专利名称：：乌灵胶囊标准指纹图谱的建立方法和乌灵胶囊的鉴别方法
技术领域：
：本发明涉及乌灵胶囊的鉴别，尤其涉及乌灵胶囊标准指纹图谱的建立方法和乌灵胶囊的鉴别方法。背条技术乌灵菌粉是浙江佐力药业股份有限公司利用现代生物发酵技术，从天然乌灵参中分离菌种，经过发酵而得的国家一类新药，化学成分主要含有腺苷为主的核苷类物质、氨基酸、异黄酮、微量元素、维生素等营养物质。乌灵胶囊是纯乌灵菌粉制剂，有补肾健脑、养心安神功效，临床上用于神经衰弱的心肾不交证，症见心烦焦虑，失眠多梦，入睡困难，多梦惊恐，心悸，健忘，头晕耳鸣等。乌灵胶囊为浙江佐力药业股份有限公司独家生产和享有品种，但随着乌灵胶囊在临床的广泛应用，销量逐年快速增长，市场上也出现一些假冒乌灵胶囊的产品，由于现行标准所测定的腺苷并非乌灵胶囊特有成分，建立一种在整体上更好控制乌灵胶囊质量并作为鉴别真伪指标的鉴别方法，具有重要意义。
发明内容为了建立一种在整体上更好控制乌灵胶囊质量并作为鉴别真伪指标的鉴别方法。本发明的一个目的是提供乌灵胶囊色谱分析供试溶液和供试溶液配置方法。本发明的第二个目的是提供乌灵胶囊的鉴别方法。为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案-乌灵胶囊标准指纹图谱的建立方法，该方法包括以下的步骤(1)取乌灵胶囊内容物，加入极性小的有机溶剂，加热回流0.52小时，放冷，滤过，药渣挥干溶剂；(2)加甲醇或含水甲醇，称重，加热回流或超声提取0.51小时，放冷，再称重，加甲醇补足重量，滤过，以续滤液作为供试品溶液；(3)对照品溶液采用取腺苷对照品适量，加甲醇溶液溶解，制成含腺苷溶液，作为对照品溶液；(4)然后分别吸取对照品溶液及供试品溶液，分别注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，记录色谱图；(5)以腺苷峰为参照，计算各共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积，建立起标准指纹图谱。作为优选，上述的有机溶剂选用石油醚、环己垸、正己垸中的任意一种。作为优选，上述的液相色谱条件为检测波长为240260nm;流速0.6ml/min~0.8ml/min;色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为甲醇一0.1%磷酸溶液，梯度洗脱。作为优选，上述的标准指纹图谱的相对保留时间和峰面积比值如下各峰的相对保留时间为l号峰0.187±20%、2号峰0.468±20%、3号峰0.723±20%、5号峰2.198±20%、6号峰2.232±20%、7号峰2.437±20%，8号峰2.480±20%,参照峰4号峰，为腺苷峰；各峰的峰面积比值2号峰0.60-0.95,3号峰0.480.90;参照峰4号峰，为腺苷峰。为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案-乌灵胶囊的鉴别方法，采用上述的任意一种方法建立的标准指纹图谱，所测定的供试品指纹图谱与标准指纹图谱的相似度大于0.9。本发明的优点如下(1)因ds色谱柱对油脂性物质有强保留，易引起色谱柱堵塞，柱效下降，縮短色谱柱使用寿命，本发明供试品溶液是采用石油醚等低极性溶剂脱脂，以保护色谱柱。(2)本发明的供试品溶液是用甲醇或含水甲醇超声或加热回流提取，兼顾其水溶性及脂溶性两部分的化学成分，具有简便、稳定、精密度高以及重现性好等优点，弥补了乌灵菌粉现行质量标准中只涉及其中单一成分的缺点，使对产品质量的控制更加全面、真实、科学。(3)本发明釆用高效液相色谱法进行检测，检测波长为260nm,研究证明，供试品溶液在该波长处色谱峰最多，各峰之间分离度也较好，所以该条件下测定的指纹图谱更能全面反映乌灵胶囊所含的化学成分。图l为腺苷对照品图谱。图2为乌灵胶囊指纹图谱。具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。1仪器与试药1.1仪器戴安高效液相色谱仪；UVD-340U检测器；变色龙工作站。1.2试药腺苷对照品中国药品生物制品检定所提供；甲醇色谱纯；水重蒸水;其它试剂为分析纯。乌灵胶囊浙江佐力药业股份有限公司生产。2色谱条件色谱柱十八烷基键合硅胶(4.6X50mm，5um)kromasil;检测波长260nm;流动相为甲醇—0.1%磷酸溶液系统梯度洗脱；流速0.6ml/mim;柱温25°C;进样量10ul。理论板数以腺苷峰计算，应不低于4000。图谱记录时间为95分钟。梯度洗脱程序<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3指纹图谱测定3.1乌灵胶囊指纹图谱的确立供试品溶液的制备取乌灵胶囊内容物l.OOg，加石油醚10ml加热回流1小时，放冷，滤过，药渣挥干石油醚，精密加甲醇25ml，精密称重，加热回流提取1小时，放冷，再称重，加甲醇补足重量，滤过，续滤液作为供试品溶液。对照品溶液的制备取腺苷对照品适量，加10%甲醇溶液溶解，制成每lml含腺苷20ug的溶液，作为对照品溶液。参照物选用腺苷为参照物(S)。测定精密吸取供试品溶液及对照品溶液10Ul，分别注入高效液相色谱仪，按照液相色谱法测定，以参照物的色谱峰相对保留时间和相对峰面积为1，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，即得到乌灵胶囊标准指纹图谱。3.2共有峰的确定通过10批乌灵胶囊指纹图谱的测定，比较其色谱图，确定共有峰8个，以4号峰(腺苷峰)为参照物，相对峰面积超过0.5的共有峰为2号峰(RT0.468)和3号峰(RT0.723),其余均小于0.5。10批乌灵胶囊共有峰相对保留时间和相对峰面积统计结果见表3和表4。表3IO批乌灵胶囊指纹图谱相对保留时间统计结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表410批乌灵胶囊指纹图谱相对峰面积统计结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3.3指纹图谱精密度考察按照指纹图谱精密度考察要求，以l批乌灵胶囊为供试品，连续进样5次，分别对共有峰相对保留时间及规定的共有峰(有规定的共有峰即为与参照峰相比，相对峰面积超过0.5的指纹峰)的相对峰面积进行统计，RSDQ/。不超过3M。3.3指纹图谱重现性考察以1批乌灵胶囊为供试品(N:5)，按照指纹图谱重现性规定方法操作，分别对共有峰相对保留时间及规定的共有峰的相对峰面积进行统计，RSD。/。不超过3%。3.3指纹图谱稳定性试验按照指纹图谱稳定性测定方法操作，以l批乌灵胶囊为供试品，连续进样5次，考察24小时溶液稳定，分别对共有峰相对保留时间及规定的共有峰的峰面积进行统计，RSDy。不超过3Q/。。供试品24小时稳定。以上试验结果表明，该测定方法稳定可靠，可作为控制乌灵胶囊质量的指标之一，并可作为鉴别乌灵胶囊真伪的鉴别方法。权利要求1.乌灵胶囊标准指纹图谱的建立方法，其特征在于该方法包括以下的步骤(1)取乌灵胶囊内容物，加入极性小的有机溶剂，加热回流0.5～2小时，放冷，滤过，药渣挥干溶剂；(2)加甲醇或含水甲醇，称重，加热回流或超声提取0.5～1小时，放冷，再称重，加甲醇补足重量，滤过，以续滤液作为供试品溶液；(3)对照品溶液采用取腺苷对照品适量，加甲醇溶液溶解，制成含腺苷溶液，作为对照品溶液；(4)吸取上述对照品溶液及供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，记录色谱图；(5)以腺苷峰为参照，计算各共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积，建立起标准指纹图谱。2.根据权利要求1所述的乌灵胶囊标准指纹图谱的建立方法，其特征在于有机溶剂选用石油醚、环己烷、正己烷中的任意一种。3.根据权利要求1所述的乌灵胶囊标准指纹图谱的建立方法，其特征在于液相色谱条件为检测波长为240~260證；流速0.6ml/min~0.8ml/min;色谱柱填充剂为十八垸基硅烷键合硅胶；流动相为甲醇一0.1%磷酸溶液，梯度洗脱。4.根据权利要求3所述的乌灵胶囊标准指纹图谱的建立方法，其特征在于标准指纹图谱的相对保留时间和峰面积比值如下各峰的相对保留时间为l号峰:0.187±20%、2号峰:0.468±20%、3号峰0.723±20%、5号峰2.198±20%、6号峰2.232±20%、7号峰2.437±20%，8号峰2.480±20%，参照峰4号峰，为腺苷峰；各峰的峰面积比值2号峰0.60-0.95，3号峰0.48-0.90;参照峰4号峰，为腺苷峰。5.乌灵胶囊的鉴别方法，其特征在于采用如权利要求14任意一项权利要求的方法建立的标准指纹图谱，所测定的供试品指纹图谱与标准指纹图谱的相似度大于0.9。全文摘要本发明涉及乌灵胶囊的鉴别，尤其涉及乌灵胶囊标准指纹图谱的建立方法和乌灵胶囊的鉴别方法。乌灵胶囊标准指纹图谱的建立方法，该方法包括供试品溶液的制备；对照品溶液的制备；然后分别吸取对照品溶液及供试品溶液，分别注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，记录色谱图；以腺苷峰为参照，计算各共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积，建立起标准指纹图谱。本发明另外公开了采用上述标准指纹图谱的乌灵胶囊的鉴别方法。本发明方法简便、稳定、精密度高、重现性好，整体上更好的控制乌灵菌粉和乌灵胶囊的质量，可作为乌灵胶囊质量控制以及鉴别真伪的指标之一。文档编号G01N30/86GK101387620SQ20081006272公开日2009年3月18日申请日期2008年7月1日优先权日2008年7月1日发明者俞有强,朱方剑,罗艳萍,建陈,陈文祥申请人:浙江佐力药业股份有限公司