专利名称：一种同时手性分离分析山茛菪碱、阿替洛尔和美托洛尔的方法
技术领域：
本发明涉及手性药物的手性分离分析领域，尤其涉及一种同时手性分离分析山茛
菪碱、阿替洛尔和美托洛尔的方法。
背景技术：
阿替洛尔和美托洛尔均属于13 1肾上腺受体抑制类药物，具有相似的结构和性 质，广泛应用于高血压、心绞痛、心律失常和心肌梗塞等心血管疾病的治疗。山茛菪碱为抗 胆碱药，临床主要用于平滑肌痉挛、胃肠绞痛、胆道痉挛等疾病的治疗。阿替洛尔、美托洛尔 和山茛菪碱均为手性药物，其各自的对映异构体在药理、毒理乃至临床性质方面存在较大 差异，因此，对阿替洛尔对映异构体、美托洛尔对映异构体和山茛菪碱对映异构体进行分离 分析具有重要意义。 现有技术已经公开了多种手性分离分析阿替洛尔、美托洛尔和山茛菪碱的方法， 如H.Wang等用毛细管电泳紫外检测方法对山莨菪碱对映异构体进行了分离(H.Wang， J丄Gu， H. F. Hu， R. J. Dai， T. H. Ding， R. N. Fu。 Analyticachimica acta， 1998， 359， 39)， H. -L. Zhang等用毛细管电泳紫外检测方法对手性阿替洛尔对应异构体和酒石酸美托洛尔 对映异构体逐一进行了分离(H-L. Zhang， H. Shao， Y-M. A， Z_Z. Zhang. Chromatographia， 2008,68,653)。但是紫外检测法灵敏度较低，难以满足高灵敏度的检测要求。
电化学发光方法是一种新型的分析检测方法，尤其是以联吡啶钌体系作为发光 体系时，发光效率较高，检测灵敏度也较高。现有技术已经公开了使用毛细管电泳电化学 发光方法对氨基酸、蛋白质、DNA和有机胺类等物质进行分离检测的技术，如中国专利文献 200610173390. 8公开了一种毛细管电泳电化学发光检测美托洛尔和阿替洛尔的方法，使用 毛细管电泳电化学发光技术将结构相似的美托洛尔和阿替洛尔进行了分离分析，但是并没 有实现美托洛尔对映异构体和阿替洛尔对映异构体的分离分析。 因此，本发明人考虑提供一种方法同时将山茛菪碱对映异构体、阿替洛尔对映异 构体和美托洛尔对映异构体分离检测，以降低成本、提高效率，并获得较高的检测灵敏度。
发明内容
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供了一种同时手性分离分析山茛菪 碱、阿替洛尔和美托洛尔的方法，本发明提供的方法能够将不同结构的手性药物分离检测， 降低检测成本，提高分离效率。 本发明提供了一种同时手性分离分析山茛菪碱、阿替洛尔和美托洛尔的方法，包 括 将山茛菪碱样品、阿替洛尔样品和美托洛尔样品投入毛细管电泳电化学发光检测
联用仪器的样品池中，施加进样电压，使所述样品进入所述仪器的毛细管； 施加分离电压，使所述样品在所述毛细管内进行电泳分离，所述毛细管为含有羧
3甲基-13 -环糊精的分离溶液，所述分离溶液的pH值为3. 0-6. 0 ; 分离后的样品进入所述仪器的检测池，施加检测电压进行检测，所述检测池内为
含有三联吡啶钌的检测溶液，所述检测溶液的pH值为6. 0-9. 0。优选的，所述羧甲基-13 -环糊精的浓度为5mmol/L-20mmol/L。优选的，所述羧甲基-13 -环糊精的浓度为13mmol/L-16mmol/L。 优选的，所述分离溶液的pH值由HAc-NaAc缓冲溶液保持。优选的，所述HAc-NaAc缓冲溶液的浓度为30mmol/L-70mmol/L。优选的，所述三联吡啶钌的浓度为4mmol/L-10mmol/L。 优选的，所述三联妣啶钌的浓度为5mmol/L。 优选的，所述检测溶液的pH值由NaH2P04-Na2HP04缓冲溶液保持。
优选的，所述NaH2P04_Na2HP04缓冲溶液的浓度为50mmol/L-150mmol/L。
优选的，所述毛细管为内径为50ym的未涂层融硅毛细管。 与现有技术相比，本发明以羧甲基_ 13 _环糊精为手性选择剂，使不同结构的山茛 菪碱、阿替洛尔和美托洛尔的异构体在pH值为3. 0-6.0的毛细管内电泳分离，然后通过三 联吡啶钌电化学发光体系对各个异构体进行检测，最终实现对山茛菪碱、阿替洛尔和美托 洛尔等3种手性药物的同时分离检测。本发明提供的手性分离分析方法试剂使用较少、检 测成本较低、分离效率较高、检测灵敏度较高。实验表明，通过本发明提供的方法同时对山 茛菪碱对映异构体、阿替洛尔对映异构体和美托洛尔对映异构体进行分离检测时，山茛菪 碱、阿替洛尔和美托洛尔的检测限分别为6X 10—7mol/L、5. 5X 10—7mol/L和3X 10—7mol/L。
图1为本发明实施例提供的NaH2P04-Na2HP04缓冲溶液、三联吡啶钌、山茛菪碱、阿 替洛尔和美托洛尔在铂盘电极上的循环伏安曲线图； 图2为本发明实施例提供的NaH2P04-Na2HP04缓冲溶液、三联吡啶钌、山茛菪碱、阿 替洛尔和美托洛尔的电化学发光曲线图； 图3为本发明实施例提供的山茛菪碱、阿替洛尔和美托洛尔的电泳谱图； 图4为本发明实施例提供的空白尿样以及添加了山茛菪碱、阿替洛尔和美托洛尔
的尿样的电泳谱图。
具体实施例方式
本发明提供了一种同时手性分离分析山茛菪碱、阿替洛尔和美托洛尔的方法，包 括 将山茛菪碱样品、阿替洛尔样品和美托洛尔样品投入毛细管电泳电化学发光检测
联用仪器的样品池中，施加进样电压，使所述样品进入所述仪器的毛细管； 施加分离电压，使所述样品在所述毛细管内进行电泳分离，所述毛细管为含有羧
甲基-|3 -环糊精的分离溶液，所述分离溶液的pH值为3. 0-6. 0 ; 分离后的样品进入所述仪器的检测池，施加检测电压进行检测，所述检测池内为 含有三联吡啶钌的检测溶液，所述检测溶液的pH值为6. 0-9. 0。 按照本发明，首先将山茛菪碱样品、阿替洛尔样品和美托洛尔样品投入毛细管电泳电化学发光检测联用仪器的样品池中，施加进样电压，使所述样品进入所述仪器的毛细 管。本发明对毛细管电泳电化学发光检测联用仪器的来源没有特殊限制，可以从市场上购 得，如西安瑞迈分析仪器有限责任公司出售的MPI-A型毛细管电泳电化学发光检测仪。本 发明对进样电压没有特殊限制，优选为10kV-20kV，更优选为10kV-15kV。本发明对所使用 的毛细管没有特殊限制，优选为内径50ym的未涂层融硅毛细管。为了使样品分离效果 更好，本发明的进样时间优选为2s-15s，更优选为2s-10s，最优选为3s-8s。为了保证检 测的灵敏度及分析结果的重现性，优选在进样之前对所述毛细管进行预处理，优选依次使 用80mmol/L-120mmol/L的NaOH溶液冲洗所述毛细管5min-15min、二次水冲洗所述毛细管 2min-6min， 30mmol/L-70mmol/L、pH值为3. 0-6. 0之间的HAc-NaAc缓冲溶液冲洗所述毛细 管5min-15min。 所述样品进入毛细管后，对毛细管施加分离电压，使样品在毛细管内实现电泳分 离。本发明对所述分离电压没有特殊限制，优选为10kV-20kV，更优选为13kV-20kV，最优选 为13kV-15kV。 所述毛细管内为含有羧甲基-l3-环糊精的分离溶液。由于将山茛菪碱对映异构 体、阿替洛尔对映异构体和美托洛尔对映异构体电泳分离后还需要在三吡啶钌的发光体系 中进行检测，因此，本发明使用没有还原性的羧甲基-13 _环糊精作为手性选择剂，降低试 剂对后续检测结果的影响。所述羧甲基-P -环糊精能够分别与山茛菪碱对映异构体、阿替 洛尔对映异构体和美托洛尔对映异构体结合形成络合物，但形成的络合物的稳定度不同， 因此所述络合物在毛细管中进行电泳的速率也不同，从而最终实现对映异构体的分离。实 验表明，山茛菪碱对映异构体最先与羧甲基-e-环糊精结合并分离，美托洛尔对映异构体 最后与羧甲基_ P _环糊精结合并分离。本发明对所述羧甲基_ P _环糊精的浓度没有特殊 限制，优选为lmmol/l-25mmol/l，更优选为5mmol/l_25mmol/l，最优选为5mmol/l_20mmol/ L。 按照本发明，所述毛细管内溶液的pH值为3. 0-6. O，所述溶液的pH值优选由缓冲 溶液保持，所述缓冲溶液优选为本领域技术人员熟知的HAc-NaAc缓冲溶液，所述HAc-NaAc 的浓度优选为10mmol/L-100mmol/L，更优选为20mmol/L-90mmol/L，最优选为30mmo1/ L-70mmol/L。 所述山茛菪碱对映异构体、阿替洛尔对映异构体和美托洛尔对映异构体在毛细管 内实现分离后，先后进入毛细管电泳电化学发光检测联用仪器的检测池中，在检测电压下 进行检测。本发明对检测电压没有特殊限制，优选为1. 0V-1. 4V，更优选为1. 0V-1. 2V。
所述检测池内为含有三联吡啶钌的溶液，所述三联吡啶钌是最常见电化学发光体 系，其发光检测原理如下三联吡啶钌体系中含有Ru (bpy) 32+， Ru (bpy) 32+经工作电极被氧化 成不稳定的氧化态Ru (bpy) 33+，该氧化态物质与手性山茛菪碱相互作用，被还原成激发态的 Ru (bpy) 32+*，该激发态立即回迁至基态Ru (bpy) 32+，并释放出光子，此光信号的强度与被测物 的浓度呈线性关系。由于山茛菪碱、阿替洛尔和美托洛尔各有左旋和右旋两种异构体，经过 毛细管电泳分离先后进入检测池，会先后发生六次激发，产生六个发光强度峰值，从而实现 对山茛菪碱对映异构体、阿替洛尔对映异构体和美托洛尔对映异构体的检测。本发明对三 联吡啶钌的浓度没有特殊限制，优选为lmmo 1 /L-20mmo 1 /L，更优选为lmmo 1 /L-15mmo 1 /L， 最优选为4mmol/L-10mmol/L。
按照本发明，所述检测池内溶液的pH值为6.0-9.0，优选由缓冲溶液保持，所述 缓冲溶液优选为本领域技术人员熟知的NaH2P04-Na2HP04缓冲液，NaH2P04-Na2HP04缓冲液 的浓度优选为10mmol/L-200mmol/L，更优选为30mmol/L-200mmol/L，最优选为50mmol/ L-150mmol/L。
按照本发明，所述检测池内为三电极体系，所述三电极体系优选为直径为
500 ii m的Pt盘工作电极、Ag/AgCl参比电极(KC1饱和溶液)和Pt丝对电极。 按照本发明，所述毛细管电泳电化学发光检测联用仪器的发光检测器用于检测并
记录光信号，获得毛细管-电化学发光检测的谱图，从而得到山茛菪碱、阿替洛尔和美托洛
尔的手性分离分析结果。按照本发明，所述发光检测器优选为光电倍增管，其电压优选为
700V-900V。 按照本发明，优选将分离后的山茛菪碱、阿替洛尔和美托洛尔进行本领域技术人 员熟知的结构分析，以确定分离后的物质为左旋分子还是右旋分子。 与现有技术相比，本发明以羧甲基-e-环糊精为手性选择剂，使不同结构的山茛 菪碱、阿替洛尔和美托洛尔的异构体在pH值为3. 0-6.0的毛细管内电泳分离，然后通过三 联吡啶钌电化学发光体系对各个异构体进行检测，最终实现山茛菪碱、阿替洛尔和美托洛 尔的同时手性分离分析。本发明提供的手性分离分析方法试剂使用较少、检测成本较低、 分离效率较高、检测灵敏度较高。实验表明，通过本发明提供的方法同时对山茛菪碱、阿 替洛尔和美托洛尔进行手性分离分析时，山茛菪碱、阿替洛尔和美托洛尔的检测限分别为 6X10—7mol/L、5. 5X10—7mol/L和3X10—7mol/L。 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的同时手性分离分析山茛
菪碱、阿替洛尔和美托洛尔的方法进行详细描述。 实施例1 按以下步骤配制NaH2P04-Na2HP04缓冲溶液 分别配制浓度为200mmol/L的NaH2P04溶液和200mmol/L的Na2HP04溶液，将两溶 液混合后，用二次水稀释至浓度为10Ommol/L，然后将混合溶液的pH调到7. 0备用。
实施例2 按照以下步骤配制HAc-NaAc缓冲溶液 首先配制浓度为200mmol/L的NaAc溶液，然后用二次水稀释至57. 6mmol/L，然后 用冰醋酸将溶液的pH值调到5. 3备用。
实施例3 使用的仪器装置为内径50iim的未涂层融硅毛细管柱，直径500iim的Pt盘工作 电极，Ag/AgCl参比电极，Pt丝对电极，从西安瑞迈分析仪器有限责任公司购买的MPI-A型 毛细管电泳电化学发光检测仪。 以实施例1配制的NaH2P04-Na2HP04缓冲溶液为背景电解质，扫描电位为0-1. 30V， 记录稳定时的循环伏安曲线和电化学发光曲线，参见图1中的a曲线和图2中的a曲线；
向所述背景电解质中加入5mmol/L的三联吡啶钌，扫描电位为0-1. 30V，记录稳定 时的循环伏安曲线和电化学发光曲线，参见图1中的b曲线和图2中的b曲线；
向含三联吡啶钌的溶液中加入0. 3mmol/L的山茛菪碱、0. 3mmol/L的阿替洛尔和 0. 3mmol/L的美托洛尔，扫描电位均为0_1. 30V，记录稳定时的循环伏安曲线和电化学发光曲线，分别参见图1中的c曲线、d曲线、e曲线和图2中的c曲线、d曲线、e曲线。 将所得到的循环伏安曲线和电化学发光曲线对比，参见图1和图2，图1为本发明
实施例提供的NaH2P04-Na2HP04缓冲溶液、三联吡啶钌、山茛菪碱、阿替洛尔和美托洛尔在铂
盘电极上的循环伏安曲线图；图2为本发明实施例提供的NaH2P04-Na2HP04缓冲溶液、三联
吡啶钌、山茛菪碱、阿替洛尔和美托洛尔的电化学发光曲线图；由图l可知，加入山茛菪碱、
阿替洛尔和美托洛尔后，溶液的电响应没有显著增强；由图2可知，加入山茛菪碱、阿替洛
尔和美托洛尔后，溶液的电化学发光曲线中的响应度比只加入三联吡啶钌的响应度强，说
明山茛菪碱、阿替洛尔和美托洛尔虽然不会增强三联吡啶钌的电化学活性，但能够增强三
联吡啶钌的电化学发光活性，因此，使用电化学发光方法同时检测山茛菪碱、阿替洛尔和美
托洛尔是可行的。 实施例4 使用的仪器装置为内径50iim的未涂层融硅毛细管柱，直径500iim的Pt盘工作
电极，Ag/AgCl参比电极，Pt丝对电极，MPI-A型毛细管电泳电化学发光检测仪。 将实施例1配制的NaH2P04-Na2HP04缓冲溶液和5mmol/L的三联吡啶钌溶液加入到
MPI-A型毛细管电泳电化学发光检测仪的检测池中，将实施例2配制的HAc-NaAc缓冲溶液
和14. 7mol/L的羧甲基-13 _环糊精加入到MPI-A型毛细管电泳电化学发光检测仪的毛细管中。 对毛细管进行预处理首先用100mmol/L的NaOH溶液冲洗后备用；在使用前，再 依次用100mmol/L的NaOH溶液、二次水溶液和实施例2配制好的HAc-NaAc缓冲溶液冲洗 10min、5min禾卩10min。 将l. 0mmol/L的山茛菪碱溶液、1. Ommol/L的阿替洛尔溶液和1. Ommol/L的美托洛 尔溶液加入到MPI-A型毛细管电泳电化学发光检测仪的样品池中，控制MPI-A型毛细管电
泳电化学发光检测仪的操作条件如下进样电压10kV，进样时间4s ;分离电压17. 5kV ;检
测电压1. 15V，光电倍增光电压为800V，对山茛菪碱、阿替洛尔和美托洛尔进行手性分离分 析，检测结果参见图3，图3为本发明实施例提供的山茛菪碱、阿替洛尔和美托洛尔的电泳 谱图；由图3可知，在开始手性分离分析后1133s时出现Al、A2两个峰，2489s时出现B 1、 B2两个峰，3074s时出现C1、C2两个峰。 保持手性分离分析条件不变，以2. Ommol/L的山茛菪碱溶液、1. Ommol/L的阿替洛 尔溶液和1. Ommol/L的美托洛尔溶液为样品进行手性分离分析，得到的电泳谱图中，最先 出现的两个峰的出现时间和峰形发生了变化，但依然是最先出现，而后面的四个峰的出现 时间和峰形均无明显变化，由此可以得知，图3中1133s出现的Al和A2两个峰为山茛菪碱 对映异构体的峰。 保持手性分离分析条件不变，以1. Ommol/L的山茛菪碱溶液、2. Ommol/L的阿替洛 尔溶液和1. Ommol/L的美托洛尔溶液为样品进行手性分离分析，得到的电泳谱图中，中间 出现的两个峰的出现时间和峰形发生了变化，但依然是在中间出现，而前面两个峰和后面 两个峰的出现时间和峰形均无明显变化，由此可以得知，图3中2489s出现的Bl和B2两个 峰为阿替洛尔对映异构体的峰。 保持手性分离分析条件不变，以1. Ommol/L的山茛菪碱溶液、1. Ommol/L的阿替洛 尔溶液和2. Ommol/L的美托洛尔溶液为样品进行手性分离分析，得到的电泳谱图中，最后
7出现的两个峰的出现时间和峰形发生了变化，但依然最后出现，而前面的四个峰的出现时 间和峰形均无明显变化，由此可以得知，图3中3074s出现的CI和C2两个峰为美托洛尔对 映异构体的峰。 由此可知，山茛菪碱、阿替洛尔和美托洛尔与三联吡啶钌发生作用释放光子的时 间不同，因此，本发明提供的方法能够同时将山茛菪碱、阿替洛尔和美托洛尔进行手性分离 分析。 在上述操作条件下，山茛菪碱、阿替洛尔和美托洛尔的检出限分别为6X10—7mol/ L、5. 5X10—7mol/L和3X10—7mol/L。
实施例5 取健康人的尿液，经0. 22 m滤膜过滤后，用实施例2制备的缓冲溶液将其稀释， 作为空白尿样；向空白尿样中加入6 X 10—5mol/L的山茛菪碱溶液、5. 0 X 10—5mol/L的阿替洛 尔溶液和3X 10—5mol/L的美托洛尔溶液。 使用与实施例4相同的仪器、试剂和操作条件对空白尿样和添加了手性药物的尿 样进行手性分离分析，结果参见图4，图4为本发明实施例提供的空白尿样以及添加了山茛 菪碱、阿替洛尔和美托洛尔的尿样的电泳谱图。图4中，曲线1为空白尿样的电泳谱图，曲 线2为添加了山茛菪碱、阿替洛尔和美托洛尔的尿样的电泳谱图，在曲线2中，1133s处出现 了 Al和A2两个峰，2489s处出现了 Bl和B2两个峰，3074s处出现了 Cl和C2两个峰。
参考实施例4的分析，Al和A2为山茛菪碱同分异构体的峰，B 1禾P B2分别为阿 替洛尔同分异构体的峰，C1和C2分别为美托洛尔同分异构体的峰。由此可见，尿液的基底 对这三种手性物质的分离并没有很大影响，本发明提供的方法可以实现对尿液中的山茛菪 碱、阿替洛尔和美托洛尔同时进行手性分离分析。 以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对 于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行 若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
权利要求
一种同时手性分离分析山茛菪碱、阿替洛尔和美托洛尔的方法，其特征在于，包括将山茛菪碱样品、阿替洛尔样品和美托洛尔样品投入毛细管电泳电化学发光检测联用仪器的样品池中，施加进样电压，使所述样品进入所述仪器的毛细管；施加分离电压，使所述样品在所述毛细管内进行电泳分离，所述毛细管为含有羧甲基-β-环糊精的分离溶液，所述分离溶液的pH值为3.0-6.0；分离后的样品进入所述仪器的检测池，施加检测电压进行检测，所述检测池内为含有三联吡啶钌的检测溶液，所述检测溶液的pH值为6.0-9.0。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述羧甲基-e -环糊精的浓度为5mmo1/L-20,l/L。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述羧甲基-|3-环糊精的浓度为13mmol/L-16mmol/L。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离溶液的pH值由HAc-NaAc缓冲溶液保持。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述HA c -NaA c缓冲溶液的浓度为30mmo1/L_70mmo1。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述三联吡啶钌的浓度为4mmo1/L-10mmol/L。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述三联吡啶钌的浓度为5mmol/L。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测溶液的pH值由NaH2P04-Na2HP04缓冲溶液保持。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述NaH2P04-Na2HP04缓冲溶液的浓度为50mmol/L-150mmol/L。
10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述毛细管为内径为50ym的未涂层融硅毛细管。
全文摘要
本发明提供了一种同时手性分离分析山茛菪碱、阿替洛尔和美托洛尔的方法，包括将山茛菪碱样品、阿替洛尔样品和美托洛尔样品投入毛细管电泳电化学发光检测联用仪器的样品池中，施加进样电压，使所述样品进入所述仪器的毛细管；施加分离电压，使所述样品在所述毛细管内进行电泳分离，所述毛细管为含有羧甲基-β-环糊精的分离溶液，所述分离溶液的pH值为3.0-6.0；分离后的样品进入所述仪器的检测池，施加检测电压进行检测，所述检测池内为含有三联吡啶钌的检测溶液，所述检测溶液的pH值为6.0-9.0。与现有技术相比，本发明提供的手性分离分析方法试剂使用较少、检测成本较低、分离效率较高、检测灵敏度较高。
文档编号G01N27/447GK101788490SQ201010107910
公开日2010年7月28日 申请日期2010年2月10日 优先权日2010年2月10日
发明者于彩霞, 唐小风, 徐春荧, 李霞, 由天艳, 袁柏青 申请人:中国科学院长春应用化学研究所