专利名称：：一种蜂王浆新鲜度的红外光谱评价方法
技术领域：
：本发明属于食品检测
技术领域：
，具体地，涉及一种蜂王浆新鲜度的红外光谱评价方法。
背景技术：
：蜂王浆含有丰富的生物活性物质，具有诸如抗疲劳、抗菌消炎、抗肿瘤、降血压、促生长等多方面的营养保健作用，在保健食品、医药、化妆品等领域具有很高的应用价值。蜂王浆的组分非常复杂，富含蛋白质、碳水化合物和脂类，还包含许多可能发挥重要生理功能的微量组分。由于蜂王浆中的一些活性成分非常不稳定，其品质易受到贮存温度、时间等因素的影响，新鲜蜂王浆和贮存不当的陈旧蜂王浆的生理功能差异很大。因此，蜂王浆新鲜度评价方法的建立是使质量监管部门及加工企业在蜂王浆生产和流通过程中进行有效的监管和控制、保证蜂王浆的产品质量、进一步规范蜂王浆巿场的关键所在。但包括我国蜂王浆国家标准(GB/T9697-2002)、瑞士食品手册(Manuelsuissedesdenr6esalimentaires)等在内,目前世界各国和地区已有的一些蜂王浆国家和地区标准，都仅规定了一些常规指标，如水分、总糖、脂类、蛋白质和10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)的含量等。尚没有一个能衡量蜂王浆新鲜度的公认指标。蜂王浆是一个非常复杂的混合体系，在贮存过程中的变化也是整体化的，包含多种组成成分和含量的变化。而目前用于检测蜂王浆新鲜度的方法主要是高效液相色谱法、气相色谱-质谱法等，只能检测出蜂王浆中一种或几种活性成分，很难对蜂王浆这样一个复杂体系的综合品质进行整体评价，并且需要比较复杂的分离提取过程和昂贵的仪器设备。如何从整体上评价蜂王浆的品质和新鲜度是目前研究的趋势和热点之一。王加聪等人通过饲喂蜜蜂幼虫的生物测定法来评价蜂王浆的品质，但由于伺喂过程中影响幼虫生长的因素太多而复杂，数据分析过程中变量太多，很难将此法进行定性、定量化。
发明内容本发明的目的在于提供一种无需分离提取，试样处理简单、快捷，能整体宏观地评价蜂王浆新鲜程度的方法。本发明提出一种快速、便捷、整体宏观地评价蜂王浆新鲜度的红外光谱评价方法。该方法包括以下步骤(1)取待测蜂王浆与新釆收的蜂王浆样品，分别加入溴化钾粉末，适当烘干并研磨均匀后压片制样；(2)测定压片试样的一维红外光谱；(3)求出并绘出上述一维红外光谱图的二阶导数谱；(4)计算待测的与新釆收蜂王浆的一维红外谱图间的相关系数；(5)计算蜂王浆一维红外谱图特征谱峰的相对峰高；(6)比对待测蜂王浆与新采收蜂王浆的一维红外谱图特征、二阶导数谱特征、谱图相关系数或特征谱峰相对峰强来评价新鲜度。步骤(6)所述的比对可以是一维红外谱图、二阶导数谱、谱图相关系数和特征谱峰相对峰强单个进行比对，或者将其中任意两者或两者以上结合在一起进行比对。所述的一维红外谱图或二阶导数谱特征比对为以新釆收蜂王浆的一维红外谱图或二阶导数谱为标准谱图，比对待测蜂王浆样品一维红外谱图或二阶导数谱图的峰位、峰强、峰形与标准谱图的相似性，即可初步判定蜂王浆新鲜度。与标准谱图差别越大，待测蜂王浆越不新鲜。所述的谱图相关系数的比对为选取蜂王浆一维红外谱图的全谱图或谱图的部分区间(如17001500cm"区间)，以新釆收蜂王浆的一维红外谱图为标准谱图，计算待测样品的一维红外谱图与标准谱图间的相关系数，根据相关系数大小判定蜂王浆新鲜度。相关系数越接近1，待测蜂王浆越新鲜。特征谱峰相对峰强比对为选取蜂王浆一维红外谱图中信息量最为密集的1800~950cm"区段的5个峰位，计算相对峰高和两两之间的相对峰强。以新釆收蜂王浆的一维红外谱图为标准谱图，待测蜂王浆样品一维红外谱图与标准谱图的相对峰强大小越接近则越新鲜。本发明所提供的方法具有如下特点1、能够整体、宏观地对蜂王浆新鲜度作出准确评价，因为对于混合物体系，红外光谱的峰形、峰位、峰强代表着体系中所含各种分子和相应基团的谱峰的叠加，混合物各种组成成分和含量的变化将直接导致红外谱图的变化。2、能如实准确地反映蜂王浆所经历贮存过程对其品质和新鲜度产生的影响，不同的贮存温度和贮存时间均能在一维红外谱图特征、二阶倒数谱特征、谱图相关系数或特征谱峰相对峰强大小等的变化中得以体现。3、灵敏度较高，在16。C或28。C贮存7d的蜂王浆的品质和新鲜度所发生的变化在红外谱图中即能体现出来。4、适用于各种蜂王浆，不同蜂王浆的红外谱图随贮存条件的变化具有相似的变化规律。5、用本发明方法鉴定蜂王浆新鲜度的过程中仅用到少量溴化钾，使用化学试剂较少，有利于环境保护。6、所用仪器较为通用，操作方法简单、快速，无需分离提取和复杂的样品制备过程，易于推广应用。推广利用该发明方法可使监管部门、企业和消费者有效监控蜂王浆质量，促使蜂王浆巿场健康发展，亦可为完善现行蜂王浆国家质量标准提供依据。图l:在不同温度下贮存60d的蜂王浆一维红外谱图a.-18°C;b.4。C;c.16°C;d.28。C图2:在不同温度下贮存60d后的蜂王浆酰胺I带一维红外谱图(17001600cm")a.-18°C;b.4。C;c.16°C;d.28。C.图3:在不同温度下贮存60d后蜂王浆酰胺I带二阶导数谱(17001600cm")a.誦18。C;b,4。C;c.16°C;d.28。C.图4:在28匸下lfc存不同时间的蜂王浆一维红外谱图a.ld;b.7d;c.l7d;d,28d;e.38d;f.60d图5:在28。C贮存不同时间的蜂王浆酰胺I带一维红外谱图(1700~1600cm")a.1d;b.7d;c.l7d;d.28d;e.38d;f.60d图6:在28。C贮存不同时间的蜂王浆酰胺I带二阶导数谱(17001600cm-1)a.1d;b.7d;c.17d;d.28d;e.38d;f.60d图7:在28。C贮存不同时间的蜂王浆选点归一化一维红外谱图(1800-800cm")a.1d;b.7d;c.17d;d.28d;e.38d;f.60d具体实施方式以下结合附图和实施例进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例l取分别于-18。C、4°C、16。C和28。C贮存60d的油菜蜂王浆样品各3mg，加入约200mg溴化钾混合，烘干，研磨均匀后压片，测量一维红外谱图(图l)。图2为一维红外谱图中酰胺I带(17001600cm"区间)的放大图，图3为17001600cm"区间的二阶导数谱。结果表明，随着贮存温度增高，蜂王浆一维红外谱图1650(^1-1谱峰明显向低波数位移到1647cm"，而1247cm"谱峰向低波数位移了12cm—1，到了1235cm—1。峰形状由天然态的不对称峰逐步趋向于变性终态的对称峰；峰形由尖锐趋于平缓；贮存温度越高，峰形越平缓，越对称。分辨率增强的二阶导数谱表明在不同温度下贮存60d的蜂王浆红外谱图的二阶导数图谱各子峰的峰位都未发生变化，但随着温度的升高，1679cm"和1627cm"的峰强逐渐增加，而1649cm"峰的强度逐渐降低。说明蜂王浆样品的一维红外谱图和二阶导数谱的峰形、峰位和峰强的变化可以直观地反映不同贮存温度对蜂王浆的影响。实施例2取在28。C分别贮存1d、7d、17d、28d、38d和60d的茶花蜂王浆样品各3mg，加入约200mg溴化钾混合，烘干，研磨均匀后压片测量一维红外谱图(图4)。图5为一维红外谱图中酰胺I带(17001600cm"区间)的放大图，图6为1700-1600cm"区间的二阶导数谱。结果表明，随着贮存时间延长，蜂王浆红外谱图1650cm-U普峰明显向低波数位移到1647cm—1，而1247cm"谱峰向低波数位移了12cm",到了1235cm-1。峰形状由天然态的不对称峰逐步趋向于变性终态的对称峰；峰形由尖锐趋于平缓，且贮存时间越长，峰形越平缓，越对称。分辨率增强的二阶导数图谱表明在28。C下贮存不同时间的蜂王浆红外谱图的二阶导数图谱各子峰的峰位也未发生变化，随着贮存时间的增加，1679cm"和1649cm"峰的强度分别逐渐增加和减弱；而1627cm"峰的峰形、峰强度发生了显著变化。随着贮存时间的增加，1627cm"峰的峰强增大明显，而1639cm"峰的相对高度显著减小。说明通过蜂王浆样品的一维红外谱图和二阶导数峰形、峰位和峰强的变化可以直观地反映在28。C下不同贮存时间对蜂王浆的影响。实施例3取在不同温度条件下(-18。C、4°C、16°C、28°C)贮存ld、7d、17d、28d、38d和60d的茶花蜂王浆样品各3mg，加入约200mg溴化钾混合，烘干，研磨均匀后压片测量一维红外谱图。以釆收后第ld的新鲜蜂王浆一维红外谱图为标准谱图，通过比对软件计算其它经过不同条件贮存的蜂王浆样品的一维红外谱图与标准谱图间的相关系数。分别以1800~800cm-1、1700~1500cm-1和1700~1600cm-1三个区段进行计算，所得相关系数见表l。表l不同条件下贮存蜂王浆一维红外谱图相关系数<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>不同条件下贮存的蜂王浆一维红外谱图相关系数存在差别随着贮存温度的升高和贮存时间的延长，蜂王浆一维红外图谱与标准谱图的相关系数呈降低趋势。在60d的试验期内，无论在哪个比对区段，-18°(:和41:条件下贮存的蜂王浆一维红外谱图相关系数均在0.9950以上；而在28。C下，贮存7d后的蜂王浆一维红外谱图相关系数都在0.9900以下；在16。C下贮存的蜂王浆一维红外谱图相关系数尽管都在0.9900以上或接近0.9900(0.9892)，但在贮存38d后，其相关系数均在0.9930以下，在贮存60d后，其相关系数均在0.9910以下。对3个不同的比对区域进行分析，结果表明酰胺I带(1700-1600cm")区段的相关系数变化最明显，尤其是在高温(28°C)贮存时，贮存期为60d时蜂王浆红外谱图的相关系数降到了0.9467;其次为酰胺I带和酰胺II带的混合区域(1700-1500cm")。由于红外光谱中酰胺I带和酰胺II带代表的是蛋白质、肽类或氨基酸相关基团的振动吸收，所以蜂王浆贮存中发生的组分变化中，蛋白质、肽类及氨基酸类物质的变化可能占据了主导地位。根据实践经验，蜂王浆不能在高温下贮放，也不能在室温下放置太长时间。结合红外光谱比对结果以及蜂王浆贮存的实践经验，可以选择不同蜂王浆的一维红外谱图与标准谱图在酰胺I带区间(1700~1600cm-1)的相关系数作为评判蜂王浆品质和新鲜度的一个参考指标，并以0.9910为阈值。相关系数在0.9910以下的蜂王浆可以断定为贮存不当或贮存时间过长，亦即不新鲜的蜂王浆。实施例4取在不同温度条件下(-18。C、4°C、16°C、28。C)贮存ld、7d、17d、28d、38d和60d的油菜蜂王浆样品各3mg，加入约200mg溴化钾混合，烘干，研磨均匀后压片测量一维红外谱图。选取蜂王浆一维红外谱图中信息量最为密集的1800~950cm"区段进行选点归一化，对其中5个特征谱峰即1647cm"、1536cm"、1409cm"、1247cm-1和1054cm"附近的峰进行分析。以1850cm"和950cm"两点划定基线，计算各峰位相对峰高，将上述五个峰位的相对峰高两两比较，获得各峰位之间的相对峰强。结果表明，相对峰强1647/11536、11647/11409、WI薦、11647/11()54呈规律性变化,而相对峰强11536/114。9、11536/11247、IlWI腿、WI聰、1l柳/Il054和Il247/Il054的变化规律并不明显(图7)。表2不同贮存条件下蜂王浆的一维红外光谱特征峰的相对峰强<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>分析1647cm"峰与其它四个峰位的相对峰强(以11647/1****表示)，可以看出在-18。C和4。C，尤其是-18。C条件贮存时，11647/1****变化不大;但在16。C和28。C,尤其是28。C贮存时，随着贮存时间的延长，11647/1****明显下降。以11647/11()54为例，贮存ld时的相对峰强为1.444,而当贮存期为60d时，分别下降到了16"C的1.380和28。C的1.317。蜂王浆一维红外谱图相对峰强11647/1****的总体变化趋势是贮存时间越长，温度越高，相对峰强越小；贮存温度越高，相对峰强随贮存时间的变化速度越快，幅度越大，变化幅度大小顺序依次为28'C〉16°C>4°C>-18°C。综合蜂王浆不能在高温下贮存或在室温下贮存过长时间的实践经验和蜂王浆lfc存过程中一维红外谱图特征谱峰之间相对峰强的变化规律，初步选择在28。C贮存7d的一维红外谱图相对峰强作为评价蜂王浆新鲜度的可能阈值，对蜂王浆的新鲜度进行评价，也就是说，将评判蜂王浆新鲜度的相对峰强11647/11536、11647/114。9、11647/11247和11647/1iQ54的阈值分别设为1.744、2.430、3.345和1.412。通过测定未知蜂王浆样品的一维红外光谱图，计算特征峰的相对峰强，如果有l组或几组相对峰强小于相对应的阈值，基本就能判定此王浆是不新鲜权利要求1、一种评价蜂王浆新鲜度的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)取待测蜂王浆与新采收的蜂王浆样品，分别加入溴化钾粉末，适当烘干并研磨均匀后压片制样；(2)测定压片试样的一维红外光谱；(3)求出并绘出上述一维红外光谱图的二阶导数谱；(4)计算待测的与新采收蜂王浆的一维红外谱图间的相关系数；(5)计算蜂王浆一维红外谱图特征谱峰的相对峰高；(6)比对待测蜂王浆与新采收蜂王浆的一维红外谱图特征、二阶导数谱特征、谱图相关系数或特征谱峰相对峰强来评价新鲜度。2、根据权利要求l所述的方法，其特征在于，步骤(6)所述的比对为将一维红外谱图、二阶导数谱、谱图相关系数和特征谱峰相对峰强单个进行比对，或将其中任意两者或两者以上结合进行比对。3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，比对待测蜂王浆与新釆收蜂王浆一维红外谱图或二阶导数谱图的峰位、峰强、峰形的相似性，二者差别越大则待测蜂王浆越不新鲜。4、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，选取蜂王浆一维红外谱图的全谱图或谱图的部分区间，计算待测蜂王浆与新釆收蜂王浆的一维红外谱图间的相关系数，相关系数越接近1则待测蜂王浆越新鲜。5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于，待测蜂王浆与新采收蜂王浆的一维红外谱图在1700~1600cm"区段的相关系数小于0.9910时，则评价待测蜂王浆为不新鲜。6、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，选取蜂王浆一维红外谱图中信息量最为密集的1800~950cm'1区段的5个峰位，计算相对峰高和两两之间的相对峰强，比对待测蜂王浆样品与新采收蜂王浆一维红外谱图的相对峰强，二者越接近，待测蜂王浆越新鲜。7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于，相对峰强I1647/I1536、WI,11647/11247和11647/1054的阈值分别设定为1.744、2.430、3.345和1.412，当待测蜂王浆一维红外谱图的1组或几组相对峰强小于相对应的阈值时，则评价为不新鲜。全文摘要本发明提供了一种蜂王浆新鲜度的红外光谱评价方法。该方法包括以下步骤在待测蜂王浆样品中加入溴化钾粉末，烘干并研磨均匀后压片制样，测定压片试样的一维红外谱图，求出并绘出相应的二阶导数谱，计算一维红外光谱中特征谱峰的相对峰强，以及待测样品与新采收蜂王浆的一维红外谱图的相关系数，然后以待测蜂王浆样品的一维红外谱图、二阶导数谱、相对峰强、相关系数与新采收蜂王浆样品间的差异判定其新鲜度。该方法能够客观反映贮存温度和时间对蜂王浆品质和新鲜度的影响、整体宏观地准确评价蜂王浆的新鲜度，操作方法简单、快速，且极少使用化学试剂，利于环境保护。推广利用该方法能够有效监控蜂王浆质量，促进蜂王浆市场健康发展。文档编号G01N33/02GK101324550SQ200810117290公开日2008年12月17日申请日期2008年7月28日优先权日2008年7月28日发明者吴黎明,群周,孙素琴,胡福良,静赵申请人:中国农业科学院蜜蜂研究所