样品中感兴趣结构的高空间分辨率成像的制作方法

专利名称：样品中感兴趣结构的高空间分辨率成像的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于样品中感兴趣结构的高空间分辨率成像的方法，所述方法包括权 利要求1的前序部分的特征。
背景技术：
WO 2006/127692 A2公开一种用于样品中感兴趣结构的高空间分辨率成像的方 法，其中使用以所谓的可光学变换(phototransformable)的光学标记为形式的可切换荧 光染料对感兴趣结构进行标记。将标记的子组(subgroup)分别激活为该标记的子组能够 被激发以发射荧光的状态。各自的子组包括如此少的标记以使得这些标记位于到彼此的距 离大于用于将样品成像到传感器阵列上的空间分辨率极限的位置。这使得在将子组的标记 激发为发荧光之后，能够以比应用于将样品成像到传感器阵列上的空间分辨率的衍射极限 更好的分辨率定位(localize)荧光的初始位置，从而也以该提高的分辨率分别记录被标 记的感兴趣结构的点。在WO 2006/127692中限定了可光学变换的光学标记，其中这些光学 标记能够由激活信号开启到这些光学标记可以被激发以发射荧光的状态。该激活信号可以 与随后将标记激发为荧光的激发光相同。在WO 2006/127692中公开的可光学转换的光学 标记的更加具体的实施例仅仅包括可光学激活的荧光蛋白质，即只有在已经吸收了至少一 个光量子之后才变为荧光团的分子，或者换句话说，这些分子在成为荧光之前需要被初始 开启。激活或者切换过程需要改变分子的分子结构(原子团的重新定位或者甚至键的断开 或者形成键合)。WO 2006/127692公开的方法也被称为PALM(光学激活的定位显微术)。
被称为STORM(随机光学重构显微术)并且由Rust等人在Nature Methods, 3, 793-796(2006)中描述的类似方法同样使用可切换为荧光状态的分子，即可切换的荧光染 料，尽管这些不是蛋白质而是可光学切换的有机荧光团，尤其是荧光染料Cy3和Cy5。已知 这些青色素(cyanine)染料能够在不同的构象(conformational)状态，特别是同质异构状 态，之间切换。
PALM和Storm方法的缺陷在于，不能够预测样品中感兴趣结构将何时被记录到这 样完全的程度而使得确定进一步分子的位置将不会提供任何附加的有用信息并且因此终 止了该方法。
^fc C. Geisler, A. SchOnle, C. von Middendorff, H. Bock, C. Eggeling, A. Enger 和 S.W.Hell 在 Appl.Phys.A 88,223-226(2007)中发表的标题为 “Resolution of λ /IOin fluorescence microscopy using fast single molecule photo-switching，，的文章中描 述了一种用于样品中感兴趣结构的高空间分辨率成像的方法，该方法包括权利要求1的前 序部分的特征，并且被称为PALMIRA(具有独立运行的采集的PALM)。这里，使用可切换的 荧光蛋白质标记样品中感兴趣结构。具体地说，是名称为rshstLime的蛋白质，通过波长 为488nm的光，不仅在其初始状态下被激发为发荧光而且还被部分地关闭为非荧光状态并 且自此再次被局部切换回到其荧光状态。内在机制是荧光团的构象改变。利用仅具有单一 波长的光，可切换的荧光蛋白质的这些特性使得能够交替地建立蛋白质的可发荧光的分子的子组，在该子组中，可发荧光的分子位于比衍射极限大的共同间隔处，并且将可发荧光的 分子激发为发荧光。从而能够连续，即以高频率，记录图像，该图像注册(register)荧光分 子的交替子组，并且能够以超出衍射极限的精度确定图像中各自注册的分子的位置。利用 图像的求和，以比衍射极限精细的空间分辨率记录样品中的结构。
由上面解释的方法使用的可切换荧光蛋白质已经在US 2004/0212799A1和US 2006/0038993 Al中描述的用于样品中感兴趣结构的高空间分辨率成像的方法(被称为 RES0LFT (可逆可饱和的光学荧光转换))中首次使用。
与基本上公知并且可用的荧光染料的总数量相比较，可用于RESOLFT、PALMIRA、 PALM和STORM方法的可切换蛋白质和荧光团的范围很小。既可切换(处于一种切换状态 下)又能够发荧光的染料非常稀少。因此，通过复杂的方法合成和优化染料。除此之外，切 换行为和发荧光行为强烈依赖于分子的化学环境。对于可切换的荧光蛋白质和可切换的 有机荧光团都是如此。这一缺陷被认为是根本性的，并且除此以外其还与以下事实相关联 即，分子的发荧光和切换是相互竞争的分子过程，即来自相同激发状态的分子过程经常彼 此竞争。与不可切换的有机荧光团和不可切换的荧光蛋白质的多样性相比较，可切换的荧 光染料在其发荧光状态下的亮度，即在重复激发期间来自分子的荧光的相对产量，也通常 是很小的。然而，为了获得可由用于对感兴趣结构成像的前述方法而实现的高空间分辨率， 不得不容忍(date being tolerated)由于可切换的蛋白质或者荧光团导致的强烈限制。
在所谓的GSD (基态耗尽)显微术(S. Bretschneider 等人在 Phys. Rev. Lett. 98， 218103(2007)中发表的标题为 “Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving”的文章)中，通过将位于各自测量点外部的各自荧光染 料从其电子基态转换为暗电子状态来克服用于对样品中由荧光染料标记的结构成像的衍 射极限，其中在电子基态下，各自荧光染料能够通过激发光被激发为发荧光，并且在暗电子 状态下，荧光染料无法发荧光。这在通过削减具有与激发光相同波长的光来将测量点处的 剩余分子激发为发荧光之前进行。暗电子状态通常是三重状态，而荧光染料的基态是单重 状态。分子通常被从该暗状态热返回，即非(光学)切换，到电子基态，从而仅具有单一波 长的光，即激发光，对于执行本实验是必需的。发明内容
本发明的问题在于提供一种用于样品中感兴趣结构的高空间分辨率成像的方法， 所述方法包括权利要求1的前序部分的特征，其利用被称为PALMIRA、PALM和STORM的方法 的分辨率优点并且避免关于适合的可切换荧光染料的有限数量的缺点。
通过根据独立权利要求1的方法解决所述问题。该新颖方法的优选实施例在从属 权利要求2到20中限定。
尤其令人惊奇的是，尽管本发明的方法与被描述为PALMIRA的方法具有基本相同 的过程，但是本发明的方法不具有可切换的蛋白质或者荧光团。而是使用其中第一状态和 第二状态是物质的不同电子状态的一种物质作为该新颖方法中的荧光染料，即该物质的状 态仅在电子方面彼此不同。然后，该物质没有落入US 2004/0212799 Al和US 2006/0038993 Al中用于标记的物质的定义中，并且可以是任何传统的不可切换的荧光染料。除了电子基 态之外，实际上所有传统的荧光染料都具有电子暗状态，这些荧光染料能够从该电子基态被激发为发荧光，并且这些荧光染料可以利用具有与能够用于激发荧光的相同波长的光以 由于激发导致的相关速率转换为电子暗状态。这些通常是作为可发荧光基态的单重状态和 作为暗状态的三重状态。在正常的荧光显微术中，荧光染料到其非荧光三重状态而不是其 激发的单重状态的部分转换，特别是利用激发光的高强度，被认为是一缺点，因为其降低了 来自样品的荧光的产量。在本发明中，可以特别利用这一效果，因为仅在来自分子的荧光被 隔离注册时，即与相邻分子的荧光分开时，才以好于衍射极限的分辨率记录可以用于标记 样品中感兴趣结构的物质的任何单独分子的位置。为此，仅有很少分子应该分别处于第一 状态下。
在本发明的新颖方法中，实现修改样品中荧光染料的非荧光第二状态的寿命的措 施通常是有利的。然而，与传统的荧光显微术相比较，这通常涉及延长而非缩短非荧光第二 状态的寿命。造成这样的寿命延长的措施包括将样品冷却到低温，在该低温下将热激发降 低到碰撞诱发的转换，降低样品中终止荧光染料的三重状态的氧气浓度，例如利用结合氧 气的葡萄糖氧化酶或者通过在真空中进行测量，或者将样品固定或嵌入到例如PVA的聚合 物中。非荧光第二状态的增加寿命使得即使利用具有第一波长的光的较低强度也能够将荧 光染料的大部分保持在非荧光第二状态下。
然而，有时，在该新颖方法中，有目的地降低荧光染料的非荧光第二状态的寿命以 增加从样本收集的荧光的强度并且因而降低总的测量时间，特别是利用荧光染料的低的初 始浓度，甚至是更有利的。这可包括例如利用具有增加荧光染料到其荧光状态的返回速率 的第二波长的光照射样本。
使传统荧光染料从其三重状态进行光学漂白的公知风险在该新颖方法中同样没 有问题。严格地说，对于荧光染料的分子的基础部分来说，在已经被泵浦(pump)到其非荧 光第二状态或者不同的荧光第二状态之后足以一次返回到其荧光第一状态。在该返回之 后，分子被单独注册。它们的随后命运(fate)是无关紧要的。例如，它们可以再次进入到 三重状态并且由此状态进行光学漂白。
在本发明的新颖方法中，在注册剩余的未漂白分子之前，甚至可以故意执行荧光 染料的部分光学漂白。在荧光染料的分子不超出样品中的特定空间密度时，能够尤其有利 地执行该新颖方法，这是因为，之后保持在第一状态下的分子的特定百分比同样不超出特 定空间密度，这对于能够分开注册单独分子是必要的。另一方面，如果样品中荧光染料的实 际浓度超出该特定的空间浓度，则会难于单独注册分子。为了避免这一困难，可以通过利用 具有所述一个波长或者另一个波长的光的高强度的光学漂白永久关掉(turn off)过量的 荧光染料，即被转换为不同于第一状态和第二状态的持续暗状态。该持续暗状态通常不仅 在电学上而且例如也在化学上与根据本发明的用于单独分子的注册中使用的第一状态和 第二状态不同，在该持续暗状态下，记录用于注册单独分子的图像的步骤中不再涉及荧光 染料。
利用对于本领域的普通技术人员公知的不可切换的可商购的荧光染料，例如若丹 明(MiodamineWG，成功执行本发明的新颖方法。与使用该荧光染料的传统荧光显微术相 比，偏离于样本制备中的不同优选细节，为了被执行，具有一个波长的光的强度仅需要利用 通过传感器阵列记录图像的频率进行调谐。通过许多荧光显微镜实现对于此必需的设备需 求。这里，仅需要修改根据本发明的方法的具有一个波长的光的强度的控制。作为替代，改变通过传感器阵列或者包括该传感器阵列的照相机的图像记录的频率。因此，新的荧光显 微镜的区别仅在于对于具有一个波长的光的强度的控制的特殊设计。优选地，在这种情况 下，对于由传感器阵列记录的单独图像，提供在线图像处理。
为了将具有一个波长的光的强度调节到实际上使得能够将空间上彼此分离的单 个分子的荧光注册在单个图像中的值，该评估是便利的。设置用于具有一个波长的光的强 度的值可以是恒定值。这也包括具有比所记录的图像的图像频率高很多的频率的非常快的 脉冲序列。然而，该具有一个波长的光的强度也可以具有利用图像记录的序列临时调制的 强度轮廓(profile)，例如为了在单独图像之间有意建立处于第一状态下的物质的分子的 子组，并且为了在单独图像的记录期间将建立的子组的分子主要激发为发荧光。而且，在这 种情况下，可以将具有一个波长的光连续地(具有时间调制的强度轮廓)或者以在图像的 记录中没有被解析的脉冲形式(同样具有时间调制的强度轮廓)引导到各自感兴趣区域 上。
单独记录的图像的在线评估可以用于确定物质的空间不可分的荧光分子，因此光 的强度可以改变，直到这样不可分的荧光分子的密度落入所选择的阈值之下(通常限定较 低阈值)。通过在线评估记录的图像，确定表现出物质的可分离荧光分子的最大密度，并且 改变光的强度以使得从下面达到用于这样的可分的荧光分子的密度阈值(通常限定较高 阈值)，可以进一步限定适合的强度范围。这是期望的，因为一方面处于荧光状态的分子不 具有如此高的浓度而使得它们不再被彼此单独注册是重要的，并且另一方面低于该极限的 浓度应该尽可能得高以利用每一个图像获得关于感兴趣结构的尽可能多的信息。而且，照 射光的强度应该足够高但同时尽可能低以避免潜在的光损坏。
也可以使用物质对于具有一个波长的光的初始暴露来通过传感器阵列记录样品 中全部物质的荧光的强度分布，该初始曝光主要用于将其基本上转换为其第二状态。该强 度对应于具有样品在传感器阵列上的成像的空间分辨率的样品中物质的浓度分布。
样品中物质的浓度分布表示利用样品中的物质标记的感兴趣结构的位置的概况。 这简化了该新颖方法的进一步步骤，因为其因此能够例如集中于样品中部分被标记的结构 实际存在的那些区域中。这对于利用可切换的以及上述全部可激活的荧光团来说通常是 不可能的，因为可切换的以及上述全部可激活的荧光团的大部分在初始时不处于荧光状态 下，这由于缺乏信号而导致不存在概况。
取决于样品中物质的浓度分布，也可以对于每一个区域调节具有一个波长的光的 强度以进行更加详细的检查，或者至少可以被预设到大致适合的值，并且随后进行精细调 节。而且，可以以样品中物质的浓度分布为基础限定用于样品的相同区域的进一步图像记 录的局部(local)终止标准。样品的区域的附加图像的信息内容减少，同时取决于各自区 域中物质的浓度的信息内容也减少。如果仅有该物质的非常少的分子存在于区域中，则为 了记录分子的高百分比的位置，相对少的图像就足够。在这方面进一步的图像仅贡献冗余 信息。对于区域中物质的非常高的浓度，该情况不同。这里，即使利用许多图像，并且每一 个进一步的图像使新信息可用，也仅记录样品中物质的较小部分。
具体地说，在该新颖方法中，可以将在连续图像中注册的分子的每一个位置不仅 输入到样品中感兴趣结构的高分辨率整体图像中，但是与样品在传感器阵列上的成像的 PSF(点扩散函数)或者导出的函数进行卷积(convolute)，而且也可以输入到初始记录的强度分布的重构中。在该重构已经接近初始记录的强度分布或者具有一定保真度的推导分 布时，不期望利用来自进一步图像的进一步分子的位置的关于感兴趣结构的重要的进一步 信息。对于与PSF或者相关函数的卷积，可以将各自分子的亮度考虑为加权因子。可以采 用各种值作为重构与初始记录的强度分布的相似度的度量，例如互相关、归一化轻度分布 的二次偏差或者简单的差分、或者强度分布的空间频率(傅里叶变换)之间的偏差。
该新颖性方法尤其很好地适用于利用不可切换的荧光团标记样品的感兴趣结 构，通过利用基因技术修改生物样品以使得该生物样品本身表现为不可切换的荧光染料 或者表现为对于该不可切换的荧光染料或者对于耦合到其的结合体的特定结合部位。按 照这种方式，利用经由所谓的小标签或者诸如FIAsh，snap tag或者halo tag的自标记 蛋白质标签的不可切换有机染料尤其有利地标记样品中的感兴趣结构。这些和类似的概 念对于本领域的普通技术人员来说基本上是公知的，例如参见http://WWW. promega. com/ cnotes/cn011/cn011_02. htm 或者 http://www. covalys. com/ 或者 BioForum Europe 6， 51-59(2005)。这使得能够使用广泛传统的荧光染料以高分辨率对生物样品中的蛋白质进 行成像。
对于在该新颖方法中采用的荧光染料，其第二状态是非荧光，即不能够发荧光并 且因此是完全暗的，并不是关键的。也可以是与第一电子状态不同的荧光。如果荧光染料 在这种情况下由与在其第一电子状态下相同的光激发为第二状态下的荧光，则由该荧光染 料在其第一电子状态下发射的荧光能够与由该荧光染料在第二电子状态下发射的荧光区 分开是重要的。
应该理解，该新颖方法可以与对于本领域的普通技术人员熟悉的各种措施结合， 特别是来自被称为PALM和STORM的方法领域的措施。尤其包括对于样品中分子的注册位置 的多彩色成像和三维分辨率的措施，即也对于这些位置沿ζ方向的空间分辨率。这些措施 包括荧光染料从其第一状态的多光子激发，对于荧光以及到其非荧光第二状态的转换，通 过将具有一个波长的激发光聚焦到各自感兴趣平面上并且使用具有高数字孔径4-pi配置 的两个互相相对的物镜以将样品暴露于具有一个波长的光和/或注册来自该样品的荧光。 在随后将光仅聚焦到平面的一个或者多个单独点的情况下，在该方法的所有步骤期间，例 如在每一个单独图像的记录期间，利用这些点扫描该平面。将具有一个波长的光聚焦到样 品的单独点中可以有利地与来自样品的荧光的共焦注册结合。作为替代，可以利用例如由 圆柱透镜形成的具有一个波长的光的光片沿与将样品成像到传感器阵列上的方向正交的 方向暴露样品。该过程对于本领域的普通技术人员来说被公知为SPIM(选择性平面照射)。
实现了比衍射极限更好的空间分辨率的用于执行该新颖方法的荧光显微镜与几 个已知的荧光显微镜的不同之处在于，不需要用于精细地在空间上构造来自任何光源的任 何光的措施来提高分辨率；而是，通过实现对于具有一个波长的光的光源的控制足以调节 根据该方法的具有一个波长的光的强度。
可以附加提供至少一个光学检测器，在该光学检测器上成像与传感器阵列的多个 像素相对应的样品的区域，以观察来自该区域的单独光子的发射的时间先后顺序。如已经 结合该新颖方法所解释的，利用这样的光检测器，能够非常快速地，即特别是即使在传感器 阵列读取之前，建立是否仅将物质的一个或者多个分子的测量信号的强度注册在各自区域 中，例如如果没有发现该强度仅来自单个分子则终止有利于新企图的注册。在到目前为止传感器阵列的读取通常是对于结束该新方法的循环的速率限制因素的情况下，这是非常重 要的。适于执行该新颖方法以及该新颖的荧光显微镜的传感器阵列包括CCD并且优选的是 传统设计的CMOS传感器阵列。然而，在选择时，有必要确保能够快速读取以及暗噪声和读 取噪声足够小以在执行该新颖方法时获得良好的信噪比。


参照下面的附图将更好地理解本发明。附图中的部件不必表示为真实尺寸，而是 强调清晰地说明本发明的原理。在附图中，相同的附图标记指代各附图中的相同部件。
图1示意性表示用于根据本发明的方法对样品中感兴趣结构进行高空间分辨率 成像的荧光显微镜的结构。
图2(A)示出了由所述新颖方法记录的作为感兴趣结构的PtK2细胞的微管蛋白 (microtubuli)的整体图像。该结构利用染料若丹明6G进行染色。所述细胞所处的介 质是具有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的缓冲剂水溶液(50mM三羟甲基氨基甲烷，pH 7.5， IOmM NaCl，葡萄糖氧化酶(Sigma，G2133)，40 μ g/ml 过氧化氢酶(Roche Applied Science, 106810),10% (w/v)葡萄糖)。对于整体图像记录的单独图像的数量是61440，曝光时间是 5ms。光强度是恒定于50kW/cm2。
图2 (B)是对应于图2 (A)中相同对象的分辨率限制图像的重构。该重构通过61440 个单独图像的求和来生成。图2(B)右下方处的小图像示出了图2(A)和2(B)的标记位置 处的轮廓，借助该轮廓可以清晰地看出该新颖方法的分辨率提高。
图3说明了如何使用其暗状态“切换”常规的不可切换荧光团。(a)单重基态&到 第一被激发单重状态S1的重复激发(Exc)引出荧光(Flu)发射并且将分子“切换”到具有 长寿命(τ)的三重状态T1或者其它暗状态D。(b)由荧光染料I h6G、Att0532以及Atto532 加传统用于增加荧光强度的三重淬灭剂(β_巯基乙醇；βΜ)发射的荧光强度对从用于发 荧光的染料发出的连续激发光的强度。(c)在最大暗状态搁置(shelve)(参见附录表1)之 后活性荧光团的恢复。(d)考虑每2-ms时间间隔(time bin)检测的光子数量(/= 115kW/ cm2) PVA中单个Atto532分子的荧光时间轨迹。
图4示出了由根据本发明的被称为伴随有单独分子返回的基态耗尽显微术 (GSDIM)的方法记录的子衍射分辨率图像。(a，b)嵌入在PVA中的PtK2-细胞的免疫染色 (Atto532,绿色或者Atto565，红色)微管和过氧化物酶的GSDIM图像。在右上角示出了落 射荧光(印ifluorescence)图像。(b)中的荧光团标签相对于(a)中反向。(c)水缓冲剂中 的PtK2细胞的免疫染色(I h6G)微管。(d，e)细胞介质中人类神经胶质瘤细胞的免疫染色 (Atto532)整联蛋白-β -3集群的衍射限制(d)和⑶SIM(e)记录。(f，g)利用Citrine-Map2 标记的活性PtK2细胞的落射荧光(f)和GSDIM(g)图像微管细胞骨架。比例条，lym。彩 色条表明每点(spot)定位的事件数量。照相机帧数量72，000(a)，82，000(b)，61，000 (c) 和31，000(d-g)；通过增加全部帧的总体信号获得落射荧光图像。照相机帧速率100Hz (a， b)，200Hz (c-g)。激光强度和波长10kff/cm2 (a)，20kff/cm2 (b)，115kff/cm2 (c_e)，2. 5kff/ cm2(f, g)，532nm(a-e)和 488nm(f，g)。事件的总数量:413, 668 (绿色)和 39，694(红色) (a)，29，819(绿色)和 176，443 (红色)(b) ,870, 699(c)，130，117(d, e)，738，395 (f，g)。
图5说明了通过加入405nm(a)或者671nm(b)光，荧光团从暗状态到亮单重系统的返回的加速并且因而GSDIM显微术中图像采集的加速；注意到，这些波长位于染料的吸 收最大值之外。
具体实施方式
现在将更加详细地参照附图。图1示意性图示了荧光显微镜101。在执行根据本 发明的用于利用荧光显微镜101对样品102中感兴趣结构进行高空间分辨率成像时，经由 镜132提供来自光源104的具有一个波长(黑色线)的光103，并且光103利用透镜135聚 焦到物镜136中。光103用于样品102中整个感兴趣区域的大面积照明。来自样品102中 的荧光染料的荧光105(灰色线)同样由物镜收集，在这种情况下是相同的物镜6，并且利用 二向色镜110与光103分离，而且如果需要，可以通过适合的荧光滤波器139进一步滤波。 结合物镜135，透镜109确保荧光染料的荧光分子在传感器阵列106上的适当成像。
在使用荧光显微镜101执行根据本发明的方法的优选实施例时，执行下列步骤
首先，利用不可切换的荧光染料对样品中感兴趣结构进行染色。
然后将样品嵌入到适合的环境中。这可以例如是PVA，或者可选地是从其中提取了 氧的水介质(例如对于活性细胞)。该措施通常是必需的，因为利用现代技术和传统的荧 光染料，在没有氧浓度降低的水溶液中暗三重状态的寿命不够长到能够分离单独的分子事 件。可以例如通过增加葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶来实现氧减少。这样的水缓冲剂对于显 微术来说是广泛公知的介质。一种也适合于活性细胞应用的原理的介质是
具有IOmM HEPES, 10% (ν/ν)葡萄糖氧化酶(5mg/ml, Sigma,G2133), 2% (ν/ν)过 氧化氢酶 Omg/ml，Roche Applied Science, 106810)的88% (v/v)Gibco-DMEM(Invitrogen Corporation, Carlsbad, California)。
有时，在标记密度，即在荧光染料的空间密度太高时，在开始实际测量之前，必须 通过样品的适合曝光对荧光染料的分子的足够部分进行不可逆漂白。在任何情况下，通过 在开始测量之前使其发光，必须将分子的足够大的部分从其荧光第一状态泵浦到其暗的第 二状态，以使得保持在荧光状态下的很少分子在传感器阵列上的图像彼此距离得比传感器 阵列上的分辨率极限更远。取决于环境和荧光染料，典型强度在1和lOOkW/cm2之间。可以 在开始发光时由传感器阵列记录的荧光的强度分布示出了感兴趣结构的分辨率限制的图 像。这可以随后用作终止标准的参考。实际上，为了记录感兴趣结构的分辨率限制的图像， 不得不调节包括传感器阵列的照相机的曝光时间或者放大倍数，或者由于照相机将通常优 化用于检测单个分子，不得不使用强度滤光器。作为替代，在用于将分子的多样性转换为暗 状态的光信号之前，可以使用具有低亮度的光信号，以记录衍射限制的参考图像。
一旦已经将足够部分的分子泵浦为暗状态，可以没有延迟地开始实际测量，并且 在任何情况下，这必须在比暗状态的寿命更短的时间段内进行。处于亮的第一状态的分子 在被转换回到暗的第二状态之前发射荧光的平均时间表示单独图像的优化曝光时间。在所 使用的示例中，这导致2到IOms的典型曝光时间。在该时间期间，在被转换回到暗状态之 前，来自每一个分子的平均1000个数量级的光子被记录在检测器上。
在测量期间，例如如果通过不可逆漂白丢失了分子，则可调节光的强度以实现处 于第一状态下的分子的优化密度。
整个测量的时段由单独图像的数量及其曝光时间表示。所需的单独图像的数量由选择的终止标准表示。对于更加复杂的结构，典型地记录高达100，000个单独图像。因此 总体记录时间是分钟数量级的。
下面更加详细地解释根据本发明的被称为伴随有单独分子返回的基态耗尽显微 术(GSDIM)的方法的具体实施例。
伴随有单独分子返回的基态耗尽显微术(GSDIM)
本方法涉及以将普通荧光团的大多数“切换”到暗状态，例如三重，并且计算剩余 的或者已经自发返回到基态的那些荧光团的位置为基础，利用该普通荧光团的远场荧光纳 米显微术。(这里以非常广泛的方式使用术语“切换”，并不专门指代在更加具体的意义上 被认为可切换的荧光团)。单个激光器的连续宽视野照射以及连续操作的照相机产生若丹 明和荧光蛋白质标记的(活性)样本的双色图像，验实了简单而强大的超分辨率方案。
几十年来，一直假设任何远场光学显微镜的分辨率受限于光的波长的大约一半。 在发现了基本的荧光团转换可以用于抵消衍射的限制作用u之后，这种观点已经改变。更 具体地说，开启荧光或者关闭荧光的转换使得能够顺序记录比衍射极限更加接近的对象。 因此，并不令人惊讶的是，目前使用的所有远场荧光纳米显微术形态都依赖于使用荧光切 换的变型的时间序列读取。在激励的发射耗尽(STED)显微术1中，使用去激励束切换染料 的荧光能力。在基态耗尽(GSD)显微术2’3中，将荧光团切换到暗的三重状态。与STED相比 较，饱和构图的激发显微术(SPEM或者SSIM)4’5将荧光切换到其最大值。所有这些策略已 经延伸到切换可光学激活的荧光蛋白质和可光学切换的(光致色变的)有机荧光团6。它 们全部使用在空间中平移的一个或者许多强度零为特征的光分布切换荧光，限定出荧光在 给定的时间点7处打开或者关断的坐标。
这在光学激活定位(PALM)8’9或者随机光学重构显微术(STORM)"1中是不同的，其 中在随机光学重构显微术中在空间中逐分子地随机切换标记的荧光能力。稀疏而随机开启 (激活)的分子的荧光衍射模式被记录在照相机上，允许以精确度 △/ Vm计算其位置，其 中Δ表示衍射最大值的宽度并且m表示检测的光子数量"。显然，为了使该概念成立，必 须使分子从暗状态循环到亮状态，产生m个可检测的光子，并且随后返回到暗状态。因此， PALM和STORM使用“可光学激活的”蛋白质或者有机化合物，其中通过吸收光子引出分子的 荧光能力。通过该“激发”光子提供的能量开启荧光团，例如，通过改变化学键或者异构化状 态。这样的化合物的示例是光学可激活的蛋白质EosFP8和PA-GFP9，“受限的(caged) ”若 丹明12以及可光学异构化的青色素染料Cy3和Cy5，这已经用作激活器-发射器对“1和单 个可光学激活的标签13’14。
尽管已经提供了出色的图像，但是这些可光学激活的化合物在生物兼容性，标签 化以及切换性能方面具有局限。此外，它们会需要专用的激活激光器8_1(1’12’14。但是至少，对 于“可激活”化合物的明显需求缩窄了这些技术的范围。这里报告的结果示出了可以使用 标准标记的基础转换在不需要光学激活的情况下执行通过随机单分子切换和定位的远场 荧光纳米显微术将荧光团切换到其三重状态T1或者另一亚稳的暗状态，同时记录仍然剩 余或者已经返回到基态&的那些荧光团。利用普通的荧光团操作并且使光学激活呈现为 可选或者可省略，伴随有单独分子返回的基态耗尽显微术(GSDIM)扩展了远场光学纳米显 微术的概念范围和可应用性。
具有10_3到IOOms寿命(τ )并且实际上在全部荧光团中共同的、最低的三重状态T1是切换分子的主要候选2。此外，T1用作到具有类似或者甚至更长的1到104ms15的τ的 其它暗状态D的入口(图3a)。在时段τ之后，分子返回到&，在该状态下这些分子能够被 重复激发到荧光状态S1，产生计算其位置所需的m个可检测光子的爆发。相同的重复激发 也将荧光团关闭，因为来自S1的分子与T1交叉的典型概率是0.1%。如果τ KS1 的 3ns荧光寿命(τη)长 107倍，则连续波照射强度_1 > Ι3 = Κν/(Φ 3εδ τ)将&分 子的一部分最小化到ε ^ Tfl/Oisc τ << 10%;hv是激活光子的能量并且δ是&中分 子的光子吸收截面。注意，剩余的&分子的最小部分不依赖于I。
由于较大暗状态群体(population)的存在，来自一批(bulk)若丹明染料的信号， 特别是嵌入在聚(乙烯基-乙醇)(PVA)中的若丹明6G(I h6G)和Atto532，随着所使用的 532-nm激活束的强度增加而降低(图北)。值得注意的是，活性染料的大部分在几十毫秒 内恢复(图3c)。三重淬灭剂巯基乙醇的加入降低了 τ并且因此增加了 ε。该实验 表明切换机制中T1的关键作用。在单分子级别上，T1或者D的瞬间群体诱发快速的随机开 关切换；平均接通时间是几毫秒并且断开时间稍微大一些(图3d)。在荧光(接通)单重系 统中花费的时间< 总记录时间的10%。然而，由于一旦它们返回到单重系统中，在时间上每 2ms检测的光子数量达到m > 500，因此荧光团明亮地发射，且m的分布在峰值处为1，000 光子。
嵌入在PVA中并且利用若丹明衍生物Atto532 (发射最大值 550nm)和 Atto565(发射最大值飞90nm)免疫标记的哺乳动物细胞(PtK2系)的微管纤丝和过氧化物 酶的双彩色GSDIM图像示出了传统图像中缺失的细节(图^，4b)。使用同时用于激活和 耗尽的532-nm连续波(CW)激光器以及连续运行的照相机记录图像。GSDIM图像的分辨率 < 30nm(参见附录)。
两种染料的发射峰值之间的差异只是40nm。无论如何，在将短通(< 575nm)信道 中检测的单个隔离发射器的信号与在长通(> 590nm)信道16中检测的单个隔离发射器的 信号相比，能够以> 90%的置信度进行区分。传统的批记录要求数学上未混合。
由常规染料的单重系统提供光子爆发m的事实解释了 m容易超出500个光子的原 因。由于ε τη/Φ^τ，荧光团的τ和Φ is。的大值改善了切换，但是大的Φis。还降低 由ndet。fl/。is。近似的m，并且因而与I无关。(!！她和Φη分别表示仪器的检测效率和荧 光量子产量。)因此，使用具有0is。<0. 和大的τ的标记。后者通过PVA环境提供， 其降低三重淬灭氧的移动性并且产生附加的暗状态15。放置在PVA中的许多荧光团，包括 Alexa488, Texas Red, FITC，若丹明 110 和 Oregon Green 产生 ε ^ 10% 以及大于毫秒的 τ ；它们都适合于GSDIM(附录表1)。m可能大于真正的可光学切换的荧光团中的值，因为 后者进入到关闭状态的概率通常较高。GSDIM得益于标准荧光团对于大的荧光量子产量优 化的事实。
接下来，将样本浸入到包含氧清除剂的水溶液中，通过将τ从大约毫秒增加到 lO-lOOms，能够使ε <10% (附录表1)。浸入到包含葡萄糖氧化酶作为氧清除剂的TRIS缓 冲剂中的利用I h6G免疫染色的微管的GSDIM图像显示了优越的分辨率(图2c)。值得注意 的是，在诸如具有氧清除系统的HEPES缓冲剂的Dulbecco修改的Eagle介质(HDMEM)的细 胞介质中，GSDIM也是可行的。利用Atto532标记的人类神经胶质瘤细胞的整联蛋白-β_3 的集群通过GSDIM比通过传统记录能够被更好地解析(图4d，4e)。
荧光蛋白质也能够被有效转换到诸如三重或者不同质子状态17的亚稳的暗状态。 所有测试的荧光蛋白质，即EGFP，EYFP, Citrine和WiiYFP在水介质中具有ε彡10%并 且τ > 1，并且因而适合于GSDIM(附录表1)。表示熔化于微管相关联的蛋白质Map2的 Citrine的活性PtK2细胞的GSDIM图像，产生微管细胞骨架的标记，说明了与传统的宽视野 图像(图4f，4g)相比较通过GSDIM的标记分辨率增益，而分辨率C40nm)和对比度仍然稍 微低于依赖于免疫染色的记录(图。这是由于荧光蛋白质比有机染料通常更快地 切换到暗状态的事实，将光子的数量m局限为束(参见附录方法)。而且，在该分子结构中 Citrine分子的平均关闭时间相当长(> Is ；附录表1)，这限制了在不可逆漂白之前开关 循环的数量。结果，重构的GSDIM图像的对比度也降低。相比而言，Mi6G分子返回得更快， 更加光学稳定并且更加经常返回。无论如何，由于这些蛋白质在纯水环境中暗状态的寿命 更短(50ms)，Citrine的更强的光学漂白看起来不是基本特性，这意味着Citrine通常比上 述示例中的蛋白质更加光学稳定。尽管寿命的实质变化归因于PH或者分子氧浓度的变化 (附录表1)，但是该示例显现出在GSDIM的特定应用中分子环境的相关性。
荧光耗尽而非激活提供传统的第一图像，给出样本的概览以及何时停止随机图片 组件的指示。由于少于一个单重状态的分子被允许存在于衍射区域中，在该区域中有用荧 光团的可允许的总数量是1/ ε ^ Oisc τ / τ fl，这是染料和环境的函数。对于密集标记的样 本的补救是在成像之前对一些荧光团进行漂白(图4)或者使它们处于非常长期活性的暗 状态下。同样，几个剩余的荧光团的返回速率1/τ可能会在后来的照相机帧中太低，减慢 了图像采集。在这种情况下，可以随后通过经由暗状态吸收17对暗状态(T1或者D)进行附 加的光减少来加速该返回(图幻。通过在图4的记录中增加375-nm光来应用该过程，从 图如中数量为 20，000的图像帧以及图4b和如中数量为 10，000的图像帧开始；在图如 和4g的记录中不使用附加的光。注意，这种类型的激活是可选的并且仍然应用于常规荧光 团。由于GSDIM单独记录分子，其要求荧光团仅恢复到H
总而言之，说明了以利用基本荧光团转换切换单独发射器为基础的远场荧光纳米 显微术。激发并且随后交叉到亚稳的三重(暗)状态关闭标记，而其到基态的自发返回将 它们再次开启，诱发计算其位置所需的光子的爆发。通过随机记录单独分子的位置，GSDIM 实质上与GSD显微术不同(使用零切换光强度限定发射器的位置)。二者的概念均依赖于 相同的分子机制，但是强调在作为实际元素的暗状态和亮状态之间切换的事实能够进行超 分辨率成像。
在任何情况下，强度-零，基于总体的方案以及基于随机单个分子的方案保持确 定附近分子位置的互补形态。后者的形态具有需要较少切换周期的优点，这也归因于GSDIM 当前呈现出比GSD显微术更容易应用的事实。而且，GSDIM尤其简单利用自由操作的照相 机进行连续的落射荧光记录允许利用多个标准染料和荧光蛋白质进行纳米级图像的计算 构建。
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附录
图5示出了在PVA (黑色方块)中Atto532以及嵌入在包含氧清除系统(空心圆) 的水缓冲剂中的PtK2细胞中的Atto532-免疫染色的微管的基态耗尽之后已经恢复的荧 光信号的一部分。测量了探针-泵-探针模式中的荧光恢复。在耗尽之前，第一探针脉冲 (532nm)建立参考信号。通过对于PVA具有聚焦强度/ = lkW/cm2并且对于水溶液具有聚 焦强度lOOkW/cm2的IOms脉冲(532nm)，然后跟随持续0. 5ms并且产生/ = 100ff/cm2的第 二探针脉冲(532nm)实现耗尽。第二探针脉冲相对于耗尽脉冲延迟10ms。如曲线所绘制 的，在泵浦和第二探针脉冲之间的时段中照射具有强度I4(l5nm(a)的405nm光以及具有强度 I671nm(b)的671nm光增加了在耗尽和第二探针脉冲之间的时间段中恢复的荧光的部分。染 料在其暗状态下对405nm或者671nm光的吸收可以经由较高的激发状态诱发暗状态减少， 如对于反向系统间交叉u所观察的。由于较强的暗状态吸收以及到单重系统的反向交叉 和/或由于多个长持续的暗状态的存在，在PVA中效果会更强。
附录表1
对于几个标准荧光团的光学暗状态搁置的参数最大暗状态群体[D]和暗状态恢 复时间τ
权利要求
1.一种用于对样品中的感兴趣结构进行高空间分辨率成像的方法，具有步骤 -从一组物质中选择一种物质，-这些物质包括具有第一荧光特性的第一状态以及具有第二荧光特性的第二状态； -这些物质能够由具有一个波长的光激发以自发地发射荧光； -这些物质能够通过所述具有所述一个波长的光从所述第一状态转换到其第二状态；并且-这些物质能够从其第二状态返回到其第一状态； -利用所述物质的分子标记所述样品的感兴趣结构；-将所述样品成像在传感器阵列上，所述成像的空间分辨率极限大于(即差于)所述样 品中所述物质的最接近的相邻分子之间的平均间隔；-在具有比所述样品在所述传感器阵列上成像的所述空间分辨率极限大的尺寸的至少 一个区域中使所述样品暴露于所述具有所述一个波长的光，所述物质的部分所述分子被所 述具有所述一个波长的光交替激发以自发地发射荧光并且被转换到其第二状态，并且所述 物质中分别处于所述第一状态的所述分子的至少10%与其处于所述第一状态的最接近的 相邻分子的距离大于所述样品在所述传感器阵列上成像的所述空间分辨率极限；-在所述样品连续暴露于所述具有所述一个波长的光的期间，在由所述传感器阵列记 录的多个图像中注册从所述物质的分子的所述区域自发地发射的所述荧光；以及-根据由所述传感器阵列记录的所述图像确定所述样品中分别处于所述第一状态的所 述物质的所述分子的位置，所述分子与其处于所述第一状态的最接近的相邻分子的距离大 于所述样品在所述传感器阵列上成像的所述空间分辨率极限，其特征在于，所述第一状态 和所述第二状态是所述物质的不同电子状态。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述物质是不可切换的。
3.如权利要求1或者2所述的方法，其特征在于，所述第一状态是单重状态并且所述第 二状态是所述物质的三重状态。
4.如权利要求1到3中的至少一项所述的方法，其特征在于，在开始将所述样品暴露于 所述具有所述一个波长的光时，将所述光的强度设置得如此高，以将所述物质转换到其第 二状态，直到所述物质的超过90%的所述分子已经被转换到所述第二状态。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在开始将所述样品暴露于所述具有所述一 个波长的光时，将所述光的强度设置得如此高，以将所述物质转换到其第二状态，直到所述 物质的基本上全部所述分子已经被转换到所述第二状态。
6.如权利要求1到5中的至少一项所述的方法，其特征在于，所述物质选择自包括诸如 以下物质的物质的子组-自发地从其第二状态返回到其第一状态的物质；-通过所述具有所述一个波长的光的作用从其第二状态返回到其第一状态的物质；以及自发地和通过所述具有所述一个波长的光的作用返回到其第一状态的物质。
7.如权利要求1到6中的至少一项所述的方法，其特征在于，实施修改所述样品中所述 荧光染料的所述第二状态的寿命的至少一个措施。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，实施延长所述样品中所述荧光染料的所述第二状态的所述寿命的至少一个措施。
9.如权利要求1到8中的至少一项所述的方法，其特征在于，在记录所述图像之前，借 助于高强度的光通过光学漂白将部分所述物质转换到与所述第一状态和所述第二状态不 同的持续暗状态，所述光选自所述具有所述一个波长的光以及具有另一波长的光。
10.如权利要求1到9中的至少一项所述的方法，其特征在于，在所述图像的所述记录 期间，将所述具有所述一个波长的光的所述强度设定为恒定值。
11.如权利要求1到10中的至少一项所述的方法，其特征在于，在所述图像的所述记录 期间，将所述具有所述一个波长的所述光的所述强度设定为利用所述图像的所述记录的序 列进行时间调制的强度轮廓。
12.如权利要求1到11中的至少一项所述的方法，其特征在于，将所述具有所述一个波 长的光连续导向到所述样品的所述区域上。
13.如权利要求1到11中的至少一项所述的方法，其特征在于，将所述具有所述一个波 长的光以在所述图像的所述记录期间没有被解析的快速脉冲形式导向到所述样品的所述 区域上。
14.如权利要求1到13中的至少一项所述的方法，其特征在于，关于单独记录的图像是 否显示所述物质的不可分的荧光分子，对所述单独记录的图像进行在线评估，并且其特征 在于，所述光的所述强度发生变化，直到这样的不可分的荧光分子的密度下降到低于特定 阈值。
15.如权利要求1到14中的至少一项所述的方法，其特征在于，关于单独记录的图像显 示所述物质的可分的荧光分子的最大密度，对所述单独记录的图像进行在线评估，并且其 特征在于，所述光的所述强度发生变化，直到达到这样的可分的荧光分子的密度阈值。
16.如权利要求1到15中的至少一项所述的方法，其特征在于，在开始将所述样品暴露 于所述具有所述一个波长的光时，通过所述传感器阵列以所述样品在所述传感器阵列上成 像的所述空间分辨率记录所述样品中整个物质的所述荧光的强度分布。
17.如权利要求1到16中的至少一项所述的方法，其特征在于，基于所述样品中整个物 质的所述荧光的所述强度分布限定用于所述样品的相同区域的进一步图像的记录的终止 标准。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，将所述多个图像中的一个图像中注册的 所述物质的分子的每一个位置与所述样品在所述传感器阵列上成像的PSF(点扩散函数) 或者根据其推导的函数进行卷积，并且其特征在于，将该重构与初始记录的强度分布进行 比较。
19.如权利要求1到18中的至少一项所述的方法，其特征在于，通过利用基因技术修 改生物样品以使得所述生物样品自身表现所述物质，以所述物质标记所述样品的感兴趣结 构。
20.如权利要求1到18中的至少一项所述的方法，其特征在于，通过利用基因技术修改 生物样品以使得所述生物样品表现具有对于所述物质的特定结合部位或者耦合到所述物 质的联接体的蛋白质，以所述物质标记所述样品的感兴趣结构。
全文摘要
对于样品中感兴趣结构进行高空间分辨率成像，从一组物质中选择一种物质，这些物质具有两个不同的电子状态荧光第一状态以及非荧光第二状态；这些物质能够通过将其激发为荧光的光从其第一状态部分地转换到其第二状态，并且这些物质能够从其第二状态返回到其第一状态；将所述样品的感兴趣结构成像在传感器阵列上，所述成像的空间分辨率极限大于(即差于)所述样品中所述物质的最接近的相邻分子之间的平均间隔；在具有比所述空间分辨率极限大的尺寸的区域中使所述样品暴露于光，部分所述物质被所述光交替激发以发射荧光并且被转换到其第二状态，并且所述物质中分别处于所述第一状态的所述分子的至少10％与其处于所述第一状态的最接近的相邻分子的距离大于所述空间分辨率极限；并且在所述样品连续暴露于所述光的期间在由所述传感器阵列记录的多个图像中注册由所述物质从所述区域自发地发射的荧光。
文档编号G01N21/64GK102037347SQ200980118266
公开日2011年4月27日 申请日期2009年5月20日 优先权日2008年5月21日
发明者A·舍恩勒, A·艾格纳, C·埃格林, J·弗林, M·博西, S·黑尔 申请人:马克思-普朗克科学促进协会