膜性肾病的诊断的制作方法

专利名称：膜性肾病的诊断的制作方法
膜性肾病的诊断相关申请的交叉引用
本申请要求2008年7月18日提交的美国临时申请NO. 61/081,786的根据35 U. S. C. § 119 (e)的权益，其内容通过完全引用合并在本文中。政府支持
本发明是利用国家卫生研究所授予的款项No. DK067658和DK30932的政府支持作出的。在本发明中政府具有某些权利。
背景技术：
特征在于水肿和尿液中的大量蛋白质的肾病综合征是相对常见的肾的失调，其具有许多可能的原因，包括膜性肾病(MN)、局灶性的和节段性的肾小球硬化症、最小改变的疾病、 糖尿病性肾病、膜增殖性肾小球性肾炎，以及其他原因。虽然存在着改善肾病状况的某些体征和症状的非特异性治疗，对原发疾病的具体认知通常是进行确定性的治疗所必需的。当患有肾病综合征的患者最初被评估为门诊患者或在医院中评估时，医师通常安排一组血液测试来寻找可通过血清学来检测的可能的病因(例如，在尿沉淀中典型的发现物的情境下抗核抗体(ANA)和/或抗双链DNA抗体的存在将表明狼疮肾炎)。当前没有鉴定MN的血清学试验，诊断仅仅依靠肾脏活检，其是一种在许多机构中需要过夜住院的侵入性的操作，并且可能并发主要的内出血。MN可能由许多次级因素引起，例如，全身性红斑狼疮、B型肝炎或梅毒，血液测试常规地进行来寻找这些病因(分别为ANA、抗B型肝炎抗原、快速血浆反应素(RPR))。然而，在美国，MN在起源上更经常地是原发的或自发的，如上所述，当前没有这种形式的血液测试。因而，需要鉴定MN的根本病因，并开发简单的、非侵入性的测试来诊断丽和跟踪对治疗的应答。发明_既述
本发明的实施方式是基于以下发现，自发性膜性肾病(MN)的根本病因是针对M型磷脂酶A2受体(PLA2R)的自身抗体的存在，所述M型磷脂酶A2受体在肾脏肾小球中表达。所述自身抗体主要是IgG4子类的。此外，也存在子类IgGl、IgG2和IgG3的抗PLA2R自身抗体。患有自发的丽的个体的血清具有可检测量的这种自身抗体。了解到自身抗体的存在与丽相关，PLA2R是这些自身抗体的靶标，这允许了用于诊断自发性丽的简单的血清学免疫分析的开发。与肾脏组织活检的当前方法相比，抗-PLA2R自身抗体的这种检测提供了针对自发性MN的快速、精确、低成本、安全和非侵入性的方法。因而，在一个实施方式中，在此提供的是诊断受试者中的MN的方法，所述方法包括检测对PLA2R为反应性的抗体的存在，其中所述抗体在来自受试者的样品中找到。所述抗体可以通过免疫分析来检测，在所述免疫分析中形成抗体-蛋白质复合物。所述抗体在受试者的样品，例如血清中找到。所述受试者是人类，所述MN是自发性的。在所述诊断方法之前，不进行肾脏活检。通过常规的ELISA或Western印迹，健康的个体具有最小的或不可检测的抗-PLA2R自身抗体。患有自发性MN的个体具有显著量的可检测的抗-PLA2R 自身抗体，通过在此描述的常规ELISA或Western印迹，高于来自健康非MN个体的、或健康非丽个体的群体获得的水平的至少10%的检测的抗-PLA2R自身抗体。此外，自身抗体的
7水平与疾病状况的临床特征相一致，即，蛋白尿和肾病综合征。在有效的治疗后症状缓解的患者具有通过常规的ELISA或Wfestern印迹最小的或不可检测的抗-PLA2R自身抗体。作为实例，不可检测量的抗-PLA2R自身抗体，是指在如实施例1中所描述进行的Western印迹分析中观察不到可见条带，其中人类血清1:100稀释，用于此处描述的印迹分析中。在一个实施方式中，如通过实施例1中阐述的常规的ELISA或Western印迹所测定的，在健康非 MN个体中抗-PLA2R自身抗体的量，或在健康非MN个体的群体中的平均量可以被认为是背景、参考或对照水平。来自健康非MN个体的采集的血清样品1:100稀释，用于Western印迹分析中。可见条带的强度通过光密度测定法来定量。光密度测定强度可以用与固定量的抗原PLA2R反应的一系列已知滴度的抗-PLA2R抗体来校准。例如，已知抗体滴度的范围可以是 0 yg/ml、0.5 μ g/mlU. 0 μ g/mlU. 5 μ g/ml,2. 0 μ g/ml、2. 5 μ g/ml,3. 0 μ g/ ml,5 μ g/ml,7. 5 μ g/mlUO μ g/ml 和 15 μ g/ml，固定量的 PU^R 可以是在印迹上 0. 5 μ go通过比较人类样品的光密度测定强度和标准曲线，可能估计样品中抗-PLA2R的滴度。 对于个体的群体采集的数据，计算平均值和一个数量级的标准偏差。理想地，群体是约25 位健康非MN个体，优选的更多。统计学，平均值和一个数量级的标准偏差可以上载到计算机系统和数据存储媒体上。具有超过这种抗-PLA2R自身抗体平均量至少10%的患者可能患有MN，特别是如果所述患者还呈现疾病的显著临床特征，例如蛋白尿和肾病综合征。在一个实施方式中，样品中的自身抗体对PLA2R是反应性的，所述PLA2R是从哺乳动物组织提取的或是重组哺乳动物PLA2R，例如，人类或猪PLA2R。来自受试者的样品可以是血液样品。在其他实施方式中，所述样品是血清或血浆样品。在一个实施方式中，自身抗体通过血清学免疫分析来检测，例如，酶联免疫吸附分析或浊度测量免疫分析。在一个实施方式中，在此提供的是正被治疗膜性肾病的受试者中预后评估的方法，所述方法包括(a)在第一时间点测定对PLA2R为反应性的抗体的水平，其中所述抗体在来自受试者的样品中找到；(b)在第二时间点测定对PLA2R为反应性的抗体的水平，其中所述第二时间点晚于所述第一时间点；以及(c)比较所述两个时间点的抗体水平，其中与所述第一时间点相比在所述第二时间点时抗体水平的降低表明所述治疗是有效的。所述降低是至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少 90%、100%，以及10-100%之间的所有百分比。抗体的水平可以通过免疫分析检测，在所述免疫分析中形成抗体-蛋白质复合物，检测所述复合物。所述抗体在所述受试者的样品中找到，例如血清。在一个实施方式中，所述治疗是免疫抑制治疗。在一个实施方式中，与所述第一时间点相比，在后一时间点，例如所述第二时间点的抗体水平在95-100%或更低，其被认为是低于免疫分析的检测极限，则所述受试者处于MN的症状缓解之中。在一个实施方式中，低于Western印迹的检测极限是在根据实施例1中阐述的方法进行分析时不存在可见条带之时。在一个实施方式中，在此提供的是受试者中膜性肾病的预后评估的方法，所述方法包括(a)在第一时间点测定对PLA^ 为反应性的抗体的水平，其中所述抗体在来自受试者的样品中找到；和(b)在至少第二时间点测定对PLA2R为反应性的抗体的水平，其中所述第二时间点晚于所述第一时间点；其中在所述第二时间点抗体水平降到低于检测极限时表明存在着自发的缓解。所述降低是至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、100%,以及10-100%之间的所有百分比。如在此讨论的，这样的降低表明所述患者相对于在先的读取变得更好。低于检测极限是，与所述第一时间点相比，在抗体的水平降低为95-100%之间以及更多之时。在一个实施方式中，低于Wfestern 印迹的检测极限是在根据实施例1中阐述的方法进行分析时观察不到可见条带之时。在一个实施方式中，当受试者正被治疗MN、以及所述第二时间点的抗体水平低于免疫分析的检测极限时，则所述受试者被认为处于MN的症状缓解中。在一个实施方式中，在此提供的是受试者中膜性肾病的预后评估的方法，所述方法包括(a)在第一时间点测定对PIJ^RS反应性的抗体的水平，其中所述抗体在来自受试者的样品中找到；(b)在至少第二时间点测定对PLA2R为反应性的抗体的水平，其中所述第二时间点晚于所述第一时间点；和(c)比较所述第一和第二时间点的抗体的水平，其中与所述第一时间点相比在后一时间点抗体水平的提高表明存在膜性肾病的复发。所述提高是至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、50%、至少100%、至少200%、至少300%、至少500%、 至少1000%、或更多和包括10-1000%之间的所有百分比。在一个实施方式中，在此提供的是治疗受试者中的膜性肾病的方法，所述方法包括在受试者中从样品中除去对PLA2R为反应性的抗体。所述抗体通过免疫吸附从血液中除去。所述样品在抗体的去除后返回所述受试者。在一个实施方式中，在此提供的是在受试者中治疗膜性肾病的方法，所述方法包括施用有效量的PLA2R或其片段，或表达PLA2R或其片段的载体。在一个实施方式中，在此提供的是用于自发性膜性肾病的治疗的组合物，所述组合物包括施用PLA2R或其片段。在一个实施方式中，在此提供的是有效量的PLA2R或其片段、或能表达PLA2R的核酸分子，例如表达PLA2R或其片段的载体用于受试者中膜性肾病的治疗的用途。在另一个实施方式中，在此提供的是有效量的PLA2R或其片段、或表达PLA2R或其片段的载体在制造用于治疗受试者中的膜性肾病的药物中的用途。在一个实施方式中，适合于治疗或吸附的片段是包含PLA2R的CTLDs或CRDs 4、5 6的片段。在一个实施方式中，在此提供的是免疫分析，其包括使来自受试者的样品与 PLA2R或其PLA2R片段接触；在样品中存在的抗体与PLA2R或其PU^R片段之间形成抗体-蛋白质复合物；洗涤来除去任何未结合的抗体；添加被标记的和对来自样品的抗体为反应性的检测抗体；洗涤来除去任何未结合的标记的检测抗体；将所述标记转化为可检测信号；其中可检测信号的存在表明所述受试者中MN的可能性。在一个实施方式中，在此提供的是免疫分析，其包含使来自受试者的样品与 PLA2R或其PLA2R片段接触；在样品中存在的抗体与PLA2R或其PLA2R片段之间形成抗体-蛋白质复合物；测量由抗体-蛋白质复合物的形成所产生的光散射强度，其中高于对照光散射强度至少10%的光散射强度表明所述受试者中MN的可能性或丽的复发。在一个实施方式中，所述对照光散射强度是在不存在来自所述受试者的样品的情况下PLA2R或 PLA2R蛋白质片段的光散射强度。在另一个实施方式中，所述对照光散射强度是在存在来自非MN健康受试者的样品的情况下PLA2R或PLA2R蛋白质片段的光散射强度。在另一个实施方式中，所述对照光散射强度是从非MN健康受试者的群体获得的平均光散射强度。这样的受试者不具有在此描述的疾病的任何临床特征。所述提高是至少10%、至少20%、至少
30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、100%，以及10-100%之间的
所有百分比。在一个实施方式中，所述光散射强度是在浊度计中测量的。 在一个实施方式中，所述MN是自发性的。在其他实施方式中，所述受试者是人类，
所述样品是血液样品。在另一个实施方式中，不对所述受试者进行肾脏活检。 在一个实施方式中，所述PLA2R是哺乳动物PLA2R、人类或猪PLA2R蛋白质。在一
个实施方式中，所述PLA2R或其PLA2R蛋白质片段被沉积或固定在固相支持物上。在另一
个实施方式中，已知量的PLA2R或PLA2R蛋白质片段沉积或偶联到固相支持物上。在其他
实施方式中，所述支持物可以处于量杆、测试条、乳胶珠子、微球体或多孔平板的形式。在一个实施方式中，所述抗-PLA2R自身抗体是IgG子类IgGl_4的。在一个实施方式中，所述检测抗体通过共价连接到酶、具有荧光化合物或金属的标记物、或具有化学发光化合物的标记物来标记。在另一个实施方式中，所述检测抗体是对受试者特异反应性的， 例如，如果所述受试者是人类，所述检测抗体特异于人类。在一个实施方式中，可检测信号与一组可检测信号相比较，所述一组可检测信号来自从量递增的已知量的PLA2R或片段的免疫分析得出的滴定曲线。在一个实施方式中，所述免疫分析对在一段时间内获得的、来自受试者的多个样品进行。所述多个样品在至少两年的时间每两个或三个月获得。每个免疫分析的可检测信号或光散射强度与获自在先时间点的样品的可检测信号或光散射强度相比较，其中检测信号或光散射强度的至少5%的降低表明所述受试者中有效的MN治疗。所述降低是至少10%、 至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、100%，以及 10-100%之间的所有百分比。在一个实施方式中，在此提供的是用于鉴定来自受试者的样品中对PLA2R为反应性的抗体的存在或水平的设备，包括至少一种PLA2R蛋白质或其片段；和至少一种固相支持物，其中所述PLA2R蛋白质或其片段沉积在所述支持物上。所述PLA2R蛋白质或其片段沉积在所述固相支持物上，固定在所述支持物上，所述固相支持物是量杆、测试条、乳胶珠子、微球体或多孔平板的形式。在一个实施方式中，所述设备进一步包含第二标记的PLA2R蛋白质或其片段，其产生可检测信号。在另一个实施方式中，所述设备进一步包含检测抗体，其中所述检测抗体特异于所述受试者的样品中对PLA2R为反应性的抗体，以及所述检测抗体产生可检测信号。在一个实施方式中，此处描述的设备进行免疫分析，在所述免疫分析中形成抗体-蛋白质复合物。在一个实施方式中，所述免疫分析是血清学免疫分析。在另一个实施方式中，所述免疫分析是浊度测量的免疫分析。在一个实施方式中，在此提供的是此处描述的设备用于方便受试者中MN的诊断的用途，其中可检测量的对PLA2R为反应性的抗体表明受试者中膜性肾病的可能性。在一个实施方式中，在此提供的是包含此处描述的设备的试剂盒。在其他实施方式中，所述试剂盒进一步包含检测抗体，其中所述检测抗体特异于受试者的样品中对PLA2R 为反应性的抗体，并产生可检测信号；第二标记的PLA2R蛋白质或其片段，其产生可检测信号；和/或浊度计比色杯。
在一个实施方式中，在此提供的是一种系统，其包括测量模块，其测量自身抗体信息，包括来自免疫分析的可检测信号，表明来自获自受试者的样品的对PLA2R为反应性的抗体的存在或水平；存储模块，其被配置以存储来自所述测量模块的数据输出；比较模块，适应于比较所述存储模块上存储的数据与参考和/或对照数据以及提供收回的内容，和输出模块，用于向用户显示所述收回的内容，其中所述收回的内容针对PLA2R为反应性的抗体的存在或可检测的量表明所述受试者患有MN或有MN的复发。在一个实施方式中，在此提供的是方便受试者中膜性肾病(丽)的预后评估的系统，包括测定模块，被配置以接收和输出来自获自受试者的样品的针对PLA2R的自身抗体信息，其中所述自身抗体信息测量对PLA2R为反应性的自身抗体的水平；存储模块，配置以存储来自所述测定模块的输出信息；比较模块，适应于比较所述存储模块上存储的数据与参考数据和/或对照数据并提供比较内容，以及输出模块，用于向用户显示所述比较内容，其中如果没有可检测量的对PLA2R为反应性的自身抗体，则所述受试者处于症状缓解中，或如果存在着对在先读数的至少10%的降低，则MN的治疗在所述受试者中是有效的。 所述降低是至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、 至少90%、100%，以及10-100%之间的所有百分比。在一个实施方式中，所述参考或对照数据包括来自同一受试者的早先的数据，其中所述早先的数据已经表明了可检测量的自身抗体，通过任何常规的ELISA或在此描述的浊度测量的免疫分析和本领域已知的分析可检测的。在一个实施方式中，所述参考或对照数据包括获自自发性MN患者的群体的抗-PLA2R 自身抗体的平均值以及一个数量级的标准偏差。来自这些自发性MN个体的采集的血清被 1:100稀释，用于Western印迹分析中。可见条带的强度通过光密度测定法来定量，计算平均值和一个数量级的标准偏差。理想地，群体具有约25位自发性MN个体，优选的更多。统计学，平均值和一个数量级的标准偏差可以上载到计算机系统和数据存储媒体上。在一个实施方式中，在此提供的是计算机可读的存储介质，包括储存数据模块，含有来自获自受试者的样品的数据，其代表了来自对PLA2R为反应性的抗体的免疫分析的信号水平；比较模块，其比较所述储存数据模块上存储的数据与参考数据和/或对照数据，并提供比较内容，和输出模块，向用户显示所述比较内容，其中相对于所述参考数据和/或对照数据至少10%的对PLA2R为反应性的抗体的可检测量的存在，表明所述受试者患有MN或具有MN的复发。所述可检测量是至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 80%、至少 90%、100%、200%、300% 或 1000%，包括 10-1000% 之间的所有百分比。在一个实施方式中，所述对照数据包含来自非MN健康个体的群体的数据，其是利用Ix PBS 1:100稀释度的人类血清与0.5 yg天然PLA2R免疫反应获得的检测信号，其中辣根过氧化物酶抗人IgG抗体是标记的迷惑抗体，所述检测信号是化学发光。附图的简要描述
附图IA显示了来自患有自发性膜性肾病(MN)的患者的血清通过Western印迹特异性识别200 kDa肾小球的抗原。画面(上部)显示了用来自患有自发性MN的患者的五种不同血清(泳道丽1-5)或用患有其他蛋白尿的状况的患者的五种血清(DN，糖尿病性肾病；FS， 局灶性的和节段性的肾小球硬化症)印迹的人类肾小球蛋白质。附图IB显示了具有200 kDa抗原的各种血清的反应性的特异性的图形表示。来
11自患有自发性丽的患者的57%的血清与肾小球抗原反应，而来自患有次级丽的8位患者、 19位疾病对照(其他肾病状况或自体免疫疾病)或23位正常对照没有反应性血清。附图IC显示了具有200 kDa (185 kDa)抗原的各种血清的反应性的特异性的图形表示。来自不同区域的患有自发性MN的患者的72-8 的血清与肾小球抗原反应，而来自患有次级MN的12位患者、25位疾病对照(其他肾病状况或自体免疫疾病)或32位正常对照没有反应性血清。附图2A显示了人类肾小球中的200 kDa抗原是M-型磷脂酶A2受体(PLA2R)。 显示了用或不用PNGase F处理的、以及用反应性丽血清或针对PLA2R产生的多克隆抗体 western印迹的人类肾小球蛋白质和重组PLA2R。附图2B展现了人类丽血清可以免疫沉淀(IP)PLA2R。来自丽患者的三种反应性和三种非反应性的血清，以及三种对照血清，用于IP来自人类肾小球蛋白质的混合物的目标抗原。免疫沉淀物然后用针对PLA2R的抗体western印迹(上部)，以及用针对总的人类IgG的抗体western印迹(底部画面)。附图2C显示了通过反应性MN血清鉴定的肾小球的糖蛋白是人类PLA2R。完整的人类血清被用于免疫沉淀(IP)肾小球的蛋白质，免疫沉淀物然后电泳，用特异于M型PLA2R 的抗体Western印迹。前五个泳道显示了使用通过WB已知为阳性(如附

图1中)的血清的 IP's。第6泳道代表了使用来自患有MN的患者、已知为阴性的血清的IP。泳道7和8显示了使用来自正常志愿者的血清的IP，在最后的泳道中，在IP中省略了人类血清来排除肾小球的蛋白质与琼脂糖珠子的非特异性结合。附图3A显示了 PLA2R上的表位是还原敏感性的，引发IgG4优势的应答。附图;3B和3C显示了对PLA2R为反应性的自身抗体的IgG子类特异性。附图4A显示了仅从丽样品洗脱的IgG鉴定天然和重组的PLA2R。附图4B显示了从丽3活检样品洗脱的IgG仅识别相应于PLA2R的那些条带。附图5A显示了在患者血清中抗-PLA2R抗体的存在与疾病活性相关。从患有丽的、进入症状缓解的单个患者采集连续的血清。上部图形显示了在尿蛋白质水平的降低(菱形)和血清白蛋白的提高(圆形)。附图5B显示了上部画面中的WB，显示了对200和150 kDa天然的和去糖基化的 PLA2R的反应性仅在附图5A的同一患者的起始的样品形式中存在。相等的负载由98 kDa 条带的非特异性检测来显示。血清样品中的总IgG在底部画面中显示，展现了随着患者从丽进入症状缓解IgG的轻微提高。附图6A显示了对PLA2R的血清反应性相应于患有自发性丽的患者A中的疾病活性。图形显示了在治疗时尿液中蛋白质的降低，以及在Western印迹中在治疗开始之后抗 PLA2抗体的伴随的消失。附图6B显示了对PLA2R的血清反应性相应于患有自发性丽的患者B中的疾病活性。图形显示了在Western印迹中，在治疗开始之前和之后尿液中蛋白质的降低与抗PLA2 抗体的消失的相关性。。附图7显示了示意图，显示了反向-夹心ELISA (RS-ELISA)和间接ELISA。附图8A (上视图)和8B (侧视图)显示了用于测定流体样品中针对PLA2R为反应性的自身抗体的存在和/或水平的测试条的示意图。
附图9显示了示意图，显示了利用附图8中显示的测试条获得的结果的解释。附图10显示了包含标准PLA2R曲线的ELISA平板分析的示意图。附图11显示了利用固定量的标准PLA2R蛋白质的修改的ELISA平板分析的示意图。附图12是显示用于MN诊断的示范性系统的方框图。附图13是与此处描述的系统一起使用的计算机可读存储介质上的示范性的指令表。发明的详细说明
除非另外解释，此处使用的所有技术和科学术语具有本公开所属技术领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。肾脏疾病、肾脏学和分子生物学中常见的术语的定义可以在 The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 18th Edition, published by Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-18-2); Robert S. Porter et al. (eds. ) , The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd. , 1994 (ISBN 0-632-02182—9); VXR Robert A. Meyers (ed. ), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc. , 1995 (ISBN 1-56081-569—8) ； The ELISA guidebook (Methods in molecular biology 149)by Crowther J. R. (2000) ； Fundamentals of RIA and Other Ligand Assays by Jeffrey Travis, 1979， Scientific Newsletters； Immunology by Werner Luttmannj published by Elsevier, 2006中找到。分子生物学中常见术语的定义可以在 Benjamin Lewinj Genes IX，published by Jones & Bartlett Publishing, 2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al. (eds. ), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd. , 1994 (ISBN 0-632-02182-9);和 Robert A. Meyers (ed. ) , Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)中找到。除非另有说明，使用标准方法进行本发明，例如，在Maniatis et al.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.，USA (1982) ； Sambrook et al.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed. )，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., USA (1989); Davis et al. , Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc. , New York, USA (1986)；或 Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol. 152，S. L Berger and A. R. Kimmerl Eds.， Academic Press Inc.，San Diego, USA (1987)，Current Protocols in Molecular Biology(CPMB)CFred M. Ausubelj et al. ed.，John Wiley and Sons, Inc. )，Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coliganj et. al.， ed.， John Wiley and Sons, Inc. ) , Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed. , John Wiley and Sons, Inc. )，Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshneyj Publisher: Wiley-Lissj 5th edition (2005)， Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol 57，Jennie P. Matherand David Barnes editors, Academic Press, 1st edition, 1998)中描述的，通过弓|用将它们完全合并在此。要理解的是，本发明不局限于此处描述的特定方法、方案和试剂，等等，这些可以变化。在此使用的术语仅是为了描述特定实施方式的目的，不意图限制本发明的范围，本发明的范围完全由权利要求限定。除了在操作实例中，或另外标明了，在此使用的表示成分或反应条件的量值的所有数字应当理解为在一切情况下由术语“约”来修饰。当与百分比一起使用时术语“约”可以指士 1%。如在此使用的，术语“一”、“一个”和“该”包括复数的对象，除非上下文中明确地另外指出了。类似地，词语“或”意图包括“和”，除非上下文明显地另外指出了。进一步理解的是，对核酸或多肽所给出的，所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子重量或分子质量值，是近似的，是为了描述而提供的。虽然类似于或等同于在此描述的那些的方法和材料可以被用于本公开的实践或测试，以下描述了适合的方法和材料。缩写“e.g. ”是来自拉丁语例如，在此使用来表明非限制性的实例。因而，缩写“e.g. ”与术语“例如”同义。列出的所有专利和其他公开物为了描述和公开例如可以与本发明一起使用的这些公开物中描述的方法的目的通过引用明确地合并在此。这些公开物完全为了在本申请的提交日之前的它们的公开内容而提供。就此来说，任何内容都不应被看作是认可发明人没有资格凭借在先发明或由于任何其他原因而将这些公开的日期提前。所有关于日期的声明或关于这些文件的内容的呈现是基于申请人可获得的信息，不构成对所述日期或这些文件的内容的正确性的任何认可。术语的定义
术语“片段”是指具有氨基酸残基序列的任何主题多肽，所述氨基酸残基序列短于在此描述了氨基酸残基序列的多肽的。PLA2R的片段是缩短的或截短的PLA2R蛋白质。所述多肽可以具有N-末端或C-末端截短，和/或也有内部删除。片段的实例是包含PLA2R的 CTLDs或CRDs 4、5 6的片段。在一个实施方式中，片段包括PLA2R的外部结构域，其是人类 PLA2R的氨基酸残基1-1392 (SEQ ID NO. 2)。1-1392的更短的部分被认为是片段。如在此使用的，术语“药物组合物”是指与通常在制药工业中使用的化学物质和化合物的药学上可接受的载体组合的活性试剂。术语“药学上可接受的载体”排除了组织培养基。如在此使用的，术语“治疗有效量”是指可以降低可用于结合PLA2R的可溶性自身抗体的量的活性试剂的量。如在此使用的，术语“治疗(treat) ”或“治疗(treatment) ”是指降低或减轻与膜性肾病有关的医学状况相关的至少一种副作用或症状。这些包括降低针对PLA2R蛋白质的自身抗体的量，降低、抑制或停止针对PLA2R的自身抗体的产生，免疫系统的抑制，以及降低当自身抗体与肾肾小球结合时与自身抗体的活性相关的炎症和降解/损伤。如在此使用的术语“受试者”包括，无限制地，人类、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、奶牛、猪、猴子、黑猩猩、狒狒或恒河猴。在一个实施方式中，受试者是哺乳动物。在另一个实施方式中，受试者是人类。如在此使用的，术语“包含”是指其他要素也可以附加于提出的限定要素而存在。“包含”的使用表明涵盖而不是限制。如在此使用的，术语“自发性丽”当前用于描述MN,其不由处在当前发现之前的任何已知的继发的病因，例如，B型肝炎或狼疮引起。在当前的发现的基础上，“自发性丽”是指PLA2R相关的MN,或对于现在称为自发性MN并与抗-PLA2R抗体相关的疾病的任何其他将来的名称。对于PLA2R中的结构域，术语C-型凝集素(“ CTLD ”)或碳水化物识别结构域 (“CRD”)可互换地使用。本发明的实施方式基于以下发现，患有MN的患者的血清含有对在肾小球中存在的M型PLA2R为反应性的抗体。自发性膜性肾病(MN)被认为是靶向肾小球的自身免疫性疾病，而主要的目标抗原仍然是难以确定的。发明人通过Western印迹(WB)筛选了来自患有 MN的患者的血清针对人类肾小球蛋白质的反应性，找到了通常检测的200 kDa糖蛋白。发明人然后继续通过部分纯化和质谱分析来鉴定这种200 kDa糖蛋白。它是M型PLA2R。找到了 PLA2R的可溶的和膜结合的同种型(180kDa)。在体内，PLA2R在肾脏中表达。来自肾小球提取物的这种天然的PLA2R已经被进一步表征，现在在蛋白凝胶上被确定是近似185 kDa。在此处描述的方法中去糖基化时，它是约145 kDa。发明人发现，患有丽的患者的约70-8 具有根据WB对重组PLA2R (rPLA2R)为反应性的抗体，人类血清能够免疫沉淀(IP)来自正常人肾小球提取物的天然蛋白质。来自正常志愿者和肾病对照的对照血清，以及早先根据WB为非反应性的来自MN患者的血清，不鉴定rPLA2R或IP天然蛋白质。患者的血清中反应性免疫球蛋白的大部分是IgG4，是在自发性MN中肾小球沉积物中占优势的子类。发明人显示了，PLA2R在足状突细胞中存在，通过免疫荧光对人类肾脏的低温切片所检测到。此外，PLA2R和IgG4都共同定位于患有MN 的患者的活检标本上，处于作为疾病特征的上皮下沉积物的典型细粒状形式。虽然不希望受到理论的限制，患者的血清中针对PLA2R的自身抗体结合肾肾小球中的PLA2R，导致肾脏的结构损坏和损害肾脏功能。虽然不希望受到理论的显著，自身抗体与PLA2R的结合导致对足状突细胞的亚致死性损伤，诱导大量的蛋白尿。自发性丽抗体的主要靶点现在被鉴定为PLA2R，这将容许利用设计以测量循环的自身抗体的免疫分析更早地和较低侵入性地检测疾病，还产生了监视对治疗的应答的手段。此外，还检测了 IgGl、IgG2和IgG3子类的 PLA2R自身抗体。发明人还发现了自身抗体对哺乳动物PLA2R，例如，人类、兔和猪的PLA2R 是反应性的。特征在于水肿和尿液中的大量蛋白质的肾病综合征是相对常见的肾的失调，其具有许多可能的原因，包括膜性肾病(丽)、局灶性的和节段性的肾小球硬化症、最小改变的疾病、糖尿病性肾病、膜增殖性肾小球性肾炎，以及其他原因。虽然存在着改善肾病状况的某些体征和症状的非特异性治疗，对原发疾病的具体认知通常是进行确定性的治疗所必需的。当患有肾病综合征的患者最初被评估为门诊患者或在医院中评估时，医师通常安排一组血液测试来寻找可通过血清学来检测的可能的病因(例如，在尿沉淀中典型的发现物的情境下抗核抗体(ANA)和/或抗双链DNA抗体的存在将表明狼疮肾炎)。当前没有鉴定MN 的血清学试验，诊断仅仅依靠肾脏活检，其是一种在许多机构中需要过夜住院的侵入性的操作，并且可能并发主要的内出血。MN可能由许多次级因素引起，例如，全身性红斑狼疮、B 型肝炎或梅毒，血液测试常规地进行来寻找这些病因(分别为ANA、抗B型肝炎抗原、快速血浆反应素(RPR))。然而，在美国，MN在起源上更经常地是原发的或自发的，如上所述的，当前没有这种形式的血液测试，因为在这种自身免疫性疾病中靶向的抗原直到这时还未被鉴定。作为成年人肾病综合征的常见的原因，膜性肾病被广泛地认为是自身免疫性疾病，尽管不知道长期寻找的目标抗原。丽的自体免疫性基础的大部分的支持来自对 Heymann肾炎(HN)的大鼠模型的数十年的研究，该模型在病理水平上实际上与人类疾病是相同的。在HN中，目标抗原是megalin，一种处于LDL受体家族中的分子，对蛋白质在肾中半选择性摄取负责。它在大鼠中而不在人类中的足状突细胞上存在，循环抗体已经显示了结合原位的蛋白质，导致抗体-抗原复合物脱落进入肾小球的基底膜，导致对HN和MN为特征性的上皮下的沉积。由于来自对照健康个体和非MN肾病患者的血清不含有、或具有非常非常低量的或不可检测量的与PLA2R反应的自身抗体，不同于丽患者的血清，PLA2R抗体的存在的检出可以用作MN的诊断工具。简单的血液样品可以用于测试和检测对PLA2R为反应性的抗体。 相对于侵入性技术的肾脏组织活检的当前诊断方法，这种方法将是高度有利的。因而，在一个实施方式中，在此提供的是诊断受试者中的膜性肾病的方法，所述方法包括检测对磷脂酶A2受体为反应性的抗体的存在，其中所述抗体在来自受试者的样品中找到。所述抗体可以通过免疫分析来检测，在所述免疫分析中形成抗体-蛋白质复合物。所述免疫分析可以是血清学免疫分析或浊度测量的免疫分析。受试者是哺乳动物，例如，狗、猫或人类。不患有丽或不具有与丽相关的任何症状，例如尿液中的蛋白质的健康受试者，具有不可检测的针对磷脂酶A2受体(PLA2R)的自身抗体。当对PLA2R为反应性的抗体在怀疑患有丽的， 例如，在尿液中具有蛋白质的受试者中检出时，抗-PLA2R抗体的存在表明所述受试者患有 MN的可能性。作为实例，不可检测量的抗-PLA2R自身抗体，是指在如实施例1中所描述进行的Western印迹分析中观察不到可见条带，其中人类血清1 100稀释，用于此处描述的印迹分析中。对于非常非常低量的抗PLA2R自身抗体，所述低量是在非MN健康受试者的群体中找到的平均量。术语“受试者”、“个体”或“患者”可互换地使用。如通过实施例1中阐述的常规的ELISA或Wfestern印迹所测定的，在健康非丽个体中或在健康非丽个体的群体中的抗-PLA2R自身抗体的量可以被认为是背景、参考或对照水平。来自健康非MN个体的采集的血清1:100稀释，用于Western印迹分析中。可见条带的强度通过光密度测定法来定量，计算平均值和一个数量级的标准偏差。理想地，群体具有约25位健康非MN个体， 优选的更多。统计学，平均值和一个数量级的标准偏差可以上载到计算机系统和数据存储媒体上。超过这种抗-PLA2R自身抗体平均量至少10%的患者可能患有MN，特别是如果所述患者还呈现疾病的临床特征，例如蛋白尿和肾病综合征。在一个实施方式中，在此提供的是免疫分析，其包括使来自受试者的样品与 PLA2R或其PLA2R片段接触；在样品中存在的抗体与PLA2R或其PLA2R片段之间形成抗体-蛋白质复合物；洗涤来除去任何未结合的抗体；添加被标记的和对来自样品的抗体为反应性的检测抗体；洗涤来除去任何未结合的标记的检测抗体；将所述标记物转化为可检测信号；其中可检测信号的存在表明所述受试者中MN的可能性。在某些实施方式中，所述检测抗体通过共价连接到酶、具有荧光化合物或金属的标记物、具有化学发光化合物的标记物来标记。例如，所述检测抗体可以用过氧化氢酶标记，转化利用比色底物组合物，包含碘化钾、过氧化氢和硫代硫酸钠；所述酶可以是醇脱氢酶，转化利用比色底物组合物，包含醇、PH指示剂和pH缓冲液，其中所述pH指示剂是中性红，所述PH缓冲液是甘氨酸-氢氧化钠；所述酶还可以是次黄嘌呤氧化酶，转化利用比色底物组合物，包含黄嘌呤、四唑盐和4，5- 二羟基-1，3-苯二磺酸。在一个实施方式中，所述检测抗体是仅对受试者的物种特异地反应性的。例如，如果为人类，则所述检测抗体是抗人类抗体。如果受试者是马，则所述检测抗体是抗马抗体。 如果受试者是狗，则所述检测抗体是抗狗抗体。在一个实施方式中，可检测信号与一组可检测信号相比较，所述一组可检测信号来自从量递增的已知量的PLA2R或片段的免疫分析得出的滴定曲线。在另一个实施方式中，在此提供的是免疫分析，其包括使来自受试者的样品与 PLA2R或其PLA2R片段接触；在样品中存在的抗体与PLA2R或其PLA2R片段之间形成抗体-蛋白质复合物；测量由抗体-蛋白质复合物的形成所产生的光散射强度，其中高于对照光散射强度至少10%的光散射强度表明所述受试者中MN的可能性或丽的复发。所述对照光散射强度是不存在样品时PLA2R或PLA2R蛋白质片段的光散射强度。在另一个实施方式中，所述对照光散射强度是在存在来自非MN健康受试者的样品的情况下PLA2R或PLA2R 蛋白质片段的光散射强度。在另一个实施方式中，所述对照光散射强度是从非MN健康受试者的群体获得的平均光散射强度。在一个实施方式中，所述光散射强度是在浊度计中测量的。所述提高是至少20%、至少30%、至少50%、至少100%、至少200%、至少300%、至少500%、 至少1000%、或更多和包括10-1000%之间的所有百分比。在一个实施方式中，受试者中的丽是自发性的，对所述受试者不进行肾脏活检。 在一个实施方式中，所述受试者是人类，来自所述受试者的样品是血液样品，例如，血清或血浆。在一个实施方式中，PLA2R是哺乳动物PLA2R，例如，人类或猪的PLA2R。在一个实施方式中，所述抗-PLA2R抗体是IgG子类IgGl_4的。在一个实施方式中，所述免疫分析是血清学免疫分析。在某些实施方式中，PLA2R或其PLA2R蛋白质片段沉积在固相支持物上，或它可以被偶联来将蛋白质固定在支持物上。所述支持物可以是量杆、测试条、乳胶珠子、微球体或多孔平板的形式。在一个实施方式中，已知量的PLA2R或PLA2R蛋白质片段沉积或偶联到固相支持物上。蛋白质的范围在0.1 ng-1 mg之间。在一个实施方式中，此处描述的免疫分析对在一段时间内获得的、来自受试者的多个样品进行。在一个实施方式中，所述多个样品在至少两年的时间每两个或三个月获得。 例如，每三个月从诊断为患有MN的患者采集血液样品，来监视状况的发展或免疫抑制治疗的有效性。每个血液样品的免疫分析的结果被记录，标注样品的日期。每个血液样品的免疫分析的结果与从在三个月之前采集的早先的血液样品获得的结果相比较。它还可以与在开始免疫抑制治疗之前在起初的诊断期间获得的结果相比较。在一个实施方式中，每个免疫分析的可检测信号或光散射强度与获自早先时间点的样品的可检测信号或光散射强度相比较，其中可检测信号或光散射强度的至少5%、至少 10%或更多的降低表明所述受试者中丽治疗的有效性，包括至少20%、至少30%、至少40%、 至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、100%和10-100%之间所有百分比的降低。
17在先的时间点可以是紧邻的在先时间点，或更早的时间点，例如，六个月之前，或在开始免疫抑制治疗之前起初的诊断期间获得的。在一个实施方式中，在此提供的是正被治疗膜性肾病的受试者中预后评估的方法，所述方法包括(a)在第一时间点测定来自受试者的样品中对PLA2R为反应性的抗体的水平；(b)在第二时间点测定来自同一受试者的样品中对PLA2R为反应性的抗体的水平，其中所述第二时间点晚于所述第一时间点；和(c)比较所述两个时间点获得的抗体水平，其中与所述第一时间点相比在所述第二时间点抗体水平的降低表明所述治疗是有效的。抗体的水平可以通过免疫分析来检测，在所述免疫分析中形成抗体-蛋白质复合物。受试者起初被诊断为患有MN，具有可检测量的针对PLA2R的自身抗体。在治疗时，例如，用免疫抑制疗法，随着时间的过去，存在着可检测的针对PLA2R的自身抗体量的降低。在理想的情况下，自身抗体的量应当降到低于此处描述的检测方法的可检测的水平，所述受试者被认为处于所述失调的症状缓解中。与所述第一时间点相比在所述第二时间点抗体水平的降低是，与所述第一时间点相比在第二时间点的血清中针对PLA2R的自身抗体滴度方面至少 5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、 100%和10-100%之间所有百分比的降低。低于所述检测极限是当抗体的水平降低到与所述第一时间点相比95-100%之间或更多时，在所述第一时间点受试者被起初诊断为患有MN并且没有进行治疗。使用的分析对于所有不同时间点采集的来自受试者的样品是相同的。自身抗体的降低的滴度表明治疗在受试者中是有效的。在其他实施方式中，与所述第一时间点相比在所述第二时间点没有抗体水平的降低。作为替代，可以有提高或稳定水平的抗体。在一个实施方式中，与所述第一时间点相比在所述第二时间点存在抗体水平的提高，所述第一时间点没有可检测的自身抗体。这表明所述患者具有复发，MN已经复发。在一个实施方式中，与所述第一时间点相比在所述第二时间点存在抗体水平的提高，所述第一时间点具有可检测的自身抗体。这表明疾病的恶化和/或缺乏有效的治疗。所述提高是至少30%、至少50%、至少100%、至少200%、至少300%、至少500%、至少1000%、或更多和包括10-1000%之间的所有百分比。在一个实施方式中，稳定水平的抗体，其中在第二和第一时间点可检测的自身抗体在统计分析变异之内是可比较地相似的，距来自第一时间点的自身抗体水平约1%、2%、 3%、4%、5%以及1%_5%之间所有百分比的偏差。抗体的稳定的水平表明稳定的疾病，其中治疗是不充分地持续的(即，如果临床上表明了，它应当继续)，或是无效的。 如在此使用的，术语“自身抗体”和针对PLA2R的“抗体”可互换地使用。在其他实施方式中，所述免疫分析包括用天然的或重组的PLA2R蛋白质包被的珠子，如在Binder SR.，Lupus. 2006, 15:412-21中描述的。通常使用的是被染色以建立独特的身份的聚苯乙烯珠子。检测通过流式细胞术进行。自身抗体检测利用多通道技术。其他类型的基于珠子的免疫分析是本领域公知的，例如，激光珠子免疫分析和相关的磁性珠子分析(Fritzler, Marvin J; Fritzler, Mark L, Expert Opinion on Medical Diagnostics, 2009, pp. 3: 81—89)。在另一个实施方式中，在此提供的是受试者中膜性肾病的预后评估的方法，所述方法包括(a)在第一时间点测定来自受试者的样品中对PLA2R为反应性的抗体的水平；和(b)在随后的时间点，即，第二时间点测定来自同一受试者的样品中对PLA2R为反应性的抗体的水平，其中所述第二时间点晚于所述第一时间点；其中与所述第一时间点相比在所述第二时间点没有可检测的针对PLA2R的自身抗体表明所述受试者处于MN的症状缓解之中。抗体的水平可以通过免疫分析来检测，在所述免疫分析中形成抗体-蛋白质复合物。 低于检测极限是，与所述第一时间点的相比，在抗体的水平降低为95-100%之间以及更多之时。在进一步的实施方式中，在此提供的是受试者中膜性肾病的预后评估的方法，所述方法包括(a)在第一时间点测定来自受试者的样品中对PLA2R为反应性的抗体的水平； (b)在随后的时间点，即，第二时间点测定来自同一受试者的样品中对PLA2R为反应性的抗体的水平，其中所述第二时间点晚于所述第一时间点；和(c)比较所述两个时间点的抗体的水平，其中与所述第一时间点相比在所述第二时间点抗体水平的至少5%的提高表明存在MN的复发。抗体的水平可以通过免疫分析来检测，在所述免疫分析中形成抗体-蛋白质复合物。所述提高是至少10%、至少20%、至少30%、至少50%、至少100%、至少200%、至少 300%、至少500%、至少1000%、或更多和包括10-1000%之间的所有百分比。在一个实施方式中，所述受试者已经成功地治疗MN，在血液循环中没有可检测的针对PLA2R的自身抗体，并且当前不处于任何MN治疗当中。在这个受试者中，所述第一时间点没有可检测的自身抗体。所述受试者早先被诊断为患有MN,具有可检测量的针对PLA2R 的自身抗体。在治疗时，例如，使用免疫抑制疗法，随着时间的过去，针对PLA2R的自身抗体的量跌至低于此处描述的检测方法的可检测水平，所述受试者处于MN的症状缓解之中。可检测量的针对PLA2R的自身抗体的重新出现，以及随着时间的过去自身抗体的逐步提高， 表明MN在受试者中复发。在另一个实施方式中，受试者当前正被治疗MN，在血液循环中具有可检测的针对 PLA2R的自身抗体。与所述第一时间点相比在所述第二时间点抗体水平的提高表明疾病状况正在恶化，在当前的治疗方案下的治疗在减缓/停止疾病方面是无效的。在另一个实施方式中，所述受试者当前正被治疗MN，在血液循环中具有可检测的针对PLA2R的自身抗体，在所述第一和第二时间点自身抗体的水平在统计分析变异内是可比较地相似的。这表明所述受试者具有在治疗期间稳定水平的自身抗体，表明所述治疗是不充分地持续的(即，如果临床上表明了，它应当继续)或是无效的。在一个实施方式中，所述MN是自发性的。所述怀疑患有MN的受试者对于MN的一般病因，例如，全身性红斑狼疮、B型肝炎和梅毒被测试为是阴性的。通过排除法，熟练的临床医师将排除MN的所有可能的病因。留下的是来自模糊的或未知的病因，例如，可能的针对PLA2R的自身免疫性自身抗体的MN的初步诊断。在此描述的非侵入性诊断方法因而可以用于这样的受试者用于确认。在一个实施方式中，此处描述的诊断MN的方法被应用于患者，所述患者呈现了 MN 的症状，没有经历常规筛选来排除MN的所有可能的病因。此处描述的方法可以是为了诊断目的对患者进行的常规的测试集的一部分，所述患者呈现MN的症状，例如蛋白尿。所述测试可以是免疫分析，在所述免疫分析中形成抗体-蛋白质复合物，例如，血清学的免疫学分析。这样的患者没有被活检用于MN的确证性诊断。类似地，此处描述的方法可以是对患者进行的常规的血清学免疫学测试集的一部分，所述患者已经通过活检或通过血清测试已知患有MN，正在治疗MN。所述方法对于在患者中监视免疫抑制性疗法效力和预后评估是有用的。在一个实施方式中，受试者是哺乳动物。在另一个实施方式中，受试者是人类。预想的是，此处描述的方法适合于具有肾脏、表达PLA2R并具有包含抗体的免疫系统的任何哺乳动物。在一个实施方式中，所述被怀疑患有MN的受试者没有经历肾脏活检用于MN的确证性诊断。发明人发现，丽患者的血清中的抗体对哺乳动物PLA2R，例如人类、兔和PLA2R是免疫反应性的。因而，在此涵盖的，此处描述的方法包括检测针对人类磷脂酶A2受体或猪PLA2R为反应性的抗体。如在此使用的，所述术语“针对……为反应性的”、“反应于”或 “与……反应”是指抗体识别人类或猪PLA2R并结合所述PLA2R。所述识别和结合是标准的抗体-抗原相互作用，其是生物化学和免疫学充分地表征的。在一个实施方式中，来自受试者的样品是血液样品。在其他实施方式中，所述样品是全血、血清或血浆。在一个实施方式中，所述抗体是IgG4子类的。在其他实施方式中，所述PLA2R自身抗体是IgG3和IgGl子类的。在又其他的实施方式中，PLA2R自身抗体是IgG子类IgGl_4 的。在一个实施方式中，丽的治疗是免疫抑制疗法，例如，环孢菌素、他克莫司、硫唑 infliximab、 omalizumab> daclizumab> adalimumab> eculizumab> efalizumab>
natalizumab、omalizumab和雷帕霉素。在进一步的实施方式中，MN的免疫抑制性治疗另外包括但不限于环磷酰胺、苯丁酸氮芥和利妥昔单抗。在某些实施方式中，对于此处描述的方法，针对PLA2R的自身抗体的检测是通过血清学的免疫分析，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)来进行的。ELISA和本领域已知的其他免疫分析一般利用标准方案来创建，主要的变化是靶点或捕获、抗原。对于此处描述的方法，抗原是人类PLA2R、猪PLA2R、或其片段。在哺乳动物或昆虫细胞系中表达的重组的全长 PLA2R可以被纯化的，并用作捕获抗原。所述蛋白质可以表达为具有N-或C-末端FLAG标签来便于从其他细胞系衍生的蛋白质中纯化。ELISA平板将用PLA2R或片段以恒定的浓度包被。平板可以用牛酪蛋白或血清白蛋白或其他封闭试剂来封闭，以防止样品的非特异性结合。要测试的人类血清可以以标准稀释度(1:40、1:80、1:160，等等)添加到反应孔，随后是常规的洗涤。结合的IgG可以用与辣根过氧化酶连接的二级抗人类Ig抗体检测。在一系列洗涤之后，比色底物可以添加到所有反应孔并产色。ELISA平板可以在微滴平板读取器上读取。利用已知是阳性或阴性的MN血清样品，以及来自正常人志愿者的血清，有可能建立合适的筛截滴度来定义哪些将构成阳性测试结果。不患有MN或不具有与MN相关的任何症状，例如尿液中的蛋白质的健康受试者，具有不可检测的针对PLA2R的自身抗体。当对PLA2R为反应性的抗体在怀疑患有MN的，例如，在尿液中具有蛋白质的受试者中检出时， 抗-PLA2R抗体的存在表明所述受试者患有MN的可能性。在一个实施方式中，ELISA可以利用针对PLA2R的自身抗体提供免疫活性的丽， 即，活性MN的简单的血清学分析。所述简单的血清学分析可以与其他广泛使用的诊断，或另外在具有重蛋白尿，例如，抗核抗体、抗B型和C型肝炎抗体以及补体C3和C4水平的患者中信息性的血液测试一起进行。在这项分析中被测试为阳性的患者的情况中，可能不必进行肾脏的活检来指导治疗，除非存在可能要求活检的其他非典型的特征。然而，在测试为阴性、仍然具有不可解释的蛋白尿的那些患者中，肾脏活检仍是指明的。所描述的免疫分析比肾活检是显著更便宜的，肾活检常常需要医院的过夜的入院。对于患者和医师它也是更方便得多的。已知的事实是，蛋白尿可能由于肾小球的结构改变甚至在免疫性疾病结束之后在 MN患者中持续(短暂地或永久地)。仅依赖于蛋白质排出的水平，可能导致患者用有毒的免疫抑制药物比所需要的治疗更久得多。因而，用所描述的ELISA监视自身抗体的消失将帮助定义膜性肾病治疗的转变点，在此时应答停止免疫抑制疗法，但应继续抗蛋白尿治疗(例如，血管紧张素转化酶抑制物)。在一个实施方式中，在此提供的是在受试者中治疗膜性肾病的方法，所述方法包括施用有效量的PLA2R或其片段，或表达PLA2R或其片段的载体。通过提供可溶的PLA2R或其片段，可溶蛋白质可以作为引诱物抗原起作用，将自身抗体隔绝远离肾小球中的PLA2R， 从而降低对肾脏的潜在损害。PLA2R可以是人或猪的PLA2R。在一个实施方式中，适用于针对来自血清的PLA2R的自身抗体的处理或吸附的片段是包含PLA2R的CTLDs或CRDs 4、5 6的片段。在另一个实施方式中，所述片段包含人类或猪的PLA2R的细胞外结构域。在一个实施方式中，所述片段是SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :5的更小的部分，例如，至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95，包括 10-95%之间的所有的百分比。还包含的是在SEQ ID NO :5的序列上衍生的、可以用于丽的治疗的10-50个氨基酸残基之间的肽。在一个实施方式中，几种肽的混合物被用于治疗。 预想的肽可以与用于更长血清半衰期的其他蛋白质、串联连接的肽或环形肽融合。在一个实施方式中，所述膜性肾病是自发性的。受试者被测试为对PLA2R反应性的抗体是阳性的。在一个实施方式中，自身抗体是对人PLA2R或猪PLA2R为反应性的。在另一个实施方式中，在此提供的是治疗受试者中的膜性肾病的方法，所述方法包括在受试者中从样品中除去对PLA2R为反应性的抗体。所述抗体通过用PLA2R或其片段作为抗原的免疫吸附来从血液中除去，样品在除去抗体之后返回受试者。适合吸附的片段是包含PLA2R的CTLDs或CRDs 4、5 6的片段。对于人类PLA2R受体1同种型1前体 (GENBANK 登记号No. NP_031392. 3，SEQ ID NO :2)，适合的片段可以是由 PU^R 的 CRDs 4、 5 6构成的氨基酸残基650到1100。在一个实施方式中，在此提供的是有效量的PLA2R或其片段、或表达PLA2R或其片段的载体用于治疗受试者中的膜性肾病的用途。在一个实施方式中，在此提供的是有效量的PLA2R或其片段、或表达PLA2R或其片段的载体在制造用于治疗受试者中的膜性肾病的药物中的用途。在一个实施方式中，所述样品是血液。在其他实施方式中，所述样品是血清或血浆。在一个实施方式中，所述受试者是人类，所述膜性肾病是自发性的。所述自身抗体对人 PLA2R或猪PLA2R受体是反应性的。在一个实施方式中，所述抗体是IgG4子类的。在其他实施方式中，所述PLA2R自身抗体是IgG3、IgG2和IgGl子类的。在又其他的实施方式中， PLA2R自身抗体是IgG子类IgGl-4的。针对PLA2R的自身抗体的免疫吸附帮助降低循环的自身抗体的量，从而降低对肾脏的潜在损害。这种治疗可以在对PLA2R为反应性的自身抗体存在的免疫学确认之后、以及在任何免疫抑制疗法开始之前开始施加。在免疫抑制疗法可能对免疫系统和受试者中自发抗体的生产具有影响之前，在这个早期时间期间这是特别有用的。在一个实施方式中，针对PLA2R的自身抗体的免疫吸附可以通过使血液、血清或血浆穿过固定的PLA2R来发生。重组的人类或猪PLA2R或片段可以固定在本领域已知的惰性和无菌的基质上，例如琼脂糖。针对PLA2R的自身抗体将结合固定的PLA2R或片段，从而与基质间接地结合。然后采集血液、血清或血浆。这种产生的血液、血清或血浆应当没有可检测的或降低的针对PLA2R的自身抗体。免疫吸附操作应当在无菌的条件下进行。现在耗尽了针对PLA2R的自身抗体的采集的血液、血清或血浆此时可以输回患者。设备、试剂盒、计算机系统和计算机数据贮存
在一个实施方式中，在此提供的是用于鉴定来自受试者的样品中对PLA2R为反应性的抗体的存在或水平的设备，包含至少一种PLA2R蛋白质或其片段；以及至少一种固相支持物，其中所述PLA2R蛋白质或其片段沉积在所述支持物上。在一个实施方式中，沉积在固相支持物上的PLA2R蛋白质或其片段被固定在支持物上。在一个实施方式中，所述PLA2R蛋白质是人类或猪的PLA2R蛋白质。在一个实施方式中，所述固相支持物是量杆、测试条、乳胶珠子、微球体或多孔平板的形式。在一个实施方式中，所述受试者是人类，在所述受试者中不进行肾脏活检。在一个实施方式中，来自受试者的样品是血液样品。在其他实施方式中，此处描述的设备或试剂盒可以进一步的包含第二标记的 PLA2R蛋白质或其片段，其产生可检测信号；检测抗体，其中所述检测抗体特异于受试者的样品中对PLA2R为反应性的抗体，以及所述检测抗体产生可检测信号；或浊度计比色杯。在一个实施方式中，所述设备进行免疫分析，其中形成抗体-蛋白质复合物，例如，血清学免疫分析或浊度测量免疫分析。在某些方面，此处描述的设备方便了受试者中膜性肾病的诊断，其中可检测量的对PLA2R为反应性的抗体表明受试者中膜性肾病的可能性。在一个实施方式中，在此提供的是试剂盒，其包含此处描述的设备和检测抗体，其中所述检测抗体特异于受试者的样品中对PLA2R为反应性的抗体并产生可检测信号。在一个实施方式中，所述试剂盒可以包括第二标记的PLA2R蛋白质或其片段，其产生可检测信号。在进一步的实施方式中，所述试剂盒包括浊度计比色杯。可以使用任何固相支持物，包括但不限于，硝化纤维膜、尼龙膜、固体有机聚合物， 例如，聚苯乙烯，或叠层的量杆，例如美国专利5，550，375中描述的。“量杆”或测试条和其他固相支持物的使用已经在本领域许多抗原的免疫分析的情境中描述了。三份美国专利(美国专利 NO. 4，444，880，授予 H. iTom 的；美国专利 NO. 4，305，924，授予 R. N. Piasio 的， 以及美国专利NO. 4，135，884，授予J. Τ. Sien的)描述了“量杆”技术通过免疫化学分析检测可溶性抗原的运用。这三份专利的装置和方法广泛地描述了固定在“量杆”的固体表面上的第一成分，其暴露于含有可溶性抗原的溶液，所述可溶性抗原结合固定在所述“量杆” 上的成分，之后检测所述杆上的成分-抗原复合物。“量杆”技术可以由本领域技术人员容易地适应于本发明。在此处描述的发明中，抗原PLA2R沉积在支持物上，检测自身抗体。试剂盒的实例包括但不限于ELISA分析试剂盒，以及包含测试条和量杆的试剂
22盒。在ELISA试剂盒中，过量的PLA2R抗原被固定在固相支持物上。含有未知量的针对 PLA2R的自身抗体的样品添加到固定的PLA2R上，引起由所述蛋白质和抗体组成的复合物的形成。通过也对自身抗体为特异性的标记的第二抗体来检测复合物。检测的标记的量是样品中存在的自身抗体的量的度量(参见实施例3)。在此处描述的试剂盒的某些实施方式中，试剂盒包含测试条或量杆。在此处描述的试剂盒的某些实施方式中，标记的抗体是通过酶标记、荧光标记、生物素标记或放射性同位素标记来可检测地标记的。其他标记物包括但不限于胶体金和乳胶珠子。乳胶珠子也可以是有色的。标记抗体的方法是本领域已知的，例如，在"Colloidal Gold. Principles. Methods and Applications", Hayat MA (ed. ) (1989-91). Vols 1-3, Academic press, London； in "Techniques in Immunocytochemistry，，，Bullock GR and Petrusz P (eds) (1982-90) Vols 1, 2, 3, and 4, Academic Press, London； in "Principles of Biological Microtechnique〃， Baker JR (1970)， Methuen, London； Lillie RD (1965)， Histopathologic Technique and practical Histochemistry, 3rd ed, McGraw Hill, New York; Berryman MA, et al(1992), J. Histochem Cytochem 40, 6，845-857中描述的，所有这些通过完全引用合并在此。在典型的胶体金标记技术中，在膜上通过固定的抗体捕获抗原，当沿着膜的侧向或横向流观察时，或通过在溶液中红色强度的观察，积累的金标记物的独特的红颜色提供了检测溶液中亚纳克量的蛋白质的极度敏感的方法。胶体金轭合物由包被了选定蛋白质或大分子(例如，抗体或基于抗体的部分)的金颗粒的悬浮液组成。金颗粒可以制成1-250 nm 的任何选定的大小。这种金探针检测系统，当与特定的靶标孵育时，例如，在组织切片中，将通过金颗粒本身的可见性显示靶标。对于由眼睛检测，金颗粒还将通过金溶胶的积累的红颜色显示固相上固定的抗原，例如，印迹的膜。这种金沉淀的银增强作用也进一步赋予了检测的敏感性。用于标记的胶体金试剂的供给可从SPI - MARK 获得。聚苯乙烯乳胶珠子，包被有抗体的大小200 nm有色乳胶珠子，SIGMA ALDRICH , Molecular Probes, Bangs Laboratory Inc.禾口 AGILENT Technologies。在此处描述的试剂盒的其他实施方式中，至少一种标记的抗体包含酶标记的抗体。被固相支持物(例如，微量滴定板反应孔)上固定的PLA2R结合和捕获的抗-PLA2R通过添加与抗-抗体轭合的酶的产色底物来鉴定，所述抗-抗体例如抗-人IgG，产生的颜色通过光学设备，例如ELISA平板读取器来检测。也可以使用其他检测系统，例如，生物素-链霉抗生物素蛋白系统。利用链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶共轭物和产色底物测定定量。这样的链霉抗生物素蛋白过氧化物酶检测试剂盒是商业上可获得的，例如，来自DAK0; Carpinteria, CA。检测抗体和PLA2R做为选择可以用任何量的用于免疫分析的荧光化合物，例如，异硫氰酸荧光素、铕、萤光黄、罗丹明B异硫氰酸酯(Wood，P. In: Principles and Practice of Immunoassay, Stockton Press, New York, pages 365-392( 1991))来标记。 与用于分离抗体-抗原复合物的已知的技术一起，这些荧光团可以用于定量自身抗体的水平。对于化学发光免疫分析也一样，在这种情况下，抗体或PLA2R可以用异鲁米诺或吖啶酯 (Krodel, E. et al. , In: Bioluminescence and Chemiluminescence Current Status, John Wiley and Sons Inc. New York, pp 107-110 (1991) ； Weeks, I. et al. , Clin.Chem. , 29:1480-1483( 1983))来标记。放射免疫分析(Kashyap, M. L. et al. , J. Clin. Invest.，60:171-180 (1977))是另一种技术，其中在用放射性同位素例如125I标记之后可以使用检测抗体。这些免疫分析的一些可以通过使用合适的仪器，例如用于荧光免疫分析的 IMX (Abbott, Irving, iTex.))和用于化学发光免疫分析的 Ciba Coming ACS 180 (Ciba Corning, Medfield, Mass.)来容易地自动化。在某些实施方式中，此处描述的试剂盒进一步包含已知量的PLA2R或其片段的标准物。在某些实施方式中，此处描述的试剂盒进一步包括抗-PLA2R抗体水平的参考值。 所述参考值是来自非MN健康人类的群体的样品中抗-PLA2R抗体的平均水平。参考值可以作为数值来提供，或作为以pg/ml-μ g/ml存在的抗-PLA2R抗体的已知量或滴度的标准物来提供。在某些实施方式中，此处描述的试剂盒进一步包含用于样品采集的至少一种样品采集容器。采集设备和容器包括但不限于注射器、刺血针、BD VA⑶TAINER 血液采集管。在某些实施方式中，此处描述的试剂盒进一步包含使用所述试剂盒和解释结果的说明。例如，显示附图9结果解释的图表。作为示例，典型的基于ELISA的试剂盒分析将涉及将含有血清的样品分配到微量滴定板反应孔中，优选的一式两份或三份(如在附图11中)。反应孔用固定的PLA2R包被。此外，根据试剂盒的说明，随试剂盒提供的固定量的标准抗-IgG也分配到微量滴定板的参考反应孔中，也优选的一式两份或三份。固定量的标准抗-IgG相应于通常在健康受试者中存在的抗-PLA2R自身抗体的参考值的至少两倍。相应于抗-PLA2R自身抗体的参考值的二分之一的第二固定量的标准抗-IgG可以添加到另一组参考反应孔中。随后，特异于抗-PLA2R 自身抗体的标记的检测抗体添加到样品和参考反应孔中，例如，抗-IgG抗体。这是种“夹心”ELISA分析，其中抗-PLA2R自身抗体被夹在PLA2R和抗-IgG抗体之间。由于检测的标记物的量是反应孔中存在的抗-PIJ^R自身抗体的量的度量，各个反应孔中检测的标记物的量提供了比较样品中的抗-PLA2R自身抗体水平与通常在健康受试者中存在的抗-PLA2R 自身抗体参考值的手段。例如，如果标记物是有色的乳胶珠子，与参考反应孔相比样品反应孔中更大的颜色强度表明，样品中抗-PLA2R自身抗体的水平高于通常在健康受试者中存在的抗-PLA2R自身抗体参考值的两倍。另一方面，如果样品反应孔中的颜色强度与参考反应孔相比更低，表明样品中抗-PLA2R自身抗体的水平为健康受试者中通常存在的自身抗 PLA2R抗体参考值的至多二分之一。本发明的实施方式还提供了进行诊断受试者中的MN、评估受试者发生MN的风险、 监视患有MN的受试者的治疗效力的方法的系统(和用于带来(cause)计算机系统的计算机可读介质)。在一个实施方式中，在此提供的是系统，其包含测量模块，测量包含来自免疫分析的可检测信号的自身抗体信息，表明获自受试者的样品的对PLA2R为反应性的抗体的存在或水平；存储模块，其被配置以存储来自所述测量模块的数据输出；比较模块，适应于比较所述存储模块上存储的数据与参考和/或对照数据以及提供收回的内容，和输出模块，用于向用户显示所述收回的内容，其中所述收回的内容针对PLA2R为反应性的抗体的存在或可检测的量表明所述受试者患有MN或有MN的复发。
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在一个实施方式中，在此提供的是方便受试者中膜性肾病(丽)的预后评估的系统，包括测定模块，被配置以接收和输出获自受试者的样品的针对PLA2R的自身抗体信息，其中所述自身抗体信息测量对PLA2R为反应性的自身抗体的水平；存储模块，配置以存储来自所述测定模块的输出信息；比较模块，适应于比较所述存储模块上存储的数据与参考数据和/或对照数据并提供比较内容，以及输出模块，用于向用户显示所述比较内容，其中如果没有可检测量的对PLA2R为反应性的自身抗体，则所述受试者处于症状缓解中，或如果存在着对在先读数的至少10%的降低，则MN的治疗在所述受试者中是有效的。在某些实施方式中，对照数据包括来自同一受试者的早先的数据，其中所述早先的数据表明了可检测量的自身抗体。在一个实施方式中，在此提供的是计算机可读的存储介质，包括储存数据模块， 含有来自获自受试者的样品的数据，其代表了来自对PLA2R为反应性的抗体的免疫分析的信号水平；比较模块，其比较所述储存数据模块上存储的数据与参考数据和/或对照数据， 并提供比较内容，和输出模块，向用户显示所述比较内容，其中相对于所述参考数据和/或对照数据至少10%的对PLA2R为反应性的抗体的可检测量的存在，表明所述受试者患有MN 或具有丽的复发。在一个实施方式中，所述对照数据包含来自非MN健康个体的群体的数据，其是利用Ix PBS 1:100稀释度的来自非丽健康个体的人类血清与0.5 μ g天然PLA2R免疫反应获得的检测信号，其中辣根过氧化物酶抗人IgG抗体是标记的检测抗体，所述检测信号是化学发光。本发明的实施方式可以通过功能模块来描述，其由记录在计算机可读介质上的计算机可执行指令来定义，当被执行时其使得计算机进行方法步骤。为了清楚，所述模块通过功能来区分。然而，要理解的是，所述模块/系统不必相应于分离的编码块，描述的功能可以通过保存在各种介质上和在各种时间执行的各种编码部分的执行来进行。此外，应该理解的是，模块可以进行其他功能，因而模块不限于具有任何特定的功能或功能组。计算机可读存储介质#30可以是任何可获得的、可由计算机访问的有形的介质。 计算机可读存储介质包括易失性的和非易失性的、可移动的和非可移动的有形介质，以用于信息存储的任何方法或技术实现，例如计算机可读指令、数据结构、程序模块或其他数据。计算机可读存储介质包括但不限于，RAM (随机存取存储器)、R0M (只读存储器)、EPR0M (可擦可编程只读存储器)、EEPROM (电可擦可编程只读存储器)、闪速存储器或其他存储技术，⑶-ROM (光盘只读存储器)、DVDs (数字通用盘)或其他光存储介质，磁带盒、磁带、磁盘存储器或其他磁存储介质，其他类型的易失的和非易失性存储器，任何其他有形的介质，其可以用于保存期望的信息并且其可以由计算机访问，包括以及上述的任何适合的组合。包含在一种或更多种计算机可读介质上的计算机可读数据可以定义指令，例如， 作为一个或更多个程序的一部分，作为被计算机执行的结果，其指示计算机进行在此描述的一种或更多种功能和/或各种其各种实施方式、变化和组合。这样的指令可以以多种编程语言的任一种来写入，例如，Java、J#、Visual Basic、C、C#、C++、Fortran、Pascal、 Eiffel、Basic, COBOL汇编语言，等等，或其多种组合的任一种。其上可以包含这样的的指令的计算机可读介质可以处于系统的一个或更多个部分上，或此处描述的计算机可读存储介质可以跨越一个或更多个这样的部分而分布。
计算机可读介质可以是可运输的，从而保存在其上的指令可以加载到任何计算机资源上来实现在此讨论的本发明的方面。此外，应该理解的是，保存在计算机可读介质上的指令，如上所述的，不限于作为主机上运行的应用程序的一部分而包含的指令。而是， 所述指令可以作为任何类型的计算机代码(例如，软件或微码)来包含，其可以被采用来为计算机编程以实现本发明的方面。计算机可执行指令可以以适合的计算机语言或几种语言的组合来写入。基础的计算生物学方法是普通技术人员已知的，例如，在Setubal and Meidanis et al.，Introduction to Computational Biology Methods (PWS Publishing Company, Boston, 1997); Salzbergj Searlesj Kasifj (Ed. ), Computational Methods in Molecular Biology, (Elsevier, Amsterdam, 1998) ； Rashidi and Buehlerj Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine (CRC Press, London, 2000)and Ouelette and Bzevanis Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley & Sons, Inc. , 2nd ed. , 2001)中描述了。本发明的某些实施方式的的功能模块至少包括测量模块#40、存储模块#30、比较模块#80和输出模块#110。功能模块可以在一个或多个计算机上执行，或通过利用一个或多个计算机网络执行。测量模块具有计算机可执行指令来提供例如以计算机可读形式的表 ？if η 息 ο测量模块#40可以包含用于检测表示抗-PLA2R自身抗体的表达水平的信号的任何系统。这样的系统可以包括DNA微阵列、RNA表达阵列、任何ELISA检测系统和/或任何 western印迹检测系统。在测定系统中测定的信息可以由存储模块#30读取。如在此使用的，“存储模块”意图包括任何适合的计算或处理装置，或其他配置以或适合于保存数据或信息的设备。适用于本发明的电子装置的实例包括独立的计算装置、数据远程通信网络，包括局域网(LAN)、 广域网(WAN)、互联网、内部网和外部网，以及局部和分布式计算机处理系统。存储模块还包括但不限于磁存储介质，例如，软性磁盘、硬磁盘存储介质、磁带、光存储介质，例如 CD-ROM、DVD、电子存储介质，例如，RAM、ROM、EPR0M、EEPROM等等，一般的硬盘和这些类别的杂合物，例如，磁/光存储介质。存储模块被适应或配置用于在其上记录表达水平或蛋白质水平信息。这样的信息可以以数字形式提供，其可以电子地传输和阅读，例如，通过互联网， 在磁盘上，通过USB (通用串行总线)或通过任何其他适合的通信方式。如在此使用的，“存储”是指在存储模块上编码信息的过程。本领域技术人员可以容易地采用任何当前已知的方法来将信息记录在已知的介质上，来产生包含表达水平信息的产品。在一个实施方式中，存储模块中保存的、由比较模块阅读的参考数据是，例如，获自非MN受试者的群体、MN受试者的群体的表达数据，在在先的时间段利用测量模块MO获自同一受试者的表达数据。“比较模块” #80可以使用多种可用的用于比较操作的软件程序和格式，来比较测量模块中测定的表达数据和参考样品和/或存储的参考数据。在一个实施方式中，所述比较模块被配置以使用模式识别技术来比较来自一个或更多个项目的信息和一个或更多个参考数据模式。比较模块可以利用用于比较模式的现有的商业上可获得的或免费获得的软件来配置，可以为了所进行的特定的数据比较来优化。比较模块提供了与自身抗体的标准化的表达水平、个体中MN的存在/缺乏、个体中的治疗效力和/或治疗个体的方法相关的计算机可读的信息。本发明的比较模块或任何其他模块可以包括操作系统(例如，UNIX)，在其上运行关系数据库管理系统，万维网应用软件和万维网服务器。万维网应用软件包括产生数据库语言语句所需的可执行码(例如，结构化查询语言(SQL)语句)。一般地，可执行的将包括嵌入式SQL语句。此外，万维网应用软件可以包括配置文件，其含有各种软件实体的指针和地址，其包括服务器以及对于服务用户请求必须可访问的各种外部和内部数据库。配置文件还将对服务器资源的请求指导到合适的硬件上，如果服务器在两个或更多个独立的计算机上分布，这可能是必需的。在一个实施方式中，万维网服务器支持TCP/IP方案。局部网络， 例如这种有时被称为“内部网”。这样的内部网的优点是，它们容许与万维网上存在的公共域数据库(例如，GenBank或Swiss Pro万维网位点)容易地通信。因而，在本发明的特别优选的实施方式中，用户可以利用网络浏览器和网络服务器所提供的HTML界面直接访问互联网数据库上存在的数据(通过例如超级文本连接)。比较模块提供了计算机可读的比较结果，其可以通过预定义的指标、或由用户定义的指标以计算机可读形式来处理，来提供部分地基于比较结果的内容，其可以被保存和按用户的要求利用输出模块#110输出。基于比较结果的内容可以是与参考相比较的表达值，显示了个体中丽的存在/缺乏或受试者发生MN的评估的风险。在本发明的一个实施方式中，基于比较结果的内容显示在计算机监视器#120上。 在本发明的一个实施方式中，基于比较结果的内容通过可印刷的介质#130、#140显示。显示模块可以是任何适合的设备，其被配置以从计算机接收和向用户显示计算机可读信息。 非限制性实例包括，例如，通用计算机，例如基于英特尔奔腾型处理器、摩托罗拉PowerPC、 Sun UltraSPARC、惠普 PA-RISC 处理器、可从 Sunnyvale, California 的 Advanced Micro Devices (AMD)获得的各种处理器中的任一、或任何其他类型的处理器的那些，可视显示设备例如平板显示器、阴极射线管等等，以及各种类型的计算机打印机。在一个实施方式中，万维网浏览器被用于提供显示基于比较结果的内容的用户界面。要理解的是，本发明的其他模块可以适合于具有网络浏览器界面。通过网络浏览器，用户可以构建用于从比较模块收回数据的请求。因而，用户一般将指向并点击通常在图形用户界面中采用的用户界面元件，例如，按钮、下拉菜单、滚动条等等。因而本发明提供了系统(和用于带来计算机系统的计算机可读介质)来进行诊断 MN或评估个体中MN的治疗预后的方法。此处描述的系统和计算机可读介质仅仅是本发明用于检测个体中抗-PLA2R自身抗体的说明性的实施方式，不意图限制本发明的范围。此处描述的系统和计算机可读介质的变体是可能的，意图落入本发明的范围。机器的模块、或在计算机可读介质中使用的那些，可以采取许多的结构。例如，可以在单个机器上提供功能，或在多个机器上分布功能。样品采集和制备
样品采集可以通过本领域技术人员公知的方法来进行。例如，患者的血液可以通过受训的医务人员直接抽取到抗凝剂例如柠檬酸盐和EDTA中。全血可以通过在3500XG冷冻离心2分钟分离成血浆部分、细胞和血小板部分。 在离心之后，上清液是血浆。作为选择，血清可以从全血采集。在硬塑料或玻璃管中采集血液，血液将不会在软塑料中凝块。6 mL的血清抽取15mL的全血。容许全血在室温放置30分钟到2小时直到形成血块。利用玻璃棒或木制敷涂器杆从容器的侧面小心地分离血块，在4°C过夜。之后，滗析血清，离心和/或利用Pasteur吸移管将血清移动到清洁的试管中。通过在2000-3000 rpm离心10分钟来澄清血清。在进行针对PLA2R的自身抗体的分析之前，血清保存在-20°C 或-80°C。利用采集管获得血清的详细说明可以在美国专利No. 3，837，376中找到，通过完全引用将其合并在此。血液采集管也可以购自BD Diagnostic Systems,Greiner Bio-One 禾口 Kendall Company。PLA2R抗体的检测
血液、血清或血浆中针对人或猪PLA2R的自身抗体的检测可以通过本领域已知的任何方法来检测。优选的通过ELISA，其中该检测方法是免疫化学的方法，涉及自身抗体与 PLA2R蛋白或其片段的结合。然后通过本领域已知的多种方法检测抗体-蛋白质复合物的形成。酶联免疫吸附测定，也称为ELISA、酶免疫分析或EIA，是在免疫学中主要使用的生物化学的技术，来检测样品中抗体或抗原的存在。ELISA已经被用作医学和植物病理学中的诊断工具，以及各种产业中质量控制检验。对于此处描述的方法，在ELISA中，已知量的抗原(PLA2R或其片段)固定到表面，然后怀疑含有对PLA2R的自身抗体的样品，例如，血液、 血清或血浆在所述表面上冲过，从而自身抗体可以结合到固定的抗原上。洗涤表面来除去任何未结合的蛋白质，将检测抗体施加到表面上。检测抗体特异于来自受试者的抗体。例如，如果受试者是人类，检测抗体应当是抗人IgG抗体。如果受试者是狗，检测抗体则应当是抗狗IgG抗体。这种检测抗体与酶连接，在最后的步骤中，添加一种物质，所述酶可以转化成某些可检测信号。例如，对于荧光ELISA来说，当光线照射到样品时，任何抗原/抗体复合物将发荧光，从而可以测量样品中抗体的量。这是间接的酶联免疫吸附测定。间接ELISA 的示意图在附图7中显示。以下的是用于建立和进行间接酶联免疫吸附测定的一般的标准方案。使用96孔微量滴定板(Falcon Pro-Bindassay plate 3915； Becton Dickinson, Paramus, N.J·), 测试孔通过在室温下与每孔100 μ 1纯化的PLA2R(PBS中3 μ g/ml)孵育过夜来包被抗原 (PLA2R或其片段)，对照孔中用PBS代替抗原。在平板用PBS-Tween洗涤三次之后，250 μ 1 的PBS中21的PBS添加到每个反应孔，平板在室温下孵育1小时。平板用PBS-Tween洗涤三次，在室温下与在PBS-Tween-BSA中1 100稀释的测试血清和对照血清孵育1小时(一种高阳性血清样本，两种阴性血清样本，一种弱阳性血清样本)；每种血清样本在包被抗原的反应孔以及抗原对照反应孔中一式三份地测试。然后通过在PBS-Tween-BSA中1:2，000稀释的每反应孔100 μ 1的轭合辣根过氧化酶的山羊抗人IgG(Bio-Rad，Richmond, Calif.) 在室温下孵育1小时来分析平板的针对PLA2R的人类自身抗体IgG的存在(使用合适的对照物)。在PBS-Tween中洗涤三次之后，底物溶液(邻苯二胺二氢氯化物；Sigma)添加到每个反应孔。平板然后在暗处在室温下孵育30分钟，通过添加2 N硫酸来终止反应。490 nm (OD490)的光密度值在微平板ELISA读取器中测量。对于每个血清样本，对测试孔和抗原对
28照孔计算平均OD49tl读数，前者减去后者来获得净ELISA值。进行ELISA涉及具有对特定抗原的特异性的至少一种抗体。已知量的抗原 (PLA2R)非特异性地(通过吸附到表面)或特异性地(通过由对同一抗原特异性的另一种抗体捕获，在“夹心” ELISA中)固定在固相支持物上(通常，聚苯乙烯微滴定平板)。在抗原固定之后，添加检测抗体，与抗原形成复合物。检测抗体可以共价连接到酶，或本身可以通过二级抗体来检测，所述二级抗体通过生物轭合连接到酶上。在每个步骤之间，平板一般用轻度洗涤剂溶液洗涤来除去未特异性结合的任何蛋白质或抗体。在最后的洗涤步骤之后， 通过添加酶底物来产生可视信号来使平板显色，所述信号表明了样品中抗原的量。更老的 ELISA利用生色底物，而更新的分析采用具有更高敏感性的产荧光底物。在另一个实施方式中，使用竞争性ELISA。来自受试者的纯化的抗-PLA2R抗体包被在多个反应孔的固相上。血清样品重组的PLA2R、(抗原)或其片段以及用抗-PLA2R抗体标记的辣根过氧化酶(轭合的)添加到包被的反应孔，形成竞争性结合。在孵育之后，如果针对PLA2R内容物的自身抗体水平在样品中是高的，将形成用HRP标记的PLA2R-自身抗体-抗-PLA2R的复合物。洗涤反应孔将除去复合物，与TMB (3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺) 显色底物孵育用于定位反应孔中辣根过氧化酶轭合的抗体。随后，将没有颜色改变或很小的颜色改变。如果血清样品中没有针对PLA2R的自身抗体，将有大的颜色改变。这样的竞争性ELISA测试是特异性的、敏感、可重复的，并且易于操作。在一个实施方式中，使用反-夹心(RS)ELISA(MiyazawaH，· et. al, J Allergy Clin Immunol. 1988; 82:407 - 413)，其中感兴趣的抗体在此处描述的方法中针对PLA2R 的自身抗体，被抗原(PLA2R)夹心一个抗原可以固定在表面，第二抗原是可溶的并标签化。这种方法也称为双抗原夹心方法。RS ELISA的示意图在附图7中示出。以下的是用于建立和进行RS-ELISA的一般的标准方案。在0. 5 M NaCl - 0. 1% NaN3 - 0. 05 M 碳酸钠(pH 9. 6)中 0. 1 mL 量的 PLA^UO. 3 μ g/ml)或 PLA^UO. 9 μ g/ml)加牛血清白蛋白(BSA; 25 μ g/ml)添加到 Maxisorp 微量培养板(Nalge Nunc, Copenhagen, Denmark)的反应孔中。平板在4°C孵育过夜用于抗原固定。在洗涤反应孔之后，添加用 FBS-PBSTC10%[vol/vol]胎牛血清[FBS]、0. 1% NaN3-磷酸缓冲盐水[PBS] - 0. 05% Tween 20[PBST]) 1:4、1:40和1:400稀释的测试血清，平板在室温下孵育60分钟。使用七份参考血清的三倍连续稀释物。在另一次洗涤之后，FBS-PBST中的生物素化的PLA2R或PU^R (0. 05 μ g/ml)添加到反应孔中，容许反应在室温下发生60分钟。反应孔再次洗涤，添加链霉抗生物素蛋白-轭合的β-d-半乳糖苷酶(GIBCO BRL, Life Technologies Inc., Rockville, Md.；在含1% BSA的PBST中1:50，000稀释)，平板在室温下孵育60分钟。在另一次洗涤之后，添加0. 1 M NaCl-I mM MgCl2-O. 1% BSA-0. 1% NaN3-O. 01 M磷酸钠(pH 7.0) 中的 0.2 mM 4-甲基 umbelliferyl-P-d-半乳糖苷(Sigma Chemical Co. , St. Louis ，Mo .)。反应孔用胶带密封，平板浸入37°C水中60分钟。最后，0.1 ml的0.1 M甘氨酸-NaOH CpH 10. 2)添加到每个反应孔来停止酶反应。每个反应孔中的荧光单位(FU)用 Fluoroskan II 装置(Flow Laboratories, Rockville, Md.)测量。测试血清的抗体浓度从每毫升已知抗体单位的参考血清的滴定曲线来计算。在一个优选的实施方式中，检测抗体通过将抗体连接到酶来可检测地标记。随后， 当暴露于它的底物时，所述酶将以如下方式与所述底物反应，来产生化学部分，其可以通过
29例如分光光度法、荧光或通过可见装置来检测。可用于可检测标记本发明的抗体的酶包括但不限于，苹果酸脱氢酶、葡萄球菌的核酸酶、△-V-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、 beta-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿酶、过氧化氢酶、葡萄糖-VI-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。在其他实施方式中，所述检测抗体用荧光化合物标记。当荧光标记的抗体暴露于适当波长的光线时，然后由于荧光可以检测它的存在。在最常用的荧光标记化合物之中有CY染料、异硫氰酸荧光素、罗丹明、phycoerytherin、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、 o-phthaldehyde 和荧光胺。检测抗体也可以使用荧光发射金属，例如152EU或其他镧系元素来可检测地标记。这些金属可以使用金属螯合基团如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸 (EDTA)来附着于抗体。检测抗体也可以通过将它连结到化学发光化合物来可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程期间出现的发光的存在，来确定化学发光-抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例有鲁米诺、萤光素、isoluminol.theromatic acridinium ester、咪唑、acridinium盐和草酸酯。存在其他不同形式的ELISA，其是本领域的技术人员公知的。在"Methods in Immunodiagnosis", 2nd Edition, Rose and Bigazzi, eds. John Wiley & Sons, 1980； Campbell et al. , "Methods and Immunology", W. A. Benjamin, Inc. , 1964；以及 Oellerich, Μ. 1984，J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22:895-904 中描述了本领域已知的用于ELISA的标准技术。其他技术可以用于检测样品中的PLA2R自身抗体。一种这样的技术是western印迹(Towbin et at. , Proc. Nat. Acad. Sci. 764350 (1979))，另一种是 Western 印迹的修改，斑点印迹。在Western印迹中，PLA2R蛋白质或其片段可以用洗涤剂和加热来解离， 在SDS-PAGE凝胶上跑动，之后转移到固相支持物，例如硝酸纤维素膜上。滤过器用怀疑含有针对PLA2R的自身抗体的样品洗涤。然后洗涤滤过器来除去未结合的蛋白质和非特异性结合的蛋白质。可检测地标记的酶连接的二级抗体然后可以用于检测和评估测试的样品中自身抗体的量。来自可检测标记的信号的强度相应于存在的酶的量，从而相应于针对PLA2R 的自身抗体的量。可以对水平进行定量，例如，通过光密度测定法。另一种免疫学的分析是浊度测量免疫分析。浊度测量的免疫分析是本领域技术人员已知的并且可以根据美国专利N0. 4730922,4268171,4401387,4408880,4889815, 4690906,4784947和516223中描述的来进行，所有这些通过完全引用合并在此。作为针对PLA2R的抗体的阳性对照，可以使用已知量的抗-PLA2R抗体。抗-PLA2R 抗体可以获自商业来源，例如，INVITR0GEN Inc.、MILLIPORE、SIGMA-ALDRICH、R & D Systems、ABCAM和World，s Antibody Gateway (超过个150家抗体公司的免费搜索引擎)和GeneTexto，等等。抗体可以是多克隆的或单克隆的抗体。做为选择，抗体可以针对人 PLA2R 蛋白质(GENBANK 登记号 No. ΝΡ_001007268 ；SEQ ID NO. 1 和 ΝΡ_031392· 3，SEQ ID NO. 2)或其片段由本领域技术人员产生。产生抗体的方法在PCT公开W097/40072或美国申请N0. 2002/0182702中公开了，通过引用合并在此。免疫来引发哺乳动物中的抗体生产、产生杂交瘤来生产单克隆抗体、纯化抗体的方法可以通过“Current Protocols in Immunology，，(CPI) (John Wiley and Sons, Inc.)禾口 Antibodies: A Laboratory Manual (Ed Harlow and David Lane editors, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988)中描述的进行，这两者都通过完全引用合并在此。当免疫分析信号超过不存在针对PLA2R或其片段的抗体、或存在非相关的非 PLA2R结合抗体的情况下对照免疫分析信号的至少10%时，针对PLA2R的自身抗体的检测被认为是阳性的。在另一个实施方式中，对照免疫分析信号是用非MN健康受试者的血清获得的，受试者不具有疾病的临床特征。在另一个实施方式中，对照免疫分析信号是从非MN健康受试者的群体获得的平均值。群体是至少25位非MN健康受试者，优选的更多。所述提高是至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少50%、至少100%、至少200%、至少300%、至少 500%、至少1000%、或更多和包括10-1000%之间的所有百分比。在一个实施方式中，自身抗体的检测包括鉴定和检测编码所述抗体的提高量的mRNA。存在着本领域公知的检测、鉴定和测定mRNA的许多方法，例如，Northern印迹和RT-PCR。在一个实施方式中，mRNA可以通过定量的实时PCR来测定。实时PCR是可以用于测定mRNA表达水平的扩增技术。(参见，例如，Gibson et al.，Genome Research 6:995-1001，1996; Heid et al. , Genome Research 6:986-994, 1996)。实时PCR评估扩增期间PCR产物积累的水平。这种技术允许多个样品中mRNA水平的定量评估。对于mRNA 水平，mRNA提取自生物样品，例如，血液样品，cDNA利用标准技术来制备。例如，利用Perkin Elmer/Applied Biosystems (Foster City,Calif. ) 7700 Prism 仪器，可以进行实时 PCR。 匹配引物和荧光探针可以利用例如，Perkin Elmer/Applied Biosystems (Foster City, Calif.)提供的引物表达程序对感兴趣的基因来设计。引物和探针的最佳浓度可以通过本领域普通技术人员来初步测定，对照(例如，肌动蛋白)引物和探针可以商业地获自，例如，Perkin Elmer/Applied Biosystems (Foster City, Calif·)。为了定量样品中感兴趣的特定核酸的量，利用对照物产生标准曲线。标准曲线可以利用实时PCR中测定的Ct值来产生，其与分析中使用的感兴趣的核酸的初始浓度相关。从10-106个拷贝的感兴趣基因的标准稀释物一般是足够的。此外，对对照序列产生标准曲线。这允许用于比较目的的，组织样品中感兴趣的核酸的初始含量针对对照量的标准化。利用TaqMan探针的实时定量PCR的方法是本领域公知的。例如，对于RNA在 Gibson et al. , 1996，Genome Res. , 10:995-1001;以及对于 DNA 在Heid et al., 1996，Genome Res. , 10:986-994中提供了实时定量PCR的详细的方案。基于TaqMan的分析利用了含5’荧光染料和3’猝灭剂的发荧光的寡核苷酸探针。 探针与PCR产物杂交，但是由于3’末端的封闭试剂本身不能延伸。当在随后的循环中扩增 PCR产物时，聚合酶例如AmpliTaq的5’核酸酶活性引起TaqMan探针的裂解。这种裂解分离了 5’荧光染料和3’猝灭剂，从而产生作为扩增的函数的荧光提高(参见，例如，Perkin Elmer的万维网)。在另一个实施方式中，通过Northern印迹可以实现RNA转录产物的检测，其中RNA 的制备物在变性琼脂糖凝胶上跑动，转移到适合的支持物，例如活化的纤维素、硝化纤维或玻璃或尼龙膜上。标记的(例如，放射性标记的)cDNA或RNA然后与所述制备物杂交，洗涤， 并通过例如放射自显影的方法来分析。
在另一个实施方式中，RNA转录产物的检测可以进一步使用已知的扩增方法来实现。例如，在本发明的范围内的是将mRNA逆转录成cDNA，随后聚合酶链式反应(RT-PCR)； 或如美国专利No. 5，322，770描述的对两个步骤使用单个酶，或将mRNA逆转录成cDNA，随后对称性缺口脂肪酶链式反应(RT-AGLCR)JnR. L. Marshall, et al.，PCR Methods and Applications 4: 80-84 (1994)所描述的。检测酶mRNA转录产物的一种适合的方法在参考文献 Pabic et. al. Hepatology, 37 (5): 1056-1066，2003 中描述了，通过完全引用将其合并在此。在其他实施方式中，，检测RNA转录产物可以用其他已知的扩增方法实现，包括但不限于在 PNAS USA 87 1874-1878 (1990)中描述的和也在 Nature 350 91-92 (1991) 中描述的所谓“NASBA”或“3SR”技术；在公开的欧洲专利申请(EPA)No. 4544610中描述的 Q-beta 扩增；链置换扩增(如 G. T. Walker et al.，Clin. Chem. 42 9-13 (1996)和欧洲专利申请No. 684315所描述的；以及目标介导的扩增，如PCT公开WO 932M61所描述的。此处描述的方法中涵盖的在原位杂交可视化中采用，用于检测血液样品中针对 PLA2R RNA转录产物的自身抗体。在原位杂交中，放射活性标记的反义RNA探针与血小板的薄涂片杂交，之后洗涤血小板的涂片，用RNase裂解，暴露于感光乳剂用于放射自显影。样品可以用苏木精染色来表现样品的组织学组成，使用适合的滤光器暗视野成像来显示显色的乳剂。也可以使用非放射性的标记物例如毛地黄毒苷。做为选择，可以在DNA阵列、芯片或微阵列上检测mRNA表达。相应于PLA2R RNA 转录产物的自身抗体的寡核苷酸被固定在芯片上，芯片然后与从患者获得的血小板的样品的标记的核酸杂交。阳性杂交信号用含有针对PLA2R RNA转录产物的自身抗体的样品获得。制备DNA阵列的方法和它们的使用是本领域公知的。(参见，例如美国专利Nos: 6，618，6796 ； 6，379，897 ； 6，664，377 ； 6，451，536 ； 548，257 ； U. S. 20030157485 和 Schena et al. 1995 Science 20:467—470; Gerhold et al. 1999 Trends in Biochem. Sci. 24, 168-173 ； and Lennon et al. 2000 Drug discovery Today 5: 59-65,通过完全引用将它们合并在此)。也可以进行基因表达的系列分析(SAGE)(参见例如美国专利申请 20030215858)。为了监视mRNA水平，例如，从要测试的血液样品提取mRNA，逆转录，产生荧光标记的cDNA探针。能够与cDNA杂交的微阵列然后使用标记的cDNA探针来探测，扫描载玻片， 测定荧光强度。这种强度与杂交强度和表达水平相关。cDNA相应于针对PLA2R RNA转录产物的自身抗体，特别是抗体的可变区中。“定量”扩增的方法是本领域技术人员公知的。例如，定量的PCR涉及利用相同的引物同时地共同扩增已知量的对照序列。这提供了内标准物，其可以用于校准PCR反应。定量 PCR 的详细方案，例如，在 hnis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N. Y.中提供了。重组PLA2R蛋白质和PLA2R表达载体
重组PLA2R蛋白质和其片段也可以通过本领域公知的分子的方法合成和纯化。例如， 重组蛋白质可以在细菌、哺乳动物、昆虫、酵母菌或植物细胞中表达。常规的聚合酶链式反应(PCR)克隆技术可以用于克隆编码PLA2R的核酸，利用PLA2R的mRNA作为用于PCR克隆的模板。在某些实施方式中，人类PLA2R的mRNA模板是 Genbank Accession Nos. NM_001007267, SEQ ID NO. 3 和 ΝΜ_007366· 3，SEQ ID NO. 4。 理想地，限制性内切酶消化识别位点应当在PCR引物的有义和反义链的末端设计，来便于扩增的核酸向克隆载体或其他载体中的连接。做为选择，3’-A突出可以被包括，用于 TA-克隆的目的，这是本领域公知的。这样的具有3’ A突出的编码核酸可以容易地连接到 Invitrogen 拓扑异构酶辅助的 TA 载体中，例如 pCR -T0P0、pCR -Blunt 11-TOPO, pENTR/ D-TOPOe和pENTR/SD/D-TOPO 。编码核酸可以克隆到通用的克隆载体中，例如pUC19、 pBR322、pBLUESCRIPT 载体(STRATAGENE Inc.)或来自 Invitrogen Inc. ^ pCR Τ0Ρ0 。产生的带有编码PLA2R的核酸的重组载体然后亚克隆到蛋白质表达载体或病毒载体中，用于在各种蛋白质表达系统中PLA2R融合蛋白的合成，利用选自由哺乳动物细胞系、昆虫细胞系、酵母、细菌和植物细胞组成的组的宿主细胞。蛋白酶裂解位点也可以设计和包括在核酸之内，来便于PLA2R从更大的融合蛋白的释放，例如，His-PLA2R或硫氧还蛋白-PLA2R。蛋白酶裂解位点的实例包括但不限于肠激酶、糜蛋白酶和凝血酶的那些。PCR扩增编码核酸可以克隆到载体中，利用Τ0Ρ0 克隆方法到hvitrogen拓扑异构酶辅助的 TA 载体中，例如，pCR -T0P0、pCR -Blunt 11-Τ0Ρ0, pENTR/D-T0P0 和 pENTR/ SD/D-T0P0 。pENTR/D - Τ0Ρ0 和 pENTR/SD/D - Τ0Ρ0 都是定向的 T0P0 进入载体，其容许DNA序列以5’ 一3’方向克隆到GATEWAY 表达载体中。5’ 一3’方向的定向克隆便于DNA序列单向插入到蛋白质表达载体中，从而启动子处在核酸的5’ ATG起始密码子的上游，因而允许启动子驱动的蛋白质表达。带有PLA2R编码核酸的重组载体可以转染到一般的克隆大肠杆菌细胞中并在其中增殖，例如XLlBlue、SURE (STRATAGENE)和TOP-IO细胞 (INVITR0GEN)。不同的表达载体是可获得的，用于从异源蛋白质表达系统产生的重组蛋白质的表达和纯化。利用选自例如，哺乳动物、昆虫、酵母、细菌或植物细胞的宿主细胞的异源蛋白质表达系统是本领域技术人员公知的。表达载体应当具有必要的5’上游和3’下游调节元件， 例如，启动子序列、核糖体识别和结合TATA框，以及3’ UTR AAUAAA (SEQ ID N0. 5)转录终止序列，用于在其相应的宿主细胞中有效基因转录和翻译。表达载体可以具有另外的序列， 例如6X-组氨酸、V5、硫氧还蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、c-Myc、VSV-G、HSV、FLAG、麦芽糖结合肽、金属结合肽、HA和“分泌”信号(Honeybee melittin，α -因子，ΡΗ0，Bip)，其被掺入到表达的重组蛋白质中。此外，可以有酶消化位点掺入到这些序列之后，来便于在不需要额外的序列之后它们的酶催化去除。这些额外的序列对于重组蛋白质表达的检测，通过亲和层析的蛋白质纯化，重组蛋白质在宿主细胞质中增强的溶解度，更好的蛋白质表达，特别是小的蛋白质片段，和/或将表达的重组蛋白质分泌到培养介质内、原核生物细菌的周质中、或酵母细胞的原生质球中是有用的。重组蛋白质的表达可以是宿主细胞中组成型的，或可以用例如，硫酸铜、糖类如半乳糖、甲醇、甲胺、硫胺、四环素、用杆状病毒感染以及(异丙基-β -D-硫代半乳糖苷)IPTG、乳糖的稳定的合成类似物来诱导。在某些实施方式中，重组PLA2R可以在多种表达宿主细胞中表达，例如，细菌，如大肠杆菌、酵母、哺乳动物、昆虫和植物细胞，例如衣藻属，或甚至从无细胞表达系统中表达。核酸可以从克隆载体亚克隆到重组表达载体中，所述重组表达载体适合于在哺乳动物、 昆虫、酵母、细菌或植物细胞或无细胞表达系统例如兔网织红细胞表达系统中蛋白质的表
33达。亚克隆可以通过PCR克隆、限制消化随后连接、或重组反应来实现，例如，利用(Gateway LR和BP CLONASE 酶混合物的基于λ噬菌体的位点特异性重组的那些。亚克隆应当是单向的，从而核酸的5’ ATG起始密码子处在表达载体中启动子的下游。做为选择，当编码核酸克隆到 pENTR/D-TOPO ,、pENTR/SD/T0P0 (定向进入载体)或任何 hvitrogen，s Gateway Technology pENTR (进入)载体中时，编码核酸可以转移到各种GATEWAY 表达载体(目的) 用于分别在哺乳动物细胞、大肠杆菌、昆虫和酵母菌中在单个重组反应中的蛋白质表达。 GATEWAY 目的载体的一些被设计用于杆状病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒(AAV)、逆转录病毒和慢病毒的构建，其在感染它们相应的宿主细胞时，允许重组蛋白质在宿主细胞中的异源表达。将基因转移到目的载体中根据厂家的说明在仅两个步骤中实现。存在着GATEWAY 表达载体用于在大肠杆菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞和酵母菌中的蛋白质表达。在大肠杆菌中转化和选择之后，表达载体将准备好用于在合适的宿主中表达。其他表达载体和宿主细胞的实例有pET载体(NOVAGEN)、pGEX载体(Amersham Pharmacia)和pMAL载体(New England labs. he.)，用于在大肠杆菌宿主细胞例如BL21、 BL21 (DE3)和 AD494 (DE3) pLysS、Rosetta (DE3)和 Origami (DE3) (NOVAGEN)中的蛋白质表达；基于强CMV启动子的pcDNA3. 1 (INVITR0GEN)和pCHneo载体(Promega)，用于在哺乳动物细胞系例如CH0、C0S、HEKj93、Jurkat和MCF-7中的表达；复制不能的腺病毒载体 pADENO X、pAd5F35、pLP-ADEN0-X-CMV (CL0NTECH)、pAd/CMV/V5-DEST、pAd_DEST 载体 (INVITR0GEN)，用于哺乳动物细胞中腺病毒介导的基因转移和表达；用于来自Clontech 的RETRO - X 系统的pLNCX2、pLXSN和pLAPSN逆转录病毒载体，用于在哺乳动物细胞中逆转录病毒介导的基因转移和表达；pLenti4/V5-DEST 、pLenti6/V5_DEST pLenti6. 2/ V5-Gff/lacZ (Invitrogen)用于在哺乳动物细胞中慢病毒介导的基因转移和表达；腺病毒相关病毒表达载体例如pAAV-MCS、pAAV-IRES-hrGFP和pAAV-RC载体(Stratagene)，用于哺乳动物细胞中腺相关病毒介导的基因转移和表达；BACpali6杆状病毒(CL0NTECH)和 pFASTBAC HT (INVITROGEN)，用于 Spodopera frugiperda 9 (Sf9)和 Sf 11 昆虫细胞系中的表达；pMT/BiP/V5-His Gnvitrogen)用于 Drosophila Schneider S2 细胞中的表达； 毕赤氏酵母表达载体pPICZa、pPICZ、pFLDa和ρFLD anvitrogen)，用于巴斯德毕赤氏酵母中的表达，以及用于P. methanolica中的表达的载体ρΜΕΤ α和ρΜΕΤ ； pYES2/GS和 ρYDl (INVITROGEN)载体，用于酵母菌酿酒酵母中的表达。电Chlamydomonas reinhardtii 中大规模表达异源蛋白质的新的进展由Griesbeck C. et. al. 2006 Mol. Biotechnol. 34:213-33 和 Fuhrmann M. 2004，Methods Mol Med. 94:191-5 描述了。外源的异源编码序列通过同源重组插入到核、叶绿体和线粒体的基因组中。叶绿体表达载体P64带有通用的叶绿体选择性标记氨基糖苷类腺嘌呤转移酶(aadA)，其赋予对壮观霉素或链霉素的抗性，可以用于在叶绿体中表达外源蛋白。生物射弹基因枪方法可以用于将载体导入藻类中。 在它进入叶绿体时，外源DNA从基因枪颗粒上释放，通过同源重组整合到叶绿体基因组中。不同的宿主细胞中的重组蛋白质表达可以是组成型或可诱导的，诱导物例如硫酸铜、糖类如半乳糖、甲醇、甲胺、硫胺、四环素或IPTG。在蛋白质在宿主细胞中表达之后，宿主细胞裂解释放表达的蛋白质用于纯化。裂解各种宿主细胞的方法在“Sample Preparation-Tools for Protein Research" EMD Bioscience 以及Current Protocols in Protein Sciences (CPPS)中详述了。优选的纯化方法是亲和层析，例如，利用镍、钴或锌亲和树脂对组氨酸标签的重组蛋白质的离子-金属亲和层析。纯化组氨酸标签的重组蛋白质的方法由CL0NTECH利用它们的TAL0N 钴树脂，和N0VAGEN在它们的pET系统手册第10版中描述了。另一种优选的纯化策略是通过免疫亲和层析，例如，与树脂轭合的抗myc抗体可以用于亲和纯化myc标签的重组肽。丝氨酸蛋白酶例如凝血酶和肠激酶的酶消化从组氨酸或myc标签上裂解并释放重组蛋白质，将重组蛋白质从亲和树脂上释放，同时组氨酸标签和myc标签保持附着在亲和树脂上。无细胞表达系统也是期待的。由于降低的反应体积和处理时间，无细胞表达系统提供了相比传统的基于细胞的表达方法的几种优点，包括反应条件容易修改来有利于蛋白质折叠，降低对产品毒性的敏感性，以及对高通量策略的适应性，例如，快速表达筛选或大量蛋白质生产。无细胞表达系统可以使用质粒或线性DNA。此外，翻译效力方面的改进产生了每毫升反应混合物超过一毫克蛋白质的产量。能够以高产量生产蛋白质的无细胞翻译系统的实例由Spirin AS. et. al.，Science 242:1162 (1988)描述了。所述方法利用了饲喂缓冲液通过反应混合物的连续流动设计，其含有氨基酸、腺苷三磷酸(ATP)和鸟苷三磷酸(GTP)，以及翻译的多肽产物的连续去除。该系统利用了大肠杆菌溶胞产物来提供无细胞的连续饲喂缓冲液。这种连续流动系统与原核和真核的表达载体是兼容的。举例来说， 膜内在蛋白质EmrE多药物转运蛋白的大规模无细胞生产由Chang G. el. al. , Science 310:1950-3 (2005)描述了。其他商业上可获得的无细胞表达系统包括EXPRESSWAY 无细胞表达系统 (Invitrogen)，其利用基于大肠杆菌的体外系统用于高效的偶联的转录和翻译反应，来以试管反应的形式产生高达毫克量的活性重组蛋白质；快速翻译系统(RTS) (Roche Applied kience)，其也利用基于大肠杆菌的体外系统；以及TNT偶联网织红细胞溶胞产物系统 (TNT Coupled Reticulocyte Lysate Systems) (Promega)，其利用基于兔网织红细胞的体外系统。涵盖在此处描述的方法中的是哺乳动物PLA2R，其是从哺乳动物，例如猪或兔纯化的。在一个实施方式中，天然的(非重组的)哺乳动物PLA2R从肾脏先体外后体内地(ex vivo)纯化。天然蛋白质纯化的方法是本领域技术人员公知的。治疗/预防组合物和施用
在一个实施方式中，本发明提供了包含PLA2R或其片段和药学上可接受的载体的药物组合物。药物组合物可以是全长PLA2R和各种大小的片段、以及药学上可接受的载体的组合。片段的实例是包含PLA2R的CTLDs或CRDs 4、5 6的片段或PLA2R的细胞外结构域的其他片段。药物组合物被用于特征在于针对PLA2R的自身抗体的存在的MN的治疗。在一个实施方式中，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准的，或在美国药典或其他一般公认的药典中列出的用于动物、更特别地用于人类的。术语 “载体”是指稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体，治疗剂与它们一同施用。这种药物载体可以是无菌的液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的，例如花生油、豆油、矿物油、 芝麻油等等。当静脉内地施用药物组合物时，水是优选的载体。盐溶液和含水葡萄糖和甘油溶液可以被用作液体载体，特别是对于可注射的溶液。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、 脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果希望，组合物也可包含少量的湿润或乳化剂、或PH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、药丸、胶囊、粉未、持续释放制剂，等等的形式。可以使用传统的粘合剂和载体例如甘油三酯来将组合物配制为栓剂。 口服制剂可以包括标准的载体例如药物级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适合的药物载体的实例在Remington，s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. , Gennaro, ed. (Mack Publishing Co. , 1990)中描述了。在一个实施方式中，其他成分可以添加到药物制剂中，包括，抗氧化剂，例如，抗坏血酸；低分子量(小于约十个残基)多肽，例如，聚精氨酸或三肽；蛋白质，例如，血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物， 例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖和其他碳水化物，包括纤维素或它的衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA ；以及糖醇，例如甘露醇或山梨醇。在一个实施方式中，将组合物根据常规程序配制为适合于对人类进行静脉内施用的药物组合物。一般地，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗含水缓冲液中的溶液。必要时，组合物也可以包括增溶剂和局部麻醉剂，例如lignocamne来在注射的位点镇痛。一般地，在单位剂型中分别地或混合地提供这些成分，例如，在密闭容器例如标明了活性试剂量的安瓿瓶或者小袋中，作为冻干的粉末或无水的浓缩物存在。当通过输液施用组合物时， 可用含有无菌的药学级水或盐水的输液瓶进行配药。当通过注射施用本组合物时，可以提供灭菌注射水或盐水的安瓿瓶以便在施用前将成分混合。本发明的药物组合物可以配制为中性的或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子，例如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些形成的那些，和与阳离子，例如来自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙胺基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些形成的那些。各种递送系统是本领域已知的，可以用于施用PLA2R蛋白质或其片段，例如，在脂质体、微粒和微囊中封装(参见，例如mi and ffu, J. Biol. Chem. , 262:4429-4432 (1987))。可以在泡囊、特别是脂质体中递送组合物(参见，Langer，Science, 2491527-1533 (1990) ； Treat et al. , in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler, eds. (Liss, New York 1989), pp. 353-365; Lopez-Berestein,同上，pp. 317-327 ；参见，一般地，同上)。导入的方法包括但不限于皮内的、肌肉内的、腹膜内的、静脉内的、皮下的、鼻内的、硬膜外的和口服的途径。 可以通过任何便利的途径施用组合物，例如，通过输注或快速浓注，通过上皮或粘膜皮肤内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜，等等)的吸收，并且可以与其他生物活性试剂一同施用。 施用可以是全身性或局部的。此外，可能期望的是通过任何适合的途径将本发明的药物组合物导入中枢神经系统中，包括心室内的和鞘内注射；心室内的注射可以通过心室内的导管，例如，附着于储存器例如Omcana储存器的，来便利化。也可以采用肺部施用，例如，通过使用吸入器或喷雾器，和具有雾化试剂的制剂。在一个实施方式中，用于治疗施用的药物制剂必需是无菌的。无菌性可以通过过滤通过无菌滤膜(例如，0. 2微米膜)来容易地实现。药物制剂的pH值一般应是约6到8。在一个实施方式中，药物组合物可以在控释系统中递送。在一个实施方式中，可以使用泵(参见 Langer,上文；kfton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. , 14:201 (1987)； Buchwald et al. , Surgery, 88:507 (1980) ； Saudek et al. , N. Engl. J. Med.,321:574(1989))。在另一个实施方式中的，可以使用聚合材料(参见Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise, eds. (CRC Press, Boca Raton, Fla. 1974)； Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smo1en and Ball, eds. (Wiley, New York 1984) ； Ranger and Peppas, Macromo 1. Sci. Rev. Macromo 1. Chem. , 23:61 (1983)；还参见 Levy et al. , Science, 228:190 (1985)； During et al. , Ann. Neurol. , 25:35 1 (1989) ； Howard et al. , J. Neurosurg. , 7 1:105 (1989))。在 Langer 的综述(Science 249:1527-1533 (1990))中讨论了其他控释系统。持续释放组合物的实例参见美国专利NO. 3，773，919、EP 58，481A、美国专利No. 3，887，699、EP 158，277A、加拿大专利 No. 1176565、U. Sidman et al. , Biopolymers 22:547 (1983)禾口 R. Langer et al. , Chem. Tech. 12:98 (1982)。在制剂中采用的准确剂量也将取决于给药途径、MN的严重度和血清中针对PLA2R 的自身抗体的滴度，并且应当根据医师的判断和每个患者的状况来决定。有效的剂量可以从来源于体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线推断。施用给患者的剂量一般是0. 1 mg/kg到100 mg/kg患者体重。优选的，施用给患者的剂量在0.1 mg/kg和20 mg/kg患者体重之间，更优选的1 mg/kg到10 mg/kg患者体重。对于基因治疗，病毒载体应当在IX IO6到IO14个病毒载体颗粒每位患者每次应用的范围内。此外，可以选择性地使用体外或体内测定来帮助鉴别最佳的剂量范围。采用的准确剂量还将取决于施用途径，要治疗的状况的严重度，应当根据医师的判断和每位受试者的状况，考虑到例如公开的临床研究来确定。然而，适合的有效的剂量从约10微克到约5 克约每4小时，而它们一般是约500 mg或更少每4小时。在一个实施方式中，有效的剂量是约 0. 01 mg、0. 5 mg、约 1 mg、约 50 mg、约 100 mg、约 200 mg、约 300 mg、约 400 mg、约 500 mg、约 600 mg、约 700 mg、约 800 mg、约 900 mg、约 1 g、约 1. 2 g、约 1. 4 g、约 1. 6 g、约 1. 8 g、约 2. 0 g、约 2. 2 g、约 2. 4 g、约 2. 6 g、约 2. 8 g、约 3. 0 g、约 3. 2 g、约 3. 4 g、约 3. 6 g、 约3. 8 g、约4. 0 g、约4. 2 g、约4.4 g、约4. 6 g、约4. 8 g、或约5. 0 g每4小时。相等的剂量可以在各种时间周期内施用，包括但不限于，约每2小时、约每6小时、约每8小时、约每12小时、约每M小时、约每36小时、约每48小时、约每72小时、约每周、约每两周、约每三周、约每月和约每两个月。此处描述的有效的剂量是指施用的总量。在一次或一系列的治疗中，包含PLA2R蛋白质、其片段、或表达载体和/或病毒载体的组合物被适合地施用给患者。为此，包含PLA2R蛋白质、其片段、或表达载体和/或病毒载体的组合物的“治疗有效量”是有效降低来自受试者的样品中针对PLA2R的自身抗体的量的量。量降低是与开始治疗之前血清中存在的自身抗体的量相比自身抗体的至少10%的降低。在一个实施方式中，包含PLA2R或其片段的组合物与免疫抑制治疗组合地施用，包括但不限于，硫唑嘌呤、英夫利昔单抗、omalizumab、daclizumab、adalimumab、 eculizumab、efalizumab、natalizumab 禾口 omalizumab。在另一个实施方式中，包含 PLA2R 或其片段的组合物与免疫抑制疗法和环磷酰胺、苯丁酸氮芥和/或利妥昔单抗组合施用。基因治疗
在一个实施方式中，PLA2R蛋白质或其片段通过本领域技术人员已知的几种基因治疗技术的任一种施用给个体。一般地，基因治疗可以通过哺乳动物受试者内目标细胞的直接转化(体内基因治疗)，或体外的细胞转化和随后将转化的细胞植入哺乳动物受试者(先体外后体内基因治疗)来实现。带有处在组织特异性调节元件之下编码PLA2R蛋白质或其片段的核酸的病毒载体被施用给个体。组织特异性调节元件容许PLA2R蛋白质或其片段在目标细胞，例如，肌肉中的表达。基因治疗的原则由 Oldham, R. K. (In: Principles of Biotherapy, Raven Press, N. Y., 1987)和相似的教科书公开了。基因治疗的方法和运用的公开由Boggs，S. S. (Int. J. Cell Clon. 8:80-96 (1990)) ； Karson, Ε. Μ. (Biol. Reprod. 42:39-49 (1990)); Ledley, F. D. , In: Biotechnology, A Comprehensive Treatise, volume 7B, Gene Technology, VCH Publishers, Inc. NY, pp 399-458 (1989))提供了，所有这些参考文献通过引用合并在此。编码PLA2R蛋白质或其片段的核酸可以在基因治疗中导入动物(特别是哺乳动物，包括人类)的体细胞中。最优选的，采用病毒或逆转录病毒载体作为这种目的的转移运载体。基因治疗病毒可以是腺病毒、腺病毒相关病毒或慢病毒的形式。逆转录病毒载体是递送的共同方式，在这种情境中是逆转录病毒，从所述逆转录病毒上除去或改变了所有病毒基因，从而在用所述载体感染的细胞中不产生病毒蛋白质。 通过使用产生所有病毒蛋白质但不产生传染性病毒的逆转录病毒“包装”细胞提供病毒复制功能。逆转录病毒载体DNA向包装细胞中的导入引起病毒粒的产生，所述病毒粒带有载体RNA并可以感染目标细胞，但是这样在感染后不发生进一步的病毒传播。为了区分这种过程和自然的病毒感染，在自然感染中病毒继续复制和传播，常常使用术语转导而不是感
^fe ο在一个实施方式中，此处描述的治疗MN的方法提供了用于PLA2R蛋白质或其片段在分裂的和非分裂的哺乳动物细胞中递送和表达的重组慢病毒。基于HIV-I的慢病毒可以比基于莫洛尼氏白血病病毒(MoMLV)的逆转录病毒系统有效地转导更广泛的寄主范围。重组慢病毒的制备可以利用pLenti4/V5 - DEST 、pLenti6/V5 - DEST 或pLenti载体与来自hvitrogen的ViraPower 慢病毒表达系统一起来实现。慢病毒载体用于遗传失调和各种类型癌症的基因治疗的实例，以及这些参考文献通过引用合并在此(Klein, C. and Baum, C. (2004) . Hemato 1. J. , 5，103-111; Zufferey, R et. al. (1997). Nat. Biotechnol. , 15, 871-875; Morizono, K. et. al. (2005). Nat. Med. , 11， 346—352; Di Domenico, C. et. al. (2005)， Hum. Gene Ther. , 16, 81-90; Kim, Ε. Y. , et. al. , (2004). Biochem. Biophys. Res. Comm., 318， 381-390)。非逆转录病毒载也可以用于遗传学治疗。一种这样的选择是腺病毒(Rosenfeld， Μ. Α. , et al. , Cell 68:143155 (1992) ； Jaffe, H. A. et al. , Nature Genetics 1:372-378(1992); Lemarchand, P. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6482-6486 (1992))。腺病毒载体的主要优点是它们携带大的DNA片段(36 Kb基因组)的潜力、非常高的滴度(ion/ml)、感染非复制性细胞的能力、以及对原位感染组织，特别是在肺部中的适合性。迄今为止这种载体的最惊人的应用是通过向棉花大鼠的气道上皮的气管内滴注来递送人类囊性纤维化跨膜传导调节物(CFTR)基因(Rosenfeld, Μ. A.，et al.，Cell63:143-155 (1992))。类似地，疱疹病毒也证实了对于人类基因治疗是有价值的(Wolfe， J. H. et al. , Nature Genetics 1:379-384 (1992))。当然，任何其他适合的病毒载体可以用于本发明的遗传学治疗。美国专利No. 6，531，456提供了利用重组AAV病毒粒向实体肿瘤细胞中成功的基因转移的方法。一般地，美国专利No. 6，531，456中描述的方法允许重组AAV病毒粒向肿瘤细胞块中的直接的体内注射，例如，通过肿瘤内注射。本发明还提供了利用重组AAV病毒粒的第二基因的同时递送，其中当在转导的细胞中表达时所述第二基因能够提供辅助的治疗效果。美国专利No. 6，531，456通过完全引用合并在此。用于基因治疗病毒粒可以是本领域已知的任何病毒粒，包括但不限于来自腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒和慢病毒的那些。重组病毒提供了基因表达研究和治疗应用的通用系统。如上所述的重组AAV病毒粒，包括感兴趣的DNA，可以利用本领域技术人员已知的标准方法来产生。所述方法一般涉及步骤(1)向宿主细胞中导入AAV载体；(2)向所述宿主细胞导入AAV辅助构建体，其中所述辅助构建体包括AAV编码区域，其能够在宿主细胞中表达来补充AAV载体缺少的AAV辅助功能；(3)向所述宿主细胞中导入一个或更多个辅助病毒和/或附属功能载体，其中所述辅助病毒和/或附属功能载体提供了能够支持所述宿主细胞中的高效重组AAV (“rAAV”)病毒粒生产的附属功能；和(4)培养所述宿主细胞来生产rAAV病毒粒。AAV载体、AAV辅助构建体和辅助病毒或附属功能载体可以同时地或次序地利用标准转染技术导入宿主细胞中。利用rAAV载体，基因可以递送到大范围的宿主细胞中，包括许多不同的人类和非人类细胞系或组织。因为AAV是非致病的，并且不引发免疫反应，大量的临床前研究报告了极好的安全性分布。rAAV能够转导大范围的细胞类型，转导不取决于活性的寄主细胞分裂。高滴度，〉IO8病毒颗粒/ml容易在上清液中获得，以及 IOll-IO12病毒颗粒/ml的进一步的浓度。转基因被整合到宿主基因组中，从而表达是长期和稳定的。生产重组腺病毒的简化的系统由He TC. et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514，1998呈现。感兴趣的基因首先克隆到穿梭载体，例如pAdTrack-CMV中。产生的质粒通过用限制性内切酶Pme I消化来直线化，随后共转化到大肠杆菌中。具有腺病毒主干质粒的BJ5183细胞，例如Mratagene，s AdEasy 腺病毒载体系统的pAdEasy-Ι。选择重组腺病毒载体的卡那霉素抗性，通过限制性内切酶分析确认重组。最后，直线化的重组质粒转染到腺病毒包装细胞系中，例如HEK 293细胞(El转化的人类胚肾细胞)或911 (El转化的人类胚胎视网膜细胞)(Human Gene Therapy 7:215-222，1996)。重组腺病毒在HEK 293细胞内产生。除了 AAV-2之外的可选择的AAV血清型的使用(Davidson et al (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (7) 3428-32; Passini et al (2003)，J. Virol. 77 (12) :7034-40)展现了不同的细胞向性和提高的转导能力。对于脑癌，进入脑部的新的注射技术的开发，特别是对流(convection)增强的递送(CED； Bobo et al (1994)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (6) :2076-80; Nguyen et al (2001)，Neuroreport 12 (9) : 1961-4)显著地增强了用AAV载体转导大面积的脑部的能力。AAV载体的大规模制备通过包装细胞系的三质粒共转染来作出带有hnRNPLL的反义寡核苷酸的DNA编码序列或siRNA hnRNPLL核酸分子的AAV载体；含有AAV r印和cap 基因的AAV RC载体，以及腺病毒辅助质粒pDF6，转染入50 X 150 mm亚汇合的293细胞的平板中。在转染后三天收获细胞，通过三次冻融循环或通过超声处理来释放病毒。AAV载体然后取决于载体的血清型通过两种不同的方法来纯化。根据其对肝素的亲和性通过单步骤的重力流动柱纯化方法来纯化AAV2载体(Auricchio，Α., et. al., 2001, Human Gene therapy 12；71-6； Summerford, C. and R. Samulski, 1998, J. Virol. 72:1438-45; Summerford, C. and R. Samulski, 1999，Nat. Med. 5: 587—88)。 AAV2/1和AAV2/5载体当前通过三次连续的CsCl梯度来纯化。此处描述的方法中使用的药物组合物可以通过体内基因治疗全身地递送。已经开发了多种方法来实现体内转化，包括机械方法(例如，核酸直接注射到目标细胞中或粒子轰击)、重组病毒、脂质体和受体介导的内吞作用(RME)(综述参见Chang et al. 1994 Gastroenterol. 106:1076-84; Morsy et al. 1993 JAMA 270:2338-45;禾口 Ledley 1992 J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 14:328-37)。在人类中使用的另一种基因转移方法是在脂质体中质粒DNA直接向人类细胞的原位转移(Nabel, E. G.，et al.，Science 249:1285-1288(1990))。质粒 DNA 应当易于确保在人类基因治疗中使用，因为不同于逆转录病毒载体，它可以被纯化到同质。除了脂质体介导的DNA转移之外，几种其他的物理DNA转移方法，例如，通过将质粒DNA轭合到蛋白质将DNA靶向细胞上的受体的那些，在人类基因治疗中具有前景(Wu，G. Y., et al. , J. Biol. Chem. 266:14338-14342 (1991) ； Curiel, D. Τ. , et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8850-8854 (1991))。对于基因治疗病毒，剂量从每次应用IO6到IOw个颗粒。做为选择，可以使用递送的生物射弹基因枪方法。基因枪是原本为植物转化设计的、用于给细胞注射遗传信息的设备。有效负荷是包被有质粒DNA的重金属的基本粒子。这种技术常常简称为生物射弹。利用生物射弹技术的另一种仪器是PDS-1000/He颗粒递送系统。蛋白质、表达载体和/或基因治疗病毒可以包被在微小的金颗粒上，这些包被的颗粒在高压下被“射击”入生物组织，例如血管瘤和黑素瘤。基于基因枪的方法的实例由Loehr B. I. et. al. J. Virol. 2000， 74:6077-86对牛的基于DNA的疫苗接种来描述了。本发明可以通过以下按字母顺序排列的段落来定义 一种诊断受试者中的膜性肾病(MN)的方法，所述方法包括检测对磷脂酶A2受体 (PLA2R)为反应性的抗体的存在，其中所述抗体在来自受试者的样品中找到。[B]段落[A]的方法，其中所述丽是自发性的。[C]段落[A]的方法，其中所述受试者是人类。[D]段落[A]_[C]的任一项的方法，其中不进行肾脏活检。[E]段落[A]的方法，其中所述PU^R是哺乳动物PLA2R。[F]段落[A]的方法，其中所述样品是血液样品。[G]段落[A]的方法，其中所述抗体是IgG子类IgGl_4的。[H]段落[A]_[G]的任一项的方法，其中所述检测通过血清学的免疫分析进行。[I] 一种正被治疗MN的受试者中预后评估的方法，所述方法包括
a. 在第一时间点测定对PLA2R为反应性的抗体的水平，其中所述抗体在来自受试者的样品中找到；
b.在第二时间点测定对PLA2R为反应性的抗体的水平，其中所述第二时间点晚于所述第一时间点；和
c.比较所述两个时间点的抗体水平，其中与所述第一时间点相比在所述第二时间点抗体水平的降低表明所述治疗是有效的。[J] 一种受试者中MN的预后评估的方法，所述方法包括
a.在第一时间点测定对PLA2R为反应性的抗体的水平，其中所述抗体在来自受试者的样品中找到；和
b.在第二时间点测定对PLA2R为反应性的抗体的水平，其中所述第二时间点晚于所述第一时间点；
其中在所述第二时间点抗体水平降到低于检测极限时表明存在着症状缓解。[K] 一种受试者中MN的预后评估的方法，所述方法包括
a.在第一时间点测定对PLA2R为反应性的抗体的水平，其中所述抗体在来自受试者的样品中找到；
b.在第二时间点测定对PLA2R为反应性的抗体的水平，其中所述第二时间点晚于所述第一时间点；
c.比较所述两个时间点的抗体的水平，其中与所述第一时间点相比在所述第二时间点抗体水平的提高表明存在膜性肾病的复发。[L]段落[I]、[J]或[K]的方法，其中所述丽是自发性的。[M]段落[I]、[J]或[K]的方法，其中所述受试者是人类。[N]段落[I]、[J]或[K]的方法，其中不进行肾脏活检。
段落[I]、[J]或[K]的方法，其中所述PLA2R是哺乳动物PLA2R。[P]段落[I]、[J]或[K]的方法，其中所述样品是血液样品。[Q]段落[I]、[J]或[K]的方法，其中所述抗体是IgG子类IgGl_4的。[R]段落[L]4Q]的任一项的方法，其中所述检测通过血清学的免疫分析进行。[S]段落[I]的方法，其中所述治疗是免疫抑制的治疗。[T] 一种受试者中MN的治疗方法，所述方法包括先体外后体内地从受试者中的样品除去对PLA2R为反应性的抗体。[U]段落[T]的方法，其中所述受试者是人类。[V]段落[T]的方法，其中所述丽是自发性的。[W]段落[T]的方法，其中所述磷脂酶A2受体是哺乳动物PLA2R。[X]段落[T]的方法，其中所述样品是血液样品。[Y]段落[T]的方法，其中所述抗体是IgG子类IgGl-4的。[Z]段落[T]的方法，其中所述抗体通过免疫吸附从所述血液中除去。[AA]段落[T]的方法，其中所述样品在除去抗体之后返回给所述受试者。[BB] 一种在受试者中MN的治疗方法，所述方法包括施用有效量的PLA2R或其片段，或表达PLA2R或其片段的载体。[CC]段落[BB]的方法，其中所述丽是自发性的。[DD]段落[BB]的方法，其中所述受试者被测试为对针对PLA2R为反应性的抗体为阳性。[EE]段落[BB]的方法，其中所述磷脂酶A2受体是哺乳动物PLA2R。[FF] 一种用于自发性MN的治疗的组合物，所述组合物包含PLA2R或其片段。[GG]有效量的PLA2R或其片段或表达PLA2R或其片段的载体用于受试者中MN的治疗的用途。[HH]有效量的PLA2R或其片段、或表达PLA2R或其片段的载体在制造用于治疗受试者中的丽的药物中的用途。[II]段落[GG]或[HH]的用途，其中所述丽是自发性的。[JJ]段落[GG]或[HH]的用途，其中所述受试者被测试为对针对PLA2R为反应性的抗体为阳性。[KK]段落[GG]或[HH]的用途，其中所述磷脂酶A2受体是哺乳动物PLA2R。[LL] 一种免疫分析，包括
a.使来自受试者的样品与PLA2R或其PLA2R片段接触；
b.在样品中存在的抗体与PLA2R或其PLA2R片段之间形成抗体-蛋白质复合物；
c.洗涤来除去任何未结合的抗体；
d.添加被标记的和对来自样品的抗体为反应性的检测抗体；
e.洗涤来除去任何未结合的标记的检测抗体；和
f.将所述标记物转化为可检测信号；其中可检测信号的存在表明所述受试者中MN 的可能性。[匪]段落[LL]的免疫分析，其中所述MN是自发性的。[NN]段落[LL]或[匪]的免疫分析，其中所述受试者是人类。
段落[LL]、[匪]或[NN]的免疫分析，其中所述样品是血液样品。[PP]段落[LL]_
的任一项的免疫分析，其中在所述受试者中不进行肾脏活检。[QQ]段落[LL]_[PP]的任一项的免疫分析，其中所述PLA2R是哺乳动物PLA2R。[RR]段落[LL]-[QG!]的任一项的免疫分析，其中所述抗体是IgG子类IgGl_4的。[SS]段落[LL]_[RR]的任一项的免疫分析，其中所述PLA2R或其PLA2R蛋白质片段沉积或固定在固相支持物上。[TT]段落[LL]_[SS]的任一项的免疫分析，其中已知量的PLA2R或PLA2R蛋白质片段沉积或偶联到固相支持物上。[UU]段落[SS]或[TT]的免疫分析，其中所述支持物是量杆、测试条、乳胶珠子、 微球体或多孔平板的形式。[W]段落[LL]_[UU]的任一项的免疫分析，其中所述检测抗体通过共价连接到酶、具有荧光化合物或金属的标记物、或具有化学发光化合物的标记物来标记。[WW]段落[LL]_[VV]的任一项的免疫分析，其中所述检测抗体是对所述受试者特异地反应性的。[XX]段落[LL]-[ffff]的任一项的免疫分析，其中所述可检测信号与来自滴定曲线的一组可检测信号比较，所述滴定曲线来自递增量的已知量PLA2R或片段的免疫分析。[YY]段落[LL]_[XX]的任一项的免疫分析，其中所述免疫分析对在一定时期内获得的来自受试者的多个样品进行。[ZZ]段落[YY]的免疫分析，其中多个样品在至少两年的时间每两个或三个月获得。[AAA]段落[ZZ]的免疫分析，其中所述每个免疫分析的可检测信号与接连地在先的时间点获得的样品的可检测信号相比较，其中可检测信号的10%的降低表明所述受试者中丽的有效的治疗。[BBB] 一种免疫分析，包括
a.使来自受试者的样品与PLA2R或其PLA2R片段接触；
b.在样品中存在的抗体与PLA2R或其PLA2R片段之间形成抗体-蛋白质复合物；
c.测量由抗体-蛋白质复合物的形成所产生的光散射强度，其中高于对照光散射强度至少10%的光散射强度表明所述受试者中MN的可能性或MN的复发。[CCC]段落[BBB]的免疫分析，其中所述PLA2R或其PLA2R蛋白质片段固定在固相支持物上。[DDD]段落[CCC]的免疫分析，其中所述固相支持物是乳胶珠子或微球体。[EEE]段落[BBB]_[DDD]的任一项的免疫分析，其中对照光散射强度是在不存在样品的情况下PLA2R或PLA2R蛋白质片段的。[FFF]段落[BBB]_[EEE]的任一项的免疫分析，其中光散射强度是在浊度计测量的。[GGG]段落[BBB]_[FFF]的任一项的免疫分析，其中所述免疫分析对在一定时期内获得的来自受试者的多个样品进行。[HHH]段落[GGG]的免疫分析，其中多个样品在至少两年的时间每两个或三个月获得。[III]段落[HHH]的免疫分析，其中所述每个免疫分析的光散射强度与接连地在先的时间点获得的样品的光散射强度相比较，其中光散射强度的10%的降低表明所述受试者中丽的有效的治疗。[JJJ] 一种用于鉴定来自受试者的样品中对PLA2R为反应性的抗体的存在或水平的设备，包括
a.至少一种PLA2R蛋白质或其片段；和
b.至少一种固相支持物，其中所述PLA2R蛋白质或其片段沉积在所述支持物上。[KKK]段落[JJJ]的设备，其中沉积在所述固相支持物上的至少一种PLA2R蛋白质或其片段被固定在所述支持物上。[LLL]段落[JJJ]的设备，其中所述固相支持物是量杆、测试条、乳胶珠子、微球体或多孔平板的形式。[MMM]段落[JJJ]的设备，其中所述受试者是人类。[NNN]段落[JJJ]的设备，其中在所述受试者中不进行肾脏活检。
段落[JJJ]的设备，其中来自受试者的样品是血液样品。[PPP]段落[JJJ]的设备，其中所述PLA2R蛋白质是人类或猪的PLA2R蛋白质。[QQQ]段落[JJJ]的设备，进一步包括产生可检测信号的第二标记的PLA2R蛋白质或其片段。
[RRR]段落[JJJ]的设备，进一步包括检测抗体，其中所述检测抗体特异于受试者的样品中对PLA2R为反应性的抗体，并且所述检测抗体产生可检测信号。[SSS]段落[JJJ]的设备，其中所述设备进行免疫分析，在所述免疫分析中形成抗体-蛋白质复合物。[TTT]段落[SSS]的设备，其中所述免疫分析是血清学的免疫分析。[UUU]段落[SSS]的设备，其中所述免疫分析是浊度测量的免疫分析。[VVV]段落[JJJ]-[SSS]的设备的任一项的用途，用于方便受试者中膜性肾病的诊断，其中可检测量的对PLA2R为反应性的抗体表明所述受试者中膜性肾病的可能性。[WWW] 一种包含段落[JJJ]的设备和检测抗体的试剂盒，其中所述检测抗体特异于受试者的样品中对PLA2R为反应性的抗体，并产生可检测信号。[XXX] 一种试剂盒，其包含段落[JJJ]的设备和产生可检测信号的第二标记的 PLA2R蛋白质或其片段。[YYY] 一种试剂盒，包含段落[JJJ]的设备和浊度计比色杯。[ZZZ] 一种系统，包含
a.测量模块，测量包含来自免疫分析的可检测信号的自身抗体信息，表明来自获自受试者的样品的对PLA2R为反应性的抗体的存在或水平；
b.存储模块，其被配置以存储来自所述测量模块的数据输出；
c.比较模块，适应于比较存储模块上存储的数据与参考和/或对照数据，并提供收回的内容，以及
d.输出模块，用于向用户显示所述收回的内容，其中所述收回的内容针对PLA2R为反应性的抗体的存在或可检测的量表明所述受试者患有MN或有MN的复发。[AAAA]段落[ZU]的系统，其中所述对照数据包含来自非丽健康个体的群体的数据。[BBBB] 一种便于受试者中MN的预后评估的系统，包括
a.测定模块，被配置以接收和输出来自获自受试者的样品的针对PLA2R的自身抗体信息，其中所述自身抗体信息测量对PLA2R为反应性的自身抗体的水平；
b.存储模块，配置以存储来自所述测定模块的输出信息；
c.比较模块，适应于比较存储模块上存储的数据与参考和/或对照数据，并提供比较内容，以及
d.输出模块，用于向用户显示所述比较内容，其中如果没有可检测量的对PLA2R为反应性的自身抗体，则所述受试者处于症状缓解中，或如果存在着对在先读数的至少10%的降低，则MN的治疗在所述受试者中是有效的。[CCCC]段落[BBBB]的计算机系统，其中所述对照数据包括来自同一受试者的早先的数据，其中所述早先的数据表明了可检测量的自身抗体。[DDDD] 一种计算机可读存储介质，包含
a.储存数据模块，含有来自获自受试者的样品的数据，其代表了来自对PLA2R为反应性的抗体的免疫分析的信号水平；
b.比较模块，其比较存储数据模块上存储的数据与参考数据和/或对照数据，并提供比较内容，以及c.输出模块，用于向用户显示所述比较内容，其中相对于所述参考数据和/或对照数据至少10%的可检测量的针对PLA2R为反应性的抗体的存在表明所述受试者患有MN或有 MN的复发。[EEEE]段落[DDDD]的系统，其中所述对照数据包括来自非MN健康个体的群体的数据。本发明进一步由以下实施例说明，其不应被看作是限制性的。本申请中引用的所有参考文献的内容，以及附图和表格通过引用合并在此。
实施例材料和方法
人类血清
根据来自波士顿大学的hstitutional Review Board的批准，我们从患有膜性肾病、 其他肾小球或自体免疫性失调的患者以及正常的志愿者采集并保存了编码的血清样品。被分类为患有自发性丽的那些患者患有活检证实的丽，不存在传统的继发特征，例如，阳性抗核抗体(ANA)、抗双链的DNA抗体或B型肝炎血清。向这些组中的进一步的分类在补充信息中讨论了。人类肾脏组织
我们获得了不适合移植的、从新英格兰器官库赠予用于研究的人类肾脏。肾小球通过金属筛网(ref)过滤从切碎的肾脏皮层采集，在含有洗涤剂的RIPA缓冲液(Boston BioProducts, Boston, ΜΑ)中重悬浮并提取。通过与固定的蛋白G PlusCThermo Fisher) 孵育从这个制品除去污染IgG。在标明时，我们使用了不存在还原剂的情况下的肽N-糖苷酶F (PNGase F; New England Biolabs)来从肾小球蛋白质除去N-连接的糖残基。为了部分地纯化肾小球的糖蛋白，我们使人类肾小球提取物穿过麦胚凝集素(WGA)琼脂糖珠子柱(Vector Laboratories)，用500 mM N-乙酰基氨基葡萄糖(GlcNAc)洗脱结合的糖蛋白。 发现天然的和200 kDa PNGase F-去糖基化的抗原与柱结合。Wes tern 印迹方案
人类肾小球提取物或细胞表达的人类PLA2R在非还原条件下电泳，根据标准方案转移到硝化纤维膜。我们用人类血清作为初级抗体，一般在1:100到1:250，以及1:40,000的辣根过氧化酶轭合的驴抗人类IgG 二级抗体(Jackson ImmunoResearch)，来进行免疫印迹。用于这些实验的PLA2R抗体是针对全长纯化的兔PLA2受体产生的多克隆豚鼠抗体。 它在还原的和非还原的凝胶电泳条件下识别人类蛋白质(Granate，F., et al. 1995，J. Immunol. 174: 464-74； G. Lambeau, personal communication)。我 ]从 The Binding Site购买了针对四种IgG子类的绵羊抗体，在厂家建议的稀释度下使用它们。质谱分析和数据解释
我们切下感兴趣的凝胶区域，如早先在Powell, 2003 Mol Cell Biol 23:5376-5387 中描述的进行凝胶中的胰蛋白酶消化。我们使用修改形式的早先描述的方法分析了产生的肽，所述方法偶联了液相层析(LC)和串联质谱(MS/MS) (Powell, 2004, Mol Cell Biol 24:7249-7259).我们使用获得的MS数据来利用SEQUEST算法检索NCBI RefSeq人类数据库，并用 kquestSorcererTM (Sage-N Research, San Jose, CA)分析数据。通过蛋白
45质的预测的分子量将与蛋白质匹配光谱计数的量进行标准化，测定每种鉴定的蛋白质的富集或相对丰度。这个值被称为蛋白质丰度系数(PAF) (Powell, 2004, Mol Cell Biol 24:7249-7259)。免疫组织学
我们在最佳切削温度溶液(TissueTek)中冷冻人类肾脏的新鲜切片，用cryotome切下 4微米切片。我们从来自Dr. Helmut Rennke (Boston，ΜΑ)的五份MN肾脏活检获得连续的冷冻切片。我们用甲醇丙酮固定和渗透所述切片，用TBS中的10%牛血清白蛋白封闭。 为了检测PLA2R，我们使用了 1 400的豚鼠抗兔PLA2R和1 500的Cy3轭合的驴抗豚鼠IgG (Jackson ImmunoResearch).为了展现染色的特异性，我们用含有第4到第6凝集素结合结构域的兔PLA2R的片段预先清洁了多克隆抗体。这显著地耗尽了针对PLA2R的免疫荧光信号。膜性肾病的诊断在所有情况下通过肾活体检查来建立。被分类为自发性MN的那些没有继发特征的证据，其包括抗核抗体或抗双链DNA抗体阳性、B型肝炎抗原血症、或在上皮下以外的位置中肾活体检查上的电子密度沉积。我们不试图排除隐性的恶性肿瘤作为继发的MN的潜在可能性。另一种肾小球失调通过活检(2 FSGS； 1 DN; 1 Henoch-Shonlein purpura)或通过临床特征来诊断。这些包括具有逐渐地渐进性的蛋白尿、通过分流尿液采集证明的直立性蛋白尿的长期的MN。患有其他自体免疫性或风湿状况的患者包括没有显著的蛋白尿的全身性红斑狼疮、皮肌炎、硬皮症/混合的结缔组织重叠疾病和大疱性天疱疹。考虑到与IgG的大小相似性，我们起初排除了 IgG作为膜性血清中可能作为类风湿因子样活性的靶点。肾小球提取物用蛋白G连接的琼脂糖珠子处理来除去总是在肾小球提取物中存在的污染的IgG。反之，丽血清与共价连接到Affi-Gel 10珠子的热聚集的IgG 孵育，来预先吸出对IgG为反应性的任何血清因子。按这种方式处理的血清样品展现了与起始血清所做的相同的与200 kDa抗原的反应性(数据未显示)。另外，我们能够显示在低百分比(6%)琼脂糖凝胶上跑动延长的时间IgG和MN-Ag之间迁移的细微的差异，当用PNGase F处理时没有注意到IgG大小方面大的偏移。尽管我们确信，目标抗原不是免疫球蛋白，与人类IgG的大小相似性以及在非还原条件下运行凝胶以检测抗原的必需性使得MN-Ag的免疫沉淀几乎不可能，尽管用各种方法。因而我们进行了利用生物化学纯化技术鉴定膜性肾病中这种推定的目标抗原(MN-Ag)的工作。结果
MN血清与200 KDA肾小球蛋白质反应
我们对鉴定人类膜性肾病中目标抗原的方法是基于假定，患有MN的患者的血清中的自身抗体将通过人类肾小球蛋白质的标准western印迹鉴定出候选条带。直到我们偶然地在非还原条件下对蛋白质电泳，此时对早先使用更标准的还原条件为阴性的几种血清检测出显著的约200kDa的条带，才检测出一致地鉴定的条带。来自患有自发性MN的患者的其他的库存的和新近采集的血清的测试显示了在超过50%的这些患者中相似的反应性。在附图 IA中，五种MN血清全部识别约200 kDa的条带，而来自肾病的对照患者的血清不识别。在附图IA的下部画面中，这五种反应性的MN血清被用于对天然和脱糖基化的(PNGase F +) 肾小球蛋白质的交替的泳道进行Western印迹。所有五份丽血清与200 kDa天然抗原和约150kDa的脱糖基化的蛋白质相同地反应。显著地，来自正常的志愿者(ri=23)、患有其他肾病状况如糖尿病性肾病FSGS的患者(ri=13)、或患有其他自体免疫性、风湿性失调的患者 (n=6)的血清，当在相同的条件下分析时对这个抗原都是非反应性的。患有MN的患者的进一步的分析揭示了继发的MN的八个病例(6个狼疮相关的和2个B型肝炎相关的)对200 kDa抗原都不是反应性的。用肽N-糖苷酶(PNGase)F除去N-连接的碳水化物链导致这种抗原的运动性向接近150 kDa处的显著的移位，表明它是严重地糖基化的。起初与天然的 200 kDa条带为反应性的所有血清也鉴定出更小的、脱糖基化的条带(附图1A)。为了验证抗PLA2R自身抗体阳性反应性对自发性膜性肾病的特异性，我们提高了通过western印迹来测试针对PLA2R的抗体的、来自受试者的样品的量。我们也将对照提高到n=32，以及患有其他肾病状况例如糖尿病性肾病FSGS (n=25)的患者。在波士顿(MA， USA)除了患有自发性丽的受试者的量提高之外，我们从Rochester (丽，USA)的Mayo Clinic、瑞典的Limd大学和荷兰的大学接受和测试样品。我们还提高了来自患有继发性 MN、其他自体免疫性和肾脏疾病的患者的对照样品的量，疾病对照和正常受试者也是一样。 患有自发性MN的患者的约72-8 测试为抗-PLA2R抗体阳性，而正常的或疾病对照、或患有继发形式MN的患者都不是阳性的(附图1C)。考虑到显著糖基化的证据，我们测试了抗原结合各种凝集素柱的能力，发现它在其天然和N-脱糖基化形式下都结合小麦-胚芽凝集素(WGA)。两种形式的结合可以反映对维持抗原性所需的在非还原条件下对PNGaseF难接近的残余的N-连接的碳水化物。天然的和脱糖基化的人类肾小球蛋白质从WGA上洗脱，电泳；切下WB上相应于200 kDa和150 kDa抗原带的两个凝胶区域，进行凝胶内胰蛋白酶消化，通过质谱法来分析。在假定与推定的目标抗原相应的肽序列将在两种样品中鉴定出的情况下，我们产生了推定的丽抗原的一列候选物身份(参见表1)。利用可用的抗体和/或重组蛋白质，我们评估了这些候选抗原，当针对M型磷脂酶A2受体的抗体鉴定出人类肾小球中类似大小的蛋白质时，幸运地遇到了可能的匹配(附图2A)。MN中目标抗原中的磷脂酶A2受体
丽血清和抗-PLA2R都识别肾小球提取物的WB (Westren印迹)中相同的条带(附图 2A)。重组蛋白质迁移到相比天然肾小球蛋白质稍微更低的位置，而用PNGase F脱糖基化引起两者迁移到相同的位置。用MN血清印迹的细胞表达的重组人类PLA2R (rPLA2R)产生了在WB上的不同的条带，其稍微小于来自人类肾小球的相应信号。然而，当两种样品被脱糖基化时，它们迁移到相同的位置(附图2A)。这提示了在天然蛋白质和重组形式的总体糖基化方面小的差异。重要地，利用针对PLA2R的单特异性多克隆抗体对这些相同样品的WB 揭示了相同的形式。我们因而确认了，对来自人类肾小球的200 kDa糖蛋白为反应性的所有丽样品也识别rPLA2R，确认了我们所研究的来自人类肾小球的200 kDa条带实际上是 PLA2R。通过WB与200 kDa MN-Ag为反应性的人类血清可以免疫沉淀(IP)来自人类肾小球提取物的PLA2R(附图2B)。所有三种反应性丽血清能够IP来自人类和猪肾小球蛋白质提取物的PLA2R，而对照不能。明显量的起始IgG存在于所有情况中；在泳道2中该量较低， 因为这个患者是特别地肾病的。三种非反应性血清中的两种以及全部三种肾病对照血清在相同条件下不IP PLA2R。有趣地，使用起初由WB发现是非反应性的血清之一，通过IP检测到模糊的条带(在重现中不可见)。当在1 25稀释度重新分析血清时，发现它通过WB鉴定出rPLA2R (数据未显示)。这可能表明，起初被认为不具有抗-PLA2R自身抗体的其他MN患者反而可能具有低水平的滴度，通过我们起始的WB分析是不易检测的(筛选一般在1:100血清稀释度下进行)。此外，附图2C显示了，通过反应性MN血清鉴定的肾小球的糖蛋白是人类磷脂酶A2 受体。完整的人类血清被用于免疫沉淀(IP)肾小球的蛋白质，免疫沉淀物然后电泳，用特异于M型磷脂酶A2受体的抗体Western印迹。前五个泳道显示了使用通过WB已知为阳性 (如附图1中)的血清的免疫沉淀。第6泳道代表了使用来自患有MN的患者、已知为阴性的血清的IP。泳道7和8显示了使用来自正常志愿者的血清的IP，在最后的泳道中，在IP中省略了人类血清来排出肾小球的蛋白质与琼脂糖珠子的非特异性结合。重组PLA2R与天然的肾小球蛋白质共有还原敏感的表位(附图3A)。在还原和非还原条件下电泳的等量人类肾小球提取物(HGE)的WB中，重组PLA2R被类似地处理。用反应性的MN血清或多克隆抗-PLA2R抗体进行WB，用合适的二级抗体检测。针对天然或重组 PLA2R的反应性在非还原状态中，MN血清和多克隆抗-PLA2R都注意到了。然而，当抗-PLA2R 识别还原形式的抗原时，MN血清未能检测还原的天然或重组蛋白质。在非还原条件下，通过WB，单特异性的抗-PLA2R抗血清和MN血清都强烈地检测重组的和天然的肾小球PLA2R。 当在还原条件下运行时，多克隆抗体仍然检测两种形式(虽然较少强健地)，MN血清未能与任一种形式反应。对PLA2R、人类肾小球蛋白质、重组PLA2R和来自大肠杆菌的抗原为反应性的自身抗体的IgG类别用单反应性MN血清来印迹，随后通过对IgG子类特异性的抗体来印迹。与天然的或PLA2R反应的主要子类是IgG4，而对作为对照包括的70 kDa大肠杆菌蛋白质是 IgG2。这种特定血清中IgG子类的相对量通过利用子类特异性抗体对稀释的总血清WB来评估。IgG2形式在它的变性的形式中是不良地检测的，但是由于它与70 kDa大肠杆菌蛋白质的结合所检测的是明显存在的。充分地确立的是，在患有自发性MN的患者的肾小球中通过免疫荧光显微术检测的IgG抗体是IgG4子类的。在此我们发现，患有自发性MN的患者的血清中与PLA2R反应的IgG抗体也是IgG4子类的。在来自诊断为自发性MN的6位患者的额外的血清中，我们进一步确认了这个观察结果。人类肾小球提取物(HE)首先用来自患有自发性MN的六名患者的血清样品印迹(MNl到MN6)，随后用特异于每种人类IgG子类 (1到4)的绵羊抗体来印迹，用过氧化物酶轭合的抗绵羊IgG抗体来检测。与天然抗原反应的主要的IgG子类是IgG4，对IgGl、IgG2和IgG3见到变化的量的反应性。利用重组PLA2R 代替HGE获得了相同的结果(数据未显示)。膜性肾病中的免疫球蛋白应答是典型的Th2应答，主要是IgG4子类的(Kuroki，2005，Kidney Int 68:302-310)。当任一种人类肾小球蛋白质或rPLA2R用适当反应性的丽患者血清免疫印迹时，通过WB检出的主要子类是IgG4 (附图3B)，而对非相关的细菌抗原是IgG2。磷脂酶A2受体的肾小球的位置
人类MN的提出的病理机制是对足状突细胞上存在的抗原的自身抗体原位结合。因为 PLA2R已经在可溶的形式中描述了，我们首先扣减循环抗体-PLA2R复合物在GBM中截留的可能性。MN血清和对照血清都不具有任何可检测的PLA2R，甚至在通过凝集素结合富集之后(数据未显示)。在来自任一组的血清样品中，通过用聚乙二醇6000沉淀或IgG的蛋白G 免疫沉淀，我们都没有检测到PLA2R - IgG的循环的免疫复合物。反之，我们能够通过使用单特异性抗-PLA2R抗体的免疫荧光在足状突细胞上检测到PLA2R的存在。正常人肾脏皮层的冷冻切片用抗-agrin、随后用FITC轭合的抗-兔二级抗体共同染色，来标记肾小球基底膜(GBM)，以及抗-PLA2R随后是CY3-轭合的抗豚鼠二级抗体(数据未显示)。我们发现， PLA2R信号在GBM外部明显地存在，定位于足状突细胞的细胞体和突起部分。当抗体用含有 CRD结构域4-6的PLA2R的重组片段预先清洗时，这种染色显著地降低(数据未显示)。染色图案是粒状的，从细胞体延伸到基足突起。当冷冻切片通过用针对PLA2R和agrin的抗体双免疫荧光来染色时，agrin是肾小球基底膜(GBM)的成分，足状突细胞信号在GBM紧邻的外部清楚地见到。大部分的肾小球和足状突细胞PLA2R染色可以通过用含有CTLDs 4、5和 6的重组PLA2R片段的抗体的预孵育来阻断。接下来我们研究了抗-PLA2R IgG4在肾小球中的定位。PLA2R在膜性肾病活检标本中以粒状的形式存在，与IgG4共同定位。来自诊断为MN的患者的活检标本的冷冻切片揭示了 PLA2R和IgG4在外周毛细管壁和GBM中良好地共同定位(数据未显示)。同一患者的连续切片按同样的方式染色，但是省略了抗_IgG4抗体以排除抗-绵羊二级抗体检测豚鼠或驴IgG的可能性，或来自Cy3通道的渗滤引起早先所见的信号的可能性。与足状突细胞相比，正常人肾脏组织中的系膜细胞不显示PLA2R的染色(数据未显示)。在大鼠Heymann肾炎模型中的研究表明，受体_抗体复合物的“盖帽和遮挡”上皮下地沉积到GBM中，我们预期在人类丽中PLA2R的情况也是如此。在获自患有丽的患者的肾脏活检标本的冷冻切片的免疫荧光时，PLA2R在GBM的内侧以细粒状形式存在。这可以用重组PLA2R的阻断片段来阻断。虽然染色的强度在我们检查的四份患者样品之间是可变的，所有的都揭示了 PLA2R的同样的粒状形式(数据未显示)。感兴趣的是，足状突细胞细胞体的PLA2R染色，其在正常的肾小球的切片中是强的，在MN活检样品中大大地减弱。此外，GBM染色形式与双免疫荧光上的IgG4的形式紧密地匹配。免疫荧光显微术显示了抗-PLA2R和IgG4共同定位于患有自发性MN的患者，而非患有狼疮相关的MN的患者的肾小球中。为了确认来自患有膜性肾病的患者的肾小球中IgG 是对PLA2R反应性的，我们从活检标本洗脱了 IgG，在利用天然和重组PLA2R的Western印迹中使用。IgG成功地从患有自发性膜性肾病的患者的四份活检样品、来自患有狼疮膜性肾病的患者的一份、以及患有IgA肾病的患者的两份中洗脱。从来自患有自发性膜性肾病的患者的样品洗脱的IgG特异性地检测对重组PLA2R为阳性的人类肾小球提取物和细胞溶胞产物中的适当地大小的PLA2R条带(附图4A和4B)，而从来自患有免疫-复合肾小球疾病的患者的三份其他样品洗脱的IgG不行。IgG从来自患有自发性丽(丽)、狼疮丽(LMN)或 IgA肾病(IgAN)的患者的活检核心上洗脱。这种洗脱的IgG用于免疫印迹人类肾小球提取物(HGE)或重组 PU^R (rPLA2R)0与疾病活性的相关性
在可能的时候，我们获得了连续的血清样品，检测了在实现了治疗或自发缓解、或复发的几个个体中反应性的改变。一般地，对PLA2R的自身抗体的存在与根据尿蛋白质和血清白蛋白测量的临床上显著的疾病活性并行(图5和6)。重要地，抗-PLA2R抗体的降低或消失可以在蛋白尿的消失之前见到。考虑到免疫沉积物的清除以及足状突细胞构造和功能性裂隙隔膜的复原所需的时间，这是可以理解的。我们研究了在治疗诱导的症状缓解之前和之后的其他患者。我们发现，在治疗前
49抗-PLA2R为阳性的患者在用免疫抑制治疗诱导症状缓解之后变为阴性(附图6A和B)。图形中实心的正方形代表尿液蛋白质排出。在用环磷酰胺和泼尼松开始治疗之后，尿液蛋白质排出降低，对PLA2R的反应性消失，如在Western印迹中所示的。类似的结果在用利妥昔单抗和合成的ACTH治疗的患者中发现。这些发现支持了针对PLA2R的免疫分析不仅用于MN的诊断、还用于监视治疗期间或等待自发缓解时疾病的活性的实用性。总之，我们将M-型磷脂酶A2受体鉴定为自体免疫性肾小球疾病、自发性膜性肾病中的主要目标抗原。该蛋白质存在于正常人足状突细胞上，超过百分之五十的患有MN的患者带有对这个蛋白质有反应性的抗体。此外，蛋白质在患者的活检标本中的免疫沉积物内存在。针对PLA2R的抗体的水平看起来与疾病活性相关，可能证明是MN的初步诊断、以及跟踪治疗或等待自发缓解时疾病活性的有用的方法。所有的参考文件，包括本说明书中引用的任何专利或专利申请，以及附图和表格， 通过引用合并在此。关于任何参考文献构成现有技术不作出承认。参考文献的论述部分声明了它们的作者所声称的内容，申请人保留怀疑引证的文件的准确度和相关性的权利。要清楚地理解的是，虽然在此引用了许多现有技术公开内容，这种引用不构成对在美国或任何其他国家任何这些文件形成了本领域的公知常识的一部分的认可。实施例2
此处描述的抗-PLA2R自身抗体的水平还可以利用如附图8-9中说明的测试条来测定。 在测试条中，膜被分成三个分隔的区域处在膜的一个末端的样品(S)位置，处在膜的中间的测试(T)位置，以及在膜的另一末端的对照(C)位置(附图8A)。位于S的是过量的脱水的PLA2R。PLA2R可以轭合到胶体金珠子或乳胶珠子用于可视化目的。在T处，有过量的抗-IgG固定在膜上。在C处，有另一种固定的抗-PLA2R抗体(附图8A)。在S位置的脱水的PLA2R的过量是这样，使得当样品(例如，血清)施加到S时，形成抗-PLA2R抗体和PLA2R复合物，游离PLA2R仍可用于结合位置C处的固定的抗-PLA2R。S位置是施加血清样品的位置。箭头描绘了当向膜施加血清时样品血清不应跨越的膜上的边界限。血清中的水使PLA2R再水化。当对PLA2R为反应性的自身抗体与再水化的PLA2R形成复合物时，产生抗体-蛋白质复合物。抗体-蛋白质复合物和未复合的PLA2R 的混合物通过毛细管作用移动远离位置S朝向位置T和C。在到达T位置时，抗体-蛋白质复合物将结合固定的抗-IgG抗体，被固定在T位置。胶体金或乳胶珠子标记的抗体-蛋白质复合物的局部化的浓度将作为T位置处的有色线显现(附图9，中间的)。样品中自身抗体的量越大，T处的可见条带越宽。当区域在T位置保持清晰时，这意味着存在抗-PLA2R自身抗体(附图9，左侧)。在C位置，游离的和标记的PLA2R将被固定的抗-PU^R抗体结合和捕获。这随后将产生在C位置处胶体金或乳胶珠子标记的PLA2R的浓度，将作为C位置处的有色线显现。C位置的结果充当测试对照，在测试材料中存在功能性的PLA2R并应当总是存在(附图9，右侧)。测试条可以设计为量杆测试条的形式(附图8B)。作为量杆测试条，条在S位置末端浸入血清样品中，样品平面不超过边界限。条然后水平地放置，膜表面在平面上向上。给予固定量的时间用于抗体重新水化、毛细管作用和抗体结合反应发生。在固定的时间结束时，应当有C位置处的可见条带，取决于自身抗-PLA2R抗体的水平，其中在T位置可以或可以不具有可见条带(附图9)。实施例3
此处描述的抗-PLA2R自身抗体的水平可以利用如附图10中说明的ELISA分析来测定。ELISA分析包括进行标准的滴定分析和样品分析，以测定获自受试者的样品中抗-PLA2R自身抗体的量。如所示的，ELISA分析微量滴定板由IgG蛋白质递增量的两个双份参考行组成。从0-50 ng/ml或pg/ml的标准量的IgG蛋白置于参考行中，产生人类IgG 的标准曲线。过量的PLA2R固定在平板的样品反应孔中。血清样品置于样品反应孔中。随后，辣根过氧化物酶标记的抗人类IgG抗体添加到反应孔中。容许反应孔中的混合物在室温下孵育90分钟，滗析出液体。反应孔用去离子水洗涤五次。然后，3，3’，5，5’四甲基联苯胺(TMB)试剂的等分量添加到每个反应孔中。混合物轻轻地混合10秒，在室温下孵育 20分钟(18-25°C)。酶反应通过添加1 N HCl来终止。进行柔和的搅拌，直到所有蓝色完全地改变成黄色。副产物的颜色量通过在450 nm用微滴定反应孔读取器读取它的吸光度来测定。A45tl相应于反应孔中人类IgG抗体的量。测试样品中抗-PLA2R自身抗体的量可以从获自样品反应孔的A45tl和获自参考反应孔的标准曲线来估计。在可选择的实施方式中，可以使用附图11中所示的修改的ELISA分析。如附图10 中，参考行和样品反应孔是标记的(附图11)。过量的PLA2R固定在平板的反应孔中。固定量的IgG置于双份的参考反应孔中。这种固定的量是参考值，相应于非MN健康受试者的血清中存在的抗-PLA2R自身抗体的平均量。样品、血清也置于双份样品反应孔中。分析平板如此处描述的处理。获自样品反应孔的A45tl与获自相应的参考行的相比较，以测定在血清样品中是否存在抗-PLA2R自身抗体量的提高或降低。表1
权利要求
1.一种诊断受试者中的膜性肾病(丽)的方法，所述方法包括检测对磷脂酶A2受体 (PLA2R)为反应性的抗体的存在，其中所述抗体在来自受试者的样品中找到。
2.权利要求1的方法，其中所述丽是自发性的。
3.权利要求1的方法，其中所述受试者是人类。
4.权利要求1-3的任一项的方法，其中不进行肾脏活检。
5.权利要求1的方法，其中PLA2R是哺乳动物PLA2R。
6.权利要求1的方法，其中所述样品是血液样品。
7.权利要求1的方法，其中所述抗体是IgG子类IgGl-4的。
8.权利要求1-7的任一项的方法，其中所述检测通过血清学的免疫分析来进行。
9.一种正被治疗MN的受试者中预后评估的方法，所述方法包括a.在第一时间点测定对PLA2R为反应性的抗体的水平，其中所述抗体在来自受试者的样品中找到；b.在第二时间点测定对PLA2R为反应性的抗体的水平，其中所述第二时间点晚于所述第一时间点；和c.比较所述两个时间点的抗体水平，其中与所述第一时间点相比在所述第二时间点抗体水平的降低表明所述治疗是有效的。
10.一种受试者中MN的预后评估的方法，所述方法包括a.在第一时间点测定对PU^R为反应性的抗体的水平，其中所述抗体在来自受试者的样品中找到；和b.在第二时间点测定对PLA2R为反应性的抗体的水平，其中所述第二时间点晚于所述第一时间点；其中在所述第二时间点抗体水平降到低于检测极限时表明存在着症状缓解。
11.一种受试者中MN的预后评估的方法，所述方法包括a.在第一时间点测定对PLA2R为反应性的抗体的水平，其中所述抗体在来自受试者的样品中找到；b.在第二时间点测定对PLA2R为反应性的抗体的水平，其中所述第二时间点晚于所述第一时间点；c.比较所述两个时间点的抗体的水平，其中与所述第一时间点相比在所述第二时间点抗体水平的提高表明存在膜性肾病的复发。
12.权利要求9、10或11的方法，其中所述丽是自发性的。
13.权利要求9、10或11的方法，其中所述受试者是人类。
14.权利要求9、10或11的方法，其中不进行肾脏活检。
15.权利要求9、10或11的方法，其中所述PLA2R是哺乳动物PLA2R。
16.权利要求9、10或11的方法，其中所述样品是血液样品。
17.权利要求9、10或11的方法，其中所述抗体是IgG子类IgGl-4的。
18.权利要求12-17的任一项的方法，其中所述检测通过血清学的免疫分析来进行。
19.权利要求9的方法，其中所述治疗是免疫抑制的治疗。
20.一种受试者中MN的治疗方法，所述方法包括从受试者中的样品先体外后体内地除去对PLA2R为反应性的抗体。
21.权利要求20的方法，其中所述受试者是人类。
22.权利要求20的方法，其中所述丽是自发性的。
23.权利要求20的方法，其中所述磷脂酶A2受体是哺乳动物PLA2R。
24.权利要求20的方法，其中所述样品是血液样品。
25.权利要求20的方法，其中所述抗体是IgG子类IgGl-4的。
26.权利要求20的方法，其中所述抗体通过免疫吸附从血液中除去。
27.权利要求20的方法，其中所述样品在除去抗体之后返回给所述受试者。
28.一种在受试者中MN的治疗方法，所述方法包括施用有效量的PLA2R或其片段，或表达PLA2R或其片段的载体。
29.权利要求观的方法，其中所述丽是自发性的。
30.权利要求观的方法，其中所述受试者被测试为对于针对PLA2R为反应性的抗体是阳性的。
31.权利要求观的方法，其中所述磷脂酶A2受体是哺乳动物PLA2R。
32.一种用于自发性MN的治疗的组合物，所述组合物包含PLA2R或其片段。
33.有效量的PLA2R或其片段或表达PLA2R或其片段的载体用于受试者中MN的治疗的用途。
34.有效量的PLA2R或其片段、或表达PLA2R或其片段的载体在制造用于治疗受试者中的丽的药物中的用途。
35.权利要求33或34的用途，其中所述丽是自发性的。
36.权利要求33或34的用途，其中所述受试者被测试为对于针对PLA2R为反应性的抗体是阳性的。
37.权利要求33或34的用途，其中所述磷脂酶A2受体是哺乳动物PLA2R。
38.一种免疫分析，包括a.使来自受试者的样品与PLA2R或其PLA2R片段接触；b.在样品中存在的抗体与PLA2R或其PLA2R片段之间形成抗体-蛋白质复合物；c.洗涤来除去任何未结合的抗体；d.添加被标记的和对来自样品的抗体为反应性的检测抗体；e.洗涤来除去任何未结合的标记的检测抗体；和f.将所述标记物转化为可检测信号；其中可检测信号的存在表明所述受试者中MN的可能性。
39.权利要求38的免疫分析，其中所述MN是自发性的。
40.权利要求38或39的免疫分析，其中，所述受试者是人类。
41.权利要求38、39或40的免疫分析，其中所述样品是血液样品。
42.权利要求38-41的任一项的免疫分析，其中在所述受试者中不进行肾脏活检。
43.权利要求38-42的任一项的免疫分析，其中所述PU^R是哺乳动物PLA2R。
44.权利要求38-43的任一项的免疫分析，其中所述抗体是IgG子类IgGl-4的。
45.权利要求38-44的任一项的免疫分析，其中所述PLA2R或其PLA2R蛋白质片段沉积或固定在固相支持物上。
46.权利要求38-45的任一项的免疫分析，其中已知量的PLA2R或PLA2R蛋白质片段沉积或偶联到固相支持物上。
47.权利要求45或46的免疫分析，其中所述支持物是量杆、测试条、乳胶珠子、微球体或多孔平板的形式。
48.权利要求38-47的任一项的免疫分析，其中所述检测抗体通过共价连接到酶、具有荧光化合物或金属的标记物、或具有化学发光化合物的标记物来标记。
49.权利要求38-48的任一项的免疫分析，其中所述检测抗体对受试者是特异性地反应性的。
50.权利要求38-49的任一项的免疫分析，其中所述可检测信号与来自滴定曲线的一组可检测信号比较，所述滴定曲线来自递增量的已知量PLA2R或片段的免疫分析。
51.权利要求38-50的任一项的免疫分析，其中所述免疫分析对在一定期间获得的来自受试者的多个样品进行。
52.权利要求51的免疫分析，其中多个样品在至少两年的时间每两个或三个月获得。
53.权利要求52的免疫分析，其中所述每个免疫分析的可检测信号与接连地在先的时间点获得的样品的可检测信号相比较，其中可检测信号的10%的降低表明所述受试者中MN 的有效的治疗。
54.一种免疫分析，包括a.使来自受试者的样品与PLA2R或其PLA2R片段接触；b.在样品中存在的抗体与PLA2R或其PLA2R片段之间形成抗体-蛋白质复合物；c.测量由抗体-蛋白质复合物的形成所产生的光散射强度，其中高于对照光散射强度至少10%的光散射强度表明所述受试者中MN的可能性或MN的复发。
55.权利要求讨的免疫分析，其中所述PLA2R或其PLA2R蛋白质片段固定在固相支持物上。
56.权利要求55的免疫分析，其中所述固相支持物是乳胶珠子或微球体。
57.权利要求M-56的任一项的免疫分析，其中所述对照光散射强度是不存在样品时 PLA2R或PLA2R蛋白质片段的。
58.权利要求M-57的任一项的免疫分析，其中光散射强度在浊度计中测量。
59.权利要求M-58的任一项的免疫分析，其中所述免疫分析对在一定期间获得的来自受试者的多个样品进行。
60.权利要求59的免疫分析，其中多个样品在至少两年的时间每两个或三个月获得。
61.权利要求60的免疫分析，其中所述每个免疫分析的光散射强度与接连地在先的时间点获得的样品的光散射强度相比较，其中光散射强度的10%的降低表明所述受试者中MN 的有效的治疗。
62.一种用于鉴定来自受试者的样品中对PLA2R为反应性的抗体的存在或水平的设备，包括a.至少一种PLA2R蛋白质或其片段；和b.至少一种固相支持物，其中所述PLA2R蛋白质或其片段沉积在所述支持物上。
63.权利要求62的设备，其中沉积在所述固相支持物上的至少一种PLA2R蛋白质或其片段被固定在所述支持物上。
64.权利要求62的设备，其中所述固相支持物是量杆、测试条、乳胶珠子、微球体或多孔平板的形式。
65.权利要求62的设备，其中所述受试者是人类。
66.权利要求62的设备，其中在受试者中不进行肾脏活检。
67.权利要求62的设备，其中来自受试者的样品是血液样品。
68.权利要求62的设备，其中所述PLA2R蛋白质是人类或猪的PLA2R蛋白质。
69.权利要求62的设备，进一步包括产生可检测信号的第二标记的PLA2R蛋白质或其片段。
70.权利要求62的设备，进一步包括检测抗体，其中所述检测抗体特异于受试者的样品中对PLA2R为反应性的抗体，并且所述检测抗体产生可检测信号。
71.权利要求62的设备，其中所述设备进行免疫分析，在所述免疫分析中形成抗体-蛋白质复合物。
72.权利要求71的设备，其中所述免疫分析是血清学的免疫分析。
73.权利要求71的设备，其中所述免疫分析是浊度测量的免疫分析。
74.权利要求62-71的设备的任一项的用途，用于方便受试者中膜性肾病的诊断，其中可检测量的对PLA2R为反应性的抗体表明所述受试者中膜性肾病的可能性。
75.—种包含权利要求62的设备和检测抗体的试剂盒，其中所述检测抗体特异于受试者的样品中对PLA2R为反应性的抗体，并产生可检测信号。
76.—种试剂盒，其包含权利要求62的设备和产生可检测信号的第二标记的PLA2R蛋白质或其片段。
77.—种试剂盒，包含权利要求62的设备和浊度计比色杯。
78.一种系统，包含a.测量模块，测量包含来自免疫分析的可检测信号的自身抗体信息，表明来自获自受试者的样品的对PLA2R为反应性的抗体的存在或水平；b.存储模块，其被配置以存储来自所述测量模块的数据输出；c.比较模块，适应于比较存储模块上存储的数据与参考和/或对照数据，并提供收回的内容，以及d.输出模块，用于向用户显示所述收回的内容，其中所述收回的内容针对PLA2R为反应性的抗体的存在或可检测的量表明所述受试者患有MN或有MN的复发。
79.权利要求78的系统，其中所述对照数据包含来自非MN健康个体的群体的数据。
80.一种便于受试者中MN的预后评估的系统，包括a.测定模块，被配置以接收和输出获自受试者的样品的针对PLA2R的自身抗体信息， 其中所述自身抗体信息测量对PLA2R为反应性的自身抗体的水平；b.存储模块，配置以存储来自所述测定模块的输出信息；c.比较模块，适应于比较存储模块上存储的数据与参考和/或对照数据，并提供比较内容，以及d.输出模块，用于向用户显示所述比较内容，其中如果没有可检测量的对PLA2R为反应性的自身抗体，则所述受试者处于症状缓解中，或如果存在着对在先读数的至少10%的降低，则MN的治疗在所述受试者中是有效的。
81.权利要求80的计算机系统，其中所述对照数据包括来自同一受试者的早先的数据，其中所述早先的数据表明了可检测量的自身抗体。
82.—种计算机可读存储介质，包含a.储存数据模块，含有来自获自受试者的样品的数据，其代表了来自对PLA2R为反应性的抗体的免疫分析的信号水平；b.比较模块，其比较存储数据模块上存储的数据与参考数据和/或对照数据，并提供比较内容，以及c.输出模块，向用户显示所述比较内容，其中相对于所述参考数据和/或对照数据至少10%的可检测量的针对PLA2R为反应性的抗体的存在表明所述受试者患有丽或有丽的复发。
83.权利要求82的系统，其中所述对照数据包含来自非MN健康个体的群体的数据。
全文摘要
本发明涉及自发性膜性肾病(MN)的免疫分析、试剂、治疗剂以及诊断和预后评估方法。免疫分析包括对针对磷脂酶A2受体(PLA2R)为反应性的血清自身抗体的酶联免疫吸附分析和浊度测量免疫分析。治疗方法包括通过可溶性PLA2R或片段的吸附或施用来隔绝自身抗体的自身抗体去除。
文档编号G01N33/68GK102159951SQ200980135977
公开日2011年8月17日 申请日期2009年7月20日 优先权日2008年7月18日
发明者D·J·萨兰特, G·兰博, L·H·贝克 申请人:法国国家科学研究中心, 波士顿医疗中心有限公司