了扰乱的ID构造(Pernard等，2003)。由于ID中的变化已经显示引起了扩张性心肌病(Periard等，2003),所以猜测LIMP-2对于ID的正常功能可以是关键的。新生大鼠的心脏肌细胞蛋白的免疫沉淀反应显示LIMP-2与粘着连接的关键成分N-钙粘蛋白(N-cadhenn)存在物理上的相互作用(图7A)。这种发现转换为人的情况，如对照的和人类心肌衰竭的共聚焦显微镜所示，证明在钙粘蛋白和LIMP-2之间存在相互作用，并且示出这种相互作用发生在ID的钙粘蛋白和LIMP-2共位的位置(图7B)。这表明通过调节4丐粘蛋白的作用，LIMP-2对于正常的ID功能可能是非常重要的。事实上，对UMP-2缺失小鼠的心脏中的钙粘蛋白进行组织化学分析显示异常的4丐粘蛋白分布(图7C)，但是在AnglI处理的野生型小鼠中显示正常分布。AnglI处理的野生型小鼠显示在两个纵向的心脏肌细胞之间的接触位的4丐粘蛋白表达，而这种表达在AngII处理的剔除了LIMP-2的小鼠中更加的无组织并且更加分散。这些数据确定LIMP-2对于闰盘的正常结构组织是关键的。LIMP-2调节闰盘完整性为了确定哪种调整机制依赖于LIMP-2,采用针对LIMP-2的慢病毒引入的短发夹RNA(shLIMP-2)，来获得新生大鼠心脏肌细胞中的LIMP-2失活的单独才莫型。培养10天之后，与对照处理的心脏肌细胞相比，shLIMP-2处理的心脏肌细胞中的LIMP-2蛋白表达被缩减了92%(图8A)。已经报道了闰盘的功能完整性取决于P(Ser37)-(3-连环蛋白(P(Ser37)-(3-catenin)和钙粘蛋白之间的适当的相互作用。因此，已经研究了LIMP-2的缺失是否影响P-(3-连环蛋白与钙粘蛋白的结合。钙粘蛋白在心脏肌细胞裂解液中的免疫沉淀反应显示，LIMP-2抑制实际上降低了P-(3-连环蛋白和钙粘蛋白之间的相互作用(图8B)。免疫沉淀反应对于钙粘蛋白是特异性的(图8C)。该项研究表明溶酶体蛋白LIMP-2是心脏肌细胞闰盘(具体的是粘着连接)的重要的且新的组分。根据本发明，已经示出了LIMP-2结合到N-甸粘蛋白，并且示出了LIMP-2缺失小鼠在AngII导致高血压时发展为扩张性心肌病，伴随心脏中的N-4丐粘蛋白的局部混乱。确定的是，体外的这种结合示出在培养的肌细胞中LIMP-2的抑制扰乱了N-4丐粘蛋白和(3-连环蛋白之间的相互作用。这表明LIMP-2作为最初了解的溶酶体蛋白是闰盘的重要部分。LIMP-2在压力超负荷期间对心脏的作用LIMP-2在ID蛋白中是引人注目的。完全缺失ID的其它主要組分(《丐粘蛋白、(3-连环蛋白、盘状球蛋白)导致致命的进展型心脏紊乱，表明ID的这些组分对于正常的心脏发育是必需的。相反，根据本发明，如果不是LIMP-2缺失仅影响后天的心脏重构，则发现LIMP-2缺失小鼠具有正常的心脏发育。这表明LIMP-2代表不同类型的ID蛋白，该ID蛋白的作用主要在负荷增加的情况下是必要的。LIMP-2的这种特殊作用由于发现LIMP-2的表达还在处于向衰竭发展边缘的肥大大鼠心脏中增加而得到重视，该事实表明LIMP-2表达尤其在看起来不能正常响应负荷条件的心脏肌细胞中增加。总之，表明LIMP-2是ID功能的一种新型介体，并且代表一种迄今为止未经确认类型的介体，该介体对于ID和肌细胞响应增加的负荷条件来说是必要的。LIMP-2缺失小鼠对增加的负荷产生异常响应与保持代偿的肥大心脏相比，LIMP-2尤其在以后将发展为衰竭的那些肥大的心脏中增加。这表明心脏的LIMP-2表达可能是超负荷的早期分子标志。LIMP-2组成针对超负荷的防御机制是根据下面的发现而提出的在LIMP-2缺失小鼠经历由于慢性血管紧张素II侵染导致的压力负荷时，LIMP-2缺失小鼠发展为心脏扩张和纤维化，而心脏肌细胞肥大非常少。正常地诱导利钠肽，这表明如a-骨骼肌肌动蛋白的消弱表达所证明的，LIMP-2缺失小鼠的心脏肌细胞确实感受到增加的负荷条件，但是不能进行适当的肥大响应。这表明LIMP-2对心脏负荷进行正常响应是所必需的，并且LIMP-2表达在负荷条件超过代偿机制时显著增加。这些发现被转换到人的情况，显示LIMP-2在临床上具有严重压力负荷的病人中也显著增加。总之，LIMP-2是ID的一种新组分，并且看起来代表一种新类型的ID蛋白，对正常的心脏功能之外的负荷产生响应是所必需的。LIMP-2对负荷的响应机制在压力负荷的LIMP-2缺失小鼠中证实了闰盘异常，其表征为心脏闰盘紊乱，这正常地作用于临近肌细胞的组织。之前已经示出了在从代偿的LV肥大向心力衰竭转变的过程中的闰盘重构，而闰盘的结构扰乱已经联系，J人类、仓鼠和猪的扩张性心肌病。已经示出了LIMP-2与N-4丐粘蛋白结合，表明经过这种ID组分对LIMP-2起作用。实际上，压力超负荷的LIMP-2KO小鼠在电子显微镜下示出了异常的闰盘，并且它们的N-4丐粘蛋白分布混乱，表明粘着连接中存在缺陷。粘着连接的强度由N-4丐粘蛋白和p-连环蛋白之间的结合亲和力确定(Gumbmer等，2000)，结合亲和力通过(3-连环蛋白的磷酸化来调节。在体外示出，通过抑制培养的肌细胞中的LIMP-2，LIMP-2缺失扰乱了这种N-钙粘蛋白/(3-连环蛋白复合体。假设粘着连接与肌原纤维有关，则LIMP-2缺失预计会导致跨质膜的力量转导的效率下降(Ferreira等，2002)已经表明LIMP-2是N-钙粘蛋白与p-连环蛋白正常结合所必需的，并且这种作用在负荷条件下尤为重要。然而，仍需说明LIMP-2确保将N-钙粘蛋白结合到(3-连环蛋白的确切方式。LIMP-2包含两个跨膜区、一个细胞质环和两个鲁米那糖基化区。已知的是溶酶体膜蛋白可以在溶酶体和质膜之间穿梭，其中，LIMP-2可以结合到TSP1和TSP2(数据未示出)。TSP2如在早期所证实的是令人感兴趣的，即，TSP2对于心脏压力负荷的响应也是所必需的，并且增加LV肥大的形式的衰竭倾向(Schroen等，2004)。这表明LIMP-2和TSP2均可以是心脏肌细胞所需的复合体的一部分，以对负荷进行适应性的响应。推论根据本发明，已经揭示了当心肌面对负荷增加的条件时LIMP-2作为ID的重要介体的新作用。除了这种新颖的生物学发现之外，还发现了LIMP-2表达在处于向衰竭发展边缘的肥大大鼠心脏中增加，从而推测心脏肌细胞的LIMP-2表达增加证实了它们不能正常响应负荷条件。这样，LIMP-2增加表达可以表示衰竭即将到来。由于已经示出了LIMP-2表达在临床上具有严重压力负荷的病人中也明显增加，并且位于质膜中，所以LIMP-2可能是分子影像学的引人注目的目标，从而在非常早的阶段鉴別将要屈服于压力的心肌。示例2TGF(3通过抑制KrUp。d样因子15来促进心脏肥大，Kriippel样因子15是心脏肥大的一种新型抑制剂材料和方法转基因的大鼠，左心室活检物和血液动力学研究研究了十八只雄性的纯合Ren-2大鼠和5只年龄匹配的Sprague-Dawley(SD)(M6llegardBreedingCenter,LilleSkensveld,丹麦)。有心力衰竭的临床体征的三只Ren-2大鼠在10周到12周周龄被处死，从研究中将这三只大鼠排除。如前所述，在10周周龄，从剩余的健康的15只Ren-2大鼠和5只SD对照大鼠中提取左心室的活检物。如上所述，在10周、12周、15周、16周、18周、19周和21周周龄，对大鼠进行连续的超声波心动描记术。存在心力衰竭的临床体征的九只Ren-2大鼠在15周至18周周龄被处死，并且被指定为"有心力衰竭倾向"的大鼠。监视剩余的6只Ren-2大鼠，当没有出现衰竭的临床体征时，这些大鼠在21周被处死，并且被指定为"代偿的"大鼠。微阵列分析如前所述，从10周周龄的4只SD对照大鼠、6只保持代偿的大鼠和4只有心力衰竭倾向的大鼠中提取LV活检物，从LV活检物分离总RNA并且扩增。接着，扩增后的cRNA与Affymetrix大鼠2302.0基因芯片杂交。利用MicroarrayAnalysisSuiteSoftwareversion5.0(MAS5.0)来确定SD对照大鼠、代偿的大鼠和HF大鼠的基因转录水平。慢病毒shKLF-15产物将互补的shKLF-15寡核苷酸(正义5'-GATGTACACCAAGAGCAGC-3'和反义5'-GCTGCTCTTGGTGTACAT-3')退火，并且利用E.ColiDH5a感受态细胞将它们克隆到内切的pLL3.7嘌呤霉素载体DNA(由美国剑桥的麻省理工学院生物系的LukvanParijs友情提供)，来获得慢病毒载体。利用QiagenPlasmidMidikit将所得物纯化。在加有10%的FCS、2mM的L-Glut、10mM的非必需氨基酸、ImM的丙酮酸钠和青链霉素的DMEM中培养293FT细胞。利用Lipofectamine2000(InvitrogenLifeTechnology,Breda,荷兰)，卄夸3|dgshKLF-15和包装载体，或者将3吗shTgfbrl/pLL3.7。票呤霉素和包装载体，或者将3路空的pLL3.7嘌呤霉素和包装载体共转染到293FT细胞，来获得慢病毒产物，48小时后收集包含病毒的上清液，过滤，快速冷冻。新生大鼠心室肌细胞试验如早先所述(Schroen等，2004),通过对1天到3天大的新生大鼠心脏进行酶分裂，将新生大鼠的心室肌细胞(NRVM)分离。以每孔5xl()S个细胞，在6孔胶质板上，在加有10。/。的马血清(HS)、5。/。的新生牛血清(NBCS)、葡萄糖、庆大霉素和2%的抗生素/抗真菌药的DMEM/M199(4:1)培养基中培养NRVM。为了shKLF-15侵染，将NRVM过夜培养，第二天通过聚凝胺(Sigma)促进shK丄F-15和空的慢病毒对照载体侵染NRVM。48小时后，清洗细胞，去除载体，并且将细胞放置在嘌呤霉素筛选的条件下再过48小时。接着，细胞在DMEM/M199(4:1)、葡萄糖、庆大霉素和10%的抗生素/抗真菌药中在静态条件下过夜。第二天，用包含DMEM/M199、葡萄糖、庆大霉素、5%的抗生素/抗真菌药、胰岛素、L-肉碱和BSA的培养基来替换原来的培养基。l小时之后，添加TGF-b(10ng/ml培养基)1小时，此后，利用RNeasyminiprotocol(Qiagen)分离RNA,采用KLF-15或BNP引物(F5'-GCTGCTTTGGGCAGAAGATAGA-3'R5'-GCCAGGAGGTCTTCCTAAAACA-3')进行SYBRGreen定量PCR。与用空的慢病毒载体侵染的NRVM的水平相比，shKLF-15的抑制效果是大约80%。MEF2荧光素酶启动子检测如上所述，分离NRVM。以每孔5xl()S个细胞，在6孔胶质板上，在加有10%的马血清(HS)、5%的新生牛血清(NBCS)、葡萄糖、庆大霉素和2%的抗生素/抗真菌药的DMEM/M199(4:1)培养基中培养细胞。为了shKLF-15侵染，将NRVM过夜培养，第二天通过聚凝胺(Sigma)促进shKLF-15和空的慢病毒对照载体侵染NRYM。48小时之后，清洗细胞，去除载体，并且将细胞放置在噤呤霉素筛选的条件下再过48小时。包含三个Mef2结合位的Mef2报告质粒(pGL2-3xMEF2-荧光素酶)经过瞬时转染克隆到细胞中的Tata-box和荧光素酶的上游。清洗细胞，每个孔中添加1.6昭的MEF2结构以及Opti-MEMI培养基(Invitrogen)和lipofectamine2000与没有抗生素的培养基。第二天早晨清洗细胞，并且将细胞放置在正常的培养基中再过两天。在低血清条件下保持细胞过夜(见上)，第二天早晨添加AngII(x克/ml)4小时。利用LuciferaseAssayProtocol(Promega)进4亍焚光素酶斗全观'J。双转基因小鼠的产生在a-MHC启动子(MerCreMer""wt,Larsson等)的控制下，将通过TGF卩RI的外显子3与lox-P位(Sohal等，2001)侧连接产生的rGi^兄严小鼠(C57B1/6背景)与包含cre-重组酶的小鼠(C57B1/6FVB背景)异种交配，产生包含r(7i^/^'—e基因的杂合双转基因小鼠。这些小鼠随后与7T7F/^,小鼠回交，得到C57B1/6FVB和C57BL/6混合背景中的具有rGF/^产'"和:TG"朋严，的种群。DNA分离和基因分型才艮据制造商的说明书，利用基因组DNA纯化试剂盒(Promega)从小鼠尾部分离DNA。如早先所述(Sohal等，2001),我们利用三个引物5-ATGAGTTATTAGAAGTTGTTT、3'-ACCCTCTCACTCTTCCTGAGT和3'-GGAACTGGGAAAGGAGATAAC采用PCR来测定T(3RIflox小鼠的基因型。为了检测MerCreMer转基因，我们用引物5-CCTGGAAAATGCTTCTGTCCG和5-CAGGGTGTTATAAGCAATCCC，从c厂e扩增400-bp片段。Cre重组方案为了资导心脏肌细胞中的结合有ot-MHC的tre重组酶，通过皮下插入渗透性微泵(ALZET，型号2001)用三苯氧胺(Sigma)以每天20mg/kg的剂量处理成年的rG印i/^和rG"/严嫌双转基因小鼠，持续7天。用三苯氧胺处理一组野生型小鼠，来检查三笨氧胺本身是否对心脏的形态和功能产生影响。将三苯氧胺溶解在10%的乙醇和90%的聚乙二醇-400中，接着进行简短的超声处理。在用AngII或载体处理之前，使小鼠恢复两周。渗透性微泵的皮下植入和AngII注射用2.5%的异荧烷将重量为24g-32g的任何性别的小鼠麻醉。在无菌条件下，进行肩月甲中切割(midscapularincision),通过钝性解剖在皮下组织中产生袋状物，并且插入填充有盐水或AngII(0.5mg/kg/天)的渗透性微泵(ALZET型号2004，ALZACorp.,PaloAlto,加利福尼亚，美国)。渗透性樣i泵中的成分以0.25^1/小时的速率被递送到局部皮下空隙中，持续4周。在每组中，新添加7只至9只小鼠用于试验，每组中的至少5只小鼠完成了试验。除了LV导管插入术不成功的3只动物外，所有的中途退出的小鼠均是由于麻醉而死亡。超声波心动描记术在2.5%的异荧烷麻醉的条件下，在外科手术之前以及在野生型、7T/^R/-/-和rOF/^/-/++鼠中注入4周的AngII之后进行经胸超声波心动描记术。在2D超声波心动描记术中得到标准观点，测量心室舒张末期和心室收缩末期的内径，计算射血分数和缩短率。血液动力学测量采用腹膜内注射氨基曱酸乙酯将小鼠麻醉。将Millar(1.4F)导管(由美国推进到左心室中，来测量左心室内的压力。利用热控制的外科手术台将体温保持在37。C,并且用直肠4冢针进行监测。然后4吏小鼠在血液动力学测量之前稳定30分钟。组织获取和心肌形态测量血液动力学测量之后，将心脏快速切离，在0.9%的氯化钠溶液中清洗，去除心房，将心室切成片。为了将RNA和蛋白分离，将样品在液氮中快速冷冻，并且在-80。C下保藏。为了进行组织学分析，将左心室固定在多聚甲醛(1%)中，并且埋入石蜡中。为了清楚地呈现总胶原，如前所述执行天狼猩红染色。根据制造商的说明书(CellSignalingTechnology,Leusden,荷兰)，利用抗P38抗体通过免疫染色将P38定位。蛋白分离和免疫蛋白印迹根据标准协议(SantaCruzBiotechnology,Leiden，荷兰)，在放射免疫测定緩冲液中，将冷冻的心室压碎并且使之成为均匀的颗粒。利用针对T卩RI(1:1000)、总的和磷酸(P)-Smad2、总的和P-P38(1:1000，CellSignalingTechnology,Leusden，荷兰)、P-Smad3(1:5000，E.Leof教授和M.Wilkes博士(MayoClinicCancerResearch,Rochester,Minnesota,美国)々赍贝曾)的4争异性抗体以及胶原I(1:3000)和III(1:500)抗体(Abeam,Leusden,荷兰)进行免疫蛋白印迹。TGFj51型受体免疫组织化学去除心脏组织切片上的石蜡并且进行再水合，使抗原修复组织与一抗体(兔抗TGF卩受体1(SantaCruzSC-398))过夜培养，接着与二抗体(羊抗兔-Biotme(DakoCytomationE0432))过夜培养，此后它们用Streptavidin-HorseradishPeroxidase(抗生蛋白寺连菌素-辣冲艮过氧"f匕物酶)(RenaissanceTSATMBiotinSystem,PerkinElmerPrecisely,TyramideSignalAmplificationkit)处理。涉及到动物试验的上述所有的研究方案均得到了马斯特里赫特大学的动物关爱和使用委员会的批准，并且根据基于对试验动物的关爱和使用在荷兰法律中制定的官方规则(与NIH的规则非常类似)下进行。统计学分析数据被示出为平均土SEM。进行不成对的t-检验，来比较AnglI/TGFp/shKLF-15的调节子与媒介处理过的动物和细胞之间的差别。P值$0.05被认为是统计学上显著的。结果早先已经示出了高血压的远系繁殖纯合TGR(mRen2)27大鼠(Ren-2)可以用来研究从肥大向心力衰竭的转变(Schroen等，2004)。使用在10周周龄得到的心肌活检物来研究改变后的基因表达是否可以预测哪只大鼠以后将发展为心力衰竭。这些活检物的表达镨显示编码Kriippel样因子15(KLF-15)的基因的抑制表征出将快速发展为衰竭的肥大心脏。通过实时PCR确认了上述结果，实时PCR示出了在代偿的LVH中，KLF-15被下调；而在快速发展为衰竭的肥大心脏中明显地进一步抑制了KLF-15(图9A)。原位杂交示出了在心脏肌细胞中KLF-15的表达被明显下调(图9B)。这些发现扩展了早期的观察，在该早期的观察中，KLF-15在心脏中被组成型地表达，而在肥大的情况下被下调。在向心力衰竭转变之前的KLF-15的更强烈的抑制导致了这样一种说法，即，KLF-15具有重要的保护性质。为了探究KLF-15的功能作用，稳定地引入了相对于KLF-15的短发夹RNA(shRNA)。导致BNP(肥大基因程序的分子标志)的自发表达大于培养的心脏肌细胞中的KLF-15的shRNA介导抑制的10倍(图9C)。这表明KLF-15的组成型存在对于防止肥大基因程序的表达来说是重要的。在并行的研究中，已经示出了KLF-15缺失小鼠发生肥大，并且在压力负荷下心脏功能缺失，被引起重视的是组成型表达的KLF-15对于防止LVH的不良形式是必要的。为了探究KLF-15能够压制肥大基因程序的机制，研究了KLF-15在MEF2活化中的作用。MEF2是通过神经4丐蛋白(calcmeurin)和MAPK途径传达肥大信号的目标，并且被认为是肥大基因程序的关键的转录激活因子之一。采用MEF2报告子来确认改变了水平的KLF-15是否影响心脏肌细胞中的MEF2活性。该报告仅是无力地响应了MEF2的刺激(Creemers，Olson未公布数据)。实际上，响应于血管紧张素II,在MEF2活性方面仅观察到少许增加来响应。然而，KLF-15的抑制明显增加了MEF2活性(图9D),这表明KLF-15作为MEF2的抑制物。接下来试图探索是什么机制抑制了心脏肌细胞中的KLF-15。因此，对心脏肥大的已知介体进行筛选，筛选有能力抑制KLF-15在心脏肌细胞中的表达的介体。在培养的心脏肌细胞中，TGFp非常强烈地抑制KLF-15,使得在添加了TGF卩之后KLF-15的表达几乎完全被消除。由抑制RNA导致的TGF(3I型受体被抑制防止了KLF-15被TGF卩抑制(图10A),这表明典型的TGF卩给出信号，包括它的I型受体对于这种效果是必要的。为了弄清楚TGF(H型受体在体内对KLF-15的调节作用，产生了携带有鼠给服三苯氧胺来使心脏肌细胞中特有的cre活化(Larsson等，Sohal等，2001)。这使得剔除了成年小鼠的心脏肌细胞中特有的TGF(3I型受体，避免TGF(3I型受体的胚胎缺失对发育产生影响。在这些小鼠中，如上所述，由于慢性血管紧张素II注射而引起高血压，从而引起肥大和KLF-15下调。全心脏匀浆的免疫蛋白印迹揭露了TGF[3I型受体明显下调(图IOB)。免疫组织化学确定了TGF(3I型受体的肌细胞明显下调，这种受体在其它细胞型中的表达说明了在全心脏匀浆中发现的TGFpI型受体的残余信号(图IOC)。血管紧张素II引起野生型小鼠的LVH，但是MerCreMer-TGF(3I型小鼠中LVH的发生被防止(图IOD)。尽管在WT小鼠中，血管紧张素II减少了缩短率，但是在MerCreMer-TGF卩I型小鼠中，仍然保持缩短率(图IOE)。这表明心脏肌细胞中的TGF(H型受体缺失可以防止高血压导致的肥大和功能缺失。如所预计的，KLF-15的表达在WT小鼠的肥大心脏中受到抑制，但是这种抑制没有出现在MerCreMer-TGF卩I型小鼠的心脏中(图IOF)。这表明心脏肌细胞上的TGFPI型受体对于高血压型肥大的发展是重要的，同时对于抑制KLF-15也是重要的。总之，KLF-15是第一位的Kriippel样因子，在心脏肌细胞中起到心脏肥大抑制剂的作用。KLF-15抑制MEF2,并行的工作显示KLF-15也抑制其它前肥大转录因子，例如GAT4。结果，可以想到的是，KLF-15的缺失非常强烈地引起肥大基因表达，并且与不利的结果相关。因此，KLF-15的抑制可以是衰竭倾向形式的肥大的发展过程中的新颖的和关键的一步。已经证明，TGFP能够非常强烈地抑制KLF-15。因此，当前在不同领域正在开发TGF卩的抑制剂，TGF(3的抑制剂可具有预料不到的治疗潜力，由此来防止心脏肥大发展为心力衰竭。结论心脏对负荷和损伤响应而变得肥大，这经常向明显的心力衰竭发展。根据本发明，揭露了该过程的新机制，其中，细胞因子TGFp对肥大的新型抑制剂(Kriippel样因子15(KLF-15))进行抑制。体内和体外的TGF(3I型受体的缺失防止KLF-15被抑制并且防止心脏肥大和衰竭的发展。TGF(3能够阻碍抑制心脏肥大的这种新机制，该发现令人兴奋地揭示了抑制TGF[3发出信号从而防止心脏肥大的不利形式的可能性。示例3Kriippd样因子15,心脏肥大的转录抑制剂根据本发明，已经示出了锌指转录因子Kriippel样因子15(KLF-15)是有效的LV肥大转录抑制剂。基因打靶研究示出了KLF-15缺失小鼠正常发育，但是在响应压力超负荷的情况下，发展为扩张形式的心脏肥大，其特点在于心脏重量增加、肥大基因表达增加、肌细胞尺寸增加的左心室室腔扩张以及左心室收缩功能下降。总之，这些研究证实了KLF-15在体内的LV肥大中的作用。有趣的是，KLF-15在几种形式的病理性肥大中:^皮下调，但是在生理性肥大中没有被下调，这表示KLF-15是病理性肥大的调节剂，而不是生理性肥大的调节剂。KLF-15阻碍肥大这一事实以及另外的发现(KLF-15在病理性肥大和心力衰竭中明显下调)带来令人兴奋的可能性，即，以防止KLF-15水平下降为目标的干预能够防止病理性生长，甚至使病理性生长逆转。体内试验为了证明在病理性肥大过程中防止KLF-15缺失可以限制心脏的病理性生长的令人感兴趣的可能性，在心肌肌钩蛋白I启动子的控制下，利用重组腺相关病毒(rAAV)介导的基因送递使小鼠心脏中的KLF-15明显地过表达(Vandedriessche等，2007)。具体地讲，rAAV9载体已经示出了在静脉给药之后的几周内，在心脏组织中完成了转基因表达的快速增加。小鼠被静脉注射lxl(V。vg的AAV9-KLF-15或者AAV9-GFP,此后通过血管紧张素n(AngII)处理(通过渗透性微泵处理4周)来引起肥大。如图11中所示(上图)，KLF-15在心脏中被过表达。需要注意的是，与接收AAV9-GFP的AngII处理的小鼠相比，被分配给AAV9-KLF-15基因转移的小鼠在AngII刺激的情况下发生明显较小的肥大(见图11,下图)。总之，这些数据示出了KLF-15在心脏肌细胞中的强制性表达能够使心脏肥大下降。结论KLF-15缺失是肥大的发展和向心力衰竭转变的过程中的关键步骤。KLF-15的心脏过表达抑制病理性肥大的发展，这一发现令人兴奋地揭示了防止体内KLF-15下调，从而防止肥大和后来的心力衰竭的策略的可能性。表1:SYBRGreenPCR和shLIMP-2产物的引物列表<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>3探针设计ID,Affymetrix探针设计数bp值，PO.05祐:认为在统计学上显著M咅数变化，与代偿的Ren-2大鼠相比，有衰竭倾向的Ren-2大鼠的基因表达的倍数变化。例如，负号意味着有衰竭倾向的Ren-2大鼠有下调。d基因名称，与探针设计ID有关的基因的名称表3:在基础状态以及14天和28天的AngII处理之后，LIMP-2KO和WT小鼠的超声波心动描记术参数<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>平均±SEM*与基础状态的KO或WT相比PO.005$与年龄匹配的WT相比P<0.05$$与年龄匹配的WT相比PO.001a从短轴测量IVSd,心脏舒张情况下的室间隔；LVIDd，心脏舒张情况下的左心室内径；LVPWd，心脏舒张情况下的左心室后壁厚度；FS(%)，缩短率；b从长轴测量LVAd,心脏舒张情况下的左心室面积；LVLd，心脏舒张情况下的左心室长度参考文献Gamp等，Hum.Mol.Genet.12:631-646,2003.VanHaaften等,BMCBioinformatics7:onine,2006-09-21.Schroen等，Circ.Res.110:3121-3128,2004.Heymans等，Circulation112:1136-1144，2005.J皿queira等，Histochem.J.11:447-455,1979.DeWmdt等，J.Mol.Cell.Cardiol.29:2095-2106,1997.Crombie等，J.Biol.Chem.273:4855-4863,1998.Eskelinen等，TrendsCell.Biol.13:137-145,2003.Nishmo等，Nature406:906-910，2000.Stypmann等，Proc.Natl.Acad.Sci,USA99:6234-6239,2002.Stilli等，Exp.Physiol.2006.Perriard等，TrendsCardiovasc.Med.13:30-38,2003.G腦biner,J.Cell.Biol.148:399-404,2000.Ferreira-Comwell等，J.Cell.Sci.,115:1623-1634,2002.Sohal等，Circ.Res.89:20-25，2001.Larssoii等,EmboJ.20:1663-1673Vandendriessche等，J.Thromb.Haemost.5(1):16-24,2007.40DNA序列KLF15智人来源NCBI_智人Kruppel样因子15,mRNA(cDNA克隆MGC:45113IMAGE:5526657):完整cds.添加BC036733<formula>formulaseeoriginaldocumentpage42</formula>氨基酸序列KLF15智人来源NCBI智人种Kruppel样因子15,mRNA(cDNA克隆MGC:45113IMAGE:5526657)完整cds.添加BC036733MVDHLLPVDENFSSPKCPVGYLGDRLVGRRAYHMLPSPVSEDDSDASSPCSCSSPDSQALCSCYGGGLGTESQDSILDFLLSQATLGSGGGSGSSIGASSGPVAWGPWRRAAAPVKGEHFCLPEFPLGDPDDVPRPFQPTLEEIEEFLEE顧EPGVKEVPEGNSKDLDACSQLSAGPHKSHLHPGSSGRERCSPPPGGASAGGAQGPGGGPTPDGPIPVLLQIQPVPVKQESGTGPASPGQAPENVKVAQLLVNIQGQTFALVPQVVPSSNLNLPSKFVRIAPVPIAAKPVGSGPLGPGPAGLLMGQKFPKNPAAELIKMHKCTFPGCSKMYTKSSHLKAHLRRHTGEKPFACTWPGCGWRFSRSDELSRHRRSHSGVKPYQCPVCEKKFARSDHLSKHIKVHRFPRSSRSVRSVN:LT^P-2l'叛因應列以"B，，格式表示其它外显子的位置以""表示已选择外显子的位置〉染色体:NCBB6:4:77298918:77354059:-1GTCTTCCAGAAGGCTGTAGACCAGAGTATCGAGAAG;TGAGGCGGGGCGGGCTGTGTGTG<formula>formulaseeoriginaldocumentpage45</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula><image>imageseeoriginaldocumentpage47</image><formula>formulaseeoriginaldocumentpage48</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage49</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage50</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage51</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage52</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage53</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage54</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage55</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage56</formula>GGGGATGCTGCTGTCTTAATATACCTCTGCTCCGC:JJACTGTCATAGAGTGGTGCCAGGTGCACTTCCTCAGGGAGATCATCGAGGCC^TGTTGAAAG(;CTATCAGCAGAAGCTCTTTGTGACTCACACAGTTGACGAATTGCTCTGGGiGCTACAAAGATGAAATCTTGTCCCTTATCCATGTTTTCAGGCPCGATATCTCTCCCTATTTTGGCCTATTCTATGAG<formula>formulaseeoriginaldocumentpage58</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage59</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage60</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage61</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage62</formula>TGTTTAGTCATCAAGAATACTATTTTCrTGCCTCTCC'AGAGTGTTC^CATTGATAAAGAGACGGCG入GTCgACTCi!iAGTCTATG^rTAKciw;T—TTTGATCATCACCAACATACCCTACATCATCATGGC^GCTGGG+GTGTTCTTTGGTTTGGTTiTTACCTGGCTTGCATGCAAAGGACAGGGAfCCATGGATGAG;AACTGGCTGAAGGAACTTCTTCCTTACTGGATAACTTagaagtttctgacatgaacatct.二—二-cttgttttctctcttctgtgtttc-:-(ggaacagcggatgaaagac;cacccctcattcgaacctaaacattgcctttgcttggtgaagaAactgtgtgagctgtcctgacctggacgatgacgtggggaaaccctccacctccttgcagc^cttgttgcctgttgaaagaaggaaaaagacacggcgctdgcaagtgataggaacatt(^tggccaga^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ggttaaagagcaggctgacatggctggccattaagctt'tataaaatcatgtgggctctgaaattg.ttcttttatgtgtctagcaagtatttaataaacccttgtatagtaattttgttgttgttgggtjsctg^t^gctccagaattt;tgtgacd:kctattgtgggtaafl^tgtc:tctgcatcacttgttaatg—aci"ggtctaac^tcattca6tatgcttcattcaccgaactttgtgctcaaaatgcgtatAtaccat.tttatgttgtattcctccatttcacttgcaaaacagaagtaaataagagttcgggacccagggtaaaatggtagcttcatccaatatatcattcaaatgcatctga^ttctaaaacatattacattttatgcltgatcttcagttcataaitcttccaggaaaactcagtcttccaactgcaataaaatactgggtagaatcaaatgggaaaggggttgggtgggg,c[aatacccatgagttgatagtgata^gctcctaaggatttttaacttgtacttttgtgaacq;^agagaatgcataaataatgttggtgaggataaagtacagatatttcatgta^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^GAATTA7V5TGCTApT;TAGATGgTTGTGGATC;AGa^A^CTGTTTTTTTTTTAGTCAAAATGi-,ww'"^-,,,jf"1,:、s■■"'J*-.^3^(^i'，战化"曙，"、v二，■,,itATCATGC.TACGAft^GATGCTTCTGAGAG^ATGTAATGAGTAACTGATTTTTCTTCCTGAGTCGCfcCTTGCCAAATATGTTACT(3TATTAAT;rAATCT^ATATTGAGTGATTATTTGTAAAATTATGA^ATGGGAAATCCA^CTATCafAqAGCCTAAG^TACACATAAGTT^TCAGAAAGTCTGATTA)3ACTAft!AGAG々TATT;rCTTC—G;AGAGC.C一qCTTCTTGGTAATTTTGAAGTtctttttacaagttccttcctcagtttcagttctttccagtgttttgtagctcactgtcaCTCACTGAATAGAGAAACGTGTGCCCTATACTTdCJTGTGAcAATbAT't—gctgacagaai，^V'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