专利名称：：堆肥中生物酶基因多样性的分析方法
技术领域：
：本发明涉及一种基因多样性的方法，尤其涉及一种堆肥微生物总DNA中基因多样性的分析方法。
背景技术：
：堆肥是利用微生物对可生物降解固体废物进行分解，从而对其实现最终处理的一种系统，因此，充分认识其中的微生物学原理能为改进处理工艺、提高处理效率提供依据。对堆肥进行微生物群落研究的传统方法主要是微生物培养和纯种分离技术。因为环境中的绝大多数微生物无法通过培养方法进行研究，而且堆肥中微生物种类繁多，常处于动态变化状态，培养研究无法反映系统中微生物种群的动态变化，因此，这样的研究方法无法满足堆肥微生物学研究的要求。分子生态学技术正是一种能不依赖于微生物分离培养而对其进行研究的新技术。目前，分子生态学研究已经涉及至U环境科学研究的众多领域，包括在堆肥微生物分子生态学方面的研究。变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)正是其中应用最为广泛的一项技术，其原理是DNA进行电泳时使用具有化学变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶，该凝胶能够有区别地解链PCR扩增产物。长度相同而在碱基序列上存在差异的不同DNA在进行变性梯度凝胶电泳时，会在各自相应的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化。DNA双链一旦解链，DNA分子形成端部的叉状或中间的环形，其在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度将会急剧下降；以至停留在其相应的不同变性剂梯度位置，染色后可以在凝胶上呈现为分开的条带，这样便能将具有相同长度而序列有差异的DNA分子分离开。该技术可以分辨具有相同或相近分子量的目的片段序列差异，可以用于检测单一碱基的变化和遗传多样性以及PCR扩增DNA片段的多态性。目前，对环境中功能基因的分离和多样性的研究还要结合构建克隆文库的方法，但是该方法却不适合对堆肥过程中多种功能基因的分离和多样性的研究，其原因在于构建一个克隆文库必须一次性挑取几十甚至上百个克隆子，而堆肥又是一个不断变化的动态过程，因此，如果要对堆肥过程中的多个功能基因进行分离以及进行后续的多样性研究就必须构建多个克隆文库，这不仅大大增加了工作量，一定程度上还会增加实验成本。
发明内容本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种高通量、低成本、简便直观的堆肥中生物酶基因多样性的分析方法，以便于更好地表征堆肥中具有降解功能(例如木质素的降解等)的微生物种群。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种堆肥中生物酶基因多样性的分析方法，包括以下步骤首先提取堆肥中的微生物总DNA,该微生物总DNA的提取过程又包括样品的脱腐、DNA的粗提和DNA的纯化三个步骤；然后利用PCR扩增程序对特定生物酶基因进行扩增；再在lxTAE缓冲液中，6(TC恒温、100V恒压条件下运行变性梯度凝胶电泳12~14h;最后对变性梯度凝胶电泳图谱进行分析，确定所述堆肥中特定生物酶基因的多样性。上述的堆肥中生物酶基因多样性的分析方法，具体包括以下步骤-(1)提取堆肥中的微生物总DNA样品的脱腐向待提取DNA的堆肥样品中以815ml/g堆肥的用量加入去腐缓冲液，然后置于60~65'C的水浴中保温38min，保温期间可将样品与去腐缓冲液轻轻搅匀，再以30005000xg离心57min，去上清；重复本步骤直至离心后的上清颜色与所述去腐缓冲液的颜色无明显差异(一般重复12次即可满足要求)；DNA的粗提将上述脱腐后的样品置于液氮中保持35min，然后以60~65'C的温度解冻15-20min;以1.0~1.5ml/g堆肥的用量加入DNA提取缓冲液，并在37'C温度下以20(K250rpm振荡4560min;然后以100~150td/g堆肥的用量加入十二烷基硫酸钠溶液(简称SDS，其W/V浓度优选为10%)得混合液，65'C水浴1.01.5h，水浴时可每隔1015min上下轻轻颠倒一次；再加入与所述混合液等体积的氯仿-异戊醇试剂(氯仿与异戊醇的V/V为24:1)，摇匀后(至乳状)以8000~12000xg离心至沉淀完全，回收水相；往回收的水相中加入0.6倍水相体积的异丙醇并沉淀l2h，以10000~13000xg速度离心815min;离心后的沉淀以0.8~1.5ml/g堆肥的用量加入预冰冷的乙醇溶液(V/V为70。/。)进行洗涤，以1000013000xg速度离心35min,然后以500~1000pl/g堆肥的用量将洗涤后的堆肥样品溶于TE缓冲液中，得到粗提的DNA溶液；DNA的纯化用试剂盒对上述粗提的DNA溶液进行纯化，在纯化产物中加入终浓度为0.25~0.5pg/ml的核糖核酸酶A(RnaseA)，37'C水浴中消化30^40min以除去RNA,得到纯化后的堆肥微生物总DNA;(2)PCR扩增生物酶基因选用一对用于特定生物酶基因PCR扩增的简并引物，并在其上游引物的5'端加上GC发卡结构(GC发卡结构主要作用是使PCR产物的一侧产生一个高熔点区，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区，从而有利于DGGE对扩增出来的基因序列进行分离)；再利用PCR扩增程序对该特定生物酶基因进行扩增；由于拟分析的特定生物酶基因的不同，在PCR引物的设计和选用上会存在差异，对于研究较多的生物酶基因的引物可直接通过查阅文献获得；而对于研究较少的生物酶基因的引物可自行通过专业软件进行设计；(3)变性梯度凝胶电泳电泳在通用突变检测系统中进行，所用胶浓度为10%(质量浓度)的聚丙烯酰胺(配制胶的溶液含有丙烯酰胺、N，N'-甲叉双丙烯酰胺和50xTAE，最后加灭菌双蒸水补足至所需的浓度)，变性梯度为30%~60%;电泳运行后的凝胶用SYBRGreenI染色2030min，经凝胶成像系统拍照得到DNA指纹图谱；(4)变性梯度凝胶电泳图谱分析将变性梯度凝胶电泳条带切下，用无菌水清洗，并用TE缓冲液(一般为20~30pL)将所述条带浸泡过夜；以浸泡出的DNA溶液为模板，以步骤(2)中的简并引物(不带GC发夹结构)作为扩增用引物，利用PCR扩增程序扩增条带中所述特定生物酶基因片段；用试剂盒纯化回收PCR产物，然后将该产物进行基因测序和Blast比对，确定所述堆肥中特定生物酶基因的多样性。上述技术方案中，所述的特定生物酶基因优选为漆酶(丄wca^)基因，其对应的所述简并引物和GC发卡结构如下上游引物5'-CAYTGGCAYGGNTTYTTYCA-3'下游引物5'-GRCTGTGGTACCAGAANGTNCC-3'GC发卡结构5，國CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGG-3'。上述技术方案中，所述PCR扩增程序为起始95t:预变性5min;94'C变性lmin，50°C引物复性lmin，72。C引物延伸lmin，35个循环；72。C延伸5min。上述技术方案中，所述去腐缓冲液是由作为溶质的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)、焦磷酸钠(Na4P207)、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、氯化钠(NaCl)、曲拉通X-100(TritonX-100)与溶剂水配制而成，各溶质组分在去腐缓冲液中的浓度分别为三羟甲基氨基甲烷盐酸50~100mM焦磷酸钠100~150mM乙二胺四乙酸二钠50-100mM聚乙烯吡咯垸酮0.5~1.0%W/V氯化钠100~200mM6曲拉通X-1000.02~0.06%V/V。以上配制得到的去腐缓冲液的pH值一般保持在10.0左右。上述技术方案中，所述DNA提取缓冲液是由作为溶质的Tris缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA)、磷酸钠(Na3P04)、氯化钠(NaCl)、十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、蛋白酶K与溶剂水配制而成，各溶质组分在DNA提取缓冲液中的浓度分别为Tris缓冲液0.1-0.15M乙二胺四乙酸0.1-0.15M磷酸钠0.1~0.12M氯化钠l-1.5M十六垸基三甲基溴化胺1~2%W/V蛋白酶K0.1~0.2mg/ml。以上配制得到的DNA提取缓冲液的pH值一般保持在8.0左右。与现有技术相比，本发明应用的DGGE技术是一种可以不依赖于挑取克隆且操作简单的分子生态学技术，该技术用于本发明的分析环境样品功能基因多态性具有以下优势1)高通量，低成本可一次性分析多个样品，无需构建多个克隆，省去了挑取克隆的繁琐步骤，可以最大程度地提高研究者的工作效率，节约实验成本；2)实验结果直观通过DGGE指纹图谱，研究者可以直观地看到编码某种特定生物酶的所有功能基因多样性分布、变化规律及各基因的相对丰度。作为本发明的进一步改进，本发明的方法首先对堆肥样品中的腐殖酸和其它杂质进行洗脱，这样既减少了腐殖酸类物质的污染，又避免了这些物质对后续DNA提取过程的干扰；据此，本发明专门配制了一种新的去腐缓冲液，该去腐缓冲液中含有的Na4P207、Na2EDTA、PVP等均具有较好的脱腐功能，并优化了各组分的浓度配比，使本发明的去腐缓冲液能够达到理想的脱腐效果，为后续DNA的提取和纯化步骤提供了保证和支持。在本发明的DNA提取步骤中，本发明还配制了一种能有效提取微生物总DNA的DNA提取缓冲液；为了尽可能避免DNA在提取中的机械损伤，提取过程仅采用液氮与6(K65'C之间冻融的方法以提高微生物细胞的裂解效率，从而保持了DNA较好的完整性；为了使蛋白酶K的作用更好地发挥，本发明还将DNA提取缓冲液与堆肥样品在37'C下振荡温浴4560min，这样既保证了其处于酶催化的最适温度，又可以与样品充分接触；在DNA提取步骤中加入的氯仿-异戊醇试剂能够抽提掉大部分细胞裂解产生的蛋白质和糖类物质；可见由于综合采用了生物、化学、物理相结合的方法，使堆肥中的微生物细胞在蛋白酶K、SDS和CTAB等物质作用下尽可能地裂解，充分释放其中的核酸物质，从而实现了DNA产量的最大，获得了片段长度比较单一的DNA;经过纯化后，堆肥中提取的DNA产量相比于现有技术，提高了40%以上；同时，腐殖质类物质的产量大大减少，几乎去除了堆肥中所有的腐殖酸类物质。正是因为本发明的上述改进，使得从堆肥中提取和纯化的DNA具有产量大、纯度高、质量好等明显优势，这为本发明结合应用DGGE技术以全面、快速地分析堆肥中微生物的多样性及功能基因提供了更好的条件和基础。图1为本发明实施例中PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图片；其中M为DNA分子量标记DNAMarderV(从Tiangen生物公司购买的)，1、2、3分别代表三个平行堆肥样品，数字表示DNA的大小，单位是bp。图2为本发明实施例中PCR扩增产物漆酶基因的DGGE图谱及l号泳道中a、b、c所指的三个条带测序结果；图左侧为漆酶基因的DGGE图谱，1、2、3分别代表三个平行的堆肥样品。具体实施例方式实施例-本实施例的分析方法拟分析的堆肥样品取自一个20L的实验规模的堆肥装置，堆肥材料主要包括稻草1.074kg、菜叶0.9kg、树叶0.216kg、麸皮0.24kg和土壤0.721kg,采样点为堆肥表面以下3cm，一共取三个样品(分别编号为l、2、3)，每个样品lg，取样时间是在堆肥处理12d(为堆肥腐熟期样品)，温度为38。C，pH值为8.32，含水率为58%，有机质含量为20.3%。其中，pH值用玻璃电极法测定，含水率在105'C下重复烘烤至恒重测定，有机质含量根据重铬酸钾法测定。采用本发明的分析方法对上述堆肥样品进行堆肥中漆酶基因多样性的分析，具体包括以下步骤1、提取堆肥中的微生物总DNA(1)样品的脱腐向每个堆肥样品(lg)中分别加入10ml的去腐缓冲液，然后置于60'C的水浴中保温5min，保温期间用玻璃棒将堆肥样品与去腐缓冲液轻轻搅匀，再以5000xg离心5min，去上清；重复两次本步骤的洗涤与离心过程，至离心后的上清颜色与去腐缓冲液的颜色无明显差异；本步骤中用到的去腐缓冲液是由作为溶质的Tris-HCl、Na4P207、Na2EDTA、PVP、NaCl、TritonX-lOO与溶剂水配制而成，各溶质组分在去腐缓冲液中的浓度分别为Tris-HCl100mMNa4P207100mMNa2EDTA100mMPVP1.0%W/VNaCl120mMTritonX-1000.06%V/V。(2)DNA的粗提将上述洗涤脱腐后的样品置入液氮中保持5min,然后以60~65'C的温度解冻20min;加入lmlDNA提取缓冲液，并在37'C恒温条件下以200rpm振荡45min;然后加入100pl的十二垸基硫酸钠溶液(W/V为10。/。)得混合液，65'C水浴1.5h，水浴时每隔15min上下轻轻颠倒一次；水浴结束后再加入与所得混合液等体积的氯仿-异戊醇试剂(氯仿与异戊醇的V/V为24:1),摇匀至乳状后以9000xg离心至沉淀完全，回收水相；往回收的水相中加入0.6倍水相体积的异丙醇并沉淀1.5h，以13000xg速度离心iomin;离心后的沉淀用lml预冰冷的乙醇溶液(V/V为70。/Q)进行洗涤，以10000xg速度离心3min，然后溶于500pL的TE缓冲液中，得到粗提的DNA溶液；本步骤中用到的DNA提取缓冲液是由作为溶质的Tris缓冲液、EDTA、Na3P04、NaCl、CTAB、蛋白酶K与溶剂水配制而成，各溶质组分在DNA提取缓冲液中的浓度分别为；Tris缓冲液0.1MEDTA0.1MNa3P040.1MNaCl1.5MCTAB1%W/V蛋白酶K0.2mg/ml。(3)DNA的纯化用Universal通用型DNA纯化回收试剂盒(Tiangen，北京)对上述粗提的DNA溶液进行纯化，在纯化产物中加入终浓度为0.5pg/ml的核糖核酸酶A,37'C水浴中消化30min以除去RNA,得到纯化后的堆肥微生物总DNA。2、PCR扩增生物酶基因(1)PCR扩增引物的选用通过査阅文献选择适合堆肥中漆酶基因PCR扩增的简并引物，并在上游引物的5'端加上GC发卡结构，如下所示上游弓I物5'-CAYTGGCAYGGNTTYTTYCA-3'下游引物5'-GRCTGTGGTACCAGAANGTNCC-3'GC发卡结构5'隱CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGG-3，扩增片段约为200bp;(2)PCR扩增体系PCR反应体系(50nL)包括纯化后的堆肥微生物总DNA2nL、dNTP0.2mMeach、上下游引物各0.8pM、10xBuffer(withMgCl2)5pL、ra《DNA聚合酶(Tiangen,北京)2.5U，然后加去离子水补足至50nL;(3)PCR扩增条件如下预变性95'C5min变性94°Clmin，退火50°Clmin「35个循环延伸72°Clmin」后延伸72°C5min;(4)PCR扩增产物用2。/。(W/V)的琼脂糖凝胶进行检测，检测时每个堆肥样品取3jiL点入琼脂糖凝胶孔中进行电泳，检测结果如图l所示，从检测结果来看，该PCR扩增产物的序列长度约为200bp，与漆酶基因的序列长度基本一致，这能作为PCR扩增得到漆酶基因的初证。3、变性梯度凝胶电泳电泳在DCodeSystem通用突变检测系统(Bio-Rad，USA)中进行，所用胶浓度为10%的聚丙烯酰胺(配制胶的溶液含有丙烯酰胺24.3313g、N，N'-甲叉双丙烯酰胺0.6688g和50xTAE5mL，最后加灭菌双蒸水补足至终体积250mL);变性梯度为30%~60%(100。/。的变性剂为7M的尿素和40%的去离子甲酰胺)；每个堆肥样品取30^L上述PCR产物进行DGGE电泳，在lxTAE缓冲液中，60C恒温、100V恒压条件下运行12h，凝胶用SYBRGreenI染色2030min,经GelDoc2000凝胶成像系统(BioRad，USA)拍照得到DNA指纹图谱。4、DGGE图谱条带分析(1)选择DGGE图谱上任一泳道上的三个条带(见图2中的条带a、b、c)，分别用无菌水清洗，然后用25pLTE溶液将其浸泡过夜；(2)以浸泡出来的DNA溶液为模板，PCR扩增其中的漆酶基因片段，引物采用不带GC发夹结构的上述步骤(2)中的简并引物，扩增模板使用10pl，其它扩增条件和程序与上述步骤2的PCR反应相同；(3)用纯化试剂盒(Tiangen，北京)纯化PCR产物；(4)DGGE图谱条带分析结果如图2所示，图2左侧为漆酶基因的DGGE图谱，泳道条带所在位置的多样性即表示样品中漆酶基因的多样性，处于同一水平位置的条带则代表同一个基因类型；从图2中可以看出三个平行堆肥样品中漆酶基因多样性较为一致；为了进一步证实泳道中的条带即代表漆酶基因，将l号泳道中a、b、c所指的三个条带分别测序，测序结果见图2右侧的基因序列表，其中数字表示碱基数目，字母表示碱基序列。(5)将测序结果与Genbank数据库中的基因序列进行比较，找出同源性最高的序列，与Genbank数据库中的基因序列Blast比对结果见下表l:表l:Blast比对结果表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>从上表l的同源性比对结果可以看出，与三个序列同源性最高的序列均为漆酶基因，因此推测得到的基因均为漆酶基因或与漆酶基因相关。<110>湖南大学<120>堆肥中生物酶基因多样性的分析方法<160>3<210>1<211>20bp<212>DNA<213>人工序列<400>1caytggcayggnttyttyca20<210>2<211>22bp<212>DNA<213>人工序列<400>2grctgtggtaccagaangtncc22<210>3<211>37bp<212>DNA<213>人工序列<400>3cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggg3权利要求1、一种堆肥中生物酶基因多样性的分析方法，包括以下步骤首先提取堆肥中的微生物总DNA，该微生物总DNA的提取过程又包括样品的脱腐、DNA的粗提和DNA的纯化三个步骤；然后利用PCR扩增程序对特定生物酶基因进行扩增；再在1×TAE缓冲液中，60℃恒温、100V恒压条件下运行变性梯度凝胶电泳12～14h；最后对变性梯度凝胶电泳图谱进行分析，确定所述堆肥中特定生物酶基因的多样性。2、根据权利要求1所述的堆肥中生物酶基因多样性的分析方法，具体包括以下步骤(1)提取堆肥中的微生物总DNA样品的脱腐向待提取DNA的堆肥样品中以815ml/g堆肥的用量加入去腐缓冲液，然后置于60~65。C的水浴中保温38min，再以3000~5000xg离心57min，去上清；重复本步骤直至离心后的上清颜色与所述去腐缓冲液的颜色无明显差异；DNA的粗提将上述脱腐后的样品置于液氮中保持35min,然后以60~65'C的温度解冻15-20min;以1.0~1.5ml/g堆肥的用量加入DNA提取缓冲液，并在37'C温度下以200250rpm振荡4560min;然后以100-150pl/g堆肥的用量加入十二烷基硫酸钠溶液得混合液，65'C水浴1.01.5h;再加入与所述混合液等体积的氯仿-异戊醇试剂，摇匀后以800012000xg离心至沉淀完全，回收水相；往回收的水相中加入0.6倍水相体积的异丙醇并沉淀12h,以10000-13000xg速度离心815min;离心后的沉淀以0.81.5ml/g堆肥的用量加入预冰冷的乙醇溶液进行洗涤，以1000(M3000xg速度离心35min，然后以500~1000pl/g堆肥的用量将洗涤后的堆肥样品溶于TE缓冲液中，得到粗提的DNA溶液；DNA的纯化用试剂盒对上述粗提的DNA溶液进行纯化，在纯化产物中加入终浓度为0.25~0.5^g/ml的核糖核酸酶A，37'C水浴中消化30~40min,得到纯化后的堆肥微生物总DNA;(2)PCR扩增生物酶基因选用一对用于特定生物酶基因PCR扩增的简并引物，并在其上游引物的5'端加上GC发卡结构；再利用PCR扩增程序对该特定生物酶基因进行扩增(3)变性梯度凝胶电泳电泳在通用突变检测系统中进行，所用胶浓度为10%的聚丙烯酰胺；变性梯度为30%~60%;电泳运行后的凝胶用SYBRGreenI染色2030min，经凝胶成像系统拍照得到DNA指纹图谱；(4)变性梯度凝胶电泳图谱分析将变性梯度凝胶电泳条带切下，用无菌水清洗，并用TE缓冲液将所述条带浸泡过夜；以浸泡出的DNA溶液为模板，以所述简并引物作为扩增用引物，利用PCR扩增程序扩增条带中所述特定生物酶基因片段；用试剂盒纯化回收PCR产物，然后将该产物进行基因测序和Blast比对，确定所述堆肥中特定生物酶基因的多样性。3、根据权利要求1或2所述的堆肥中生物酶基因多样性的分析方法，其特征在于所述的特定生物酶基因为漆酶aaccwe)基因。4、根据权利要求1或2所述的堆肥中生物酶基因多样性的分析方法，其特征在于所述PCR扩增程序为起始95'C预变性5min;94'C变性lmin，5(TC引物复性lmin，72'C引物延伸lmin，35个循环；72。C延伸5min。5、根据权利要求2所述的堆肥中生物酶基因多样性的分析方法，其特征在于所述去腐缓冲液是由作为溶质的三羟甲基氨基甲垸盐酸、焦磷酸钠、乙二胺四乙酸二钠、聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、曲拉通X-100与溶剂水配制而成，各溶质组分在去腐缓冲液中的浓度分别为-三羟甲基氨基甲烷盐酸50~100mM焦磷酸钠100~150mM乙二胺四乙酸二钠50~100mM0.5~1.0%W/V100~200mM0.02~0.06%V/V。6、根据权利要求2所述的堆肥中生物酶基因多样性的分析方法，其特征在于所述DNA提取缓冲液是由作为溶质的Tris缓冲液、乙二胺四乙酸、磷酸钠、氯化钠、十六烷基三甲基溴化胺、蛋白酶K与溶剂水配制而成，各溶质组分在DNA提取缓冲液中的浓度分别为聚乙烯吡咯垸酮氯化钠曲拉通X-100Tris缓冲液乙二胺四乙酸磷酸钠氯化钠十六垸基三甲基溴化胺蛋白酶K0.1~0.15M0.1~0.15M0.1~0.12M1~1.5M1~2%W/V0.1~0.2mg/mlc全文摘要本发明公开了一种堆肥中生物酶基因多样性的分析方法，包括以下步骤首先提取堆肥中的微生物总DNA，该提取过程又包括样品的脱腐、DNA的粗提和DNA的纯化三个步骤；然后利用PCR扩增程序对特定生物酶基因进行扩增；再在1×TAE缓冲液中，60℃恒温、100V恒压条件下运行变性梯度凝胶电泳12～14h；最后对变性梯度凝胶电泳图谱进行分析，确定所述堆肥中特定生物酶基因的多样性。本发明的分析方法具有高通量、低成本、简便直观等优点，以便于更好地表征堆肥中具有降解功能的微生物种群。文档编号G01N27/447GK101550449SQ200910043399公开日2009年10月7日申请日期2009年5月14日优先权日2009年5月14日发明者曾光明,凤李,贞李,杨春平,杨朝晖,婕梁,勇肖,范长征申请人:湖南大学