专利名称：：用检查母体血液的非侵入性方法发现唐氏综合症的方法和设备的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种在产前检査中发现胎儿唐ft錄^(2i三染色体)的方法.ifc^^涉及到其它罕见购、但可检拥到的染色体的三染色体如！3三染色体和1S三染色体.更兵#^说，本发明涉及一种通过洲量孕妇血液中人绒毛腹使性腺激棄(BaG)'的游离e—亚单位的食量来提离检査唐氏錄余危中的发现率的方法.
背景技术：
唐氏综^&,亦称2l三染色体；^重精神发有迟铁的条f^的先天性原因.唐氏综余fe通常釆用一种包括羊腆穿刺术和染色质组型的诊断方法来确定.M种诊断方法是便入性的，会对孕妇和胎儿带来危险.羊^刺术和染色质组型不作为对所有孕妇进行常皿査的方法，当使用这靴入性诊断方诚明錄孕妇带来危险时，可以^一种戎多种检査方法代替这种ftA性方法进旨断..唐氏综^&的发生率随母亲年龄的增加而悉速増加，以往对于唐氏综余￡的产前研究一直集中于年餘在3S岁以上的孕妇，；&^y^龄段，唐氏錄余匿的危险接近3ftfe过用于发IWP氏錄M的诊断方法所带来的危险.因此,产前检査的标准方法一塞包括以孕妇年龄为基准挑选出作举M刺诊断的孕妇，但年龄並不絲分的检絲据，因为对S《的最可能处于危险中的孕妇、即年龄为3S岁或更大的孕妇进行羊胰穿刺和染色质组型只mt^有唐氏综咖匿妊嫌的205左右.处由于錄际临床实践中，只有大约一半的年龄在35岁成以上的孕妇辨絲刺和染M扭私所以在^f发现的唐絲械妊拔低于io多，i9*4年,有人发现了母体血液中低的tx—胎儿蛋自(a:fp)衬与胎AlP氏练^&t问的絲.例如参见"Anassooia"cm"betweenlownxaternaiserumalplifi—fotoproteiixandfetalGlxro边osomaiabnormalities"，(母体血清a—胎儿蛋白的旨囊与胎A^色1^常之问的伴随关系),:多s"j9s4,该^f内容5iai引用被结合到本申请中，该文中记载7其它一些三染色仏特另谈J3三染色体和JS三染色体,也与母体血液中AP:p舍量低有关，这些其它的染色体中的三染色体的发生率(射H为五千分之一和六千六百分之一)远低于;21三染色体(唐氏錄余fe)—般的先验患病率.但由于这些其它的染色体中的三染色^MSA7P讨低有关，因此，这些染色体的异常也可利用本文所描述的母体血液AEP和Hoa的游离e—亚单位和可能的其它指标的检査方案M现，本领械的专业人员風然也可以用这里描述的用于21三染色体的方案用于发现i3三染色体和S三染色体，母体血液中atp^Hk低与胎JUfr氏综^&有关g—发现使我们有可能在那些唐氏錄械发痈丰灼为so多的年轻的、者絲乎不悉癬的家庭中采用非便入性的血液检s试验来发现康氏錄含症病树，计，糊以母体血液ay:p(作为一个检査指标)1狄基础的检査试验键胎A^氏综錄的产前发现率达到总病例的2o多左右.另一种检査方法包括测量母体血液中非结合的鲻三獰(uE)的^Jt,例如参见"MaternalDiooascTeeniixgforDownsyndromeinaarl7pregnano7""(母亲血液检査在早期妊4效对发鄉氐絲械〉，Wald等A^，BritishjcmrnalOfst,1;riosandOynoooiogT*(BUT)Volume9S,April19S其公开内容通过引用被结合到本申请中.伹对口B的浏4值^检来提^小祖劣的基准.近，发现母体血液中H0G含囊的提离、E0G的d—亚单位含Jt的提离(BCG由两个亚单位组成，以下分别称a—B0G和e一H口G)与胎儿唐氏錄錄之问的关雜，例如参见"A》xxor边aiMaternalSeru边ChorionicGoxmdotropinlevelsinPregnanciesWitix7et&lOhromosomeAbnormalities"(胎儿染色体异常妊娠中母体血清的绒毛腹促舰激素讨异常hBOgart:Pan(Uan和Jcmes:PrenatalDiagnosis,"Vo"7,623—630(29s7),其公开的内容a^t引用被结合到本申请中，在BOgarU的文章中，糾了利用毋体血液中HG(J和BO(J的a—亚卑位合H的提离M现大约68夷的染色体异常的胎儿，而这些结论^ai狄怀孕iS—25周瞎拔进行研究而得到的，而且这些患病病辨似乎是那些事先6被识别为可能患唐氏錄^&的妇章,如JJ5f逸敏鹏母体血液中的BC&值的检妙虽^些检査方法确能发，氏综a,但是还需要和希望一种发现更离百分比的胎A^氏錄械病例的方法.本发明A^现了先前不知道的母体血液中游离e—B0G舍Jk的提布与胎A^氏錄会症之问的关联性.还发现了先前不知道的母体血液愤有$—Bfl^Ht及AP衬与胎At氏雄合^t问的关联性，本发明A^发现了先前不知道瞬体血液中游离P—BOCJ讨;^体血液中未受损的Hccj^Hdfc之比与胎jut氏絲合症之间的关联性，我还进一步发现了采用一种多变量判别式分析法可以提商下面所说检奎方法在一选定的悉病*止值下的发现率，这种方法利用母体血液中游离e—HoG舍量，^N，母体血液中游离的e—HCQ^和APG舍t,成二者中任付一个的对数，戎两者的对数.特别是在，也被当作一个变i加入到判别式分析法中，发现率的提离更明显，孕龄指孕妇怀胎儿的周数，发现率是指在一^定的悉病率截止值下正确M现为唐^合症病例的百分比.患病率截止值将在后面更详细地加以说明.判别式分析法总的来iUt公如的"种多变景分析方法，涉及到用单一变4的患病率(J^险率)估计法，究对象分为二个或更多个小组，判别式分祈法有时也被描^是一种构成独立变量线性组合的方法，即将衡量夸小组差异的问题侑化成一个单变量问題，当某个问題中仅包含一个变量时也能运用判别式分析法.关于判别式分析法的H&4fe讨论可见"MarketingResearch"(销H研究)；CHurclxill,G.a.,Dryaeix,"76,笫15章p.530s43,该公开内容alil引用被结舍到本申请中.我发现4^体血液中游离^一B0G的舍囊、未受损的HCG含i;、游离e—HCG对未受报EOG分子的比值、A:p:P合量、UE含Jfc以及孕龄经过多变i判别式分析法处理后与其ti^己知的产前发现唐氏錄a的检査方法相比，发现胎儿唐氏錄舍症的百分比更高，假阳性卒更低.^^现，敏仅仅测賴体血液中游离e—H0(J的^t和ATT含4,並将:i^各自的对数与孕龄经过多变量判别式分折法进行^S,仍可发现更多数目的胎JUt氏雄^&病例这些及其它的发现东下面对本发明的概述部*详细裙述部分中将3^分以说明.
发明内容本发明的一个貝的是与其它S知的产前检变方法相比,^^定假阳性率的憒况下能发现更离百分比的胎儿唐氏錄#的检来方法和步驟，本发明另一个目的是^一种^"定的发现率条件下比其它方法^更低假阳性率的检査胎儿唐氏综^&的方法和步取，本发明的一个更进一步的目的是将多变:i判别式分析^^用于检査麿氏综^的方法中,以似会儿唐氏综M的发现糸更高,假阳性率更低，本发明另一个目的是提供一种3^滩*#体血液中游离戸一hco的合量来检査胎儿麿氏综a的^和步骤，本发明还有一个M—步的目的^1提供一种^:^*体血液中apd合4，离e—hog的合it来检査胎^t氏錄^^的方法和步猓，本发明的其它目的和优点脊在下面对本发明的描述中变得显而易见.为了达到上述目的，按照本发明，孕妇(以下称病人)的母体血清中游离P—Bo(J的^4采用常规的;^学方法测JbM法包括免疫測定法,如上述文孝中提到的那些方法以及该领械内5知的其它方法.然后，将游离e—HoG的合量与一组基准数据进行比较以确定^人怀有患唐氏综4^胎儿的患痏率.为了提离发现率，将游离e—Haa的^t^孕餘与一组基准数据比较，为进一步提商发现率,絲f规的免絲;^,包括上述论文中提到的在*^领域中^的辦方法，鄉病人母体血液糊商的e—EP(J和ApG(以下称"指标"然后絲項指,与一絲准数据比私以航该病人怀有悉唐氏錄合慰会儿的危险率.秀渴多变*判別式分析法将这些指树与一絲准数辦比较.更详细地iL;a^用贝叶斯定律，*人先验的危除率以及^将，人每项指标的定*数值的对数fix到利用多变量判別式分析法屣开的标准数栅的概率密度函数中而确定出来未患病和悉病妊拔的相对发生率来计算出每个痏人具体的危险率，若该病人怀有唐氏錄^Mi的危险丰大f^定的危险率截止值,则应劝说该病人作进一步的诊断试验,以便确iiA否悉有唐氏錄合症，除了母体血液中游离e—hg(J和ayP^f:外，加入孕龄作为一个指标将会进一步提离发现率*由^*#本的母体血液，离曰一HOG合4和As:P^jt趋于按对数一高斯贿曲线^^,因此，^t将瘸人各项指标定i:值的对数和孕龄fiA用多变量判别式分析法展开的基准数据的概丰密度函数中能达到聚髙发现丰，本发明的方法和步猓的优点之一M与其它己知的方法和步取相比，可以准确预测胎AJt氏錄^&病例的百^更髙，假阳性率更低，本发明的其它一些优点在下面更详细的描述和实例中将J^m^楚.田i是例2中提到的一M格，表示了(2J三染色体)M指标的有效汰.田2是例2中提到的一^Mfc格，表示了4^指标的麿氏錄余昆的检査效丰.田3是例2中提到的一44t格，表示了组合指标的唐fc练^&的检査欢卑，困42中提到的一M格，表示了&*悉病妊效中于给卑的游离hocj的e—亚单位分市的百分率的康沃錄^fe病例n^,闺5是甸2中提到的一4^格，表泰各^Hf脊的唐^錄余昆率，田《是例2中提到的一*格,表示在不同的孕龄范围内，以ATS的对数和游离的e—B0G亚单位的对数作为一个组合指标时的唐氏錄脊度的检査效率，图7是例2中提到的一个表格，表示预计的在美闺各地由游离的e—HCG和母亲年齡得出的唐氏錄合症检出率.田s,在例2中被提到，表示了在2j三染色体病例中，游离e—:b0G亚单位相对于未悉病妊嫌的各种百分lb合量.困9,在例2中被提到，表示了游离e—HCG亚单位合量的分布，田J0是例3中提到的一^Nt格，表示由一些指标的各种组M1田H表示本发明的用于执行检絲氏錄械方法所使用的设备.田12和J3表^算用于确定一^人怀有患病胎儿的危险率有关的基准参数的计JHL^汰程田.田i4表示利用田12和13所示程序中计算出的基准参数^，人怀有患病胎儿的危险率的计算机程序汰程田.具体实施方式在本发明的一个实施方案中，从病人获4!#体血样，然后采用常规的分析方法，如本领械内^i^的被学方法，滩出母体血液帽离e—BCG的含量，然后，将该值与一组基准数据比较以^该病人好处于怀有患唐錄^feJi儿的危险中.为了提离发现来将孕龄及母体血液中游商e—HOQ的^1:值与一M^数银进行比乾以确定，人是否怀有患唐氏錄^&胎儿，尽管如闻本领械专iLA员显见的那样，在錄明中运用鄉e^的分析方法測賴体中游离e—BO(J的讨都行,狄用预离e—Hcg的分析方法必须与产生游离e—Bog基准数据的方法是—样的，如呆用了一种新的分析方法測J:游离e—Hog,则必须产生一组以i^法形成的数振为基袖的新的基准数振.不难理解，在形成对HoG的n特异的单克隆体的过程中，一些抗体对该蛋白质将4bM^的，而另一些对与抗体員关联的裙将是特异的.在本发明的说明银^中提到的P—ECG合t的测量值包含了对游脔EoG^不论是对说蛋白质特异的、M对游离e—EOG上鄉部位戎其它^^Jft有关联的糖i^的抗体.对于本领域中的专业人员来说，不难理l虽然游离的a—hgg亚单位被单独^基因编码，isA游离的e—hcg则被至少七^N1^常相似的基因成伪基因的复合族麟，例如参见"且u邮nOho;ricmicgonadotropinDeta—svlbunitisencodedatleasteiglil;genesarrangedintande迈andinvertedpairs，，Boorstein,"VamvalcopOuies,&yiides:UatureVol300,i982年t2月2日,其中的教导aiitl用被结合到本申请中.己知七个游离e—HCG基因中仅有三个在游离e—HOG辨正常胎盎形成过程中被表达，例如参见"Pragiaenl;a1;ionof"the!Beta一Su"bua丄tof'humanChorionicGonaaotropinproduce4"byOhroriocarcinoina":Uislii迈ura,工de*U1;suno边iyajKita:UmaYuki,andMochiztiki，Endocrinology,Vol.J23,MO,^9#*，其中的教导魁引用被结合到本申请中.这三个同样的基因是否在疾病状态下、如悉有胎儿唐氏综^时^达一直没有肯定的答案.因此，有可能合成aj在u酸排列顺序上或其它;m有镦小差别的多种形式的游商e—Ho还有可能在唐氏综^fe病例中，一个戎多个游离e—HcG的基因iyt^因此，产生游离P—HCG的一个独特的变种或多+夹异种，根振本发明如絲些变异种絲的话,那么它们可敏常规的測量游离e一HPG的免疫学方法被測量出来，如果能有一种掷Jt与唐氏练^￡有关的特定的游离e—Hocj变异种的测定法，可以更进一步提高发现率.事实A我们&有效地运用了单克隆抗体測^测J:BOG游离的e—亚单位以区分悉21三染色体好慨和未患病的妊旅，2j三染色体的发现率离达s3如本领械专jkA员都知道的那样,利用抗体絲量说明特定的分析对象糾到与一个有区另他又她物质的交又活性的程度.所以患病和未悉病病例之间的差別可lwt由于存在不同形式的hoG的游离e亚单位所fc这些亚单位由于与所利用的抗M某种程度的交又活性而被检测&来，如果游离e—Ho&亚单位的这种异常形式被鉴别出来，则它将^为一种新的生物化学物质，实际上科学娥中的资料表明，已经识別出e—sca的这种异常形式<例如参见HisHi边UTa等著的文聿)患2J(三染色体的病例也会以游离e—HO^亚单位的异常形式为特征，如呆21三染色体是以游离P—HCG的异常形^特征的话，则本镇械专业人员将能够发展出^些异常形式特异的抗体，这样可以使麼氏錄*的发现率进一步提离*基准数扭反映了怀有患康氏錄舍^^儿孕妇血欢中游离e—迈og的^Hfc(也称"患病的")和/M映怀有正常胎儿孕妇体内血液中游离e—hocj的食量(也称"未悉病的")对于本领域专ikA员来礼不难理解，用于检i胎jur氏综余昆的方法就是^t比较作出决策的过程，；^任何决策过程，裔要有以患有此瘸戎我们所关心的条件的病人和/成不應此病戎我们所为。条件的病人为基准的基准参数，本发明中，基准AA母体血液中被測指标的舍量，如怀有患唐^i錄^fe胎儿的孕妇和怀有正常胎儿孕妇的游商e—HCSg,通过集中大l:样本的基准值而建立一组基准数据，对本领域专业人员来说；显然这组基准数M可通过増加基准值样本的数量进一步改兽.为了确定病A^否处在怀有患唐氏錄f症胎儿的危险中，必须建立一个截止值.对本领械专1A员来说,显然，建立一个确定病人是否怀有患i3三染色体戎jis三染色Wi儿的截止值在^Ui三染色体病例中也^*有效的，这一截止值可由实验室、医生AH于每个病人的病例而建立，截止值也可以以几个判别标准为基袖，包括裔要继续作进一i^入性诊W^验的妇女的数目，所有作进一步的便入性储试验的妇女絲唐氏錄錄胎儿的平均危险^和鄉一賴女^定的患病危险率大于一个JW的危险率值如J/4oo孰应当继续作进一步的便入性诊断，成本领械专iLA员己知的其它判剁#^的决策.截止值能够^—些方法Mtofc包括，百分数，平均正负标准傭差，中问值的倍数,辨AA体的患痏危险率戎那些，械专业人员己知的其它方法，在本发明的另"H^可以发现更多数目胎X^ft^^&的实龙;^中，从祸人体内取出母体血液样*然后，敏常规的分祈法，如剩领域公知的J^m法测出母体血液中未受损的ECG分子、游离的e—HGG、UU和APy(以下称"指标，，)的含量，尽管如本领域专ikA员显见的那样，在本发明中^^TEc知的分析方法来测重母体血液中上述指标的含量都行，伹用于每项指标的分析方法与形成该特定指标的基准数据的方法必须是相同的，如果对某一指标采用一种新的分析方法，则必须产生一组以该方法产生的数据为基*的基准数据，然后、采用贝叶斯定律、该病人的先验危险率及通过将病人每项指标(未受损的sc&^、游离e—HOcj,u:e和a:p:f)的定重值和游离P—HOCJ对未受损HCG分^ft的比值以及病人的孕危险率.多变量判别式分析法可以在巿场上有的计算机^统计软#^"统计分析系统"(由sas研究所公司生产和销售)上计算，j^r-算.概率密度函数为把病人每项指标值与基准参数比较提供了一个方法.虽然，如本领域专业人员显然了解的鹏，也可以类似地飼其它概率密度函^下面具体指出了一种型式的概率密度函化並能充員^于本发明中，用于唐氏练合症危险率的公^,((J//j。OVl)EXP(—，5(Xa-Ma)TooV"(Xflr^a))*先验危险举+(!/71PO"VI)EXP(—S(Xu-Mu)To(Xu-Mu))*0—先验危险率))、(1>'下标"a"表示應病的痫例下标"u"表示未患病的病例(X—M)表示一个向Jb其中每个元紊是每个变t减去变量平均值的值，OO"V-i是该樸型中所有变囊的悤病和来悉病病例的联#方差矩阵的逸.(X—M)T是向4(X—M)的转置，HXP表示指数函数，ICO"表示该煤型中作为基准数据的所有变量的协方差矩阵的行列式，本领械专jkA员显然知道，患病妊嫌和未患病ifiiS各自的协方差矩阵可以代替联合协方差矩阵，用于患唐氏錄^&危险丰的公式就成为_(1//|。0"a)XEX:p(—，S(3Ca—Ma)IcoVa"(Xa—Ma))箭先验危险丰_(2)！〔(1/7100V|a)*EXP(—.S(Xa-Ma)TOoVa-i(Xa-Ma))*^验危险丰+(//1。0"u)*EXP(—5(Xu—Mu)TOOVu-(DCu-Mn))吖l一先缝险率)〕Ioov1来示该鄉中作为基准参数的所有变4的协方差矩阵的行列式，为进行判别式分^fe见，先在一般未挑逸的研究对象中作出一个14验概率的假设.i^fc验概率一般约为！/sooJ为了实行多变贵判别式分祈法，还要作一个关于什么样的危险率截止值能够构成一个阳性试睡结果的决策.例如，如果希望一个怀有患有唐氏综合^^儿的概率等于戎大于Jf/4OO的孕妇进行进一步的诊断试验，则当多变*分析的结*^以孕妇怀有患唐氏综合症胎儿率等于或大于i/400时，该孕妇被认为具有一个阳性试验结果，如果得出阳性试验结恭应劝说病人作进一步的诊断试睡以确证是否患有唐氏练合症，参照图U至l4,困中显示了用于计算基准数揭和具体的危险率的设备及计算机程序的流程围，如田fl所示，为建立基准数据,在患病和未患病妊娥的病例中,采用常财法确定出孕齡GA,APP^fi:和游离e—HOG的讨.为提高可靠性选择了大i:样本.用于建i^准数据的测i值被示意地用2o表示.一旦经由适当的输入装置i5进入后由处理单元2O计算出基准参数22,作为某^人具体的危险率2s可以根据该病人被测出的具体的指标数值(用3o表示)计算出来.围12和J3表示确定基准数据的程序框困，田14表示计算具体的危险率的程序框图.现参照固！2和！3,在第一个循环200中,程序从一个参照组^A识别参数工D,孕龄GA,APP和游离e—HCCJ的定囊值及一个妊ifc^否患2l三染色体的代码.见步艰J02,在流程田中，如步骤z04所示,孕龄GA用变4Xi表示，Ay;p的对数用x,表示，游离e—HCG的对数用X，表示，然后,在:^,3C，和X,敢据的基铀上确定或计算出和矩阵及和一积矩阵，见步騍106.用来对参照组中患病和来患痏病伊j计数辨突董加嗜e然后増加j一旦循环结束,如由流程线J1O所示，itit如參考标号JJ2所示的由il、J、K所定义的一系列循环计算祖平均值，在这些循环中，运用循环Jtoo定义的和矩阵和在循环ioo中计算出的和一积矩阵计算出协方差矩阵，这些循环结束后，要对是否将患病和未悤病病例的协方差矩阵组合^e作出选择，这种选择在步猓mu(j和1!s中被输入.如果选择组合，则协方差矩阵就被组合成一个由步珠J2O给出的联错方差矩阵，如步骤l22所示，该联合协方差矩,取逆，得到逆联合协方差矩阵工PCM,该逆联合协方差矩阵被存入文件中，並在步骤124和J26中被打印出来，如^fe择不组舍，则在步腺i23和i25中对r^协方差矩阵的^个取逆，且将平均值和逆协方差矩阵存入文件並在步取l2S和！27中打印出来，这些数值包括用于计算特定个人怀有悉病胎儿危险率的基准参数.参见田i4,通过执行田J2和i3所示程序计算出来的基准参数在步狭J30中被读入，基准参数包括平均值和逆#协方差矩阵,在步樣l32^A具体的病例记录，包括病人识别标记，孕龄GA,AI"iP和游离e—HC在步稞34中更准确地计算孕龄，在步猓i36中计算孕妇的年龄，在！38中，在孕妇年餘和发生率參数的基袖上确定先睡危险率，在下面讨论的实例中，这一计算结果为00,是一个典型的数汰.在J40中，确定该先败危险率与怀有應病胎儿(ABT)的相对頻率的乘积,即上述等式()、(2)的分子.在142中，计算出怀有患病胎儿的相对頻率与(1一M危险丰)的乘积(BT),即上述条《(j),(2)分餘中辨第二个因子.在144中，利用贝叶斯定律确定兵体的危险率，即abh-abt/(abt+3jt)(等式(j),(2)).在146中,打印出结朱即打印出病人特定的危险率abb和病人识别号，对于本领域专iU员，易然还可以釆用不同于线性判别式分析法的其它统计学戎数学方M计算基准参数，根据錄明一^Mfe^的实施方案，从病人获得母体血液样本然后采用常规的分析方法、包括本领域么>的免疫学方法来测**体血液中游离e—ho(j及ai"p(下面称"指标")的含量.尽管如本领域专iLA员么^P的那样，在本发明中用鄉么^P的赖方法测妙体血液中上述指标的含量都行，朋于每项指标的蔣方法必须与形成各指标基准参数的方M—样的*如果对某一指标采用一种新的分析方法，则必须在用该方法形成的数据基础上产生出一组新的基准参数，然后,运用贝叶斯定律，病人先验的危险率、及iiit将病人每项指标的定量值和孕龄一起代入用多变4判别式展开的基准数据的l^密度,数中而得到的患辨和未患痏妊號的相对发生率来计算怀有患唐氏练^fe應儿的危险率.为进一步提离发现率，将病人游离e—hog和arP定J:值的对数值和孕龄一起f^A用多变量判别式展开的基准参数钧概率密度函数中，多变t判别式^f法可以在巿场一有的计算机程序统计软件包"统计分析系统"(由sas研究所公司生产和销ll)上运算，成^本领域专业Ai公知的其它多变4统计分析方法*它统计牧#^,为进行判別式M^见,先在通常未祭选择的^对象中对患有唐氏錄被的^&概率作出一个僻私^!2:来^该先验概牟近似为2/so(，为了进行多变量判别式分析法，还要作出什么样的危险率feih值构成阳性试败结果的决策，例麵希望一^Hf有患唐氏综合症胎儿概率等于败于i/4oo的孕妇作进一步絲试私则当多变量分析的结果农明一个孕妇怀有悉唐氏雄合&^儿的概率等于J^于！Z4oo时，该孕妇被iU&具有一个阳性微结果，若显示出阳性试睡结果,应劝说该病人作进一步的诊断试验以确i2A否患有唐氏综械，对于本领域专iL^员^说，显然，在上面她的所有实齢案中,验危险丰,将会改变对每个病人作判别式分折辨结果,本发明不储限于上敏駄案,还包括所何能的实施方案以及在下面例子中所公开的M指标的组合，例？采用400以丄病例样本研究胎儿唐氏錄^&与母体血液中游离e—H0G合量以及母体血清中AP;P讨(MSAFP)、UE和未受损HOG之问的关系.这些样本包括2S例从E^怀有應唐氏综合録儿的孕妇体内得到的样拟与患病病例对照的对照样朱对每个血液样本APE、来受损HOCJ^、游离p一HOG及ue(以下称"指标")的含量值由下列m方法测定^指标^法::pp^HI接的:fe&吸附皿法(el工sa)us;fclt免疫測定法未受拥EOa小珠型ELISA游商3—H0GBI4SA每项指标的值成为在巿场上有的计算机软件统计软件包的统计分析系统(SAS研究所公司)上进行g判别^l和线性判剁式处理中的一4^ft,用于建立一组基准数据，游离e—hc(J与未受损hca分子之比絲人的辨也被S作变JbiP入.^t判别处理條所有变量能to入到线性判别式处理中，然后^3对每个变囊及各变量的不同组M行线性判别式处理.这些判别式分析法的结果归纳在下表中.、灵敏妙指测微果显示阳性的胎AJf氏錄械病例的百分比，假阳性率指测试结果为阳性的正常胎儿的百分比.变*爽敏度假阳性率<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>每项变Jt中都包括^,危险WtiL值-2/400-蜂(*)为J/3(S外,对本领械专:IbU来说，显然《改变确定阳性的危险卒^jHt爽对研究对象不简小组采用不，两的先验危险率将会改变对某病人所傲的判別式处理的结呆*例2用5so例以上的病人样本来研究胎JUr氏錄会症与母体血欢中游爽e—HoG^t之同的关系，首先对29例a知怀有悉唐氏錄合症胎儿的孕妇获得的血法样本以及用于对照孕龄(周数相同)、母亲年龄(相差3年以内)和冷冻贮存时间(相差在一个月之内)的"o例未悉病的样本进行^f，所有样本都取自于未患槺尿病的怀单胎的白人孕妇.为了i^^rit检出率中有一定倾向的固定俯差，采用了有效组的概念.有效^U—组独立于基准数据的数据，有效组中由病人得到的结^用于建诚准数银而朋来与基准数振膽以縱检出率.这另一个有效组包括26个附加的被确^21三染色体的病例(总共S5铺例)和随城取的由1S9个对照样^aj^的组.对照样**似地也取自未患糖尿病的怀单胎的白人孕妇.所有的研究包括;W体血液中下列^4ir标值购七个不简的测定方法的43S8个判定，指标洲定方法MSAITM接免疫吸附測定法(EL工SA)未受损加GLISA未受揭HOO+游离0—BOGEiISA游商P—hc^;felt免疫M法(r工a)游离。一笠0&RIAUE二种方法,埯免疫^法和RIA每项指标值均成为在巿场上可得到的计算机软件统计软件包"统计分祈系统"(sas研究所公司)±&行^判别处，线性判别式处理中的一^Jfc,以赵一腿准数据，痏人的孕龄她当f变量加入，然后分别对每个单独的变景和各变豫不阀的组^Mt线性判别式处理.以J/3(J5为患唐氏錄^￡危险率的截止值将病^分为患病或未患病病例.把划为患病的未悉病病例考虑是假阳性牟，每个病人患唐氏錄合症的危险率来用贝叶斯定朱悉病和未悉病病例的多变量概率密度函数以及通常以1/8o0作为先验危险率来计算.联合协方差矩l^于每个概率密度函数.有关初始研究组的结果显示在田J至3的表J3中，田5至7的表5—7是根据对有敏中瘸人的分类将到的鍤呆..田4所示的表4、田8和田9是根裙初始研究组和所有悉病病例得出的.由浏^T法得到的结呆被分析，以确定患痏和未患病病例之间各项指标值之问是否存在明显的差异，表l(田l)表示患病病例与未悤病病例之问除UE外的所有指标都表现出明显的差别，此外，确定了各项指标的假阳性率和发现丰，见表2(田2)^拥量未受祸耳0G及游离p—HC仔亚单位的ECCh測定法将到最离的发现率，可议^t将4^单独的指标组合成复舍指标来进一梦提离发现率,其中一种复^fe括測量未受损HC&^和游离？一且0G亚单位的BOa滩定法，它在表3(田3)所示的复合中产生最商的发现牟.单独对HCG的3和a亚单位的评估表明a—亚单位在悉瘸和未患病病例之岡没有明显差异(2=0,23)而3—亚单位在患辨病例中有明显增加(P-0001)正知本领域专JlA员所^的，概率Pifiit表明一^观察到的结果以至少这样的极大值的可能性是偶然发生的来衡量科学研究中证据的强弱.P值越小，.说明观察不是偁然出现的证据越强，困S表示iO多、50%和90多游离P—HC夺随孕龄的曲线，发现在未患病妊錄中，随著孕龄增加有连续下降的趋势，对胎儿唐氏综余度病例中游离e—HO&含量的^#辨示了*(J多下降到未患病病人购平均值之上，悉病和未患病病例中游离e—HC(J的^t都遵循对数高斯^(P-O7S'和0S6),田9菡出了这种分审，表5(田5)给出了单独依靠游离P—HOG亚单位和游离CI一HOG亚单位的发现率数据.表S中显示了游离P—HCG有离的发现率.用A:PP和游离e—BCG的组^行分析可得到更离的发现率.通过将游离e—H0G的对数和MSAI"P的对数结合到上述软件包"统计分析系统"(SAS研究所公司)的线性判别式处理中，可得到如表6(图6)所示的更优越的发现丰.与其对数相反，用游离e—HOO含豕和ATP舍量也可得到离的发现率，对数据的进一步分析表明AI1P和游离e—H0Q"都与年龄无关(T-0*39《和P-0,52JT4,对四个不两年餘组的AIP和游离p—E0G賴作Kruskal—Wallis试验(年龄=30,3J35,3$40和40)),此外,游离e—亚单位舍和AIFP^l的相关系数(r)与翠没有显著差別(未患病和患病辨例^3为r-0P-0,39,r--0.o6,P-0.81),在我们的数据中,发现的基梯果肯定了这#"^*实，即游离的P—亚单位絲氏综合症的发现率达到教离有帮助，实际上釆用只測量游离e—BOG的M^法所产生的发现率和假阳性率分别为6S4《和5。2多.这些比率与其它人利用三种^法的组合的报导相差不大.因此,如前面指出过的那样，^a数目是本发明我们关于游离e—H0O作用的发现恨振如下，(a)单独看对唐氏综M发现率:m最大的是辨离e—狂0(J滩定法，(t)对未损H0a分子的测定得到更低的发现率,(c)渊4未受损H0&分子与游离e—H0G组合的測定法将到一个比只测4未受损E0G分子洲定法更离的发现率，^经证实，胎録氏练合症的患病率随母^^龄而増加，因此，如前所逸为了用本发明在临床应用中得到病人兵体的悉病危险率，.将随母体年龄而异的先验危险率代入到多变量判别式分析处理中.由于AEP和游离e—BO0的舍均与##年齡无关，因此，我们对我们的数据作了分析,以找出有多少未患病和患病的妇女在对每4^周的年龄给定一个先验危险率滅下具有阳性的结呆，J^值患根据美頃分汰活耍孕妇年餘M为奮査中的傻阳性率和炙敏度，如表7(田7)所示，at^arit表明有可能达到*0-的发现率和S55的假阳性率.对刺2所描述的样本作进一步分析以发现各指标的其它组合的发现率.3W体地说，以两样的危险*止值和先验的危险率对4^标的不阀组合(指标中值的倍数及M标的对私在加入J^加入員下)进行钩2的线性判别式处理-利用基准数据和有效数m行线性判别式处理，结果归纳于田Jo的表s中，例3下例说明游离e—Hcg的一步测定法和二步^法的准备工作以及它们在本发明方法中的应用.游离e—Hoo—步浏定法的准备工作1.在^96井的傲滴定平皿上覆並一层对人绒毛膜促性腺激素(b0g)分子的游离e亚单位特异的"捕获"抗体.抗体可以是单克隆或多克隆抗体.用来覆並平皿的抗体浓n每^o，但如需要，也可以不闳，平加在41D下培养至少16小时，2.用合O0S夷吐温20的:PH72的磷酸盐鍵冲液冲洗平皿，也可用其它合适的絲疑冲液，然后用含3多擁动物蛋白和0,05-吐温20的p且7J2的裤l^;疑冲液将平皿"阻隔"，也可使用本领械专JlA员所熟悉的其它溶浓，如J-的牛血清蛋白溶液.将30O微升的胆琉溶液加到每个并中，让平皿在蛊湿下培养l小时.也可用另外的阻隔方法，如"涂釉法".3.然后如前所舰清洗平皿，将"O做含有麟离曰一b0g並单特异的生物棄化的抗^38试粳冲液加到每个井中i所用的測试疑冲^t舍有3-水解动物蛋白和舍有O0S-吐温2O的24pe72的鱗战疑冲液，但也可用本领械专iiA员么^的^r一些合适的溶液.抗体根据操作者的吝欢可以A单充隆、也可以是多克隆的，可以是与BWP^M^t氣化物聘成碱性裤酸lWMt样的生物柰外的一种物质结合了的抗体s测试缓冲液中抗体的浓度被调蹇到达到最佳吸收率.4.取2O粉的样品本加入每付中，样本可以是i測试疑冲艰，作为证实测试性能的空白，一种用于标准化未知样品值的游离/1-HCG溶滾，成由怀孕到中期三个月的孕妇体内取出的血清样本.将平皿涡旋30秒钟，然后放在P为200转/分的旋转器上，在室温下培养30分钟.s.然后如前所aM清洗平皿，将含有结合了JN^过氣化物聘的链球苗触物柰蛋白的J00辦測试疑冲絲入4H^中，如^J^用的第二种抗体与除生物素以外的一种物质结合的，则不f2t—步驟,测试缓冲液中的链球苗抗生物柰蛋自"Ht氣化物诲的浓J^每^2O饿克，将平加在室温下放ft在P为200转/分的旋转器上S规6.如前所述地清洗乎亚，将一种200傲升的邻一次^U质溶紗入每错中，这种基质溶液也可用本领械内专肚员^的一些适,当辨染剂中的任一种代替，並取决于与笫二种抗体结合的物质是什么.k后将平皿放在P:为200转/分的旋转桊上在窒温下置于暗处培养87.然后，将i00t^的稀琉酸(1OH)加入每个井中以中止该基质的反应.5在492n迈下aat分光光度3^^定每^:的吸收率，P—石GG的二步,法的准备工作J在W96井的#3定平诚上llt一屡对A^4Ji促性腺激素(hc&)分子的游离e—亚单位特异的"拥获*抗体，抗体既可以是单克隆的，也可以是多克隆的，用于盡平皿的抗体密:*0sS傲充,但如需要-也可不同-乎加在4t下至少培养i6小时,2.用合O0S夷吐温20的:PH7,2的璘酸盐疑冲欢清洗平皿，也可用其它适当的清洗疑冲液.然后，用含3多水解动物蛋白和00S多吐温20的EH72的璘&疑冲液将平皿"阻隔"，也可^本领域抆术人员所,的其它溶私如！多的牛血清蛋白溶液，将30O微升的阻隔溶液加到每个井中，让平皿在盡湿下培养l小时，也可用其它阻隔方法，如"涂釉法"..3.然后，如前所述地清洗平皿，将一种J00it^的测试缓冲^P入每4^中，所用的测试缓冲^t含3夷水解动物蚤白和0.05多吐温20的SH72的磷酸盐缓冲私也可用本领域专ikA员所^^的一些合^液中的任河一种.4然后将20做样柳入每错中,样本可以是，作为证实测试性能的空白的測试缓冲私一种用于标准化未知样本值的游离e一E0&溶私^^怀孕到中期三个月的妇女体内取出的血清样本，将平孤涡旋3O秒钟，然后放在P,为200特/分的旋转器上在蛊温s然后，如前所述地清洗平皿，将iooM含有对游离e—HbG亚单位特异的生物素化辨抗体的测试疑冲^P入4M^井中.根据操作者的窨5fe抗体可以是单充隆的戎多克隆的，也可狄与WP辣M:氧化物^械性裤酸l^样的生物素外的物质结合了的—、调节抗体的浓A以达到最敏牧率.将平顺旋3o秒钟,然后放在p为多p0转/分的旋转器上在盡温下堆养30^HK6然后如前所a^4^平風，将！o0*舍有结合了辣^氣化物聘的^苗^^物素蛋白的测试疑冲^>入到#^井中，如果所用的第二种抗^除生物素以外的一种物质结舍了的，则不m—步骤，测试疑冲液中m窗M物素蛋白一过栽，酶6^^4H!fc升2o傲克，将平皿在盡湿下置于p为200转/分的旋转器上5分钟，7.然后如前所述地清洗平皿，将:to0#^的一种邻一次^氣基质溶#入每个井中，这种基质溶液也可以用本领域内的技术人员公知的一些适当染剤中的^T一种代替，並取决于与笫二种抗体相结合的物质，然后M皿放在p为200转/分的旋转器上，在室温下置于暗^yt养s^4K8然后，将10o傲升的稀琉酸(1,0b〉加入每+井中以中止M质的反应.9.在492n边下ifct^光度测量絲定每^的吸收率，这两种鹏法用来执行本发明的方法.用了17s例病人样本来研究胎JUt氏综余&与母体血液中游离e—ho&^之间的关系，对从己知怀有患康氏综^&胎儿的孕妇体内取得的2i52例S知的、未患病样本进行了分析，所*#本均取自怀单胎的未患糖尿病的白人孕妇.然后,我们用2lisa测定法錄病人样本以得到msapp的定量仏解独地用一步舰法和二步敝法得出游离e—hog的舍量，由絲洲定^fr^到的msa3^值和游离e—h0g值成为在市场上可得到购计算*1^件统计數件乜《统计分析系统"上进行的线性判別式处理中的一个变量以建立一组基准数振.病人的孕餘也作为一个变*#入判别式处理中.对一切孕龄及孕龄在i4至J6周之间的判别式員结果归纳如下，一切孕餘侬阳性举发现率对照悉病-J)25226"22S8，2多33,3突"8-2)+L0g(A;pP)"J多138-2"33，3多236"61724至2<$周假阳性率发现率对照悉病IiOg(P--!)2044，S多73,7%/。4-2)9S-2)+L0g(Ayi0试-2"54.6爽S.3多",6多96注，所有分析均包括孕龄.在后面带餘的分析中，另外两组样本值为260和3J6的结果^*一2*^-步法处理,一2表示二步法处理.发现率指显示阳性測试法果的浙儿唐氏雄A度的百分丰.假阳性丰指显示阳性測试结果的正常胎儿的百分比*对照指被分析的未患辨样本的数目^j指被分析的悉病样本的数貝—对一切怀孕周ife^.怀孕i4至i6周孕妇利用游离e的一步a^法和a:pe的组舍可得到最离的发现率和条低的假阳性率，我们的结果进一步支持了在孕妇血清检i方案中以可行而有效的方絲行唐氏综錄检査的良好效能，该良好效能包括，(04战入性方法，(》)低假阳性率和高发现率,(0)朋^*賴立的指标,(a)对血样无苛刻限制(一夭的什么时侯,进食愤礼个人习惯等)及(e)与其^前检査方法的相容性，我们的结^fe明，虽然^比其它方法更少的生物化学分析法，在麿氏综^fe的检査中有可能得到更离的发现率，在唐氏综合&检査中，仅仅使用最有效的指标就能对绝大部分悉严重精神发有迟铁的最^NA原因的)^l在，妊被中提供非ftA性检査传應.对于本领域的专业人员来说，显然，改变判断阳性结果的危险卑截止值，或对研究对象的不同小组采用不词的先l^fc险率，将改变对病人进行判别式处理的结果.因此，应当明确，本发明包括了所有落在下列扭利要求书范围之内的改进.特别地，本发明涉及如下实施方案h—种确定^a是否处在怀有患唐氏錄^S^儿明显危险中的方法,包括,瑰4孕妇母体血液中A^^l促性腺激柰的游离P亚举位的《#*,的孕龄代入-^率密度函数中，由此将所说的孕妇的所说游离e亚单位合量和所说的孕妇孕龄与一组基准数据比fc以确定所说孕妇怀有患唐氏錄合^台儿的危险率.2,—种^孕妇是否处于怀有患唐氏综合^^儿明显危险中的方法，包fe,舰孕妇母体血液中A^鄉促性麟素的游离e亚单位，測战絲胎x^氏综械危险率增加的征兆，3.如实施方案2所述的方法，其中^括i^孕妇血液中的a—胎儿蛋白，人绒4^促,激素中游离e亚单iiRa—胎儿蛋白的测4结果^yMJSP氏综合症危险率增加的征兆.4.—种确定孕妇是否处在怀有患唐氏錄舍,、儿明显危险中的方法,包括，测量孕妇母体血液中A^顿促性腺激素中游离e亚单位的合量，並将该测量值与一组标准数据比较以确定孕妇怀嗜患唐氏錄4^胎儿的危险率.s.—种确定孕妇是否处于怀有患唐氏综合劍&儿明显危除中的方法，包括，用^^A绒顿促性腺激素中游离e亚单位的鹏法测量孕妇母体血液中一种被分析物的合量，並将賴被分析物的测量结果与一组基准数据比较以确定孕妇怀有患唐氏錄^fe胎儿的危险率.(5.如实施方案4戎5所述的方法，其中还包括，测量孕妇母体血液中ar"胎儿蛋白自，並将这一《*结*^孕妇的孕餘与一组基准数据比&7*如实施方案4、5或(S所述的方法，其中比较步骤包括将测Jt结果ft^到由线性判別式^l的由一组基准数振产生的一个概率密度函数中.S.如实施方案4、S、6戎7所迷的方私其中比较步驟包括将测4结果的对数与一组基准数据比较，9.一个用于执行实施方案J至《中任一个用于确定孕妇是否处于怀有患唐氏综舍&^;Uttm法的測妙法，储i用于测试孕妇血液中A^4^促性膝激素中游离e亚单位的手段.J0.—种测量人体血液中人鍵毛澳促性腺激素的游离P亚单位含囊的测定法.!1一种设备，包括《朋于接收孕妇母体血液中A^狄促性腺激素的游离e亚单位含量的測试结果的装置和用于将测试结果与一组标准数裙进行比较以确定胎儿染色体异常的计算机装置.12.如实施方案Ji所述的设备，其中的胎儿染色##常是指13，用来确定孕妇是否处在怀有悉唐氏錄^J会儿明显危险中的设备,包括，适用于接收孕妇母体血波中A^4^促性脉激素的游离P亚单位含量的测试结;^装置，及计算M置，用来计算一M准数据，和的孕妇的孕龄f^一^Nfc率密度函数中，由此将所说孕妇的游离e—亚举位值和所说孕妇的孕龄与一组基准数据比较以确^f说孕妇怀有患唐氏錄^&Ji儿的危除率，i4,用来^孕妇是否处在怀有患唐氏练"^fe^儿明显危险的设备包括，适用于接收用一种.A^毛胰促性腺激素的游离e亚单位测定^#到的孕妇母体血液中某一被分祈物询滩4值的對t,及计算机^t,用来计P组基准数据^用于将所说的被分析物舍4的鹏值和所说孕妇的孕龄代入一个概率密度函数中，由此将所说孕妇的游离e亚单位的合量和所说孕妇的孕龄与一絲准数据比私以确定孕妇怀有患唐氏錄a胎儿的危险率.js如实施方案i3戎i4所述的设备，其中a^fe括，适用于接收孕妇母体血液中a—胎儿蛋白合ft的测量值的装置，及其中的计算^ft还将a—胎儿蛋白的测试结果代入该概率密度函数中，由此将该孕妇的a—胎儿蛋白值与一组标准数振相比钇i6.如实施方案l3、f4戎JIS所说的设备，其中该组基准数据是由4^1,偟的对数计算得到的，及这些測4结果的对|^于将孕妇^#标的合囊与该组基准数据比较.权利要求1.一种用以执行可用于评价孕妇是否应该接受唐氏综合症诊断试验的筛选方法的设备，包括适用于接收孕妇母体血液中人绒毛膜促性腺激素游离β亚单位含量的测量结果的装置；和计算机装置，用于将所述孕妇血液中人绒毛膜促性腺激素游离β亚单位含量和所述孕妇的孕龄与一组基准数据比较，该比较是通过将所述孕妇的人绒毛膜促性腺激素游离β亚单位含量的所述测量结果和所述孕妇的孕龄代入到利用多变量判别式分析法展开的基准数据的概率密度函数中，由此将所述孕妇的人绒毛膜促性腺激素游离β亚单位含量和所述孕妇的孕龄与该组基准数据比较。2.权利要求1的设备，其中所述接收装置还适用于接收所迷孕妇的a-胎儿蛋白含量，且所述的计算机装置将所述oc-胎儿蛋白的含量与所述基准数据相比较。3.权利要求1或2的设备，其中所述计算机装置由怀有患唐氏综合症胎儿的孕妇和怀有正常胎儿的孕妇的母体血液中人绒毛膜促性腺激素游离P亚单位含量计算得到一组基准数据。4.权利要求l、2或3的设备，其中所迷计算机装置由怀有患唐氏综合症胎儿的孕妇和怀有正常胎儿的孕妇的母体血液中a-胎儿蛋白含量计算得到一组基准数椐。5.权利要求1、2、3或4的设备，其中所述装置由所述含量的测量数椐的对数计算得到该組基准数据。6.权利要求l、2、3、4或5的设备，其中所述装置比较所迷测量结果的对数以便将所迷的孕妇中含量与该组基准数椐比较。全文摘要一种用于确定孕妇是否处于怀有患唐氏综合症胎儿明显危险的方法和设备。该方法包括测量孕妇母体血液中人绒毛膜促性腺激素的游离β亚单位的含量。将人绒毛膜促性腺激素的游离β亚单位含量单独地或与其它指标一起地与一组基准数据进行比较。一个计算机化的设备、最好用由一组标准数据通过线性判别分析处理得到的一个概率密度函数、来进行判断。文档编号G06F19/00GK101329354SQ20081008124公开日2008年12月24日申请日期1990年1月17日优先权日1989年1月17日发明者詹姆斯·尼古拉斯·马克里申请人:Jn马克里技术有限责任公司