专利名称：一种检测农产品中2,4-二氯苯氧乙酸的电化学免疫传感方法
技术领域：
本发明涉及生物检测方法，具体是一种检测农产品中2，4-二氯苯氧乙酸的电化 学免疫传感方法。
背景技术：
2， 4-D是一种应用广泛的植物生长调节剂，其测定方法有萃取_光度法、液相色谱 法、液相色谱质谱法、薄层色谱法、衍生气相色谱法等。但这些传统方法都有一定的局限性， 如样品前处理复杂、操作繁琐费时、测定周期长、设备昂贵、灵敏度低等。免疫传感器是利 用电化学免疫传感器的高灵敏度、简便、快速等特点，结合生物识别系统(抗原抗体特异性 结合)而形成的一种自动化分析检测系统，具有操作简单、快速、廉价、精简、灵敏度高等优 点，在2， 4-D的测定中引起高度重视。因此，研究一种高灵敏度、简便、快速的2， 4-D免疫传 感测定新方法有非常重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种农产品中2，4-D含量 的检测方法。本发明能较好的满足2， 4-D测定的需要，且方法简单，快速，灵敏度高，为检测 2，4-D提供了一种新的途径。 为了达到上述目的，本发明提供的检测农产品中2，4-D含量的方法包括以下步 骤2，4-D与BSA的偶联；在金电极表面制备无试剂型2，4-D电化学免疫传感器；制备HRP
标记的羊抗鼠Ig6抗体；制作标准工作曲线；样品检测。 本发明解决其技术问题所采用的技术方案还可以进一步完善。所述2，4-D与BSA 的偶联可以由以下步骤制备称取3. 315g 2，4-D(0.015mmo1)溶解在0. 5mL的无菌DMF中， 再称取NHS 4. 028g(0. 035,1) 、EDC 6. 71g (0. 035,1)同时加入2， 4-D的无菌DMF中，室 温下搅拌反应5小时(130rpm， 28°C )。再称取0. 024gBSA溶于2. 4mL pHll的硫酸缓冲液 中，然后将含有2， 4-D的无菌DMF缓慢加入到BSA的硫酸缓冲液中，约15min加完，在室温 下慢速搅拌反应4小时，4t:过夜。将反应液放入透析袋，在500M1 10%的DMF液中4t:透 析二次，4h/次；再在500mL的0. 01M的PBS中透析四次。制得2，4-D与BSA的偶联物。将 2， 4-D-BSA保存在4°C的PBS中，备用。 所述无试剂型2，4-D电化学免疫传感器可以由以下步骤制备(l)金电极表面 的1，6-己二硫醇自组装将洗净过的金电极放入2. 5mM 1，6-己二硫醇溶液中，自组装2 小时，取出金电极，金电极表面用纯水清洗三次，即在金电极表面获得一层致密均匀的1， 6-己二硫醇自组装单层膜；(2)修饰后的金电极表面抗原固定化将自组装了 1，6-己二硫 醇自组装单层膜的金电极浸入纳米金胶溶液中室温静置1. 5-2小时，取出后用PBS搅拌洗 涤5min，用水淋洗后，吹干；在电极表面滴加15ii L的2，4-D-BSA溶液并置于37t:恒温水浴 箱中温育4小时，用PBS搅拌洗涤5min，用水淋洗后，吹干；再在电极表面上滴加40y Ll%
3BSA(pH 7. 4)并置于37t:恒温水浴箱中温育1小时，以封闭电极表面多余的蛋白结合位点， 防止免疫测定过程中的非特异性吸附产生误差，用PBS搅拌洗涤5min，用水淋洗后，吹干， 即获得无试剂型2，4-D电化学免疫传感器。 所述的制作标准工作曲线方法为取不同浓度的2，4_D标准溶液和2，4_D抗体 (单抗)混合液，取常规量滴到已制备好的无试剂型2，4-D电化学免疫传感器，37t:环境下 反应50min ;接着加入HRP标记抗体(二抗)，37。C环境下反应50min，对免疫传感器表面的 计时电流连续检测直到稳态，获得稳定的数值。改变2， 4-D标准溶液的浓度，按上述步骤测 定一系列不同浓度的2，4-D标准溶液，用免疫传感器表面的计时电流变化值与2，4-D浓度 绘制标准工作曲线。 所述的样品测定方法为取处理好的样品溶液和2， 4-D抗体(单抗)混合液，取常 规量滴到已制备好的无试剂型2，4-D电化学免疫传感器，37t:环境下反应50min ;接着加入 HRP标记抗体(二抗)，37t:环境下反应50min，对免疫传感器表面的计时电流连续检测直到 稳态，获得稳定数值。将计时响应电流值与绘制好的标准工作曲线对照获得农产品样品溶 液中2，4-D的数值。 2，4-D电化学免疫传感器的检测原理本发明是基于利用电化学免疫传感器具有 高灵敏度、简便、快速、可靠等特点，结合生物识别系统(抗原抗体特异性结合)而形成的一 种自动化分析检测系统，实现农产品中2，4-D含量的检测。本发明利用自组装技术和静电 吸附作用，将2，4-D-BSA全抗原固定在通过由自组装1，6-己二硫醇和静电吸附纳米金修饰 的金电极表面，解决了抗原固定的难题，然后在电极上滴加anti-2，4-D和2，4_D的混合物， 由于2， 4-D和2， 4-D-BSA都能与anti-2， 4-D发生高特异性的免疫反应，如果样品中2， 4-D 含量高，由于大部分2，4-D抗体已经与样品中2，4-D反应了，结合到金电极表面的2，4-D抗 体就少，这样HRP标记的二抗结合上去的量也就少。2， 4-D和2， 4-D-BSA竞争与anti-2， 4-D 反应后，用HRP标记的羊抗鼠IgG将信号进一步放大，然后用循环伏安法测定。本发明实际 上其放大倍数与样品中2，4-D含量成反比，即样品中2，4-D越少，那么连接到金电极上的抗 体反而越多，HRP标记的二抗上去的也越多，质量放大越明显。 本发明效果是在2，4-D浓度为0. 5ng/mL-2500ng/mL范围内成线性关系，校正曲 线是y = -18. 45x+71. 59，相关系数R为0. 9960，检测下限为0. 05ng/mL。经应用证实此方 法能较好的满足农产品中2，4-D测定的需要。
图1是本发明的农产品实际样品2，4-D含量的检测图。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
—.试剂与仪器 2，4_D，1，6-己二硫醇，氯金酸，BSA，拧檬酸三钠均从Sigma公司购买，铁氰化钾， 亚铁氰化钾，氯化钾磷，EDC， NHS，l，4-二氧杂环乙烷均购自上海化学试剂公司。其它试剂 均为分析纯试剂，实验用水均为二次蒸馏水。 CHI660C电化学工作站，金电极，Ag/Agcl饱和电极，钼丝电极均从上海辰华仪器公司购买，BRANS0NIC200超声清洗仪(德国BRANSON ULTRASCHALL公司)，CS501-SP型超 级数显恒温器(重庆四达实验仪器厂制造)，MP230酸度计(瑞士 Metter Toledo公司)， AB204-S电子天平(瑞士 Metter Toledo公司)，2， 4_D单克隆抗体。
二、实施方法 这种检测农产品中2，4_D的方法，主要包括以下步骤来实现
1. 2，4-D与BSA的偶联:称取3. 315g 2， 4_D (0. 015mmol)溶解在0. 5mL的无菌DMF 中，再称取NHS 4. 028g(0. 035mmol) 、 EDC 6. 71g (0. 035mmol)同时加入2， 4_D的无菌DMF 中，室温下搅拌反应5小时(130rpm， 28°C )。再称取0. 024gBSA溶于2. 4mL pH 11的硫酸 缓冲液中，然后将含有2， 4-D的无菌DMF缓慢加入到BSA的硫酸缓冲液中，约15min加完， 在室温下慢速搅拌反应4小时，fC过夜。将反应液放入透析袋，在500mL 10%的DMF液中 4t:透析二次，4h/次；再在500mL的0. 01M的PBS中透析四次。制得2，4_D与BSA的偶联 物。将2 ， 4-D-BSA保存在4 °C的PBS中，备用。 2.无试剂型2，4-D电化学免疫传感器的制备将洗净过的金电极放入2. 5mMl， 6-己二硫醇溶液中，自组装2小时，取出金电极，金电极表面用纯水清洗三次，即在金电极 表面获得一层致密均匀的1，6-己二硫醇自组装单层膜；将自组装了 1，6-己二硫醇自组装 单层膜的金电极浸入纳米金胶溶液中室温静置1. 5-2小时，取出后用PBS搅拌洗涤5min， 用水淋洗后，吹干；在电极表面滴加15 ii L的2，4-D-BSA溶液并置于37。C恒温水浴箱中温 育4小时，用PBS搅拌洗涤5min，用水淋洗后，吹干；再在电极表面上滴加40 y LI % BSA (pH 7. 4)并置于37t:恒温水浴箱中温育1小时，以封闭电极表面多余的蛋白结合位点，防止免 疫测定过程中的非特异性吸附产生误差，用PBS搅拌洗涤5min，用水淋洗后，吹干，即获得 无试剂型2， 4- 二氯苯氧乙酸电化学免疫传感器。
3.制备HRP标记的羊抗鼠IgG抗体。 4.标准工作曲线的制作取不同浓度的2，4-D标准溶液和2，4-D抗体(单抗) 混合液，取常规量滴到已制备好的无试剂型2，4-D电化学免疫传感器，37t:环境下反应 50min ;接着加入HRP标记抗体(二抗)，37。C环境下反应50min，对免疫传感器表面的计时 电流连续检测直到稳态，获得稳定值。改变标准浓度的2，4-D，按上述步骤测定一系列2， 4-D的标准溶液，用免疫传感器表面的计时电流变化值与2，4-D浓度绘制标准工作曲线在 2，4-D浓度为0. 5ng/mL-2500ng/mL范围内成线性关系，校正曲线是y = -18. 45x+71. 59，相 关系数R为0. 9960，该免疫传感器的的检测下限为0. 05ng/mL ; 5.样品检测取处理好的样品溶液和2， 4-D抗体(单抗)混合液，取常规量滴到 已制备好的无试剂型2， 4-D电化学免疫传感器，37t:环境下反应50min ;接着加入HRP标记 抗体(二抗)，37t:环境下反应50min，对免疫传感器表面的计时电流连续检测直到稳态，获 得稳定值。将计时响应电流值与绘制的标准工作曲线对照获得样品溶液中2，4-D的数值。
本方法检测实例利用该传感器对棉花幼叶中2，4_D含量进行了检测取棉花幼 叶鲜样1. 5000g，于1. 5mL离心管中冰浴研磨，加入600ii L 100%的甲醇，混匀后浸提过夜， 4800g离心10min，取上清液至一新离心管中，剩余残渣用200 y L 100X的甲醇浸提2h， 4800g离心10min，取上清液，合并两次上清液，移入一新5mL离心管中。用3000 y L超纯水 稀释提取液，过Waters S印-pak C18柱，用200iiL 20X甲醇和250iiL 30%甲醇分别洗脱 后，用300 ii L 100%甲醇洗脱并收集IAA，用于后续的检测和分析。接着，将收集好的2，4-D
5用100 ii L 100%甲醇溶解后，取20 ii L进行HPLC检测，同时，取20 y L加入PBS溶液中，用2，4_D电化学免疫传感器检测，其检测数据表明(图l)，与HPLC测定的结果基本一致。
权利要求
一种检测农产品中2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的电化学免疫传感方法，其特征在于包括以下步骤(1)2，4-D与BSA的偶联；(2)在金电极表面制备无试剂型2，4-D电化学免疫传感器；(3)制备HRP标记的羊抗鼠IgG抗体；(4)制作标准工作曲线；(5)样品中2，4-D含量的检测。
2. 根据权利要求1所述的2，4-D与BSA的偶联方法，其特征在于中所述的2，4-D与 牛血清白蛋白(BSA)的偶联按以下方法进行称取3. 315g 2，4-D溶解在0. 5ml的无菌二甲 基甲酰胺(DMF)中，再称取N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)4.028g、二氯乙烷(EDC)6. 71g同时加 入2，4-D的无菌DMF中，室温下搅拌反应5小时(130rpm， 28°C )。再称取0. 024g BSA溶于 2. 4mLpH 11的硫酸缓冲液中，然后将含有2，4-D的无菌DMF缓慢加入到BSA的硫酸缓冲液 中，在室温下慢速搅拌反应4小时，4t:过夜。将反应液放入透析袋，在500ml 10X的DMF液 中4"透析二次(4h/次)；再在500mL的0. 01M的PBS中透析四次。制得2，4_D与BSA的 偶联物。将2， 4-D-BSA保存在4°C的PBS中，备用。
3. 根据权利要求1所述的无试剂型2，4-D电化学免疫传感器由以下步骤制备将洗净 过的金电极放入2. 5mM 1，6-己二硫醇溶液中，自组装2小时，取出金电极，金电极表面用纯 水清洗三次，即在金电极表面获得一层致密均匀的1，6-己二硫醇自组装单层膜；将自组装 了 1，6-己二硫醇自组装单层膜的金电极浸入纳米金胶溶液中室温静置1. 5-2小时，取出后 用PBS搅拌洗涤5min，用水淋洗后，吹干；在电极表面滴加15 y L的2， 4-D-BSA溶液并置于 37t:恒温水浴箱中温育4小时，用PBS搅拌洗涤5min，用水淋洗后，吹干；再在电极表面上 滴加40 ii Ll% BSA(pH 7. 4)并置于37。C恒温水浴箱中温育1小时，以封闭电极表面多余的 蛋白结合位点，防止免疫测定过程中的非特异性吸附产生误差，用PBS搅拌洗涤5min，用水 淋洗后，吹干，即获得无试剂型2 ， 4-D电化学免疫传感器。
4. 根据权利要求1所述标准工作曲线的制作，其特征在于取不同浓度的2，4-D标准 溶液和2，4-D抗体(单抗)混合液，取常规量滴到已制备好的无试剂型2，4-D电化学免疫 传感器，37t:环境下反应50min ;接着加入HRP标记抗体(二抗)，37。C环境下反应50min， 对免疫传感器表面的计时电流连续检测直到稳态，获得稳定的数值。改变2，4-D标准溶液 的浓度，按上述步骤测定一系列不同浓度的2，4-D标准溶液，用免疫传感器表面的计时电 流变化值与2，4-D浓度绘制标准工作曲线。
5. 根据权利要求1所述的检测农产品中2，4-D的方法，其特征在于取处理好的样品 溶液和2，4-D抗体(单抗)混合液，取常规量滴到已制备好的无试剂型2，4-D电化学免疫 传感器，37t:环境下反应50min ;接着加入HRP标记抗体(二抗)，37。C环境下反应50min， 对免疫传感器表面的计时电流连续检测直到稳态，获得稳定数值。将计时响应电流值与绘 制好的标准工作曲线对照获得农产品样品溶液中2，4-D的数值。
全文摘要
本发明涉及了一种检测农产品中2，4-二氯苯氧乙酸的电化学免疫传感方法，主要包括以下步骤来实现1)2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)与BSA的偶联；2)电极修饰与免疫传感器的制备；3)制备HRP标记的羊抗鼠IgG抗体；4)标准曲线的制备；5)样品检测。本发明有益的效果是在检测中，利用HRP标记的羊抗鼠IgG将信号放大，提高检测灵敏度，从而实现2，4-D的高灵敏定量测定。该方法在2，4-D浓度为0.5ng/mL～2500ng/mL范围内成线性关系，检测下限为0.05ng/ml，能较好的满足农产品中2，4-D测定的需要，且具有方法简便，结果可靠，成本较低等优点。
文档编号G01N33/531GK101769892SQ201010100810
公开日2010年7月7日 申请日期2010年1月26日 优先权日2010年1月26日
发明者刘清, 夏石头, 李合松, 肖浪涛 申请人:湖南农业大学