一种浮游植物群落组成快速测定方法

专利名称：：一种浮游植物群落组成快速测定方法
技术领域：
：本发明涉及植物种类和/或数量检测
技术领域：
，特别涉及一种海洋生态环境监测过程中使用的浮游植物群落组成快速测定方法。
背景技术：
：赤潮浮游植物识别测定技术可以大致归纳为两个层面①基于活体分析的浮游植物群落组成的测定技术。最经典最常用的浮游植物分类检测方法是利用光学显微镜直接观测浮游植物的形态和数量，此方法需要专业人员完成，且费时费力，无法满足现场快速监测的需要。图象识别技术是在显微镜基础上加装CCD摄象，将浮游植物图象拍摄下来，经过处理与图象库中的图象对比识别，获得浮游植物群落组成的信息。流式细胞仪技术与图像技术结合产生了Flowcam技术，即让藻细胞呈单层状态在流通池中流动，利用CCD摄取流通池中藻细胞的图像后，进行图像识别，该技术已经商品化。但是，图像技术识别能力会受到样品溶液浊度的影响，而且也不是一个普及应用的技术。②运用化学分析技术，获得浮游植物群落组成的信息。目前研究较为广泛的是基于浮游植物色素分析的浮游植物群落组成分析方法。但色素分析方法需要高效液相色谱仪，试剂消耗量大，样品前处理繁瑣，限制了其在业务化监测中的应用。新近发展的基因分析技术，是通过一定的筛选方法确定目标浮游植物的特征DNA片段，通过DNA片段的比对分析，实现对未知样品的浮游植物群落组成测定。但是，该技术是针对单种藻建立分子探针，适用于特定海域对引发赤潮的有限种藻的识别分析，对于赤潮发生前大量藻种共存的浮游植物群落组成的分析尚有困难。上述技术所依赖的仪器都不是现有海洋监测基站的常用仪器，也难以实现快速、实时地鉴别引发赤潮的浮游植物的现实需要。浮游植物活体荧光技术则具有上述特点，且具有样品测定前不需要前处理及不产生废液的"绿色"特性。5近十年来，荧光技术在海洋浮游植物群落组成监测方面得到很大的发展。Kolbowski等(1995)通过初始荧光(F0)区分开了三个主要的藻类种群；Beutler等(2002),利用浮游植物活体叶绿素荧光激发光谱，将浮游植物分为四大类(绿藻，蓝藻，隐藻，混合藻(含曱藻和硅藻))识别测定，建立了浮游植物群落组成测定技术，这就是目前已经商品化的BBE藻类分析仪。但BBE藻类分析仪无法将我国近海海域最重要的两类藻硅藻和曱藻分类识别，因而难以满足我国海域浮游植物监测的需要。国内对浮游植物荧光检测技术也开展了广泛的研究，赵冬至等在863发明(模块化赤潮卫星遥感监测技术，2001AA636020)的支持下，采用现场实测和室内培养两种方式测定了曱藻、赤潮异弯藻、叉角藻、海洋蓝绿藻等赤潮和新月菱形藻、叉鞭金藻、塔胞藻、扁藻和小球藻等非赤潮藻类光谱曲线.采用度量太阳激发的叶绿素荧光峰高度的归一化荧光高度法，建立了不同藻类归一化荧光高度与叶绿素浓度的关系。同时建立了不同藻类荧光峰位置与叶绿素a浓度的关系。金海龙等进行比值光谱分析得到含叶绿素b、叶绿素C海藻明显的区别特征，从而为海藻活体识别进行了有意义的尝试。另外，他们还对单一海藻和混合海藻进行荧光激发光谱的二阶导数分析，用二阶导数荧光发射光谱的谷点和峰值点为特征点，取特征点对应的荧光发射光谱的相对强度的归一化数据为特征参数，进行混合海藻的线性多元回归分析，实现藻的荧光分类测定。上述这些研究和实际应用充分表明了活体荧光技术运用于浮游植物种群组成分析及发生赤潮时赤潮藻识别测定的前景。但是，目前的研究只是局限于某类具有显著荧光特征的浮游植物的测定或将浮游植物粗略的分为几大类后进行识别监测，也没有一种在发生赤潮时对引发赤潮的赤潮藻进行鉴别的浮游植物荧光分析技术。根据我国近海浮游植物群落组成特点和赤潮发生时浮游植物群落结构特点(我国近海海域主要浮游植物类群有硅藻、曱藻、绿藻、黄藻、蓝藻、金藻和隐藻，群落组成总是以l-2个门类的藻占绝对优势；发生赤潮时，多为单相型赤潮，双相型赤潮较少见，而且就我国近海海域而言，发生赤潮的藻种是有限的和相对确定的，因此赤潮发生时在属的水平利用荧光技术鉴别引发赤潮的浮游植物是完全可能的)，基于浮游植物荧光光语，建立一种在6"正常"(未发生赤潮)情况下能够在门类的水平上测定浮游植物群落组成，赤潮发生时在属的水平上识别测定发生赤潮的浮游植物的荧光鉴别方法是我国近岸海域生态监测的迫切需要。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于，提供一种浮游植物群落组成快速测定方法，根据我国近海浮游植物群落组成特点和赤潮发生时浮游植物群落结构特点，基于浮游植物荧光光谱，能够在未发生赤潮时能够在门类的水平上测定浮游植物群落组成，赤潮发生时在属的水平上鉴别测定引发赤潮的浮游植物。目前的荧光分析技术只是局限于某类具有显著荧光特征的浮游植物的识别测定或将浮游植物粗略的分为几大类后进行识别测定，特别是对于我国近海海域极为重要的硅藻和曱藻，包括BBE在内的现有荧光分析技术都无法将它们分类检测，也没有一种能够在赤潮发生时对引发赤潮的藻种进行现场、实时识别监测的技术。根据我国近海浮游植物群落组成特点和赤潮发生时浮游植物群落结构特点，建立一种在"正常"(未发生赤潮)情况下能够在门类的水平上测定浮游植物群落组成，赤潮发生时在属的水平上识别测定发生赤潮的浮游植物的技术是我国近岸海域生态监测的迫切需要，也是目前最有可能实现现场、快速、实时的浮游植物群落结构监测技术之一，该技术的实现将为研究赤潮生消机制，进而防治赤潮提供有力的技术保障。为解决上述技术问题，本发明提供了一种浮游植物群落组成快速测定方法，包括以下步骤(1)获得浮游植物荧光光语原始谱库；(2)构建高维正交空间，将浮游植物焚光光谙原始谱库投影到该高维空间，提取浮游植物荧光光谱特征，建立浮游植物荧光光谱特征谱库；(3)对浮游植物样品荧光光谱进行识别分析，给出所测样品中所含浮游植物的种类和/或数量。所述荧光光语可以包括由荧光分光光度计获得的连续三维荧光光谱，多激发荧光光镨仪获得的离散三维荧光光谱。所述构建高维正交空间的方法优选为通过小波分析技术构建高维正交空间。所述小波分析技术可以包括多小波技术和/或小波包技术。所述步骤(3)可以进一步包括(3)利用多元线性回归和非负最小二乘解析建立浮游植物荧光识别分析技术，对浮游植物样品荧光光谱进行识别分析，给出所测样品中所含浮游植物的种类和/或数量。所述步骤(2)可以进一步包括(2)利用正交小波函数构建高维正交空间，将浮游植物荧光光谱原始谱库投影到该高维空间，在各投影空间中选择稳定而特异性强的荧光特征段或特征段组合，作为浮游植物荧光特征谱，通过聚类分析技术构建浮游植物荧光光谱特征谱库。所述步骤(3)可以进一步包括(3)对浮游植物样品荧光光谱进行识别分析，给出所测样品中所含浮游植物的种类和/或数量借助多元线性回归在未发生赤潮时在门类的水平上测定浮游植物群落组成，发生赤潮时在属的水平上识别测定引发赤潮的浮游植物。所述通过小波分析技术构建高维正交空间，可以通过下列步骤实现采用Haar小波、Daubechies小波系或Meyer小波，选择DB7和COIF2作为小波基函数；小波特征谱定义为原始荧光光谱在小波空间的投影，每个小波空间上的投影为小波特征谱的特征段，采用Bayes判别分析法，根据需要选择合适的特征^更或其组合作为识别特征语。所述非负最小二乘法，可以通过下述步骤实现建立的特征光谱为A-(/"，A2，……，/J,其中，A为t门类浮游植物标准谱，厶为A门类浮游植物特征谱的第z'个数据点；样品测定后获得与特征i瞽对应的谱向量F=(^，F2，……，F"),其中，巧为样品的第''个数据点；每种藻对荧光光谱的贡献(&)通过解下列线性回归方程得到8权重因子化<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>是总误差，是^的非线性函数，使用迭代程序，首先给分母的^赋初值("*=1)，然后计算分子的A，在将新的^值赋予分母，计算分子A,如此循环，直到分子^与分母A相等；当迭代出现负的^时，下一次迭代时该^作为0不再参与迭代；化是通过各赤潮浮游植物荧光特征谱在不同特征段的数据的标准偏差获得的w"=。所述步骤(2)中，建立浮游植物荧光光谱特征谙库的步骤可以进一步包括将原始三维光谦数据中Rayleigh散射带通过Delaunay三角插值法去除，再对处理后的光谱依次进行小波分解，选择DB7小波第二层尺度分量以及第二、三层小波分量，COIF2小波第三层尺度分量特征谱以及第二、三层小波分量作为特征谱。本发明测定方法的有益的技术效果在于直接测量海水样品，无须前处理，在数分钟内快速给出主要浮游植物的类别和数量结果。与国际领先的同类技术一一德国bbe-moldaenke公司的荧光藻类分析仪相比较，本发明能够识别测定七个门类的浮游藻(包括中国近海极为重要的硅藻和曱藻)，识别正确率达到90%以上；并且能够对单藻和两种藻混合样品进行属层次的识别测定，识别正确率达到80%以上。图1是本发明实施粒所述浮游植物荧光识别技术的识别过程示意图；图2中，图2a是本发明实施粒所述中肋骨条藻原始荧光光谱图，图2b是本发明实施粒所述去除散射后的荧光光谱；图3是本发明实施粒所述37种藻DB7小波第二层尺度分量特征谱；图4是本发明实施粒所述37种藻DB7小波第二、三层小波分量特征谱；图5是本发明实施粒所述37种藻COIF2小波第二层尺度分量特征谱；图6是本发明实施粒所述37种藻COIF2小波第二、三层小波分量特征具体实施例方式本发明公开了一种赤潮浮游植物群落组成的荧光分析方法，该方法根据我国近海浮游植物群落组成特点和赤潮发生时浮游植物群落结构特点，基于浮游植物荧光光"i普，建立的一种在"正常"(未发生赤潮)情况下能够在门类的水平Jl测定浮游植物群落组成，赤潮发生时在属的水平上识别测定发生赤潮的浮游植物的荧光鉴别方法。其基本技术路线是采集中国近海常见浮游植物优势种和赤潮种分离培养，获得荧光光语，建立浮游植物荧光光谱原始谱库；然后利用小波分析、bayes判别分析等方法，将赤潮浮游植物活体三维荧光光谱投影到所构建的高维正交空间，每个空间上的投影为特征谱的特征段，在各投影空间中选择稳定而特异性强的荧光特征段或特征段组合，组成赤潮浮游植物荧光特征谱，通过聚类分析技术构建浮游植物荧光特征谱库，以此谱库为基础，借助多元线性回归建立能够在未发生赤潮时在门类的水平上测定浮游植物群落组成，发生赤潮时在属的水平上识别测定引发赤潮的浮游植物的荧光鉴别方法。该技术对小波分解后的浮游植物样品荧光光语进行识别分析，尝试特征谱库内不同物种间特征谱的所有组合，选择残差最小的组合所对应的回归系数作为分析结果，由此给出所测样品中所含浮游植物的类别和数量。本发明浮游植物群落组成的快速识别测定方法的一种实施方式，可以包括以下步骤(1)获得浮游植物焚光光谱原始语库；(2)通过小波分析技术构建高维正交空间，将浮游植物荧光光谱投影到该高维空间，提取浮游植物荧光光谱特征，建立浮游植物荧光光谱特征谱谱库；(3)利用多元线性回归辅以非负最小二乘解析建立浮游植物荧光识别分析技术；(4)对浮游植物样品荧光光谱进行识别分析，给出所测样品中所含浮游植物的种类和数量。本方法主要针对荧光光谱(由荧光分光光度计获得的连续三维荧光光谱和其他多激发荧光光谦仪获得的离散三维荧光光谱)，也包括其他光谱上的10应用。本发明对现有技术的贡献之一在于所述的提取浮游植物荧光光谱本征特征的方法是小波分析技术(包括多小波技术和小波包技术)。本发明对现有技术的贡献之二在于利用正交小波函数构建高维空间，将浮游植物荧光光语投影到该高维空间，在备投影空间中选择稳定而特异性强的荧光特征段或特征段组合，作为浮游植物荧光特征谦，通过聚类分析技术构建浮游植物荧光特征谱库。本发明测定方法是在以此谱库为基础，借助多元线性回归建立能够在未发生赤潮时在门类的水平上测定浮游植物群落组成，发生赤潮时在属的水平上识别测定引发赤潮的浮游植物的荧光鉴别方法。本发明是根据我国《海浮游植物群落组成特点和赤潮发生时浮游植物群落结构特点，基于浮游植物活体荧光光傳，综合利用小波分析、聚类分析等化学计量学技术，构建浮游植物焚光特征谱库，建立相应的浮游植物荧光鉴别方法。其基本技术路线①收集中国近海浮游植物优势种、赤潮种并分离培养，应用荧光分光光度计，在400-600nm波长激发光下，测量其600-800nm范围的发射光谱，密度归一化后，建立浮游植物荧光光谱原始谱库；②然后综合利用小波分析、聚类分析等化学计量学技术构建高位数据空间，将浮游植物活体三维荧光光谱投影到所构建的高维正交空间，每个空间上的投影为特征谱的特征段，在各投影空间中选择稳定而特异性强的荧光特征段，提取浮游植物荧光特征谱，建立浮游植物荧光光谱特征谱语库；③以此谱库为基础，借助多元线性回归分析技术及非负最小二乘法建立在未发生赤潮时在门类水平上测定浮游植物群落组成，赤潮发生时在属水平上识别引发赤潮的浮游植物的荧光鉴别方法，对浮游植物样品荧光光谱进行分析在实际应用中，通过测定叶绿素含量来确定发生赤潮与否，从而运用相应的荧光特征语库和鉴别方法。①海洋浮游藻类分离、纯化和培养根据我国近海海域特别是东海的赤潮及生物调查资料，选取近海海域最常见的能够基本反映近海海域浮游植物生态特征的37种浮游植物。针对选取的每一种藻，参照manualonharmfulmarinemicroalgae(2003，publishedbyUnitedNationsEducational,ScientificandCultureOrganization)中的标准方法，分离、纯化和培养目标藻种。②浮游植物荧光识别测定方法的建立根据我国近海浮游植物群落组成特点和赤潮发生时浮游植物群落结构特点，浮游植物荧光鉴别技术在两个水平上实现，即海域正常生态状况下在门类的水平上对浮游植物群落组成进行识别测定，而在发生赤潮时，在属的水平上对引发赤潮的浮游植物进行鉴别。在实际应用中，通过测定叶绿素含量来确定发生赤潮与否，从而运用相应的荧光特征语库和鉴别方法。本技术运用小波分析等技术实现研究目标。A浮游植物荧光标准谱库的建立令小波分析技术本研究运用小波技术等化学计量学方法，构建特定高维空间，将三维荧光光镨投影于高维空间，通过比对分析，选择各空间中特异性强且在不同生态环境条件下具有良好稳定性的荧光分量组成赤潮浮游植物荧光特征谱，在此基础上，利用多元线性回归及非负最小二乘技术建立能够在未发生赤潮时在门类水平上测定浮游植物群落组成，赤潮发生时在属水平上识别引发赤潮的浮游植物的荧光鉴别方法。小波分解的基本原理如下在线性假设条件下，(1)式给出了多种藻类混合物的荧光光谱为p(/)-I]c(附)h(m,/)")其中为多种藻类混合物的荧光光谱，i/(/w，/),(/=1,2,…M，/=1，2，…"为单位浓度藻类的荧光光谱，/为测量频点数，m为藻种编号。(1)式两边同时乘以窗函数w(/)得WW)=J]c(m)(/)(2)对(2)式作多尺度分析。选择适当的正交尺度基其相应的小波基为^,，设^和A分别是由尺度基和小波基构成的第7层尺度空间和小波空间。利用尺度空间和小波空间的关系①丄"(3)②①w(4)12其中，下标7表示多尺度分析的层数，~,"=1>)伊","(/)，(6)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>(8)(9)/=i"*"表示共轭，下标y和"分别表示尺度伸缩和尺度函数沿Z轴的平移。对于给定的尺度伸缩因子或多尺度分析的层数7，尺度基"(/)和小波基是正交的，即满足/-1①^I0n#n'<">=1A,"(/>(,)=丄n=n.(10)②.0n#n'n=n'③<">=s(/￥(,)=°:由(3)—(12)式可以确定(11)(12)(13)=yC(历)《"n=1,2,"-,F/2,炎=1,2,",j(14),由于变换是正交的，各个测量分其中">是尺度分量，4是小波分量量间不相关，我们在解算QW时，可以任选^或^中的某些分量来解算。尺度分量(也叫低频分量)反映的是测量数据^"上较多测量频点的信息(低频分量反映较大尺度的信息)，小波分量(也叫高频分量)^反映的是测量数据^乃上较少测量频点的信息(高频分量反映较小尺度的信息)。13根据已知的单位浓度藻类荧光光谱"—，乃,加",2,..《/^,2,…^选择合适的正交尺度基对其进行多尺度分析[(7)式和(9)式]，得到相应的尺度分量和小波分量。在尺度分量和小波分量中选取若干分量构成分类估计的特征。成功的运用小波分析关键取决于如下参数的选择①小波基函数的选择；②尺度分量和小波分量的选择。①小波基函数的选择为保障分解的正交性，须采用正交小波基，如Haar小波、Daubechies小波系、Meyer小波等。恰当的正交小波基分解能够凸显藻类单位浓度荧光光谱的尺度分量和小波分量的最大差异。本发明选择DB7和COIF2小波基函数。②尺度分量和小波分量的选择由于采用了正交分解，使得每个尺度分量或小波分量都满足线性关系。这使得给了只选择部分尺度分量或小波分量来解巻积成为可能。选择差异较大的分量或分量组合来解巻积，一方面可以放大差异，提高正确分类概率，另一方面可以压缩数据量，减小计算量。i特征选取小波特征谱定义为原始荧光光谱在小波空间的投影，每个小波空间上的投影为小波特征谱的特征段，在实际应用中可根据需要选择合适的特征段或其组合作为识别特征谱。本发明将采用Bayes判别分析法进行选择Bayes判别分析法是模式识别中的一个基本方法，这种方法既考虑了各类参考总体出现的概率大小，又考虑了因误判造成的损失大小，适用于在样本数量不充分大，大子样统计理论不适宜的情况下进行状态判别，适合^究使用。Bayes判别法的基本应用原理如下假设作为训练集的na条光谱均由附个变量A，A，…，&组成，都来自需要进行分类的1种浮游植物K，""4。对于另外的nx条荧光谱，每一条谱用矢量标记为p"，^，…，"，需要判定来自哪一种浮游植物。即，把^看作w维空间中的一个点，Bayes准则就是找出把空间及("°分为互不相交的1个完备子空间^A，…，^的一种划分方法。一旦子空间划定之后，荧光光谱x就必然落在且仅落在这1个完备子空间中某一子空间^中，则把^划入第g种类4，即，判定出^属于哪种浮游植物的荧光光谱。在分类过程中，利用"最大似然分析测试"(likelihoodratiotest)的计算来得到最佳的分类结果。本方法在给出一种谱的判别正确率的同时，能够通过作图一目了然的看到其被误判的概率和归属。本发明选择了DB7小波第二层尺度分量以及第二、三层小波分量作为特征谱；选择了COIF2小波第三层尺度分量特征语以及第二、三层小波分量作为特征谱。利用Bayes判别分析法筛选并确定浮游植物荧光特征谱，在研究中，我们发现，不同正交小波函数所提取的浮游植物荧光特征i普，对不同类别的浮游植物具有不同的分类能力，并且这些特征谱在识别能力上具有很强的互补性。因此，本研究按照识别能力及互补性，建立了四级谱库。ii标准i普库建立浮游植物荧光光i普会受生长环境的光照，温度及生长期等因素的影响，因此本发明将进行多个条件下的浮游植物培养实验，获得反映浮游植物不同生长条件下的荧光特征语，但由于同种浮游植物不同条件下的大多数识别特征谱是相似的，而同门类不同种的浮游植物和同属类不同种的浮游植物的大多数识别特征谱也是相似的，大量相似特征谱的存在会对识别产生不利影响，因此，需要提取出能够代表各门类和各属浮游植物荧光特征且尽可能少的特征谱一一浮游植物荧光标准谱。本发明采用系统聚类法来获得浮游植物的门类水平和属水平上的标准谱。将同门类或同属类所有浮游植物在不同培养条件下的荧光特征谱进行聚类分析，对聚为一类的荧光特征i普取平均得到荧光标准谱。系统聚类法是聚类分析中应用最为广泛的一种方法，其聚类原理是首先将一定数量的样品或指标各自看成一类，然后根据样品或指标的亲疏程度，将亲疏程度最高的两类进行合并，然后考虑合并后的类与其他类之间的亲疏程度，再进行合并，重复这一过程，最后可将所有的样品合并为一类。聚类过程可以用称为谱系图的聚类树来形象地表达出来。本发明根据需要确定所需要聚的数目。令多小波技术和小波包技术多小波是指有两个或两个以上的函数作为尺度函数生成的多小波。多小波集对称性、光滑性、短支持性、正交性和高阶消失矩于一身的良好特性。多小波的基本思想是将单小波中由单个尺度函数生成的多分辨分析空间，扩展为由多个尺度函数生成，以此来获得更大的自由度。因此多分辨分析与多小波的生成是密切相关的，是构造多小波的重要方向之一。相对于单小波而言，多小波具有更强的分辨能力，所以在信号处理方面更有优势。在小波变换的多分辨率分析中，对信号进行了有效的逐层分解，但每层分解都是将上层分解的低频信号再分解为低频和高频两部分，没有对高频部分再进行分解，因而高频段的分辨率较差。小波包分析是对多分辨率分析的一种改进，它将没有细分的高频部分作进一步分解，使信号在全频带内进行分解，并能进行频带的选择，因而是一种更加精细的信号分析方法，具有更广泛的应用价值。就其对荧光光谱特征提取而言，能够更加充分的利用高频部分的信息，从而提取到更为精细的信息。多小波和小波包的运用类似于小波分析技术，在此不再赘述。B浮游植物荧光鉴别方法建立令非负最小二乘法在特征谦确立的基础上，建立相应的识别测定方法建立的特征光语为A—九，A2，……，/切)，其中，/*为*门类浮游植物标准谱，九为*门类浮游植物特征i普的第z'个数据点。样品测定后可以获得与特征谱对应的谱向量F=(Fi，F2，……，F"),其中，巧为样品的第z'个数据点。每种藻对荧光光谱的贡献()可以通过解下列线性回归方程得到F=然而，在实际情况中，这种叠加性会受到浮游植物种类以及光谱区域的影响而呈现不一致性，为此在利用非负最小二乘法解方程时引入了权重因子w",52"丄x2(ap"2,…fl5)-22>眞、4=1是总误差，是^的非线性函数。该方程的非线性最小算法已经成熟，即使用迭代程序，首先给分母的^赋初值("*=1),然后计算分子的^，在将新的^值赋予分母，计算分子"、如此循环，直到分子A与分母A相等。当某门类的藻的计算结果出现负值时(可能是由于该门类藻浓度低，而受噪音影响)，即迭代出现负的^时，下一次迭代时该^作为o不再参与迭代。w"是通过各赤潮浮游植物荧光特征谱在不同特征段的数据的离散性(标准偏差)获得的气=。下面结合附图并通过具体实例来进一步说明本发明。如图1所示，该方法的具体操作程序如下对于一个位置样品，首先测定荧光光谱，然后计算叶绿素含量，如果叶绿素含量未超过赤潮阈值，该样品荧光光i普进入门类识别测定程序，即使用门类标准谱库进行识别分析；如果叶绿素含量超过赤潮阈值，该样品荧光光镨首先进入门类识别测定程序，得到分析结果后在进入相应门类的属水平识别测定程序，即使用相应门类的属标准谱库进行识别分析。一、浮游植物荧光光i普获得所选的37种中国东海赤潮多发区的浮游植物优势种、赤潮种浮游植物(见表1)。表l实验选用的37种浮游植物<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>浮游植物在实验室内进行培养，定时取样进行荧光光谱测量，每种藻测量完毕，再进行混合藻的光i普测定。每个样品平行取样测量两次。光谱范围-.激发波长400-600nm，发射波长600-800nm,步长5nm，激发狭缝5nm,发射狭缝5nm，扫描速度12000nm/min。二、浮游植物荧光光谱谱库的建立1.浮游植物荧光光镨特征提取及荧光特征i普库的建立——小波分析和聚类分析如图2所示，其横坐标表示荧光激发波长(EX)，纵坐标表示荧光发射波长(EM),竖坐标表示荧光强度。原始三维荧光光谱由于含有Rayleigh散射等散射效应(如图2a和图2b所示)，掩盖了光镨的本征特征，不容易有效提取其光谱特征，因此首先将原始三维光谱数据中Rayleigh散射带等通过Delaunay三角插值法去除，再对处理后的光i普依次进行小波分解。各小波分量和尺度分量作为候选特征光谱。通过bayes判别分析技术，对个候选特征谱的分类识别能力进行分析，选择选择了DB7小波第二层尺度分量以及第二、三层小波分量作为特征谱;选择了COIF2小波第三层尺度分量特征谱以及第二、三层小波分量作为特征语。如图36所示，图中各部分颜色表示量值大小，数值从小到大，颜色从深蓝到红色；图中曲线峰值表示此处的荧光强度达到高值，而低估则表示荧光强度较弱。实验所选的37种浮游植物均来自中国海洋大学海洋污染生态化学实验室。用过滤后的天然海水和营养液按照配方配制培养基，并用lmol/L的HC1溶液调节pH在8左右。培养箱的温度梯度为20°C,25。C光照梯度为200001ux，120001ux,70001ux，40001ux。光照照射周期为12h:12h。每种藻平行培养两份。浮游植物的培养周期为12d，以JobinYvon公司生产的Fluorolog3-l1荧光分光光度计每隔48小时测量一次。扫描参数设置激发波长400600nrn，发射波长600800nrn，步长为5nm,狭缝宽度为5nm。扫描信号积分时间为0.05s。每份样品平行测定两次。使用由bbemoldaenke公司生产的BBE荧光藻类分析仪测量部分样品的叶绿素浓度，然后两两混合，使优势藻的叶绿素浓度占75%。图3是37种藻DB7小波第二层尺度分量特征谱。图4是37种藻DB7小波第二、三层小波分量特征谱。图5是37种藻COIF2小波第二层尺度分量特征语。图6是37种藻COIF2小波第二、三层小波分量特征谱。3.浮游植物标准荧光光谱谦库的建立系统聚类法是聚类分析中应用最为广泛的一种方法，其聚类原理是首先将一定数量的样品或指标各自看成一类，然后根据样品或指标的亲疏程度，将亲疏程度最高的两类进行合并，然后考虑合并后的类与其他类之间的亲疏程度，再进行合并，重复这一过程，最后可将所有的样品合并为一类。聚类过程可以用称为谱系图的聚类树来形象地表达出来。本专利根据需要确定所需要聚的数目。对于37种藻共获得189条DB7尺度分量标准谱及173条DB7小波分量标准谱，分别组成这些藻的1级标准谱库和2级标准语库。获得179条COIF2尺度分量标准谱及191条COIF2小波分量标准i普，分别组成这些藻的3级标准谱库和4标准i普库。谱库的使用程序是首先使用l级谱库进行识别分析，如果识别结果落在该谱库能够正确识别的藻种范围，则给出识别测定结果，如果识别结果落在该i普库不能够正确识别的藻种范围，则进入下一级能够正确识别该藻种范围的i普库，依次类推，直至给出最为可信的结果。三、浮游植物荧光识别测定方法在特征i普确立的基础上，建立相应的识别测定方法建立的特征光谱为/*=(/，/，……，厶)，其中，A为A:门类浮游植物标准谱，厶为A;门类浮游植物特征谱的第z'个数据点。样品测定后可以获得与特征谱对应的i普向量F=^，F2，……，,")，其中，《为样品的第'个数据点。每种藻对荧光光谱的贡献(&)可以通过解下列线性回归方程得到F=2>^，然而，在实际情况中，这种叠加性会受到浮游植物种类以及光谱区域的影响而呈现不一致性，为此在利用非负最小二乘法解方程时引入了权重因子化/5、"1是总误差，是A的非线性函数。该方程的非线性最小算法已经成熟，即使用迭代程序，首先给分母的"*赋初值(^=1),然后计算分子的"t，在将新的A值赋予分母，计算分子"4，如此循环，直到分子化与分母A相等。当某门类的藻的计算结果出现负值时(可能是由于该门类藻浓度低，而受噪音影响)，即迭代出现负的"t时，下一次迭代时该^作为0不再参与迭代。化是通过各赤潮浮游植物荧光特征谱在不同特征段的数据的离散性(标准偏差)获得的3.识别测定结果该技术对37种浮游植物组成的1500多个单种藻样品及混合藻样品可分别在属水平上获得90%及85%的正确识别率，门类水平上的识别正确率保持在95%以上；对混合样在属与门类水平上可分别获得88.2%及97.1%正确识别率。可对浮游植物混合样中作为第一优势种的Al、Pr、Pm、Ma、Gy、Gs、Sc、Km、Ps、Sk、Cl、角毛藻(Cu、De、Di)、Tr、Ha、Cm、Is、Ks、PP、Ch、Pl、Ds、Pu、Mp、Cy、Rs及Ra等藻种实现门、属层次上的正确识别(获得100%正确识别率)。权利要求1、一种浮游植物群落组成快速测定方法，包括以下步骤(1)获得浮游植物荧光光谱原始谱库；(2)构建高维正交空间，将浮游植物荧光光谱原始谱库投影到该高维空间，提取浮游植物荧光光谱特征，建立浮游植物荧光光谱特征谱库；(3)对浮游植物样品荧光光谱进行识别分析，给出所测样品中所含浮游植物的种类和/或数量。2、根据权利要求1所述浮游植物群落组成快速测定方法，其特征在于，所述荧光光语包括由荧光分光光度计获得的连续三维荧光光谱，多激发荧光光谱仪获得的离散三维荧光光谱。3、根据权利要求1所述浮游植物群落组成快速测定方法，其特征在于，所述构建高维正交空间的方法为通过小波分析:技术构建高维正交空间。4、根据权利要求3所述浮游植物群落组成快速测定方法，其特征在于，所述小波分析技术包括多小波技术和/或小波包技术。5、根据权利要求1所述浮游植物群落组成快速测定方法，其特征在于，所述步骤(3)进一步包括(3)利用多元线性回归和非负最小二乘解析建立浮游植物焚光识别分析技术，对浮游植物样品荧光光谱进行识别分析，给出所测样品中所含浮游植物的种类和/或数量。6、根据权利要求1所述浮游植物群落组成快速测定方法，其特征在于，所述步骤(2)进一步包括(2)利用正交小波函数构建高维正交空间，将浮游植物焚光光谱原始i普库投影到该高维空间，在各投影空间中选择稳定而特异性强的荧光特征段或特征段组合，作为浮游植物荧光特征谱，通过聚类分析技术构建浮游植物荧光光谱特征镨库。7、根据权利要求1所述浮游植物群落组成快速测定方法，其特征在于，所述步骤(3)进一步包括(3)对浮游植物样品荧光光谱进行识别分析，给出所测样品中所含浮游植物的种类和/或数量借助多元线性回归在未发生赤潮时在门类的水平上测定浮游植物群落组成，发生赤潮时在属的水平上识别测定引发赤潮的浮游植物。8、根据权利要求3所述浮游植物群落组成快速测定方法，其特征在于，所述通过小波分析技术构建高维正交空间，通过下列步骤实现采用Haar小波、Daubechies小波系或Meyer小波，选择DB7和COIF2作为小波基函数；小波特征谱定义为原始荧光光谱在小波空间的投影，每个小波空间上的投影为小波特征谱的特征段，采用Bayes判别分析法，根据需要选择合适的特征段或其组合作为识别特征谱。9、根据权利要求5所述浮游植物群落组成快速测定方法，其特征在于，所述非负最小二乘法，通过下述步骤实现建立的特征光语为/*=C/h，/m，……，厶)，其中，A为A:门类浮游植物标准谱，人为A:门类浮游植物特征谱的第''个数据点；样品测定后获得与特征语对应的谱向量F=(A，f2，……，。，其中，《为样品的第z'个数据点；每种藻对荧光光语的贡献(A)通过解下列线性回归方程得到权重因子气'■=i、A:=l^是总误差，是A的非线性函数，使用迭代程序，首先给分母的"*赋初值(^^1),然后计算分子的^，在将新的"4值赋予分母，计算分子^，如此循环，直到分子A与分母A相等；当迭代出现负的^时，下一次迭代时该^作为0不再参与迭代；、是通过各赤潮浮游植物焚光特征谱在不同特征段的数据的标准偏差获得的^=。10、根据权利要求1所述浮游植物群落组成快速测定方法，其特征在于，所述步骤(2)中，建立浮游植物荧光光谱特征谱库的步骤进一步包括将原始三维光谦数据中Rayleigh散射带通过Delaunay三角插值法去除，再对处理后的光谱依次进行小波分解，选择DB7小波第二层尺度分量以及第二、三层小波分量，COIF2小波第三层尺度分量特征语以及第二、三层小波分量作为特征谱。全文摘要本发明公开了一种浮游植物群落组成快速测定方法，包括以下步骤(1)获得浮游植物荧光光谱原始谱库；(2)构建高维正交空间，将浮游植物荧光光谱原始谱库投影到该高维空间，提取浮游植物荧光光谱特征，建立浮游植物荧光光谱特征谱库；(3)对浮游植物样品荧光光谱进行识别分析，给出所测样品中所含浮游植物的种类和/或数量。本发明方法根据我国近海浮游植物群落组成特点和赤潮发生时浮游植物群落结构特点，基于浮游植物荧光光谱，建立的一种在未发生赤潮情况下能够在门类的水平上测定浮游植物群落组成，赤潮发生时在属的水平上识别测定发生赤潮的浮游植物的荧光鉴别方法。文档编号G01N21/64GK101561395SQ20091011985公开日2009年10月21日申请日期2009年3月20日优先权日2009年3月20日发明者张传松,段亚丽,王修林,苏荣国申请人:中国海洋大学