专利名称：：用检查母体血液的非侵入性方法发现唐氏综合症的方法和设备的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种在产前检査中发现胎儿唐氏錄a(2i三染色体)的方法.MM涉及到其它罕见询、但可检測到的染色体的三染色体如！3三染色体和iS三染色体，更具M说，本发明涉及一种通过滩量孕妇血液中人绒毛胰促性腺數素(B0CT)的游离e—亚单位的舍ft来提高检査唐氏练#中的发现率的方法.
背景技术：
唐氏综#，亦称2:t三染色化是严重精神发有迟铁的教f^的先天性原因.唐氏综^通常采用一种包括羊腆穿刺术和染色质组型的诊断方法来确定.但这种诊断方法是便入性的，会对孕妇和胎儿带来危险.羊战穿刺术和染色质组型不作为对所有孕妇进行常规检査的方法，当使用这^:入性诊断方^明*孕妇带来危险时，可以^一种戎多种检査方法代替这种ftA性方法进行渗断,唐氏综^&的发生率随母亲年龄的增加而悉速增加，以往对于唐氏综^fe的产前研究一直集中于年龄在35岁以上的孕妇，；&M^龄段，唐氏錄余匿的危险接近jftfe过用于发iyi氏练^&的诊断方法所带来的危险.因此,产前检査的标准方法一直包括以孕妇年龄为基准挑选出作羊M刺诊断的孕妇.但年龄並不絲分的检絲据.因为对5多的最可能处于危险中的孕妇、即年龄为3S岁或更大的孕妇进行羊胰穿刺和染色质组型只mm有唐氏錄WI妊嫌的20f。左右.皿由于**际临床实践中，只有大约一半的年龄在3S岁戎以上的孕妇辨條刺和染色质组齓所以在产前发现的麽絲械妊拔低于"突，19S4年，有人发现了母体血液中低的a—胎儿蛋肖(AT3)含量与胎AIP氏练^&之问的联系，例如参见"Anassociation1set;weexiicrwmaternalseru边alpbfi一f9tOproi;eizxandfetalChromosomalaDnor边aiities"，(母体血清a—胎儿蛋白的旨4与胎A^色^常之问的伴随关系)，Merkatz,Macri等^f，Am,J00》ste"bGyneo01，J48:多s6，19s4该公开内容aiat导l用被结合到本申清中，该文中记载了其它一些三染色认特别是13三*色條18三染色体，也与母体血液中AI"P舍4低有关，这些其它的染色体中的三染色体的发生率(分别为五千分之一和六千六百分之一)远低于21三染色体(唐氏绅、余fe)—般的先验患病率，但由于这些其它的染色体中的三染色#^MSATP讨低有关，因此,这些染色体的异常也可利用本文所描述的母体血液APP和H0G的游离e—亚单位和可能的其它指标的检査方案被发现，本领械的专业人员显然也可以用这里描述的用于2J(三染色体的方案用于发现23三染色体和JS三染色体.母体血液中ap:p^Hfc低与胎AJf氏錄合症有关联这一发现使我们有可能在那些唐氏錄^&发病率约为so夷的年轻的、看来似乎不悉病的家庭中釆用非ftA性的血液检3fe试验来发，氏錄4^病例.计，賴以母体血液ay:p(作为一个松4指标M狄基础的检査试验^fe胎XJP氏综^fe的产前发现率达到总病例的2O多左右.另一种检査方法包括测量母体血液中非结合的錄三酵(UE)的^JL例如参见"Maternal"biooascreeningforDownsyndromeiaearlypregnanoy"(母亲血痕检査在早期妊拔时发鄉氏錄械)，Wald等Ai1,BritishjournalOfO"bstel;riosand(KTnoooiogy(BMJ)"Volume95,April19S其公开内容逸过引用被结合到本申请中，伹对P2的測量值^检来提^小粗劣的基准.发现母体血液中HO(J含囊的提离、HCG的a—亚单位含量的提离(BCG由两个亚单位组成，以下分别称a—H0CJ和0一HP&)与胎儿唐氏錄錄之问的关雜，例如参见"AbnormalMaternalSerum。:borionieGonadotropinLevelsin!PregzianciesWithIFet&lOhroiaosoiaeAmoriaaiiUies"(胎儿染色体异常妊娠中母体lk清的绒，促歸激素付异常)，BogartPaixdian和Jones,PrenatalDiagnosis,"Vol,7,623—63Q(!987),其/^的内容敏引用被结合到本申请中，在Bogart的文章中，树了利用毋体血液中HCG和HCQ的a—亚单位合lt的提商^现大约68夷的染色体异常的胎儿.而这些结论舰赠怀孕lS—2S周6^进行研究而得到的，而且这些悉病病辨似乎是那些事先&被识别为可能患唐氏錄^fe的妇古.如Jl^f逸一^说，aiai舰母体血液中的Ho&值的检妙法通常，2bfta:c&的测,附加i(ka^^t(x—soG的測量，虽^t些检査方法确能发现)f氏综#,伹是还蘅要和希望一种发现更离百分比的胎jur氏雄余匿病例的方法.本发明A^现了先前不知道的母体血液中游离e—Hog舍量的提离与胎儿唐氏錄4&之间的关联性.还发现了先前不知道的母体血液中游离e—丑cg咱i.及a:fp舍t与胜儿廣氏錄余症之问的关联性，本发明AS发现T先前不知道的母体血液中游离P—Hog付;^体血液中未受损的HcOiH^量之比与胎JLt氏錄A昆之间的关联性，我还进一步发现了采用一种多变景判别式分析法可以提离下面所说检去方法在一选定的患病*止值下的发现率，这种方法利用母体血液中游离e—hog含i,或利用母体血液中游离的e—HC&^Affg含f;,戎二者中任fr—个的对数，戎两者的对数，特别是在孕龄也被当作一个变量加入到判别式分析法中，发现率的提离更明显，孕齡指孕妇怀胎儿的周数，发现率是指在一^fe定的悉痏率截止值下正确i^现为唐^合症病例的百分比，患病率截止值将在后面更详细地加以说明，.判别式分析法总的来i^^A知的"种多变4分析方法，涉及到用单一变量的患病率(J^li险率)估计法，究对象分为二个或更多个小组，判别式分析法有时也被描述成是一种构成独立变量线性组合的方法，即将衡量夸小组差异的问题简化成一个单变量问题，当某个问题中仅包含一个变i:时也能运用判别式分析法.关于判别式分析法的一般性讨论可见"Mark"ingResearoH"(销售研究)>CHurclUll,(J,A.，nry"n,"76,笫i5孝P.530543,该公开内容aiit引用被结舍到本申请中,我发现0体血液中游离e—hog的合量、未受损的hog含量、游离日一hcg对未受银hcg分子的比值、a:f:p含量、ue合量以及孕龄经过多变l:判别式分析法处理后与其电^r己知的产前发现唐氏综a的检査方法相比，发现胎儿唐氏综合症的百分比更高，假阳性率更低.^g;现，敏仅仅測賴体血液中游离e—sc&的^t和ATT含4,並将二者各自的对数与孕龄经过多变量判别式分浙法进行处理，仍可发现更多数目的胎JUfr氏雄棘病例.这些及其它的发现东下面对本发明的概述部^详细描述部分中将3tt分^以说明.
发明内容本发明的一个貝的是，一种与其它已知的产前检变方法相比,方法和步艰.本发明另一个目的是^一种^^定的发现率条件下比其它方法M更低假阳性率的检査胎儿唐氏综^fe的方法和步骤，本发明的一个更进一步的目的是将多变量判别式分析法运用于检査唐氏练合症的方法中,以^^儿唐氏综合症的发现率更离,假阳性率更低，本发明另一个目的是提供一种通过测4#体血液中游离戸一hcg的合i来检査胎儿唐氏综^的方法和步艰.本发明还有一个更进一步的目的:IWE:提供一种litMt^体血液中afd含量及游离e—hog的舍量来检査胎jut氏錄^的方法和步骤，本发明的其它目的和优点掩在下面对本发明的描述中变得显而易见.为了达到上述目的，按照本发明，孕妇(以下称病人)的母体血清中游离e—且o(J的^i釆用常规的:^学方法测:fci^法包括免疫测定法,如上述文章中提到的那些方法以及，械内己知的其它方法.然后，将游离e—HoG的合量与一组基准数插进行比较以确定，人怀有悉唐氏综^胎儿的患病率.为了提离发现率，将游离P—hoG的^t^孕龄与一组基准数据比较，为进一步提离发现率,絲紫规的免絲;^,包括上述论文中提到的在^t领域中么^称^;m,Mt病人母体血液中游宵的e—且。g和ayg(以下称"指标，，然后絲项指树与一絲准数据比私以膽翻人怀有絲沃錄^Ji儿的危险率.賴多变量判別式分析法将这些指树与一絲准数辦比较.更详细地t:JUt^用^W斯定律，糊人先验的危除率以及敏将絲人每項指标的定景数值的对数^X到利^多变量判别式分析法展开的标准数插的概率密度函数中而确定出来未患病和患病妊娠的相对发生率来计算出每^人兵体的危险率.若该病人怀有唐氏錄^&胎儿的危险丰大i^定的危险率截止值，则应劝说谅滴人作进一步的诊断试验,以便确iiEA否悉有唐氏錄合症.除了母体血液中游离e—Hog和app合豕外，加入孕龄作为一个指标将M—步提高发现率.由^*#*^母体血液》^离p—ho(j含量和app讨趋于按对数一离斯僻曲线^，因此，逸过将病人各项指标定量值的对数和孕龄fiA用多变量判别式分析法展开的基准数据的概率密度函数中能达到条离发现率.本发明的方法和步稞的优点之一氣&与其它&知的方*步驟相比，可以准确预测胎JUt氏錄被病例的百辨更离，假阳性率更低.本发明的其它一些优点在下面更详细的描述和实例中将^u^it楚，附困说明田l是例2中提到的一M格，表示了(2三染色体)M指标的有欢汰.田2是例2中提到的一^Ht格，表示了;^指标的唐氏综^的检査效率.田3'是例2中提到的一*格，表示了组合指标的唐氏錄合症的检査欢丰，田4是树2中提到的一^格，表示了^悉病妊娠中离于錄爽的游离hocj的e—亚单位分市的百^*的唐沃錄^&痨例^*田-是例2中提到的一个表格，表示各个指标的唐氏练余fe率，田《是例2中提到的一4^格,表示在不同的孕龄范围内，以as^询对数和游离的e—b0g亚单位的对数作为一个组合指标时的唐氏练^fe的检査效率.田7是例2中提到的一/|^格，表示预计的在美国各地由游离的曰一HCO和母亲年龄得出的唐氏综合症检出率，田豕,在例2中被提到,表示了在22三染色体病例中，游离e—h0g亚单位相对于未患病好錄的各种百分比会景.田9,在例2中被提到，表示了游离e—hog亚单位含4的分布，田20是例3中提到的一个表格，表示由一些指标的各种组合得到的唐氏综合&的检出率，困J!表示本发明的用于执行检査麿氏錄M^所使用的设备,田J2和13表^t算用于确定一^人怀有患病胎儿的危险率有关的基准参数的计^l^流程田田！4表示利用田J2和13所示程序中计算出的基准参数^，人怀有患瘸胎儿的危险率的计算机程序浙良田.具体实施方式在本发明的一个实施方案中，从病人获1Wr体血样，然后采用常规的分析方法，如本领械内公知的免疫学方法，测出母体血液中游离p—狂ca的^t,然后，将该值与一组基准数据比较以确定该病人妙处于怀有患唐絲^i儿的危除中.为了提离发现来将孕幹及母体血液中游离e—b0^辨^t值与一^i数樣进行比乾以确定，A^否怀有悉唐氏錄^胎儿，尽營如闳本领械专业人员显见的那样，在本发明中运用^rs^的分析方法測狄体中游离e—BoG的讨都行,狄用预离P—HC(J的分析方法必须与产生游离e—HOG基准数据的方法是—样的，如呆用了一种新的分析方法測量游离e—Hc0,则必须产生一组以^法形成的数据为基铀的新的基准数裙，辦理解，在形成对Hoo的n特异的单充隆体的过程中，一些抗体对该蛋白质将^AM的，而另一些对与抗体wt关联的裙将是特异的.在本发明的说明^中提到的e—HCG合囊的测量值包含了雌离HOG朋不论耿说蛋白质特异的、缺雌离3—G上^部位戎其它任何部位有关联的聘^的抗体，对于本领域中的专业人员来说，不难理^虽然游离的a—hog亚单位被单独—基因编码，^t游离的e—hcg则被至少七^#常相似的基因成伪基因的复合族,，例如参见"Bu边anOliorionicgonadotropin"beta—suUunil;isencodedal;leasteightganesarrangedintande迈andinvertedpairs，'Boorstein,"VamvalcopOules,&Eidldes,MatureVol300,!9S2年t2月2日，其中的教导iiat引用被结合到本申请中.a知七个游离e—Ho(j基因中仅有三棉游离P—HCG购正常胎盎形成过程中絲达，例如參见"iFraginejatationofth一Bata一Su"bua丄"tof.]iu边anChorionicGcmadotiropixiproducedOlxrorio.Qarcino边a，,,Uislii边ura,Ids.,ui;svino边iyay,Yuki,andMochizMki}Endocrinology,■voi.j23,no.i，19多s，其中的教导aiat引用被结舍到本申请中.这三个同样的基因是否在疾病状态1Si如悉有胎儿唐沃錄械时絲达一直没有肯定的答案，因此,有可能合成出在絲酸排列顺序上或其t;lrw有镦小ll别的多种形式的游离e—Hc还有可能在唐氏錄#辨例中,-^或多个游离卩一且0d的碁因^fc^，因此，产生游离e—Hca的一个独特的变种或多个变异种.根据本发明，如果这些变异种存在的话，那么它们可iai常规的滩量游离e一hpg的免疫学方法被測景出来，如果能有一种掷f:与唐氏综^fe有关的特定的游离e—Hod变异种的溯定法，可以更进一步提离发现率，事实上我们己有效地鄉了单克隆抗体測餘鹏HO(J游离的p—亚单位以区分悉21三染色体妊姨和未患病的好拔，2i三染色体的发现率离达S3多.如本领域专jt人员都知道的那样，利用抗体*^量说明特定的分析对象会浮到与一个有区别伹又相似物质的交又活性的程度.所以患病和未悉病病例之间的差别可IMt由于存在不同形式的HOG的游离e亚单皿致，这些亚单位由于与所利用的抗M某种程度的^X活性而被检测出来，如果游离e—HOG亚单位的这种异常形式拔鉴别出来，则它将被定为一种新的生物化学物质.实际±科学文献中的资料表明，已经识别出p—BCG的这种异常形式(例如参见H"himUTa等箸的絲)患2i三染色体的病例也会以游离e—Hoi亚单位的异常形式为特征.如果2Jt三染色体是以游离e—HOG的异常形幼特征的话，则^^械专ibU将能够发展出赠絲常形式特异的抗体，这样可以使唐氏錄^&的发现率进一步提离，基准数振反映了怀有患康氏錄舍慰Mi孕妇血液中游离P—E0(J的舍量(也称"患病的")和/戎反映怀有正常胎儿孕妇体内血液中游离e—HCG的舍4(也称w未患病的")；^本领域专鼓员来礼不难理解，用于检査胎JU8P氏錄械的方法;^A敏比较作出决策的过程，xt^任何决策过程，需要有以悉有此病或我们所关心的条件的病人和/成不患此病戎我们所关々条件的病人为基准的基准参数，本发明中，基准11*母体血波中被浏指标的合囊，如怀有患唐^錄^&胎儿的孕妇和怀有正常胎儿孕妇的游脔e—Ec(i，通过集中大量样本的基准值而建立一组基准数据，对本领域专业人员来说，显然i组基准数^可通过増加基准值样本的数量进一步改番.为了确定病A^否处在怀有患唐氏錄f症胎儿的危险中，必须建立一个截止值，对本领械专业人员来说，显然*建立一个确定病人是否怀有患J3三染色体或J[S三染色，儿的截止值在辨识2i=染色体病例中也M有效的，这一截止值可由实验宜、医生J^于每个病人的病例而建立，截止值也可以以几个判别标准为基袖，包括需要继续作进一iHIA性诊il^验的妇女的数自，所有作进一步的ftA性储试验的妇女財唐氏錄錄胎儿的平均危险4k和做一伟女^#定的患病危险率大于一个:*#的危险率值如1/400耽虫当继续作进一步的侵入性诊断试验戎本领域专生人员己知的其它判别#>|的决策.截止值能够1^±—些方法*±^包括，百分数，平均正负标准傭差，中问值的倍数,病A^体的患病危险丰戎那些，械专业人员&知的其它方法.在#明的另"H^可以发现更多数貝胎JUtft^^的实施:^中，从病人体内取出母体血液样^然后，敏常规的分析法，如*领域公知的i^il^法测出母体血液中未受损的HoG分子、游离的e—hcg、ue和ap:f(以下称"指标")的含ft，尽管如本顿械专氛人员显见的那样，在本发明中^^￡知的分析方法来测*母体血液中上述指标的含量都行，但用于每项指标的分析方法与形成该特定指标的基准数据的方法必须是相同的，如果对某一指标采用一种新的分析方法，则必须产生一组以该方法产生的数据为基敏的基准数据，然后、采用贝叶斯定律、麟人的先验危险率及通过将病人每项指标(未受损的ecg^、游离e—Hc(j,ue和ap:p)的定量值和游离e—HCG对未受损EOG分f^量的比值以及病人的孕危险率.多变量判别式分析法可以在巿场上有的计算机程序统计软#&"统计分析系统"(由sas研究所公司生产和销售)上计算，J^f-用其它多变虽统计分析法或本领域专iliA员公知的其它统计软件包计算.概率密度函数为把病人每项指标值与基准參数比较提供了一个方法.虽然，如本领域专业人员显然了解的那样，也可以类似地使用其它概率密度函化下面具体指出了一种型式的概率密度函^並能充^k^I于本发明中.用于唐氏综合症危险率的公式是(J力IOO")孤P〔一,5QCa-ite)T0OV-i(Xa-Ma)〕*先魏论*〔(i//1。oVI):ex:p(-，5(xa-Ma)icoV-i(xa,)〗*先验危险率+(。。V|)EXP(—，5(Xu-Mu)TOO"(Xu-Mu))*(卜先败危险率)〕(1)'下标"a"表示悉辨的痨例下标"u"表示未患病的病例(X—M)表示一个向it其中每个元棄是每个变景减去变:t平均值的值.OOV-i是该棋型中所有变景的患病和来悉病病例的联德方差矩阵的逆.(X—M)T是向量(x一M)的转i,表示指数函数.1OO"Vi表示该汰型中作为基准数据的所有变量的协方差矩阵的行列式.本领域专JiA员显妙道，患病妊娠和未患病^S各自的协方差矩阵可以代替联合协方差矩阵，用于悤唐氏錄^fe危险丰的公式就成为，_(J//1。0"a)XEX:P(-5(Xa-Ma)T(30H(Xa-Ma))先验危险率_(:》〔"Z/|0O*V|a)箭EXP(-5(Xa-Ma)TO0Va-1(Xa-Ma))*^验危险丰十(i//lOOV|u)*EXP(—，5(Xu—Mu)TO0(Xu-Mu))吖卜先验危险率)〕IgovI表示该鄉中作为基准參数的所有变量的协方差矩阵的行列式.为进行判别式分msL,M—^^挑逸的研究对束中作出一个可能患唐氏综合症的先验概率的假设.ifefe验概率一般约为J/sooJ为了实行多变Jt判别式分析法,还要作一个关于什么样的危险率截止值能够构成一个阳性试验结果的决策.例如，如果希望一个怀有患有康氏综合慰合儿的概率等于或大于^/40O的孕妇进行进一步的诊断试验，则当多变4分析的结;^以孕妇怀有患唐氏综舍症胎儿,率等于狄于J/4oo时，该孕妇被iU&具有一个阳性微结果，如果得出阳性试验结泉应劝说病人作^r"步的诊断试睡以确^l:否患有唐氏练合症，參照图U至l4,围中显示了用iHt算基准数据和兵体的危险率的设备及计算机程序的流程困，如田u所示，为建立基准数据,在患病和未應病妊娥的病例中,采用常M^r法确定出孕齡GA,Ayp^t和游商e—HoG的^Ht.为提高可靠性选择了大4样本.用于建i^准数据的测4值被示意地用io表示.一旦经由适当的输入装置25tA后由处理单元20计算出基准参数22,作为某^人具体的危险率2S可以根据该病人被测出的具体的指标数值(用30表示)计算出来，图12和J3表示确定基准数据的程序摆困，田J4表示计算具体的危险率的程序框图，现参照图i2和！3,在第一个循环J00中，程序从一个参照组读入识别参数工o,孕龄ga,ap:p和游离e—Ho(j的定量值及一个妊i^l否悉2J三染色体的代码，见步取:r02,在流程困中，如步骤i04所示，孕龄GA用变量Xt表示，AP:P的对彩邻X，表示，游离P"^BCG的对数用X，表示，然后,在Xi,X,和X,錄据的基铀上确定戎计算出和矩阵及和一积矩阵，见步狭106用来对参照组中患病和未患病病例计数的变景Hco^然后增加1,一旦循环结束，如由流程幾l1O所示，alat如参;标号lJ2所示的由Jtl、J、K所定义的一系列循环计算祖平均值，在这些循环中，运用循环J0O定义的和矩阵和在循环i00中计算8i辨和一积矩阵计算出协方差矩阵，这些循环结束后，要对是否将患病和未患病病例的协方差矩阵组合起来作出选择.这种选择在步稞1i4,2i(i和i1S中被输入.如果选择组合，则协方差矩阵就被组舍成一个由步稞220给出的联错方差矩阵，如步猓i22所示，该联合协方差矩,^,得到逆联合协方差矩阵IPCM，该逆联^方差矩阵被存入文件中，並在步驟224和J26中被打印出来，如^4择不组合，则在步骤123和i2S中对:1^协方差矩阵的#^个取逆，且将平均值和逆协方差矩阵存入文件並在步稞i25和227中打印出来，这些,包括用刊算特定个人怀有患病胎儿危险率的基准参数.参见田J4,通过执行田J2和i3所示程序计算出来的基准参数在步称230中被读入，基准參数包括平均值和逆^^协方差矩阵,在步騍！32仏具体的病例鄉，包括病人识别标记，孕龄GA,APP和游离e—H0在步狭J34中更准确地计算孕龄，在步驟"6中计算孕妇的年龄，在！3S中，在孕妇##和发生率參数的基袖上确定先验危险率，在下面讨论的实例中，这一计算结果为J/S00,是一个典型的数值，在140中，确定该先睡危险率与怀有患病胎儿(ABT)的相对頻率的乘积,即上述等式(1)、(2)的分子.在J42中，计算出怀有患病胎儿的相对頻率与(Jt一皿危险丰)的乘积(H),即上述等式(J),(2)分母中辨笫二个因子.在l44中，利用贝叶斯定律确定具体的危险率，即abii-a:bt/(abt+ut)(勢式(i),(2))在！46中,打印出结朱即打印出病人特定的危险率ABH和病人识别号，对于本领域专JkA员，易然还可以釆用不阀于线性判别式分析法的其它统计学成数学方法来计算基准參数，根据錄明一^&的实施方案，从病人获得母体血液样本然后采用常规的分析方法、包括本领域公知的免疫学方法来测**体血液中游离e—hoG及Ayp(下面称"指标")的含J:,尽管如本领域专业人员公知的那样，在本发明中用^r公知的分析方法测:l^体血液中上述指标的合景都行，但用于每项指标的分析方法必须与形成各指絲准参数的方缺一样的.如果对某一指标絲一种新的分析方法，则必须在用该方法形成的数据基础上产生出一组新的基准参数，然后,运用贝叶斯定律，病人先验的危险卑、及通过将病人每项指标的定量值和孕龄"起代入用多变Jk判别式展开的基准数振的;IW密度审数中而得到的悤辨和未患病坛娠的相对发生率来计算怀有悉唐氏综^S膽儿的危险率.为进一步提离发现率,将病人游离e—hcg和ar:p定i值的对数值和孕龄一起代入用多变囊判别式屉开的基准参数的概率密度函数中，多变景判别式員法可以在巿场上有的计算机程序统计软件包"统计分祈系统"(由sas研究所公司生产和销,)上运算，成自本领域专业A^公知的其它多变dt统计分析方法絲它统计软他.为^行判別式M^见,先在通常未^ii择的^对象中对悉有唐氏雄合症的先验概率作出一个僻％^9:来l该先验概举近似为!/soo,为了进行多变量判别式分析法，还要作出什么样的危险率Hih值构成阳性试验结采的决策.例机希望一传有患唐氏錄舍症胎儿概率等f駄于！/4oo的孕妇作进一步糊试私则当多变量分析的结果农明一个孕妇怀有患唐氏錄舍^l会儿购概率等于^c于i/4oo时，该孕妇被认为具有一个阳性试验结果，若显示出阳性试验结呆,应劝说该病人作进一步的诊断试验以确iiEA否患有唐氏综缘对于本领域专iL人员^说，显然，在上面^的所有实M案中,验危险丰，将会改变对每个瘸人作判别式#的结果，本发明不储限于上敏駄案，还包括所何能的实施方案以及在下面例子中所公开的M指标的组合，例？来用4oo以上病例样本研究胎儿唐氏錄舍症与母体血浓中游离e—H0g含囊以及母体血清中ajp讨(msajp)、ue和未受损hog之间的M,这些样本包括25例从￡知怀有悉唐氏综合飾儿的孕妇体内得到的样拟与患病病例对照的对照样木对每个血液样^ap:p、未受损hcg^^、游离e—hog及ue(以下称"指标")的含量值由下列m方法测定，指标aa^法"^^:p雜接的絲吸附鹏法(2lisa)口e放射免疫測定法未受祸hog小珠型elisa游离卜加3EI4SA每项指标的值成为在巿场上有的计算机软件统计软件包的统计分析系统(sas研究所公司)上进行速级判别g和线性判别式处理中的一个变量，用于建立一组基准数据.游离e—BCO与未受损HCG分子之比湖人的孕龄也被班作变妙入.^t判别处理餘所有变量能妙Alj线性判别式处理中.然后射3对每个变量及各变量的不同组M行线性判别式处理，这些判别式分析法的结果归纳在下表中.'爽敏^E指测，果显示阳性的胎JUSP氏综a病例的百分比，假阳性率指测试结果为阳性的正常胎儿的百分比.变量灵敏度假阳性率msap:p",.4秀4,.2秀",>4《>8秀未受损hog37多s,.6%msa:p:p,ue未受损hog50..o多7,,2多游离e—hcg+未受损ho(j60.0多s,,5%复舍w/0,比值76多5,>3%复合w/0ue76突5,,3%复合￡0多4,,3多复合w^/0游离e—ecg60.,o劣5,*未受损那3对数+(游离e—hog对数+未受執eo(j)68多7.,"箭未受损hc&对数、鄉厶1^对数+(游离3—hc(j对数+未炎损即g)多7,.4秀复—,msa2"P+游离p—BOO+未受裉Hco十UE十比值每项变量中都包括孕餘，对本领域专jbU来说，显然，改变确定阳性的危险率ltiHt戎对研究对象不闳小组采用不闳的先验危险率将会改变对某病AJ^做的判别式处理的结呆，例2用5S0例以上的病人样本来研究胎A^氏錄合症与母体血液中游离P—HO&舍豫之问的关系，首先对29例a知怀有麽溏氏錄舍症胎儿的孕妇获得的血液样本以及用于对照孕龄(周数相周)、母亲年龄(相差3年以内)和冷冻贮存时间(相差在一个月之内)的S2O例未患病的样本进行分析，所有样本都取自于未患搶尿病的怀单胎的白人孕妇.为了^[^tt检出丰中有一定倾向的固定侮蹇，采用了有效组的概念.有效M是一组独立于基准数据的数据.有效组中由病人得到的结果不用于建立基准数旅而是用来与基准数振比较以确定检出率,这另一个有效组包括26个附加的被确^2I三染色体的病例(总共55个祸例)和随机选取的由J59个对照样;j^的组，对照样5MS似地也取自未患糖尿病的怀单胎的白人孕妇，所有的研究包括;^体血欢中下列M标值的七个不闳的测定方法的43SS个判定，指标測定方法MSA!ffP^接免疫吸附^法(配SA)未受损HCGEIiISA未受辨HOG+游离e—加GEilSA游离e—HOG;tolt免疫^法(R工A)游爽a—加GR工AUE二种方法,聘免疫3^法和R工A每项指标值均成为在市场上可得到的计算机软件统计软件包￥统计分祈系统"(SAS研究所公司)J^行皿判别处理和线性判别式处理中的一^量，以^t一M准数据，病人的孕龄敏当伴变量加入，然后分别对每个单独的变Jt和各变;t不闳的组钱"线性判别式处理.以1/3(5S为患唐氏综^fe危险率的截止值将病乂分为患病或未患病病例，把划为患病的未患病病例考虑是假阳性率，每个病人患唐氏錄合症的危险率来用贝叶斯定朱患病和未患病病例的多变量JE^概率密度函数以及通常以i/S0O作为先验危险率来计算.联合协方差矩l^于每个概率密度函数.有关初始研究组的结呆显示在田l至3的表i3中，田S至7的表5—7是根据对有效组中瘸人的分类得到的结呆，.田4所示的表4、田8和田9是根据初始研究组和所有悉病病例得出的.由測^T^到的结果被分析，以确定悉痏和未患病病例之间各项指标值之问是否存在明显的差异.表！(田)表示患病病例与未患病病例之问除U3!外的所有指标都表现出明显的差别，此外，确定了各项指标的假阳性率和发现率，见表2(田2)3ftit拥量未受损20G及游离p—HO&亚单位的EOG測定法得到最离的发现率，可以^t将^^单独的指标组合成复舍指标^^一^提离发现率,其中一种复^fe括浏量未受祸笠cG分子和游离e—Boo亚单位的sc(j皿法，它在表3(田3)所示的复合中产生条高的发现丰.单独对Hoa的e和a亚单位的评估表明a—亚单位在患病和未患病病例之岡没有明显差异(0,23)而e—亚单位在患辨病例中有明显增加(P-o,aoi)正如本领械专JiA员所^的,概率:piiat表明一^Ht观察到的结果以至少这样的极大值的可能性是偶然发生的来銜童科学研究中证据的强弱，P值越小，.说明观^是偶然出现的证据越强，图S表示10多、50多和90贫游离9随孕龄的曲线.发现在未患病妊錄中，随着孕龄増加有连续下降的趋势，对胎儿唐氏錄械病例中游离e—HCG讨的分糊示了S(J《下降到未患病病人购平均值之上，悉病和未患病病例中游离e—hca的^t都遵循对数高斯^(P-O7S'和oS6).田9画出了这种分布，表S(田S)给出了单独依靠游离e—狂0G亚单位和游离a—H0(J亚单位的发^率数据，表S中显示了游离P—H0G有离的发现率.用AIPP和游离e—BOo的组^行分析可得到更离的发现率,通过将游离3—E0O的对数和MSAPP的对数结合到上述软件包"统计分析系统"(SAS研究所公司)的线性判别式处理中，可得到如表6(田6)所示的更优越的发现丰.与其对数相反，用游离e—hcg合囊和ai^合量也可得到高的发现丰，对数据的进一步分折表明APP和游离3—HC(M(P与年龄无关(T-oS394和1>=052JT4,对四个不两年餘组的AJ!P和游离p—E0G^!l作Krusl5争l一Wallis试验(年龄e30,3J35，3640和40)),此外,游离P—亚单位合量和AP舍Jl的相关系数(r)与零没有显華差别(未悉病和患病病例^'J为r-o(M，E-0，39,r--0.o6,P-0.81),在我们的数据中，发现的基*#果肯定了这#^+事实，即游离的e—亚单位絲氏錄合症的发现率达到最高有帮助，实际上采用只測量游离e—BCG的g法所产生的发现率和假阳性率分别为654多和5。2多.这些比率与其它人利用三种3H^法的组合的报导相差不大，因此，如前面指出过的那样，^^数目是本发明我们关于游离e—HOG作用的发皿据如下，(a)单独看对唐氏錄a发现率贡献条大的是游离e—H00测定法,(Id)对未损H0CJ分子的g得到更低的发现率,(c)渊量未受损H0&分子与游离e—HCG组合的滩定法得到一个比只测:t未受损HCG分子測定法更高的发现率，已经证实，胎録氏练舍症的患病率随母將龄而増加，因此，如前所逸为了用本发明在临床应用中得到病人兵体的患病危险率，.将随母#^龄而异的先验危险率代入到多变量判别式分析处理中.由于ATP^商e—狂0(J的^t均与"f^年齡无关，因此，我们对我们的数据作了分析,以找出有多少未悉病和悤病的妇女在对每^同的年龄给定一个先验危险率做下具有阳性的鍤果.J^值應根据美頃^Ht活耍孕妇年龄M为基础、来甜在类国进行广泛的全国性普査中的很阳性举和爽敏度，如表7(田7)所示，这种^^表明有可能达到*0秀的发现率和S55的假阳性率.对例2所描述的样本作进一步分祈以发现各指标的其它组合的发现率.3U体地说，以周样的危险*止值和先验的危险率对各指标的不两组合(指标中值的倍数及储标的对私幼入餅加入辦下)进行例2的线性判别式处理，利用基准数据和有效数M行线性判别式m结果归纳于田JO的表S中.例3下例说明游离e—HCG的一步测定法和二步测定法的准备工作以及它们在本发明方法中的应用.游离e—HCG—步测定法的准备工作1.在兵有96井的傲滴定平皿丄覆蒹一层对人绒毛胰促性腺激素(HCG)分子的游离e亚卑位特异的"捕获"抗体，抗体可以是单充隆成多克隆抗体，用来平皿的抗体浓5^每错0,S敝,但如需要，也可以不同.平皿在4tl下培养至少26小时，2.用含O0S多吐温2O的EH72的磷酸盐鍵冲液冲洗平皿，也可用其它合适的清洗铁冲液，然后用含355棘动物蛋白和0，0S秀吐温2O的PH72的璘酸盐欲冲液将平皿"阻隔，，也可使用本领械专业人员所熟悉的其它溶液，如"的牛血清蛋白溶欢.将300辦的EM溶妙到每^中，让平皿在盥温下培养J小时，也可用另外的阻隔方法，如"涂釉法".3.然后如前所述地清洗平皿，将Jt00^含有，脔e—H0(J亚卑特异时生物素化的抗体湖试粳冲欢加到每^M所用的测试鍵冲^ft舍有3豸;^动物蛋白和合有o05秀吐温20的PH72的磷l^疑冲礼但也可用本领域专业人员公知的任何一些合适的溶液.抗体根据操作者的吝欢可以是单充隆、也可以是多克隆的，可以是与一JW^t氣化物聘或碱性裤酸im样的生物素外的一种物质结合了的抗体.测试疑冲液中抗体的浓度被辨整到达到条佳吸收率.4.取20慨的样品本加入每錯中，样本可以是，测试铁冲艰，作为证实测试性能的空白，一种用于标准化未知样品值的游离一HCO溶液，成由怀孕到中期三个月的孕妇体内取出的血清样本.将平皿涡旋30秒钟,然后放在P为200转/分的旋转器上，在室温下培养30分钟，S然后如前所述地清洗平爲将合有结合了,过氣化物海的链球窗触物素蛋白的i00辦測试疑冲助入4H^中，如;^f用的第二种抗体与除生物素以外的一种物质结合的，则不蘅这一步驟,測试缓冲液中的链球苗抗生物素蛋自"^氣化物诲的浓jyHHi^2O傲充，将平加在室温下放置在P为200转/分的旋转器上5规6.如前所述地清洗平皿，将一种l00傲升的邻一次^^质溶紗入每错中，这种基质溶液也可用本领械内专鼓员/^的一些适,当赘染剂中的任一种代替，並取决于与笫二种抗体结合的物质是什么.然后将平皿放在P:为200转/分的旋转器±在室温下置于暗处培养87.然后，将J00*的稀琉酸(iOU)加入每^中以中止该基质的反应.S在492n边下afct分光光度^^定每^的吸收率，P—ECO的二步測定法的准备工作!在^9<s井的,定平Ji上承盡一屡对AM4M促性m柰(hca)分子的游商e—亚单位特异的""抗体，抗体玩可以是单克隆的，也可以是多充隆的，用于復盡平皿的抗体密1:#*0,*傲克，伹如需要，也可不同.平皿在4t下至少培养i6小时.2.用合O0S夷吐湿20的PH72的璘酸盐鍵冲浓清洗平皿，也可用其它适当的清洗疑冲液.然后，用含3多水解动物蛋白和00S秀吐溫20的SH7,2的磷魁欲冲液将平JE"阻隔"，也可使用本领域抆术人员所M的其它溶私如i多的牛血清蛋白溶液，将30O做的阻橘溶絲到每个井中，让平皿在室温下培养J小时，也可用其它阻隔方法，如"涂釉法"..3.然后，如前所舰清洗平皿，#-种！OO射的测试缓冲^&P入每^中，所用的测试鍵冲^A含3夷水解动物蛋白和00SS吐温2O的PH7,2的礴酸盐绂冲私也可用本领域专JlA员所^^的一些合il^液中的任河一种.4然后将2O做样胁入每错中.样本可以是，作为证实测试性能的空白的测试铁冲私一种用于标准化未知样本值的游离P一EOG溶私^^怀孕到中期三个月的妇女体内取出的血清样本，将平皿涡旋3O秒钟，然后放在P,为200转/分的拔转器上在室温下培养3O分钟，s然后，如前所述地清洗平皿，将iooM含有;W离e—HC3CJ亚单位特异的生物素化辨抗体的测试疑冲^p入4H井中，根据操作者的軎5fc抗体可以是单充隆的戎多克隆的，也可1^与^IP辣W:氣化物^械性裤酸WHt样的生物柰外的物质结合了的一，调节抗体的浓Jt以达到最佳吸收丰，将平皿祸旋3O秒钟,然后放在P为多00转/分的旋转眷上在室湿下堆养306然后如前所^清洗平皿，将l(0^含有结舍了辣:jR5t氣化物聘的鄉审^^物棄蛋白的测试疑冲^P入到4H^中，如果所用的第二种抗#^除生物素以外的一种物质结合了的，则不糖逸一步骤，测试疑冲液中^MTM物素蛋白"Ht氣微聘職妙顿升20傲克，将平加在盡温下置于P,为200转/分的旋转器上S分钟，7.然盾如前所述地清洗平皿，将200#^的一种邻一次^1氛基质溶#入每斗井中，这种基质溶液也可以用本领域内的技术人员么N知的一些适当染剤中的^T一种代替，並微于与笫二种抗体相结合的物质，然后将乎皿放在P为200转/分的旋转器上.在室湿下置于暗^t养Si^.s然后，将i00微升的稀统酸(2,ou〉加入每个井中以中止M质的反应.9.在492n迈下敏^:光度测量絲定每/^的吸收率，这两种鹏法用来执行本发明的方法.用了H8例病人样本来研究胎儿康氏錄余虔与母体ik液中游离e—HOa含量之间的关系.对从己知怀有患唐^余fe胎儿的孕妇体内取将的26^##1S2例3知的、未患病样本进行了分析.所有样本均取自怀单胎的未患糖尿病的白人孕妇.然后,我们用MISA测定法贿病人样本以得到MSAPP的定Jt仏鮮独地用一步舰法和二步敝法得出游离P—HOG的合*由絲渊定;SNI到的MSA^值和游离e—Eo(j值成为在巿场上可得到钧计算**件统计栽件包"统计分祈系统"上进行的线性判别式处理中的一^景以建立一组基准数据.病人的孕餘也作为一个<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>注，所有分析均包括孕龄，*在后面带*的分析中，另外两组样本值为260和3J6的结果^*一1*^步法处理,一2表示二步法处理.发现率指显示阳性測试结果的舶儿麿氏錄合症的百分丰.假阳性丰指显示阳性滩试结果的正常胎儿的百分fc.对照指H^析的未患辨样本的数苜指被分析的患瘸样本的数貝,一切怀孕周怀孕i4至i6周孕妇利用游离e的一步旨法和ay:p的组舍可得到最离的发现丰和最低的假阳性率，我们的结果进一步支持了在孕妇血清检査方案中以可行而有效的方M行唐氏錄^fe检査的良好效能，该良好效能包括，(a)4缺入性方法，(》)低假阳性#离发现率,(0)飾^賴立的指标,(a)对血样无脊刻限制(一夭的什么时侯,进食愤礼个人习惯等)及(e)与其^前检査方法的相容性.我们的结果表明，虽然^比其它方法5^的生物化学分析法，在唐氏综合症的检査中有可能得到更离的发现率，在唐氏综会虔检査中，仅仅使用最有效的指标就能对绝大部分悉严重精神发育迟疑的最4HA原因的im在早期妊娠中提供非侵入性检査催患.对于本领械的专JiA员来说，显然，改变判断阳性结果的危险率截止值，或对研究对象的不同小组采用不词的先^A险率，将改变对病人进行判别式处理的结呆，因此，应当明确，本发明包括了所有落在下列扭利要求书范围之内的改进.特别地，本发明涉及如下实施方案J.一种确定孕妇是否处在怀有患唐氏錄合慰会儿明显危险中的方法,包括，测Jfc孕妇母体血液中A^^t促性膽激素的游离P亚单位的^t,的孕龄代入一个概率密度函数中，由此将所说的孕妇的所说游离曰亚单位合量和所说的孕妇孕龄与一组基准数据比私以确定所说孕妇怀有患唐氏錄合^台儿的危险率.2—种确定孕妇是否处于怀有患唐氏综合^J3乡儿明显危险中的方法，包fe,舰孕妇母体血浓中A^锁促性腺激素的游离e亚单位，测定结絲胎x^氏综械危险率增加的征兆.3-如实施方案2所述的方法，其中还包括，皿孕妇血液中的a—胎儿蛋白，人绒4M促歸激素中游离e亚单d—胎儿蛋白的测4结果^JiA^氏錄合症危险丰增加的征兆.4一种确定孕妇是否触怀有患唐氏錄合魁会，儿明显危险中的方法,包括，測:i孕妇母体血液中A^锁促性im素中游离e亚单位的合Jt,並将该测量值与一组标准数揭比较以确定孕妇tPfr患唐氏综合症胎儿的危险率.5.—种确定孕妇是否处于怀有Af氏錄合慰&儿明显危险中的方法，包括，用^A绒顿促性腺激素中游离e亚单位的鹏法测4孕妇母体血液中一种被分祈物的含量，並将对该被分析物的测量结果与一组基准数据比较以确定孕妇怀有患唐氏錄^&胎儿的危险率.6.如实施方案4或5所述的方法，其中还包括，测量孕妇母体血液中o:"胎儿蛋白^l:,並将这一5Wt结;IM^孕妇的孕龄与一组基准数据比^7*如实施方案4、5戎6所述的方法，其中比较步取包括将测4结果fiA到由线性判別式^i的由一组基准数振产生的一个概卒密度函数中.S.如实施方案4、S、6或7所述的方法，其中比#骤包括将浏囊结果的对数与一组基准数据比较，9.一个用于执行实施方案J至S中任一个用于确定柳是否处于怀有患唐氏综合^WUft^法的測^法，，用于测试孕妇血液中A^4^促性腺激素中游脔e亚单位的手段.io，一种测量人体血液中入绒4iJi促性腺激素的游离e亚单位含*的测定法.ii一种设备,包括，^于接收孕妇母体血液中戏顿促性腺激柰的游离e亚单位含量的测试结果的装置和用于将拥试结果与一组标准数据进行比较以确^Ji儿染色体异常的计算机装置.J2如实施方案li所述的设备，其中的胎儿染色##常是指唐氏综^&，用来确定孕妇是否处在怀有患唐氏錄^Ji儿明显危险中的设备，包括适用于接收孕妇母体血液中A^毛艇促性腺激素的游离P亚单位舍1的测试结;^装置，及计算M置,用来计算一组基准数据，和的孕妇的孕龄^A—个瓶丰密度函数中，由此将所说孕妇的游离e—亚单扭值和所说孕妇的孕龄与一组基准数据比较以确^f说孕妇怀有患唐氏錄令^&儿的危除率，JT4、用来^孕妇是否处在怀有患唐氏综^fe胎儿明显危险的设条,包括，适用于接收用一种人鍵毛廣促性燫激素的游离e亚单位测定^#到的孕妇母体血液中某一被分祈物询渊:t值的對t,及计算机装置，用来计算一组基准数据^用于将所说的被分析物食囊的鹏值和所说孕妇的孕龄代入一个概率密度函数中，由此将所说孕妇的游离p亚单位的含景和所说孕妇的孕龄与一組碁准数据比私以确定孕妇怀有患唐氏综a胎儿的危险率.J5如实施方案J3或Jt4所述的设备，其中敏括，适用于接收孕妇母体血液中a—胎儿蛋白合量的测i偟的装置，及其中的计算^S还将a—胎儿蛋白的测试结果代入该概率密度闼数中，由此将该孕妇的ct一胎儿蛋白值与一组标准数据相比钇2"如实施方案i3、J4成lS所说的设备，其中M基准数据是由4^4测量值的对数计算得到的，及这些測*结果的对^于将孕妇^#标的含囊与该组基准数振比较.权利要求1.一种检测体液的方法，包括如下步骤提供特定地针对人绒毛膜促性腺激素的游离β亚单位的测定法；从孕妇得到母体血液样品；和测定所述孕妇血液的人绒毛膜促性腺激素的游离β亚单位，以便测量所述母体血液中人绒毛膜促性腺激素的游离β亚单位含量。2.—种获得孕妇生理参数的方法，包括如下步骤提供特定地针对人绒毛膜促性腺激素的游离P亚单位的测定法；从孕妇得到母体血液样品；和用所述的测定法来测定所述孕妇血液，以确定人绒毛膜促性腺激素的游离P亚单位含量。3.权利要求2的方法，进一步包括测定所述孕妇血液的a-胎儿蛋白的步骤。4.可用于评价孕妇是否应该接受唐氏综合症诊断试验的筛选方法，包4舌从孕妇取出母体血液；测量所述孕妇的母体血液中人绒毛膜促性腺激素的游离P亚单位含量；和将所述人绒毛膜促性腺激素的游离P亚单位含量的测量值与一组基准数据比较。5.权利要求4的方法，进一步包括如下步骤测量所述孕妇的母体血液中cx-胎儿蛋白含量；和将所述oc-胎儿蛋白含量和所述孕妇的孕龄与该组基准数据比较。6.权利要求4或5的方法，其中所述比较步骤包括将测量结果代入到经线性判别分析法由该组基准数椐产生的概率密度函数中。7.权利要求5或6所述的方法，其中所述比较步骤包括将测量结果的对数与该组基准数据比较。8.权利要求5、6或7所述的方法，其中所述比较步骤包括将测量结果的对数与该组基准数椐比较。9.权利要求4、5、6、7或8所述的方法，进一步包括如下步骤通过使用线性判别法，由怀有患有唐氏综合症的胎儿的孕妇以及怀有正常胎儿的孕妇的母体血液中人绒毛膜促性腺激素的游离P亚单位含量产生一组基准数椐。全文摘要一种用于确定孕妇是否处于怀有患唐氏综合症胎儿明显危险的方法和设备。该方法包括测量孕妇母体血液中人绒毛膜促性腺激素的游离β亚单位的含量。将人绒毛膜促性腺激素的游离β亚单位含量单独地或与其它指标一起地与一组基准数据进行比较。一个计算机化的设备、最好用由一组标准数据通过线性判别分析处理得到的一个概率密度函数、来进行判断。文档编号G01N33/74GK101329352SQ20081008124公开日2008年12月24日申请日期1990年1月17日优先权日1989年1月17日发明者詹姆斯·尼古拉斯·马克里申请人:Jn马克里技术有限责任公司