心脏衰老生物标志物及其用途的制作方法

专利名称：心脏衰老生物标志物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及动物健康和长寿的营养支持领域。具体而言，本发 明提供了ー组心脏中衰老的生物标志物，包括參与fct信号通路的几个基因。本发明还提供了这些生物标志物的用途，以鉴定用于延缓心脏衰老的营养和饮食方案，并用于这些基因自身的调节以延缓心脏衰老。相关技术的说明有机体及其组成器官的衰老目前是生物学和医学研究中非常关注的主題。衰老的标志包括干细胞和祖细胞功能的降低和组织再生的下降(Rando,2006, Nature 441 1080-1086)。衰老组织对创伤和损伤表现出降低的内在抗性。固有(resident)细胞和循环干细胞以及祖细胞都是非特异性细胞，其对于创伤组织修复的进行是关键的。这种再生功能随组织衰老而降低。已经假定，干细胞和祖细胞功能异常可能会促进衰老和疾病。最新的报道描述了 Wnt/β-联蛋白信号通路与干细胞衰老之间的联系(參见，例如 White 等人，2007，Current Biology 17(21) :R923_925 ;Brack 等人，2007，Science317 :807-810 ；Liu 等人，2007，Science 317 :803-806 ;Nusse，2008，Cell Research 18 523-527 ;Rando，2006，上文)。β -联蛋白是Wnt信号通路的关键中介体(Willert&Nusse，1998, Current Opinion in Genetics & Development 8 :95-102 ;Nusse, 2008,上文)。当fct蛋白质在细胞膜上与其受体结合时，将在细胞内引发一系列的生物化学反应。信号级联放大通过β_联蛋白最终进入细胞核中，所述β_联蛋白将fct信号从细胞质转递至细胞核，以与其他核内蛋白一起调节基因表达(Huelsken & Birchmeirer, 2001, Curr.Op.Genet. & Devel. 11 :547-553)。据报道，在加速衰老的动物模型的多种组织和器官中，Wnt信号是增加的(Liu等人，2007，上文)。报道了持续的Wnt暴露引起了细胞衰老。类似地，已经报道了在衰老的骨骼肌干细胞中増加的fct信号(Brack等人，2007，上文)。此外，还报道了 Wnt信号促进肌干细胞的肌源性至纤维发生性的转变，并抑制该信号保存了肌源性命运(myogenic fate)。在心脏中，Deb等人报道了用分泌型卷曲相关蛋白质2 (SFRP2)(胞外Wnt拮抗剂)拮抗fct信号抑制分化并将胚胎的和成熟的心脏祖细胞维持在未分化状态(Deb等人，2008，Stem Cells 26:35-44)。因此，那些研究者假定，Wnt信号随衰老增カロ，并且该信号驱动心脏的干细胞和祖细胞进入纤维发生型谱系(Deb，2008，ResearchProposal Summary-New Scholar Award in Aging, Ellison Medical Founaation atURLellisonfoundation. org/)。Ashton等人报道对比年轻心脏,Wnt信号通路在“衰老”心脏中下调。(Ashton 等人，2005,Experimental Gerontology41 :189-204),但该研究中没有报道β_联蛋白的表达。此外，尽管已经显示，小鼠中有功能性活性的心脏祖细胞在20月龄时达到峰值(Gonzales 等人，2008, Circulation Research 102 :597-606),但在 Ashton等人研究的“衰老”组中，小鼠的龄期范围为16-18月龄。因此，在Ashton等人研究中使用的小鼠并不是真正衰老的个体。正好处于随意摄取水平以下的限量热量摄入已经在许多动物物种，包括哺乳动物例如啮齿类动物和灵长类动物中显示出増加寿命、降低或延缓许多年龄相关的疾病的发病、改善应激抗性和减缓功能衰退。事实上，临床试验已经开始评价热量限制(CR)在人类中的长寿促进作用。但是在人类和动物中一祥，由于所需限制的程度和长短，在大多数个体中，CR似乎不可能是提高寿命的可行策略。为此，已经将研究集中于在不实质改变饮食摄入的情况下，鉴定能模拟CR的作用的物质，例如，药物试剂、营养物质等。尝试已经直接朝向鉴定可以模拟CR的ー种或多种生理或生物化学作用的试剂(參见，Barger 等人，2008，PLoS ONE 3(6) e2264. doi 10. 1371/journal, pone. 0002264),或者可以在某些组织和器官中模拟与CR相关的基因表达谱的试剂(例如，Spindler，美国专利6，406，853 ;美国专利申请公开2003/0124540 ；Barger等人，2008，上文)。关于 后者，已经公开了用于分析与CR相关的基因和筛选基于基因表达谱的CR模拟物的方法(Spindler 等人，美国专利申请公开 2004/0180003、2004/0191775 和 2005/0013776 ；Pan 等人，美国专利申请公开2007/0231371)。据报道，在多种非心脏细胞和组织系统中，许多物质与联蛋白和/或Wnt信号相互作用，所述物质包括藻酸盐(Dettmar等人,2007, Biomater Sci Polym Ed18 :317-333)、芹菜苷配基(Shukla 等人，2007，Cancer Res. 67 :6925-6935)、抗坏血酸(Quintanilla 等人，2005，J Biol Chem 280 :11615-11625)、姜黄素(Mahmoud 等人，2000，Carcinogenesis21 :921-927)、黄烧酮(Park等人，2005, Biochem Biophys Res Commun331 1222-1228)、染料木素(Guo 等人，2002，Am J Physiol Cell Physiol283 :C722_C734)、透明质酸(Bourguignon 等人，2007，J Biol Chem282 :1265-1280)、镁(Caveda 等人，1996，J Clin Invest 98 :886-893)、油酸单甘油酸憐脂酸(monooleyl phosphatidic acid)(Malbon，2005，Sci STKE 292 :pe35)、柚苷配基(Lee 等人，2005，Biochem Biophys ResCommun 335 :771-776)、一氧化氮(硝化甘油)(Pr6votat 等人，2OO6, Gastroenterology131 :1142-1152)、五羟黄酮(van Erk 等人，2005，Eur J Nutr 44 :143-556)、白藜芦醇(Hope 等人，2008, Mol Nutr Food Res 52 :S52_S61)、S-氨基甲酸胱氨酸(Proweller 等人，2006，Cancer Res 66 :7438-7444)、丁酸钠(Abramova 等人，2006，J Biol Chem281 21040-21051)、水杨酸钠(Lee 等人，2003，Int J Oncol 23 :503-508)、亚精胺(Guo 等人，2002，Am J Physiol Cell Physiol 283 :C722_734)、鞘氨醇(Olsson 等人，2004，Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol 287 :G929_937)、水溶性维生素 E (维生素 E 衍生物)(Quintanilla 等人,2005,上文)和葡萄糖(Lin 等人,2006, J Am Soc Nephrol 17 2812-2820)。然而，在许多情况下，还没有完全理解所报道的此类相互作用发生的机制，以及此类相互作用的影响。尽管可得到上面所总结的方法，但对于筛选可以延缓或逆转整个身体或者特定组织和器官的衰老过程、促进健康衰老和增加长寿的试剂更強大的、更快和更少花费的方法，仍存在需求。此外，尽管可得到上述方法和试剂，但对于可以延缓整个身体或者特定组织和器官(例如心脏)的衰老或者在不需要个体实质上改变其热量摄取的情况下模拟CR的作用的方法和组合物，仍存在需求。本发明满足了这些需求。发明概述因此，本发明的目的是提供与年轻受试者比较，在老年受试者的心脏细胞和组织中差异表达的ー个或ー个以上基因或者基因区段。本发明另外的目的是提供包含与年轻受试者比较，在老年受试者的心脏细胞和组织中差异表达的多个多核苷酸的组合。本发明的另一目的是提供两个或两个以上多核苷酸或多肽探针的组合物，所述组合物适合于检测与年轻受试者比较，在老年受试者的心脏细胞和组织中差异表达的基因的表达。本发明另外的目的是提供用于测量心脏细胞或组织的生物学衰老的方法。 本发明的另一目的是提供用于测量与年轻受试者或标准对照比较，测试物质对在老年受试者的心脏细胞和组织中差异表达的ー个或ー个以上基因的表达谱的影响的方法。本发明的另ー目的是提供用于在个体中延缓心脏衰老的方法。使用代表与年轻受试者比较，在老年受试者的心脏细胞和组织中差异表达的基因和基因区段的多核苷酸或多肽的新组合，实现了ー个或ー个以上这些另外的目的，其中所述基因通过下述内容而相关通过它们涉及心脏中的fct信号通路，通过相对于年轻心脏组织在年老组织中它们表达的降低，以及通过由CR或者白藜芦醇摄入而逆转所引起的此类年龄相关的降低。该多核苷酸用于产生组合物、探针、基于探针的装置、以及用于测定与年轻受试者或标准对照比较，在老年受试者的所选择组织中差异表达的多核苷酸的状态的方法，其对于实现以上定义的目的是有用的，例如，所述目的是在心脏中预测和诊断与衰老有关的疾病和用于在心脏中筛选物质以测定它们是否可能具有抗衰老作用。还将多核苷酸用于调节心脏中參与fct信号的基因和基因产物的表达或者活性，特别是β-联蛋白基因和β_联蛋白。也提供了包含试剂例如探针、使用探针的装置、和物质的组合的试剂盒，以及含有此类试剂盒的包装、用于操作信息的计算机程序和用于交流涉及差异表达基因的信息的通信介质和使用其的方法。本发明其他的和另外的目的、特性和优点对本领域技术人员而言是显而易见的。发明详述定义术语“衰老”指有机体、器官、组织或者其任一部分的生物学或生理学衰老。其包括有机体、器官、组织或者其任一部分中与年龄相关的疾病的发展。类似地，“心脏衰老”指心脏或者其任一部分的生物学或生理学衰老，包括心脏或者其任一部分中与年龄相关的疾病的发展。在本文中提及的心脏或者任一其他器官意图包括包含心脏或者其他器官的全部细胞和组织。术语“动物”指人类或其他动物，包括禽类、牛、犬、马、猫、hicrine、鼠类、绵羊和猪等动物。当将该术语用于比较测试受试者的情况时，比较的动物是相同物种的和可能的相同品种或种类的动物。本文中所用的术语“非人类动物”指除人类外的全部动物。“伴侣动物”是任ー驯养的动物，且包括但不限于，猫、狗、兔、豚鼠、雪貂、仓鼠、小鼠、沙鼠、马、牛、山羊、绵羊、驴、猪等。优选地，动物是人类或伴侣动物例如狗或猫。
术语“抗体”指任一与特异抗原结合的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE抗体。该术语包括多克隆抗体、单克隆抗体、单价抗体、人源化抗体、杂共轭对配合物(heteroconjugate)、具有多表位特异性的抗体组合物、嵌合抗体、双特异性抗体、双抗体、单链抗体和抗体片段例如Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv或者其他抗原结合片段。术语“阵列”指在基质上有序排列的至少两种探针。探针的至少ー个是对照或标准，并且探针的至少ー个是诊断性探针。在基质上从约2个至约40，000个探针的排列确保探针和样品多核苷酸或多肽之间形成的每ー标记复合物的大小和信号強度是分别可区别的。术语“结合复合物”指当样品中的多肽与结合配偶体特异结合(如本文中所定义)时形成的复合物，所述结合配偶体例如是抗体或其功能性片段。术语“卡路里限制”或“热量限制”(“CR” )指在没有营养不足的情况下的任一低热量饮食方案。一般而言，该限制是源自糖类、脂肪和蛋白质的总热量的限制。尽管没有限 制于此，但限制一般是相对于随意消耗的约25%至约40%的热量摄入。“饮食补充物”指除动物的正常饮食外拟被摄入的产物。饮食补充物可以是任一形式，例如固体、流体、凝胶、片剂、胶囊、粉末等。优选地，它们以方便的剂型提供。在ー些实施方案中，它们以散装消费包装例如散装粉末或液体提供。在其他实施方案中，补充物以可以包含到其他食物物品例如点心、加工处理物(treats)、补充棒(supplement bar)、饮料等中以散装量提供。如本文中所述，术语“有效量”指化合物、材料、组合物、药物或其他材料的量或者方案(例如饮食或锻炼方案)的条件的量，其对实现特别的生物结果是有效的，所述生物结果例如是在所选择的组织(例如心脏)中逆转或延缓衰老。术语“表达”(例如“基因表达”)指基因的转录以产生mRNA，WlmRNA的翻译以产生蛋白质。转录或翻译的速率的增加，以及转录或翻译的产物(例如mRNA或蛋白质)的产生的増加包括于术语“增加的基因表达”、“上调的基因表达”等中。类似地，转录或翻译的速率的減少，以及转录或翻译的产物(例如mRNA或蛋白质)的产生的減少包括于术语“减少的基因表达”、“下调的基因表达”等中。术语“基因表达的调节” “影响基因表达”等指增加或者減少基因表达。术语“差异表达”或者“差异地表达”指増加的或者上调的基因表达或者減少的或下调的基因表达，例如检测到样品中转录的信使RNA或者翻译的蛋白质的量不存在、存在或者至少I. 2倍改变。如本文中所用，“延长”施用通常指超过I个月的时间。涉及2、3或者4个月以上的时间。还考虑包括5、6、7、8、9或者10个月以上的更长时间。还包括11个月或者I年以上的时间。本文还涉及延续1、2、3年或者更多年的更长期使用。在某些动物的情况下，考虑应当将本发明方法鉴定的物质有规律地施用给该动物。如本文中所用，“定期(regularbasis) ”、“定期施用”和/或“定期摄入”指至少每周施用。考虑了更频繁的施用，例如每周两次或者三次。还包括了包含毎日施用至少一次、两次、三次或者更多次的方案。无论是否在本文中明确示例，认为任一剂量频率都是有用的。本领域技术人员应当理解，剂量频率是待施用物质的函数，并且ー些组合物可能需要更多或者更少的频率施用，以维持期望的生物化学、生理学或者基因表达影响，即包括食物摄入、饱腹感、脂类代谢和脂肪利用，以及与其相关的基因表达谱的ー种或多种影响。如本文中所用，术语“延长的定期”、“延长的定期施用”和/或“延长的定期摄入”指物质有规律地施用的延长。术语“食物”或“食物组合物”指意图由动物，包括人类消耗的，并为其提供营养的组合物。“为人类消耗配制的食物产品”是特别地意图由人类摄食的任ー组合物。“宠物食物”是意图由宠物，优选地由伴侣动物消耗的组合物。“完全的和营养均衡的宠物食物”是以合适的量和比例，例如基于伴侣动物营养领域中公认的权威机构的推荐，含有对食物的预期接受者或消费者所有已知的所需营养物的宠物食物。因此，在没有添加补充营养源的情况下，能将此类食物用作为饮食摄入的唯一来源以维持生命或促进生产。营养均衡的宠物食物组合物在本领域是广泛已知并广泛使用的。术语“片段”指(I)为完整序列的一部分的寡核苷酸或多核苷酸序列，并且对于特定的用途，其具有与完整多核苷酸序列相同的或类似的活性，或者(2 )为完整序列的一部分的肽或多肽序列，并且对于特定的用途，其具有与完整多肽序列相同的或类似的活性。此类片段可以包含认为适合于特定用途的任一数目的核苷酸或氨基酸。一般而言，寡核苷酸或多核苷酸片段含有来自完整序列至少约10、50、100、或1000个核苷酸，并且多肽片段含有至少约4、10、20或50个来自完整序列的连续氨基酸。该术语包括片段的多核苷酸变体和多肽变体。术语“基因”指參与产生多肽的全部或部分DNA区段，包括在编码区之前和之后的区域(前导区和非转录尾区)和在单个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。该术语包括与基因编码序列的互补区(complement)杂交的任一 DNA序列。术语“基因产物”指基因的转录产物，例如mRNA或其衍生物(例如，cDNA)或者基因转录物的翻译产物。术语“基因产物”一般指翻译产物，其是蛋白质。在本文中，术语“基因产物”可以与术语“蛋白质”或“多肽”互換使用。术语“同系物”指⑴多核苷酸，包括来自相同的或不同的动物物种的多核苷酸，与对照核苷酸具有大于30 %、50%、70%或90%的序列相似性，并且具有与对照多核苷酸相同的或基本上相同的特性，并执行与对照多核苷酸相同的或基本上相同的功能，或者具有在严格条件下与对照多核苷酸特异杂交的能力或(2)多肽，包括来自相同的或不同的动物物种的多肽，与对照多肽具有大于30%、50 %、70%或90%的序列相似性，并且具有与对照多肽相同的或基本上相同的特性，并执行与对照多肽相同的或基本上相同的功能或者具有与对照多肽特异结合的能力。当指全长编码序列的片段时，这些片段的功能可能仅仅是编码某序列多肽的选定部分或者是可以与编码该多肽的另一多核苷酸片段杂交的合适类似序列。当指多肽的片段吋，这些片段的功能可能仅仅是形成适合于产生抗体的表位。使用本领域技术人员已知的方法，例如Karlin和Altschul算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA87 =2264-2268(1990))可以确定两个多肽序列或两个多核苷酸序列的序列相似性。此类算法已经合并入 Altschul 等人的 NBLAST 和 XBLAST 程序中(J. Mol. Biol. 215 :403-410)。为了获得用于比较目的的空位比对，可以使用如在Altschul等(Nucl. Acids Res. 25 3389-3402(1997))中所述的 Gapped Blast。当使用 BLAST 和 Gapped BLAST 程序时，使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认參数。术语“杂交复合物”指当一个多核苷酸的嘌呤与互补的多核苷酸的嘧啶形成氢键，例如，5’ -A-G-T-C-3’与3’ -T-C-A-G-5’碱基配对时，在样品多核苷酸之间形成的复合物。互补的程度和核苷酸类似物的使用影响杂交反应的有效性和严格性。
术语“结合(in conjunction) ”指将药物、食物或其他物质(I)与组合物，特别地食物组合物一起施用给动物，或(2)使用相同或不同的施用途径在大约相同的时间或定期地分别以相同的或不同的频率施用给动物。“定期地”指对于特定物质，以可接受的剂量方案施用物质。“大约相同的时间”一般指在相同的时间或在彼此间隔约72小时内施用物质(食物或药物)。“结合”特别包括施用方案，其中将物质例如药物在规定的时期施用，并将本发明的组合物无限定地施用。术语“个体”当指动物时，指任一物种或种类的个体动物。该术语可以与术语“受
试者”互换使用。术语“多核苷酸”或“寡核苷酸”指核苷酸的聚合物。该术语包括DNA和RNA(包括cDNA和mRNA)分子，单链的或双链的，如果是单链的，其互补序列为线性或环状形式。该术 语也包括作为合适序列的片段、变体、同系物和等位基因，其具有与原始序列相同的或基本上相同的特性，并执行相同的或基本上相同的功能。特别地，该术语包括来自不同物种，例如小鼠和狗或猫的同系物。当比对时，该序列可以是完全互补的(没有错配)或者可以具有至多约30%的序列错配。优选地，对于多核苷酸，链含有约50至10，000个核苷酸，更优选地约150至3，500个核苷酸。优选地，对于寡核苷酸，链含有约2至100个核苷酸，更优选地约6至30个核苷酸。多核苷酸或寡核苷酸的确切大小取决于多种因素和特定的应用，以及多核苷酸或寡核苷酸的用途。该术语包括合成的和从天然源分离并纯化的核苷酸聚合物。术语“多核苷酸”包括“寡核苷酸”。术语“多肽”、“肽”或“蛋白质”指氨基酸的聚合物。该术语包括天然存在的和非天然存在的(合成的)聚合物和其中用人工化学模拟物取代了ー个或ー个以上氨基酸的聚合物。该术语也包括片段、变体和同系物，其具有与原始序列相同的或基本上相同的特性并执行相同的或基本上相同的功能。该术语包括任ー长度的聚合物，优选地含有约2至1000个氨基酸，更优选地约5至500个氨基酸的聚合物。该术语包括合成的和从天然源分离并纯化的氨基酸聚合物。术语“探针”指(I)寡核苷酸或多核苷酸，RNA或者DNA，不管是作为在纯化的限制酶消化中天然存在的还是合成产生的，其能与具有与探针互补的序列的多核苷酸退火或者特异杂交或者(2)化合物或物质，包括肽或多肽，其能特异地结合特定的蛋白质或蛋白质片段，而基本上排斥其他蛋白质或蛋白质片段。寡核苷酸或多核苷酸探针可以是单链的或者双链的。探针的确切长度取决于许多因素，包括温度、来源和用途。例如，对于诊断性应用，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸探针一般含有约10个至100个、15个至50个或者15个至25个核苷酸。在某些诊断性应用中，多核苷酸探针含有约100-1000、300-600个核苷酸，优选地约300个核苷酸。在本文中，选择与特定靶序列的不同链“基本上”互补的探针。这意味着在ー组预測定的条件下，该探针必须是足够互补的，以与它们的各自靶序列特异杂交或者退火。因此，探针序列不需要反映靶的确切互补序列。例如，非互补的核苷酸片段可以附着于探针的5’或3’端，而探针序列的剩下部分与靶序列互补。备选地，非互补碱基或更长的序列可以散布在探针中，条件是该探针序列具有与靶多核苷酸序列足够的互补性，以特异地与靶多核苷酸退火。肽或多肽探针可以是与蛋白质或肽特异结合的任一分子，包括DNA(对于DNA结合蛋白质)、抗体、细胞膜受体、肽、辅因子、凝集素、糖、多糖、细胞、细胞膜、细胞器和细胞器膜。
术语“样品”指含有例如，多核苷酸、多肽、抗体、代谢物等的任ー动物组织或流体，包括细胞和包含DNA和RNA的其他组织。实例包括脂肪、血液、软骨、结缔组织(connective)、上皮、淋巴、肌肉、神经、痰等。样品可以是固体的或流体的，并且可以是DNA、RNA、cDNA、体液例如血液或尿液、细胞、其细胞制备物或其可溶性组分或者培养基整分试样、染色体、细胞器等。术语“単独包装”指试剂盒的组分与ー个或ー个以上容器物理相关或包含在其内，并将其作为生产、分配、销售或使用的単位。容器包括但不限于，包、箱、瓶、热缩塑料包(shrink wrap packages)、主要的或另外固定的组分或者其组合。单独包装可以是物理相关的单独的食物组合物的容器，以将它们作为生产、分配、销售或使用的単位。术语“特异结合”指两个分子之间特异的 和精确的相互作用，其取决于它们的结构，特别是它们的分子侧基。例如，调节蛋白嵌入到DNA分子的大沟中、两单链核酸之间沿主链的氢键键合或者蛋白质的表位与激动剂、拮抗剂或抗体之间的结合。术语“特异地杂交”指具有足够互补序列的两单链多核苷酸之间的缔合，以在本领域一般使用的预测定条件下允许该杂交(有时也称为“基本上互补”)。例如，该术语可以指多核苷酸探针与包含在根据本发明的ー个方面的单链DNA或RNA分子内的基本上互补的序列杂交，以基本上排除多核苷酸探针与非互补序列的单链多核苷酸杂交。当适合于其使用的上下文时，术语“标准”或者“对照”指⑴与含有来自施用了测试物质的受试者的组织的样品比较，含有来自施用了对照或參考物质或者没有施用物质的受试者的组织的对照样品，例如，以测定测试物质是否会引起差异的基因表达。术语“严格条件”指(I)在具有O. I %牛血清白蛋白、O. I %菲可、O. I %聚こ烯吡咯烷酮的50% (体积/体积)甲酰胺、ρΗ6· 5，含有750mM NaCl、75mM柠檬酸钠的50mM磷酸钠缓冲液中，在42°C杂交，(2)在42°C，在50%甲酰胺、5XSSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0. I %焦磷酸钠、5XDenhardt杂交溶液、超声的鲑鱼精子DNA(50y g/ml)、0. 1% SDS 和 10%葡聚糖硫酸酯中杂交;在 42°C，在 O. 2XSSC和 O. 1% SDS中洗涤或者在50°C，用O. 015M NaCUO. 0015M柠檬酸钠、O. 1% Na2SO4洗涤或者应用类似的低离子强度和高温洗涤剂以及类似的变性剂进行类似的方法。术语“变体”指(I)含有来自多核苷酸序列的任何替换、变异、修饰、取代、缺失或添加ー个或ー个以上核苷酸的多核苷酸序列或对多核苷酸序列进行任何替换、变异、修饰、取代、缺失或添加ー个或ー个以上核苷酸的多核苷酸序列，并且其具有与原始序列相同的或基本上相同的特性，并执行相同的或基本上相同的功能和(2)含有来自多肽序列任何替换、变异、修饰、取代、缺失或添加ー个或ー个以上氨基酸的多肽序列或对多肽序列进行任ー替换、变异、修饰、取代、缺失或添加ー个或ー个以上氨基酸的多肽序列，并且其具有与原始序列相同的或基本上相同的特性，并执行相同的或基本上相同的功能。因此，该术语包括单核苷酸多态性(SNP)和等位变异，并包括多肽中保守或非保守氨基酸替换。根据需要，该术语也包括化学衍生化的多核苷酸或多肽，以及用天然不存在的核苷酸或氨基酸替换的核苷酸或氨基酸。术语“虚拟(virtual)包装”指试剂盒组分通过关于ー个或ー个以上物理或虚拟试剂盒组分的说明而联合在一起，其指导用户如何获取其他组分，例如，在ー个包装(bag)中含有一个组分和指导用户前往网址、联系记录的信息、查看可视信息或者联系医务工作者(caregiver)或指导者以获取如何使用试剂盒的说明的指导。术语“Wnt信号”、“Wnt通路”等指熟知的信号转导通路，其涉及參与胚胎发生，以及在成年动物中參与正常的生理过程的基因及其编码的蛋白质的复杂网络。在本文中，这些基因和蛋白质有时指“Wnt-相关的”基因或蛋白质，当将细胞暴露于胞外fct配体时，其产生或者调节fct信号分子的产生、其与靶细胞上的受体的相互作用，以及靶细胞的生理学应答。“年轻的” 一般指处于成年早期，即经过青春期或青年期的成熟的个体，如由物种或者由物种内的品系、品种或种群，根据已知的參数定义。如本文中所用，“年老的”或“老年的”指身体上或时间上在其平均预期寿命的最后30%内的个体，如由物种或者由物种内的品系、品种或种群，根据已知的參数确定。在本文中，出于简洁的目的使用范围，以避免不得不列举并描述范围内的每ー个 数值。根据需要，可以选择范围内的任ー合适的数值，作为范围的上限值、下限值或者界限。如在本文中所用，单词的単数形式包括其复数，并且反之亦然，除非另外清楚指明。因此，指代词“ー个”、“一”和“所述”(“a”、“an”和“the”)一般包括各个术语的复数。例如，提到“个体”、“动物”、“方法”或“疾病”时包括此类“受试者”、“动物”、“方法”或“疾病”的复数。类似地，应当将词语“包含”、“包括”和“含有”解释为是列举而非穷举。同样地，应当将术语“包括”、“包括的”和“或者”理解为是列举，除非上下文明确禁止此种解释。类似地，术语“实例”，特别是当后面有一系列术语时，其仅仅是示例性的和说明性的，并且不应当将其理解为排他的或者全部的。术语“包含”意图包括由术语“基本上由......组成”和“由......组成”所包括
的实施方案。类似地，术语“基本上由......组成”意图包括由术语“由......组成”所
包括的实施方案。此处公开的方法和组合物以及其他优势并不限于特定的方法、规程和试剂，因为，如本领域技术人员所理解的，他们是可以变化的。此外，本文中所用的术语仅用于描述特定的实施方案的目的，并且并不意图和并非限制公开的或要求保护的本发明的范围。除非另外定义，本文中所用的所有技术和科学术语，专业术语和縮写具有由本发明领域中或使用该术语的领域中普通技术人员通常理解的含义。尽管可以将与本文中所述的组合物、方法、生产的物品或其他手段或材料类似的或等同的那些任何组合物、方法、生产的物品或其他手段或材料用于本发明的实践，但在本文中描述了优选的组合物、方法、生产的物品或其他手段和材料。 本文中引用的或提及的所有专利、专利申请、出版物、技术和/或学术文章和其他參考文献在此处以受适用的法律允许的程度引用作为參考。这些參考文献的讨论仅g在总结其中所进行的推断。并未做出关于任一此类专利、专利申请、出版物或參考文献或其任何部分是相关的、重要的或现有技术的承诺。特别保留了质疑此类专利、专利申请、出版物和其他參考文献为相关的、重要的或现有技术的任一主张的准确性和适用性的权利。发明本文中所描述的本发明的许多方面源于发明人发现几种基因表达的年龄相关减少，所述几种基因是心脏中fct信号通路的正向决定因素(positive determinant)。在两种不同的动物物种中进行了该观察，表明在衰老的心脏中观察到的fct通路的下调并不是物种特异的。特别地，β_联蛋白(Wnt信号中的重要參与者)也是下调的。这些观察与Wnt信号随年龄増加的许多既往和最新发现相反。本发明人还发现，通常已知的延缓衰老过程的营养干预，例如热量限制和白藜芦醇补充，抑制了 Wnt通路基因表达的年龄相关減少，并使许多Wnt基因的表达增回至在来自年轻动物的心脏组织中所观察到的水平。根据上述发现，在本发明的许多方面中，通过测量或者调节參与Wnt信号通路的ー种或者多种基因的表达而监测或者操作fct信号通路，发明人发现所述ー种或者多种基因在衰老的心脏组织中下调。此类基因包括Dlghl、Magi3, AktU Dab2、RacU CtnnbUCamk2d、Mapkl、Senp2、Smad3、Mark2、Ccndl和Pias4。可以将形成这些基因的多核昔酸及其片段，以及它们所编码的蛋白质和片段，例如用于测量心脏细胞或组织的生物学年龄的诊断性或者预测性測定，或者用于筛选对延缓心脏衰老有效的测试化合物的測定，或者用于操作心脏中的Wnt信号以延缓心脏衰老。在本发明的某些实施方案中，測量了至少ー种差异表达基因的表达。在其他实施方案中，測量了两种或者两种以上差异表达基因的表达，提供了基因表达模式或者基因表 达谱。在本发明的多种实施方案中，可以以ー种或两种方式測量基因表达的改变(I)通过检测由特定的基因产生的mRNA来測量转录；和⑵通过检测由特定的转录物产生的蛋白质来测量翻译。使用本领域用于定量多核苷酸的任一熟知方法，例如，如PCR(包括但不限于，RT-PCR和qPCR)、RNA酶保护、Northern印迹法、微阵列、大阵列(macroarray)和其他杂交方法，在RNA水平测量减少的或增加的表达。根据本发明测定的或讨论的基因一般为mRNA或反转录mRNA的形式。基因可以是克隆的和/或扩增的。克隆本身似乎并不偏向基因在群体内的表现度。然而，优选地是将聚腺苷酸+RNA用作来源，因为它可以以更少的加工步骤使用。因此，本发明ー个方面的特征是包含与年轻受试者比较，在老年受试者的心脏组织中差异表达的多个多核苷酸或者其表达的蛋白质的组合，其中所述多核苷酸选自參与心脏组织中fct信号的两个或者两个以上基因或者其片段。在某些实施方案中，基因选自Dlghl、Magi3> Aktl> Dab2> Racl、Ctnnbl、Camk2d、Mapkl、Senp2、Smad3、Mark2> Ccndl 和Pias4。在其他实施方案中，基因选自 Dlghl、Magi3> Ctnnbl> Camk2d、Mapkl 和 Senp2。又在其他实施方案中，基因是Magi3、Ctnnbl和Camk2d。在某些实施方案中，差异表达通过CR或者通过白藜芦醇的摄入而逆转，所述白藜芦醇可以作为饮食方案的一部分，例如作为食物或者饲料的添加剂或者作为饮食补充物施用。在一个实施方案中，组合包含两个或两个以上的多核苷酸或者表达自该多核苷酸的蛋白质。优选地，该组合包含多个多核苷酸或者表达自多核苷酸的蛋白质，并且可以包含多达代表全部上述基因的全部多核苷酸或蛋白质或者其片段。当组合包含一种或者ー种以上的片段时，片段可以是保留原始多核苷酸或蛋白质的特性和功能的任一大小，优选地约30 %、60 %或者90 %的原始的特性和功能。多核苷酸和蛋白质可以来自任ー动物；例如包括人类或者伴侣动物，如狗和猫。通过标准信息库(standard information mining)和本领域技术人员熟知的分子方法，可以获得来自不同动物物种的多核苷酸和蛋白质的同系物。例如，可以将基因或蛋白质的名称或者功能的描述输入到几个公共可获得的数据库之一中，其会产生提供有关来自不同物种的该基因信息，包括序列信息的资源列表。此类数据库的ー种是“InformationHyperlinked over Proteins (iHOP) ” 数据库，其可以通过 url :ihop_net. org 在因特尔网上获得。备选地，可以使用已知基因或蛋白质的公共数据库检索号，以获得该基因或蛋白质的序列信息，并且使用序列比对搜索，捜索其他物种中的同系物或直向同源物。例如，ロぶ以在 National Institutes of Health’s National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)数据库中输入来自小鼠的基因或蛋白质的GenBank检索号，从而获得该小鼠基因的DNA或多肽序列。使用相同的数据库，在小鼠DNA或蛋白质序列、或者其足够定义基因或蛋白质的长度的片段上进行BLAST捜索，以鉴定来自其他物种，例如，猫的足够同源序列。然后，可以将来自其他目的物种的序列的检索号输入到数据库中，以获得涉及那些全长核苷酸或蛋白质序列的信息，以及其他描述性信息。
本发明另一方面的特征是包含用于检测与年轻受试者比较，在老年受试者的心脏组织中差异基因表达的探针的组合物，其中所述探针检测參与心脏组织中fct信号的两种或者两种以上基因或者基因产物。在某些实施方案中，基因选自Dlghl、Magi3、Aktl、Dab2、RacI、CtnnbI、Camk2d、Mapkl、Senp2、Smad3、Mark2、Ccndl 和 Pias4。在其他实施方案中，基因选自Dlghl、Magi3、Ctnnbl、Camk2d、Mapkl和Senp2。又在其他实施方案中，基因是Magi3、Ctnnbl和Camk2d。在某些实施方案中，差异表达通过CR或者通过白藜芦醇的摄入而逆转，所述白藜芦醇可以作为饮食方案的一部分施用，例如作为食物或者饲料的添加剂或者作为饮食补充物。探针可以包含与Wnt相关的基因或其片段特异杂交的多核苷酸或者寡核苷酸。备选地，它们可以包含多肽结合剂，其与由fct相关的基因或其片段的表达产生的多肽特异结合。在某些实施方案中，多肽结合剂是抗体，并且在特定的实施方案中，它们是单克隆抗体。在优选的实施方案中，探针与人类、犬或者猫的多核苷酸或者多肽特异杂交或者结合。通常，视特定物种和用途而定，组合物包含用于检测多核苷酸或蛋白质，或者其片段的多个探针，一般约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或更多的探针。本领域技术人员应当理解，可以使用针对单ー靶基因或蛋白质的多个不同探针，以完善使用该探针的測定的敏感性和准确性。例如，可以使用与靶多核苷酸上不同的序列特异杂交的几个寡核苷酸探针。同样地，可以使用对靶蛋白上不同的表位免疫学上特异的几个抗体。使用在本文中所列的任一基因的序列信息，可以制备针对来自任一物种，优选地人类、狗或猫的所讨论样品的ー个或ー个以上寡核苷酸或多核苷酸探针。该探针应当具有足够的长度，以基本上专门地与合适的互补基因或转录物特异杂交。在某些实施方案中，寡聚核苷酸探针为至少约10个、12个、14个、16个、18个、20个或25个长度的核苷酸。在一些实施方案中，期望的是至少约30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个核苷酸的更长探针，和在一些实施方案中，合适的是长于约100个核苷酸的探针。探针可以包含编码功能蛋白质的全长序列。使用本领域技术人员已知的方法，例如，从核苷酸体外合成、从天然源分离和纯化或者酶促地切割本发明的多核苷酸，可以制备或获得核酸探针。可以通过本领域已知的多种方法检测杂交复合物，其包含与包含Wnt相关的基因的多核苷酸杂交的核酸探针。在本发明的某些实施方案中，可以将固定化的核酸探针用于多核苷酸和它们的表达模式的快速和特异检测。一般地，核酸探针与固相支持体连接，并且靶多核苷酸(例如，基因、转录产物、扩增子或最常见地扩增混合物)与探针杂交。一般用荧光团或其他标记，例如链霉抗生物素，标记探针或靶或者二者。在标记靶的情况下，可以通过检测结合的荧光检测杂交。在标记探针的情况下，一般通过淬灭标记来检测杂交。在探针和靶二者都标记的情况下，一般通过监测由两个结合标记的接近产生的顔色转变(colorshift)来进行杂交的检测。多种标记策略、标记物等，特别地对于基于荧光的应用都是本领域已知的。在另ー实施方案中，探针包含多肽结合剂，其与由本文中所列的ー个或ー个以上基因或其片段的表达产生的多肽或其片段特异地结合。可以使用可得到的在本文中所鉴定的任一 Wnt相关蛋白质的序列信息制备此类蛋白质结合探针。可以用于测定样品中蛋白质的水平的測定技术也是本领域技术人员熟知的。此类測定技术包括免疫放射測定法、竞争结合測定法、蛋白印迹分析和ELISA測定法。在使用抗体的測定方法中，多克隆抗体和单克隆抗体二者都适用于在本发明中使用。正如本领域技 术人员正常理解，此类抗体可以是对特定的蛋白质、或蛋白质的表位、或蛋白质片段免疫学上特异的。制备对蛋白质或多肽免疫学上特异的多克隆抗体和单克隆抗体的方法也是本领域熟知的。本发明优选的实施方案可以使用用于检测和定量由本文所述基因的表达产生的蛋白质的抗体。尽管可以通过免疫沉淀、亲和分离、蛋白质印迹分析等检测蛋白质，但是优选的方法是使用ELISA型方法，其中将抗体固定在固相支持体上，并将靶蛋白质或多肽暴露于固定化的抗体。探针或靶，或者二者都可以标记。多种标记策略、标记物等都是本领域已知的。在一个实施方案中，可以使用寡核苷酸或多核苷酸探针的阵列，而另ー实施方案可以使用与差异表达的基因产物特异结合的抗体或其他蛋白质的阵列。可以根据已知的方法，例如，如在固相支持体上原位合成或通过微印刷(micro-printing)技术将预合成的探针连接到固相支持体，定制此类阵列。在优选的实施方案中，定制核酸或蛋白质结合探针的阵列以特异地检测由本文所述的两个或两个以上差异表达的基因或基因片段产生的转录物或蛋白质。本发明还提供涉及监测基因表达的改变的測定方法。根据这些方面的ー个方面，提供了測量心脏细胞或组织的相对生物学年龄的方法。该方法包括步骤(a)通过测量在心脏细胞或组织中与fct信号相关的ー个或ー个以上基因的转录或者翻译产物，測定测试基因表达谱；(b)将测试基因表达谱与来自己知生物学年龄的等价心脏细胞或组织的对照基因表达谱比较；和(C)根据比较測定心脏细胞或组织的相对生物学年龄。在某些实施方案中，Wnt相关的基因是 Dlghl、Magi3> Aktl> Dab2> Racl、Ctnnbl、Camk2d、Mapkl> Senp2、Smad3、Mark2、Ccndl 或 Pias4。其他实施方案使用 Dlghl、Magi3>CtnnbU Camk2d、Mapkl 或 Senp2。另外的实施方案使用 Magi3、Ctnnbl 或 Camk2d。在特定的实施方案中，測量编码联蛋白的基因，例如Ctnnbl的表达。如在下部分中更详细地描述，在某些实施方案中，在培养的细胞群体上进行该方法。更一般地，在来自动物的细胞或组织上进行该方法。在优选的实施方案中，通过检测来自人类或伴侣动物(最典型地为狗或猫)的fct相关基因的差异表达，将该方法用于测量生物学心脏年龄。在特定的实施方案中，将探针与基底结合，优选地在阵列中。在一些实施方案中，相对同时进行待测基因表达谱与对照谱之间的比较，(即，来自老年和年轻受试者的心脏细胞或者组织)。然而，在另ー实施方案中，用于比较的对照是基于使用该方法以前获得的数据。在该实施方案中，将探针暴露于样品以形成杂交或结合复合物，检测所述杂交或结合复合物，并与标准的那些杂交或结合复合物比较，其可以包含用己知生物学年龄的心脏细胞或者组织之前收集的与fct基因表达水平相关的信息。来自样品和标准的杂交或结合复合物之间的差异表明多核苷酸的差异表达，和因此在老年受试者对比标准的组织中差异表达的基因，所述标准可以包含之前从年轻受试者或另ー类型的对照受试者中分离的mRNA。可以将如上所述的那些方法用于实施、促进或指导抗衰老方案，例如热量限制和/或营养方案或者锻炼方案。此类方法包括获取来自接受了该方案的受试者的心脏组 织样品。然后，使用基因或蛋白质阵列或者本文所述的其他检测方法，分析该组织样品ー个或者ー个以上Wnt相关基因的受调节的表达。分析的结果将显示在个体中，该治疗或者方案在延缓心脏衰老中是否有效。本发明的另ー方面提供了用于筛选具有延缓心脏衰老能力的试剂或者方案。该方法包括步骤(a)在不存在试剂或方案的情况下，在来自老年受试者的心脏组织中，通过测量ー个或ー个以上与fct信号相关的基因的转录或翻译产物測定第一基因表达谱；(b)在存在试剂或方案的情况下，在来自老年受试者的心脏组织中，通过测量ー个或ー个以上与fct信号相关的基因的转录或翻译产物測定第二基因表达谱；和(C)将第一基因表达谱与第二基因表达谱比较，其中第二基因表达谱的改变表明试剂或者方案，当施用给个体时，可以用于延缓心脏衰老。这种类型的方法还可以包括将至少第二基因表达谱与对照基因表达谱比较，所述对照基因表达谱通过测量来自年轻受试者的心脏组织或者来自存在对照物质或方案的老年受试者的心脏组织中ー个或ー个以上与fct信号相关的转录或翻译产物而获得，所述对照物质或方案当施用给个体时，已知延缓心脏衰老。此类方案或者物质包括，例如，CR或者白藜芦醇的摄入。类似于以前的方法，待测基因表达谱与对照谱之间的比较是相对同时的，即同时測定来自老年和年轻受试者的心脏细胞和组织。然而，备选地，用于比较的对照可以基于使用该方法以前获得的数据。在该实施方案中，将探针暴露于样品以形成杂交或结合复合物，检测所述杂交或结合复合物，并与标准的那些杂交或结合复合物比较，所述标准的那些杂交或结合复合物可以包含用己知生物学年龄的心脏细胞或者组织之前收集的与Wnt基因表达水平相关的信息，或者接受了对照方案或治疗(例如，CR或者白藜芦醇的摄入)的心脏细胞或者组织之前收集的与fct基因表达水平相关的信息，所述对照方案或治疗如由fct相关的基因表达所测量的已知对心脏衰老具有作用。在某些实施方案中，Wnt相关的基因是 Dlghl、Magi3> Aktl> Dab2> Racl、Ctnnbl、Camk2d、Mapkl> Senp2、Smad3、Mark2、Ccndl 或 Pias4。其他实施方案使用 Dlghl、Magi3>CtnnbK Camk2d、Mapkl 或 Senp2。又其他实施方案使用 Magi3、Ctnnbl 或 Camk2d。在特定的实施方案中，測量编码联蛋白的基因，例如Ctnnbl的表达。在一个实施方案中，在培养的细胞群体上进行该方法。将包含根据本发明的fct相关基因的核酸构建体引入到培养的宿主细胞中。如本领域已知，宿主细胞可以哺乳动物细胞系，优选地是心脏来源或者谱系的，或者已知分化成心脏细胞的祖细胞系。将基因的编码序列与适合于使用的特定宿主细胞的合适调节表达元件有效连接。根据本领域的任一可接受的方法，包括但不限于，转染、转化、磷酸钙沉淀、电穿孔和脂转染，可以将核酸构建体引入到宿主细胞中。此类技术是本领域熟知且常规的。基因表达测定可以使用包含与报告基因有效连接的所选择衰老相关基因的启动子的基因构建体来实施。可以将报告子构建体引入到合适的培养细胞中，包括但不限于，上述的标准宿主细胞系或者新近分离自受试者的细胞，例如脂肪或肌肉细胞。通过在存在或不存在测试化合物的情况下监测报告基因的表达来进行測定。在另ー实施方案中，在动物上进行该方法。一般地，将测试化合物或者测试方案(饮食、锻炼等)施用给受试者，并分析在受试者的所选择心脏组织中的基因表达谱，以测 定测试化合物对fct相关基因或基因产物的转录或翻译的影响。可以原位或离体外分析基因表达，以测定测试化合物的作用。在另ー实施方案中，将测试化合物或方案施用给受试者，井根据本领域合适的任一方法，原位或离体外分析表达自基因的蛋白质的活性，以测定测试化合物对目的蛋白质的活性的影响。此外，在将测试化合物施用给受试者的情况下，也可以评价化合物的生理性、全身性和物理性作用，以及化合物的可能毒性。测试物质可以是任一物质和物质的组合，所述物质和物质的组合如通过如上所列fct相关基因的表达的改变或者逆转的年龄相关改变所測定的可能对心脏衰老具有影响。合适的测试物质包括但不限于，氨基酸；蛋白质、肽、多肽、核酸、寡核苷酸、多核苷酸、小分子、大分子、维生素、矿物质、单糖；复合糖；多糖；碳水化合物；中链三酰甘油(MCT);三酰甘油(TAG)、n-3 ( Ω -3)脂肪酸包括DHA, EPA、ALA ;n_6 ( Ω -6)脂肪酸包括LA、Y -亚麻酸(GLA)和ARA ;SA、缀合的亚油酸(CLA);胆碱源例如卵磷脂；脂溶性维生素包括维生素A和其前体例如类胡萝卜素(例如，(β_胡萝卜素))、维生素D源例如维生素D2(麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙化醇)、维生素E源例如生育酚(例如，α-生育酚)和生育三烯酚，以及维生素E衍生物，例如水溶性维生素(trolox)、和维生素K源例如维生素Kl (叶绿醌)和维生素K2(甲萘醌)；水溶性维生素包括B族维生素例如核黄素、尼克酸(包括烟酰胺和烟酸)、吡哆素、泛酸、叶酸、生物素和钴胺素；和维生素C(抗坏血酸)；抗氧化剂，包括上面列出的一些维生素、特别地维生素E和C ;并且生物类黄酮例如芹菜苷配基、儿茶素、ニ氢黄酮、染料木素、柚苷配基、五羟黄酮和茶黄素；醌例如泛醌；类胡萝卜素例如番茄红素和番茄黄素；和α-硫辛酸山-肉碱；D_苧烯；葡糖胺；S_腺苷甲硫氨酸；脱こ酰壳多糖；藻酸盐；钙；透明质酸；镁；油酸单甘油酰磷脂酸；一氧化氮(例如，作为硝酸甘油)；s-氨基甲酰半胱氨酸(氨基酸类似物)；丁酸钠；水杨酸钠；亚精胺；鞘氨醇和葡萄糖。在优选的实施方案中，测试物质是营养物，其可以添加到食物中或者作为补充物消耗。本发明还提供了通过前述方法鉴定为当施用给个体时可以延缓心脏衰老的物质或方案。鉴于所鉴定的种类，此类物质可以在心脏中增加fct信号，或者可以在心脏中增加參与fct信号的ー种或ー种以上基因或者基因产物的表达或者活性，或者可以在心脏中至少部分逆转fct相关基因表达或者基因产物活性的年龄相关降低。本发明的另一方面提供了用于测量心脏细胞或组织的生物学年龄的试剂盒。该试剂盒以在単独包装中的単独容器或者以虚拟包装中的単独容器中包含(I)适合于在心脏细胞或组织中測量与fct信号相关的ー个或ー个以上基因的表达的试剂，和(2)如何使用心脏细胞或组织中与fct信号相关的基因的表达的测量值来确定心脏细胞或组织的生物学年龄的说明。在某些实施方案中，该试剂盒包含适合于測量两个或两个以上fct相关基因的试剂。在某些实施方案中，Wnt相关基因是Dlghl、Magi3, AktU Dab2、Racl、Ctnnbl、Camk2d、Mapkl、Senp2、Smad3、Mark2、Ccndl 或 Pias4。其他实施方案使用 Dlghl、Magi3>CtnnbU Camk2d、Mapkl 或 Senp2。另外的实施方案使用 Magi3、Ctnnbl 或 Camk2d。在特定的实施方案中，測量编码联蛋白的基因的表达，例如Ctnnbl。在另ー特定的实施方案中，测量样品中β_联蛋白的量或者活性。在特定的实施方案中，试剂的至少一部分是探针，其包含(a)与基因表达的转录产物或其片段特异杂交或者扩增基因表达的转录产物或其片段的多核苷酸；或(b)多肽结合剤，其与基因表达的翻译产物或其片段特异结合。在一个实施方案中，多肽结合剂是抗体，其可以是多克隆和/或单克隆抗体。在一些实施方案中，探针与基底(substrate)结合，并可以排列在阵列中的基底上。试剂盒还可以包含将基因的表达水平与心脏衰老关联的对照。此种对照可以包含 下述的ー种或ー种以上(I) ー种或ー种以上己知生物学年龄的心脏细胞或组织，或者(2)显示在ー种或ー种以上己知生物学年龄的心脏细胞或组织中每一基因的期望表达水平的信息。该试剂盒还可以包含对照物质，例如白藜芦醇，发明人已经显示，所述白藜芦醇的摄入逆转了心脏衰老对Wnt基因表达的影响。在任一前述类型的试剂盒中，当试剂盒包含虚拟包装时，该试剂盒受限干与ー个或ー个以上物理试剂盒组分组合的在虚拟环境中的说明。在一个实施方案中，试剂盒含有探针和/或其他物理组分，并且用于使用探针和其他组分的说明可以通过国际互联网得至IJ。试剂盒可以含有其他物品例如用于混合样品、探针，和试剂的装置，以及用于使用该试剂盒的装置，例如试管或混合器具。根据另一方面，本发明的特征是包装，其包含适合于在心脏细胞或组织中測量一个或ー个以上与fct信号相关的基因的基因表达的试剂；该包装还包含贴在包装上的标签，该标签含有单词、图片、设计、縮写、标语、短语或者其他图案(device)或者它们的组合，其显示包装的内含物含有用于测定心脏细胞或组织的生物学年龄的试剂。本发明的另一方面提供了计算机系统，其包括含有识别心脏细胞或组织中与Wnt信号有关的ー个或ー个以上基因的表达水平的信息的数据库，以及使得用户能访问或者操作数据库中的信息的用户界面，与年轻动物比较，所述与Wnt信号有关的ー个或ー个以上基因的表达水平在年老的心脏中是降低的。该数据库可以含有识别ー个或ー个以上參与fct信号的基因的表达水平的信息以及与数据库交流的用户界面，所述基因例如Dlghl、Magi3> Aktl> Dab2> Racl、Ctnnbl、Camk2d、Mapkl、Senp2、Smad3、Mark2、Ccndl 或 Pias4,所述交流特别是输入、操作和查看不同动物或动物种类的信息。在一个实施方案中，数据库进一歩含有鉴定由Wnt相关基因编码的ー个或ー个以上多肽的活性水平的信息。在另ー实施方案中，数据库进一歩包含ー个或ー个以上Wnt相关基因及其编码的蛋白质的序列信息，优选地来自多种物种。在其他实施方案中，数据库含有涉及基因在一种或多种动物物种中的说明的其他信息。计算机系统是能包含并操作数据且能与用户交流的任ー电子装置，例如，典型的计算机或者设计的有助于使用本发明和输出与动物的状态有关的结果的分析仪器。本发明的此外另一方面的特征在于用于交流下述ー种或ー种以上用途的信息或者说明的介质(I)心脏细胞或组织中与fct信号相关的基因，所述与Wnt信号相关的基因在衰老的心脏中与年轻动物比较是降低的，(2)通过在个体的心脏中增加Wnt信号和/或増加β_联蛋白的量或活性，在个体中延缓心脏衰老，(3)通过在个体的心脏中施用増加fct信号和/或増加β_联蛋白的量或活性的试剂或方案，在个体中延缓心脏衰老，(4)通过在心脏中调节与fct信号相关的基因的表达，筛选测试化合物或方案延缓心脏衰老的能力，(5)通过测量心脏细胞和组织中与Wnt信号相关的基因的表达，測定心脏细胞和组织的生物学年龄，和(6)用于测量与年轻动物比较，在年老的心脏细胞或组织中与Wnt信号相关的基因的差异表达的试剂盒和试剂；其中所述介质包含ー个或ー个以上的含有信息或说明的物理或电子文件、数字存储介质、光学存储介质、声学报告、视听展示或者可视显示。介质可以选自本领域已知的多种介质或者此类介质的任何组合，包括但不限于显示的网址、可视显示kiosk、小册子、产品标签、包装说明书、广告、散发材料、公告栏、 录音带、录影带、DVD、⑶-ROM、计算机可读芯片、计算机可读卡、计算机可读盘、USB装置、FireWire装置、和/或计算机存储器。在另一方面，本发明提供了在个体中延缓心脏年老的方法，其集中于增加个体心脏中的Wnt信号。个体可以是年老的或者易于摧患或者摧患引起心脏衰老的疾病或病症的任一物种或种类的动物，包括任何年龄、物种、健康条件等的动物。优选地，动物是人类或伴侣动物，例如狗或猫。在一个实施方案中，动物是易于摧患或者摧患心脏的多种细胞和组织衰老的年老动物。在另ー实施方案中，动物是易于罹患或者罹患胁迫或者老化心脏的疾病或病症，或者与老年个体相关并对身体其他部分造成有害作用的心脏疾病或病症的动物。无论何种情况，将本发明方法应用于延缓心脏衰老对个体的心脏具有有益的影响，并从而对整个个体具有有益的影响。此类疾病和病症包括但不限于癌症、AIDS、充血性心脏病、慢性阻塞性肺病、肾衰竭、重度烧伤、心脏病发作(局部缺血)、冠状动脉病、动脉硬化、手木，例如血管成形术或心脏搭桥术(heart bypass)、瓣膜性心脏病、肥厚型心肌病等。如果个体表现出ー种或ー种以上有关心脏疾病、血管疾病等的危险因子，那么认为个体可能“易子”罹患心脏衰老或者易于发展成与心脏衰老相关的疾病或病症。此类危险因子是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于超重、缺乏体力活动(physical inactivity)、高血压、高胆固醇和/或甘油三酷、心绞痛、糖尿病、吸烟、遗传、性别为男性、压カ和过量的酒精摄取。用于在个体中延缓心脏衰老的一般方法包括步骤(a)鉴定需要延缓心脏衰老的个体；和(b)调节影响个体的心脏中fct信号的至少ー个基因的表达，其中所述调节导致心脏中的fct信号的増加，从而在个体中延缓心脏衰老。在某些实施方案中，Wnt相关基因是 Dlghl、Magi3、Aktl、Dab2、Racl、Ctnnbl、Camk2d、Mapkl、Senp2、Smad3、Mark2、Ccndl 或Pias4。其他实施方案集中于Dlghl、Magi3、Ctnnbl、Camk2d、Mapkl或Senp2的调节。另外的实施方案使用Magi3、Ctnnbl或Camk2d。在特定的实施方案中，调节编码联蛋白的基因的表达，例如Ctnnbl。在另ー特定的实施方案中，调节个体中β_联蛋白的量或者活性。在一个实施方案中,调节包括增加ー个或ー个以上基因的表达。在另ー实施方案中，増加的fct信号与个体的心脏中β -联蛋白的量或者活性的増加相关。
另ー实施方案包括给个体施用有效量的ー种或ー种以上试剂，或者对个体进行ー种或ー种以上増加心脏中fct信号或者至少部分逆转心脏中Wnt信号的年龄相关減少的方案，从而在个体中延缓心脏衰老。该试剂可以在个体的心脏中通过模拟β_联蛋白的活性而发挥作用。在某些实施方案中，通过在个体的心脏中增加Wnt信号或者通过在心脏中至少部分逆转Wnt信号的年龄相关減少，将包括CR或者白藜芦醇的摄入的方案用于延缓心脏衰老。可以将此类方案与其他方案或试剂，例如通过本文中所述的方法鉴定的那些方案或试剂组合。优选的实施方案包括定期，优选地延长的定期给个体ロ服施用增加心脏中Wnt信号的物质，从而延缓心脏衰老。通常将物质定期施用至少两周，更优选地至少4周或者更长。可以无限地持续施用物质，例如，1、2、3、6或9个月或者I年或一年以上或者甚至个体的一生。通常，物质的施用至少每日一次，但剂量方案取决于物质的性质和效力。因此，可以 较频繁地施用，例如，每日两次或者三次，或者较小频率地施用，例如每周3次、每周两次、每周一次、每月两次或者毎月一次。在某些实施方案中，物质的延长的定期ロ服施用造成了 Dlghl、Magi3、Aktl、Dab2、RacI > CtnnbI > Camk2d>MapkI > Senp2、Smad3、Mark2、Ccndl 或 Pias4 的一个或一个以上的表达的改变或者与年龄相关的表达改变的逆转。其他实施方案集中于Dlghl、Magi3、Ctnnbl、Camk2d、Mapkl或Senp2的调节。另外的实施方案使用Magi3、Ctnnbl或Camk2d。在特定的实施方案中，通过延长的定期ロ服施用该物质，调节编码β -联蛋白的基因的表达，例如Ctnnbl0在另ー特定的实施方案中，调节个体中β_联蛋白的量或者活性。白藜芦醇是ー类物质的实例，当以延长的定期ロ服施用给受试者时，逆转了心脏中fct相关基因表达的年龄相关改变。在一个实施方案中，调节包括增加ー个或ー个以上基因的表达。在另ー实施方案中，増加的fct信号与个体心脏中β -联蛋白的量或活性的増加相关。当用作为一般饮食需求的补充剂时，可以将该物质直接施用给动物。可以备选地将该物质与日常饲料或者食物接触或者与之混合，或者作为饮食补充剂而添加，所述日常饲料或者食物包括流体，如饮用水。当与日常饲料或食物一起应用或者掺入到日常饲料或食物中应用时，施用是本领域技术人员熟知的。施用可以作为动物的饮食方案的一部分实施。例如，饮食方案可以包括以有效延缓心脏衰老的量使动物定期摄入该物质。在另ー实施方案中，将该物质连同一种或ー种以上的药物、营养制品或者营养剂施用给动物，用于延缓心脏衰老或者用于一般地増加寿命。在某些实施方案中，根据该方法施用的物质的每日或者定期剂量为每千克体重约O. OOlg至每千克体重IOgo更具体地，剂量超过每千克体重O. 01,0. 02,0. 03,0. 04,0. 05、O. 06,0. 07,0. 08,0. 09或O. Igo在其他实施方案中，取决于物质和剂量频率，剂量可以是每千克体重O. 2、O. 5、I、3、5、7或IOg或更多。本领域技术人员熟悉针对受试者的剂量以及给药方案的开发。
实施例本发明可以通过以下实施例进ー步说明，应当理解，除非另外特定指明，这些实施例仅提供为说明的目的，并不意图限制本发明的范围。
实施例I材料和方法从NCBI的Gene Expression Omnibus (GEO)选择了两个公开的卩齿齿类动物心脏年老基因表达数据集(I)华盛顿大学的大鼠研究(UW) (Linford几等人(2007)i'ranscriptional Response to Aging and Calorie Restriction in Heart and AdiposeTissue。Aging Cell 6 :673-688)(研究 I);和(2) LifeGen 的小鼠研究(Barger JL 等人(2008)A Low Dose of Dietary Resveratrol partially Mimics Calorie Restrictionand Retards Aging Parameters in Mice。PLoS ONE 3(6) :1-10)(研究 2)。两个研究的材料和方法显示于參考文献中。第三个数据集来自未公开的小鼠心脏衰老研究。在该研究中，将小鼠分成两组(η = 7),并根据Barger研究中的方法 喂饲对照饮食。在5月龄(年轻组)和25月龄(老年组)时处死小鼠。收集心脏组织并进行微阵列基因表达测定(研究3)。在研究2和研究3中，使用Affymetrix小鼠基因组4302. O基因芯片。在研究I中，使用Affymetrix大鼠基因组2302. O基因芯片。表I中概述了三个研究的说明。表I
权利要求
1.包含多个多核苷酸或者其片段的组合，所述多个多核苷酸与年轻受试者比较，在老年受试者的心脏组织中是差异表达的，其中所述多核苷酸选自參与心脏组织中fct信号的两个或两个以上基因。
2.权利要求I的组合，其中所述基因是DlghUMagi3> Aktl> Dab2> RacU CtnnbUCamk2d、Mapkl、Senp2、Smad3、Mark2、Ccndl 和 Pias4。
3.权利要求2的组合,其中所述基因是Dlghl、Magi3、Ctnnbl、Camk2d、Mapkl和Senp2。
4.权利要求3的组合,其中所述基因是Magi3、Ctnnbl和Camk2d。
5.权利要求I的组合，其中所述差异表达通过热量限制(CR)或者通过白藜芦醇的摄入而逆转。
6.组合物，其包含用于检测与年轻受试者比较，在老年受试者的心脏组织中差异基因表达的探针，并且所述探针检测心脏组织中參与fct信号的两个或两个以上基因或者基因产物。
7.权利要求6的组合物，其中所述基因是Dlghl、Magi3,AktU Dab2、RacU CtnnbUCamk2d、Mapkl、Senp2、Smad3、Mark2> Ccndl 或 Pias4。
8.权利要求7的组合物，其中所述基因是Dlghl、Magi3>Ctnnbl、Camk2d、Mapkl或Senp2。
9.权利要求8的组合物,其中所述基因是Magi3、Ctnnbl或Camk2d。
10.权利要求6的组合物，其中所述差异表达通过CR或者通过白藜芦醇的摄入而逆转。
11.权利要求6的组合物，其中所述探针包含 a)与基因表达的转录产物特异杂交或者扩增基因表达的转录产物的多核苷酸，或其片段；或 b)与基因表达的翻译产物特异结合的多肽结合剤，或其片段。
12.权利要求11的组合物，其中所述多肽结合剂是抗体。
13.权利要求6的组合物，其中所述探针与基底是结合的。
14.权利要求13的组合物，其中所述探针在阵列中。
15.用于筛选能延缓心脏衰老的试剂或方案的方法，包括步骤 a)在不存在试剂或方案的情况下，在来自老年受试者的心脏组织中，通过测量ー个或ー个以上与Wnt信号相关的基因的转录或翻译产物而测定第一基因表达谱； b)在存在试剂或方案的情况下，在来自老年受试者的心脏组织中，通过测量一个或ー个以上与Wnt信号相关的基因的转录或翻译产物而测定第二基因表达谱；和 c)将所述第一基因表达谱与所述第二基因表达谱比较，其中第二基因表达谱的改变表明试剂或者方案，当施用给个体时，可以用于延缓心脏年老。
16.权利要求15的方法，进ー步包括将至少所述第二基因表达谱与对照基因表达谱比较，所述对照基因表达谱通过测量来自年轻受试者的心脏组织中或者来自存在对照物质或方案的老年受试者的心脏组织中ー个或ー个以上与fct信号相关基因的转录或翻译产物而获得，所述对照物质或方案已知当施用给个体时，延缓心脏衰老。
17.权利要求16的方法，其中所述对照物质或方案包含CR或白藜芦醇的摄入。
18.权利要求15的方法，其中所述基因是Dlghl、Magi3,AktU Dab2、RacU CtnnbUCamk2d、Mapkl、Senp2、Smad3、Mark2、Ccndl 或 Pias4。
19.权利要求18的方法，其中所述基因是Dlghl、Magi3>CtnnbI、Camk2d、Mapkl或Senp2。
20.权利要求19的方法，其中所述基因是Magi3、Ctnnbl或Camk2d。
21.权利要求20的方法，其中所述基因是Ctnnbl。
22.权利要求15的方法，其中所述测定在培养的细胞群体上进行。
23.权利要求15的方法，其中所述测定在来自动物的细胞或组织上进行。
24.权利要求15的方法，其中所述心脏组织中与Wnt信号相关的基因的转录或翻译产物的測量用探针完成，并且所述探针包含 a)与转录产物特异杂交或者扩增转录产物的多核苷酸，或其片段；或 b)与翻译产物特异结合的多肽结合剂，或其片段。
25.权利要求24的方法，其中所述多肽结合剂是抗体。
26.物质或方案，其通过权利要求15的方法鉴定为当施用给受试者时可以延缓心脏衰老。
27.用于测量心脏细胞或组织的相对生物学年龄的方法，包括步骤 a)通过在心脏细胞或组织中測量与fct信号相关的ー个或ー个以上基因的转录或者翻译产物，測定测试基因表达谱； b)将测试基因表达谱与来自己知生物学年龄的等价心脏细胞或组织的对照基因表达谱比较；和 c)根据所述比较测定心脏细胞或组织的相对生物学年龄。
28.权利要求27的方法，其中所述基因是Dlghl、Magi3,AktU Dab2、RacU CtnnbUCamk2d、Mapkl、Senp2、Smad3、Mark2、Ccndl 或 Pias4。
29.权利要求28的方法，其中所述基因是Dlghl、Magi3,CtnnbU Camk2d、Mapkl或Senp2。
30.权利要求29的方法，其中所述基因是Magi3、Ctnnbl或Camk2d。
31.权利要求30的方法，其中所述基因是Ctnnbl。
32.权利要求27的方法，其中所述测定在培养的细胞群体上进行。
33.权利要求27的方法，其中所述测定在来自动物的细胞或组织上进行。
34.权利要求27的方法，其中所述心脏组织中与Wnt信号相关的基因的转录或翻译产物的測量用探针完成，并且所述探针包含 a)与转录产物特异杂交或者扩增转录产物的多核苷酸，或其片段；或 b)与翻译产物特异结合的多肽结合剂，或其片段。
35.权利要求34的方法，其中所述多肽结合剂是抗体。
36.用于测量心脏细胞或组织的生物学年龄的试剂盒，包含(I)适合于測量心脏细胞或组织中与fct信号相关的两个或两个以上基因的表达的试剂，和(2)怎样使用心脏细胞或组织中与fct信号相关的基因的表达的所述测量来測定心脏细胞或组织的生物学年龄的说明。
37.权利要求36的试剂盒，进一歩包含将基因的表达水平与心脏年老关联的对照。
38.权利要求37的试剂盒，其中所述对照包含下述的ー种或ー种以上(I)ー种或ー种以上己知生物学年龄的心脏细胞或组织，或者(2)显示在ー种或ー种以上己知生物学年龄的心脏细胞或组织中每一基因的预期表达水平的信息。
39.权利要求36的试剂盒，其中所述基因是Dlghl、Magi3、Aktl、Dab2、Racl、Ctnnbl、Camk2d、Mapkl、Senp2、Smad3、Mark2、Ccndl 或 Pias4。
40.权利要求37的试剂盒,其中所述基因是Dlghl、Magi3>Ctnnbl、Camk2d、Mapkl或Senp2。
41.权利要求38的试剂盒,其中所述基因是Magi3、Ctnnbl或Camk2d。
42.权利要求36的试剂盒，其中所述试剂是探针，包含 a)与基因表达的转录产物特异杂交或者扩增基因表达的转录产物的多核苷酸，或其片段；或 b)与基因表达的翻译产物特异结合的多肽结合剤，或其片段。
43.权利要求42的试剂盒，其中所述多肽结合剂是抗体。
44.权利要求43的试剂盒，其中所述探针与基底是结合的。
45.权利要求44的试剂盒，其中所述探针在阵列中。
46.用于测量心脏细胞或组织的生物学年龄的试剂盒，包含(I)适合于測量心脏细胞或组织中β_联蛋白的量或活性的试剂，和(2)怎样使用心脏细胞或组织中β_联蛋白的量或活性的所述测量来測定心脏细胞或组织的生物学年龄的说明。
47.权利要求46的试剂盒，进一歩包含将β_联蛋白量或活性的水平与心脏衰老关联的对照。
48.权利要求47的试剂盒，其中所述对照包含下述的ー种或ー种以上(I)ー种或ー种以上己知生物学年龄的心脏细胞或组织，或者(2)显示在ー种或ー种以上己知生物学年龄的心脏细胞或组织中β -联蛋白的量或活性的信息。
49.权利要求48的试剂盒，其中所述试剂是探针，包含 a)与β_联蛋白基因转录产物特异杂交或者扩增β_联蛋白基因转录产物的多核苷酸，或其片段；或 b)与β_联蛋白特异结合的多肽结合剂，或其片段。
50.权利要求49的试剂盒，其中所述多肽结合剂是抗体。
51.权利要求46的试剂盒，其中所述探针与基底是结合的。
52.权利要求51的试剂盒，其中所述探针在阵列中。
53.包装，其包含适合于測量心脏细胞或组织中与Wnt信号相关的ー个或ー个以上基因的基因表达的试剂；所述包装进ー步包含贴在包装上的标签，所述标签含有单词、图片、设计、縮写、标语、短语或者其他图案或者它们的组合，所述标签显示包装的内含物含有用于测定心脏细胞或组织的生物学年龄的试剂。
54.计算机系统，其包含数据库，所述数据库含有鉴定心脏细胞或组织中与Wnt信号相关的ー个或ー个以上基因的表达水平的信息，所述表达水平在年老的心脏中与年轻动物比较是降低的，以及使得用户可以访问或操作数据库中的信息的用户界面。
55.介质，其用于显示下述ー种或ー种以上用途的信息或者说明(I)心脏细胞或组织中与fct信号相关的基因，所述与Wnt信号相关的基因在年老的心脏中与年轻动物比较是降低的，(2)通过在个体的心脏中增加Wnt信号和/或増加β -联蛋白的量或活性，在个体中延缓心脏衰老，(3)通过施用在个体的心脏中增加Wnt信号和/或増加β_联蛋白的量或活性的试剂或方案，在个体中延缓心脏衰老，(4)筛选测试化合物或方案通过在心脏中调节与Wnt信号相关的基因的表达而延缓心脏衰老的能力，(5)通过测量心脏细胞和组织中与fct信号相关的基因的表达，測定心脏细胞和组织的生物学年龄，和(6)用于测量与年轻动物比较，在年老的心脏细胞或组织中与fct信号相关的基因的差异表达的试剂盒和试齐IJ;其中所述介质包含ー个或ー个以上的含有信息或说明的物理或电子文件、数字存储介质、光学存储介质、声学报告、视听展示或者可视显示。
56.权利要求55的介质，其选自显示的网址、可视显示kiosk、小册子、产品标签、包装说明书、广告、散发材料、公告栏、录音带、录影带、DVD> CD-ROM、计算机可读芯片、计算机可读卡、计算机可读盘、USB装置、FireWire装置、计算机存储器和它们的任何组合。
57.用于在个体中延缓心脏衰老的方法,包括步骤 a)鉴定需要延缓心脏衰老的个体；和 b)调节影响个体的心脏中fct信号的至少ー个基因的表达，其中所述调节导致心脏中 的Wnt信号的增加,从而在个体中延缓心脏衰老。
58.权利要求57的方法，其中所述基因是Dlghl、Magi3,AktU Dab2、RacU CtnnbUCamk2d、Mapkl、Senp2、Smad3、Mark2、Ccndl 或 Pias4。
59.权利要求58的方法，其中所述基因是Dlghl、Magi3>CtnnbI、Camk2d、Mapkl或Senp2。
60.权利要求59的方法，其中所述基因是Magi3、Ctnnbl或Camk2d。
61.权利要求60的方法，其中所述基因是Ctnnbl。
62.权利要求57的方法，其中所述调节包含増加ー个或ー个以上基因的表达。
63.权利要求57的方法，其中所述增加的Wnt信号与个体的心脏中β-联蛋白的量或活性的増加相关。
64.权利要求57的方法，其包括给个体施用有效量的ー种或ー种以上的试剂，或者使个体接受ー种或ー种以上的方案，从而在个体中延缓心脏衰老，所述试剂或者方案増加心脏中fct信号或者至少部分逆转心脏中Wnt信号的年龄相关減少。
65.权利要求64的方法，其中所述试剂模拟个体的心脏中β-联蛋白的活性。
66.权利要求64的方法，其中所述方案包含热量限制或者白藜芦醇的摄入。
67.ー种或ー种以上増加心脏组织中Wnt信号或者至少部分逆转心脏组织中Wnt信号的年龄相关減少的试剂在制备用于延缓心脏衰老的药物中的用途。
68.权利要求67的用途，其中所述试剂是白藜芦醇。
全文摘要
本发明提供了一组涉及心脏衰老的强大的生物标志物，其包含参与Wnt信号通路的几个基因。已经发现，这些基因在老年的心脏组织对比年轻的心脏组织中是下调的。公开了使用这些生物标志物监控心脏衰老和鉴定延缓心脏衰老的营养物和饮食方案的方法。还公开了调节这些基因自身以延缓心脏衰老的方法。
文档编号G01N33/53GK102695807SQ201080060948
公开日2012年9月26日 申请日期2010年11月9日 优先权日2009年11月10日
发明者Q·李 申请人:雀巢产品技术援助有限公司